Cancers

Greffées sous la peau avec des cellules tumorales, tondues au flanc, pesées jusqu'à sept fois par semaine, 2 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Aucun médicament n'est évalué à ce stade. Le travail consiste à caler les conditions de greffe, lignée tumorale par lignée tumorale : taille de la tumeur, vitesse de croissance, moment où le traitement pourra commencer. Ces modèles serviront ensuite à tester des radiopharmaceutiques fournis par les clients du laboratoire, et le porteur précise qu'un modèle n'est monté que si le client ne le maîtrise pas déjà en interne.

Objectifs

Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la 2ème cause de décès dans le monde. Les modèles murins sont encore aujourd’hui indispensables en oncologie notamment pour comprendre la physiopathologie de ces maladies, trouver des thérapie innovantes et évaluer leur efficacité. L’utilisation de radiopharmaceutiques (molécules ciblant les cellules cancéreuses et entrainant ainso leur destruction par émission de rayonnement ionisant) est une nouvelle approche thérapeutique prometteuse. Une des approches de notre laboratoire est de caractériser la distribution tissulaire et sanguine, l’élimination de molécules fournies par nos clients dans le contexte de tumeurs sous cutanées. Cette distribution est rendue possible par le marquage du candidat médicament avec un élément radioactif non toxique aux doses utilisées, la radioactivité pouvant être suivie dans les tissus animaux après prélèvements ou par imagerie. L'approche suivante est de quantifier l’efficacité thérapeutique de molécules fournies par nos clients couplées à différents radioéléments (=élément radioactif) pour le traitement de différents modèles tumoraux greffés chez la souris en sous-cutanée et ainsi d’évaluer le retard de croissance tumorale ou sa régression. Ces molécules (=radiopharmaceutiques = molécules couplées à un élément radioactif) doivent viser spécifiquement les cellules tumorales pour permettre au radioélément d’y accéder. C’est le rayonnement ionisant de ces derniers qui doit aboutir à la destruction des cellules tumorales. L’objectif spécifique de ce projet est donc de déterminer les conditions optimales de greffe de tumeur, leurs caractéristiques de croissance tumorale ainsi que les fenêtres de début de traitement à mettre en œuvre pour chacune des lignées tumorales. Ces modèles ne sont mis en oeuvre que quand le client dispose d'un traitement le visant spécifiquement et uniquement si notre client ne les maîtrise pas déjà en interne auquel cas, un simple transfert de technologie est effectué.

Bénéfices attendus

Le cancer est une des principales causes de mortalité dans le monde. Malgré de nombreuses avancées, le besoin en thérapies innovantes reste majeur. L’utilisation de radiopharmaceutiques (ciblant les cellules cancéreuses et entrainant ainso leur destruction par émission de rayonnement ionisant) est une nouvelle approche thérapeutique prometteuse. Ce projet permettra donc de déterminer les conditions optimales de greffes de tumeurs et leurs caractéristiques de croissance tumorale afin de disposer de modèles fiables et robustes utilisables pour la sélection de candidats médicaments aussi bien pour étudier leur biodistribution dans le cadre de souris porteuses de tumeurs sous-cutanées que pour évaluer l'efficacité thérapeutique de candidats médicaments (radiopharmaceutiques).

Procédures

Sur animal vigile : Pesée (de 1 à 7 fois/semaine, 20 secondes) ; Tonte du flanc en vue de la greffe ou de la mesure du volume tumoral (1 à 3 fois, 10 secondes) ; Greffe de cellules tumorales en sous-cutanée (1 injections, 15 secondes)

Impact sur les animaux

Stress et douleur légère liés à l’administration des cellules tumorales en sous-cutanées ; stress lié à la manipulation vigile pour les pesées ou les mesures de tumeurs au pied à coulisse ; douleur légère liée à la pousse tumorale

Devenir

Mise à mort de tous les animaux de chaque procédure lorsque l’une des conditions ci après est remplie : Prélèvement d’organes ou de tumeur au cours de l’étude ; Atteinte d’un point limite justifiant la mise à mort de l’animal ; Fin de l’étude

Remplacement

Evaluer l’efficacité de molécules couplées à des radioéléments nécessite d’être en présence d’un système biologique complexe. En effet, il est nécessaire dans le cadre de notre projet de vérifier que le candidat cible les cellules tumorales et de suivre son évolution dans d’autres tissus où il n’est pas souhaitable qu’il soit en trop grande quantité. Pour pouvoir effectuer ces évaluations in vivo, il est indispensable d’utiliser un modèle tumoral maîtrisé et bien caractérisé en recréant la pathologie par implantation de cellules tumorales chez la souris. Il n’est donc pas possible aujourd’hui de faire ce suivi in vitro et l’animal reste encore le modèle le plus fin et le plus pertinent pour ce type de traitement.

Réduction

En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, 10 souris maximum par groupe sont nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement interprétables en tenant compte de la variabilité du succès de l’induction et de la croissance tumorale. Les études menées dans le cadre de ce projet permettront ainsi de déterminer les conditions optimales de greffe de tumeur, leurs caractéristiques de croissance tumorale ainsi que les fenêtres de début des traitements à mettre en œuvre pour chacune des lignées tumorales qui constitueront nos modèles d’études. Ces modèles ne sont mis en oeuvre que quand le client dispose d'un traitement le visant spécifiquement et uniquement si notre client ne le maîtrise pas déjà en interne auquel cas, un simple transfert de technologie est effectué

Raffinement

Afin de réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse au maximum, les animaux sont surveillés quotidiennement et des points limites les plus précoces possibles sont mis en place. Les animaux sont également hébergés en groupes sociaux harmonieux de 6 par cage maximum dans un environnement enrichi comme la réglementation l'exige. Les injections et les prélèvements de sang effectués sur l’animal vivant le seront selon les bonnes pratiques de bien-être animal en termes de volumes, de matériel utilisé, d’anesthésie éventuelle et de préhension des animaux.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies anti-cancéreuses. Les souris seront utilisées à un âge compris entre 6 et 12 semaines lors de leur entrée en étude, âge auquel le système immunitaire de ces animaux est décrit comme mature.

Les souris utilisées ici sont immunodéprimées par construction, seule condition pour que des tumeurs humaines prélevées sur des patients puissent pousser dans leur corps. 6 220 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sur une durée pouvant atteindre huit mois par animal. Les greffes se font sous la peau, dans l'os par injection intra-osseuse, ou dans la capsule du rein après ouverture chirurgicale, et une partie des souris est castrée pour les cancers hormono-dépendants. Toutes sont tuées pour l'analyse de leurs tissus, quatre souris étant greffées par prélèvement de patient afin de compenser un taux de prise que le porteur situe entre 30 et 35 %.

Objectifs

Le développement des modèles proposés dans ce projet va nous aider à mieux comprendre pourquoi certains traitements contre le cancer échouent chez les patients. Dans notre équipe, nous utilisons des techniques de pointe pour étudier ces mécanismes sur des modèles de souris, qui portent des tumeurs humaines. Lorsque nous ne pouvons pas réaliser ces analyses directement sur les patients, nous utilisons les données obtenues à partir de ces modèles. Ensuite, nous développons des cultures de cellules ou des mini-organes à partir de ces tumeurs pour des études plus poussées. Ces recherches nous permettent de mieux comprendre comment les cellules cancéreuses résistent aux traitements. Cela peut aider à améliorer les soins pour les patients atteints de cancer

Bénéfices attendus

Nos modèles seront disponibles pour d'autres chercheurs, ce qui leur permet de tester de nouvelles idées pour traiter le cancer. Par exemple, nous avons pu valider de nouveaux médicaments qui ont ensuite été testés chez des patients. En résumé, notre travail sur ces modèles nous aide à comprendre et à vaincre la résistance aux traitements du cancer, ce qui pourra conduire à de meilleurs traitements pour les patients dans le futur.

Procédures

Chirurgies : Greffe dans la capsule sous-rénale sous anesthésie générale, une seule, durée 15 minutes. Castration des souris, une seule, durée 5 minutes sous anesthésie générale. La majorité des modèles seront établis par injection sous-cutanée, sauf pour les échantillons osseux qui seront greffés dans l'os. Injection sous-cutanée, durée 2 minutes, sous anesthésie générale, nombre de 1 à 2. Injections intra-osseuses : durée 8 minutes, une seule sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Toutes les chirurgies seront effectuées sous anesthésie gazeuse dans des conditions stériles. La greffe dans la capsule sous-rénale sous anesthésie générale peut causer un stress et une douleur légère, mais ces effets sont temporaires et sont atténués par l'anesthésie et des analgésiques. Castration des souris : pratiquée uniquement pour certains types de cancers, cette chirurgie brève sous anesthésie générale peut causer une douleur légère, atténuée par des analgésiques. Injections sous-cutanées ou injection de cellules: pratiquées sur la majorité des souris, cette méthode est la moins invasive. Les effets sont temporaires, légers et sont atténués par l'anesthésie et par des analgésiques. Greffe intra-osseuse : réalisée sur des échantillons osseux pour reproduire l'environnement tumoral. Elle peut causer une douleur modérée, elle sera faite sous anesthésie suivie d'un traitement analgésique et d'une alimentation adaptée.

Devenir

Les souris seront euthanasiées pour études sur les tissus et organes des animaux (anatomie pathologique, biochimie, métabolomique, protéomique, génomique).

Remplacement

La complexité biologique des organismes vivants est extrêmement élevée, et les interactions entre différents systèmes biologiques peuvent être difficiles à reproduire en dehors d'un organisme vivant. Les modèles animaux peuvent fournir des informations cruciales sur la physiologie, la pathologie et les mécanismes de la maladie qui ne peuvent pas être obtenues par d'autres moyens. De plus, ils peuvent souvent mieux représenter les processus biologiques humains que les modèles cellulaires ou informatiques. Pour l'étude en cours, l'organisme entier est indispensable pour récapituler les communications humorales et cellulaires du micro-environnement tumoral avec le reste des effecteurs de l'immunité, les organoïdes ou d'autres systèmes de culture cellulaire 2D ou 3D ainsi que les systèmes de modélisation mathématique et informatique ne sont pas adéquats.

Réduction

En parallèle du développement de modèles de tumeurs dérivées de patients, et afin de réduire le nombre d'animaux utilisés en expérimentation, nous développons des organoïdes et des lignées cellulaires. Ces modèles in vitro permettent des études mécanistiques et un large criblage de médicaments, limitant ainsi l'utilisation d'animaux en validant les résultats in vitro avec des modèles plus proches de la biologie humaine. Étant donné que le matériel provient de biopsies, nous greffons 4 souris par prélèvement, ce qui est très peu mais suffisant pour obtenir un modèle selon nos données antérieures indiquant un taux de prise de 30-35 % lors de la primo-implantation. L'utilisation de 4 souris assure une quantité adéquate de matériel pour caractériser et préserver les tumeurs . Le nombre d'animaux prévu au projet est un nombre maximal qui va dépendre du nombre de tumeurs de patients accessibles sur la durée du projet.

Raffinement

Après l'arrivée des souris, nous les laisserons une semaine en acclimatation pour qu'elles s'habituent à leur nouvel environnement. Pendant les opérations chirurgicales comme les greffes sous-cutanées, l'ajout de pellets de testostérone, ou les greffes dans la capsule sous-rénale et dans les os, les souris sont anesthésiées par anesthésie générale et reçoivent un médicament contre la douleur. L'examen clinique est quotidien. Cette observation permet de vérifier si l’animal est en bonne santé, sa posture, son comportement afin de déceler tout signe de détresse. Pour les animaux avec une greffe dans la capsule rénale, une délicate palpation deux fois par semaine est réalisée au niveau du rein. Les animaux avec greffe osseuse sont suivis en vérifiant régulièrement leur état ainsi qu’en procédant à une palpation de la greffe au niveau de l’os en mesurant la largeur de l’os. Des points lmites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les souris participant à l'étude restent pendant au maximum 8 mois. Les animaux bénéficient d'un enrichissement environnemental (maisons, tunnels, sizzlenests) et de matériaux pour construire un nid. Cette optimisation des conditions de vie permet aux animaux de s’exprimer, de se sociabiliser, de s’adapter à leur nouvel environnement mais aussi d’être moins stressés en restant actifs.

Choix des espèces

L'utilisation de souris est justifiée: par l'état de l'art des modèles murins pour le développement préclinique en oncologie et par la nécessité d’utilisation de modèles immunodéprimés afin de permettre la croissance tumorale de tumeurs humaines. Des souris âgées de 5 à 9 semaines seront utilisées pour standardiser la procédure et ainsi réduire la variabilité intra-expérience. Par ailleurs, l’utilisation de souris âgées de 5 à 9 semaines permet d’améliorer le taux de prise des greffes.

Injectées dans la peau avec des cellules cancéreuses, puis anesthésiées pour recevoir des anticorps radiomarqués par voie intraveineuse, 1 100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La prise de sang finale se fait dans le thorax, sur animal anesthésié et sans réveil, et les tumeurs peuvent provoquer une perte de poids et des troubles fonctionnels qui figurent parmi les points limites. Il s'agit de mesurer où se fixent des anticorps radioactifs dans l'organisme, pour développer un outil de diagnostic du mélanome par imagerie TEP. Le porteur annonce que tous les animaux seront tués à l'issue de chaque procédure, puis écrit quelques lignes plus loin que les souris saines seront conservées, si possible, pour d'autres manipulations.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’intérêt de l’utilisation des anticorps radiomarqués dans le diagnostic et le suivi de pathologies tumorales, telles que le mélanome. L’arrivée des nouveaux anticorps thérapeutiques sur le marché, tels que les inhibiteurs de checkpoint immunitaire (ICI), notamment les anti-PD-1 et anti-CTLA_4, nécessite de développer de nouveaux outils diagnostiques qui permettront d’identifier les biomarqueurs et ainsi, déterminer le meilleur traitement à employer. En effet, les anticorps, de par leur spécificité, peuvent être utilisés en thérapie et en diagnostic ce qui en fait des candidats prometteurs pour la théragnostic. La variabilité de la réponse des patients à l’immunothérapie, malgré une analyse préalable de leur marqueur sanguin ou de leur biopsie, démontre la nécessité de développer ces outils théragnostiques. Nous proposons de développer et valider des radiotraceurs permettant un diagnostic précoce et un suivi de la réponse thérapeutique par imagerie nucléaire.Des études de biodistribution après administration intraveineuse seront réalisées sur les radiotraceurs d’intérêt afin d'observer la distribution du traceur au sein de l'organisme et dans les sites antigéniques d’intérêt. Les études précliniques se dérouleront en 2 phases : études par imagerie de Tomographie par Emission de Positons (TEP) et études post-mortem sur les organes d’intérêt. Ces études seront réalisées avec l'aide des modèles de cancers pertinents. Face à l’hétérogénéité des cancers et des mécanismes immunitaires, il est nécessaire de travailler sur plusieurs modèles murins pour ce projet. Les procédures décrites dans ce projet seront réalisées dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les études précliniques par imagerie TEP et par études post-mortem permettront d’étudier la biodistribution des anticorps thérapeutiques radiomarqués d’intérêt afin d'observer la distribution du traceur au sein de l'organisme et dans les sites antigéniques. Ainsi nous pourrons évaluer l’intérêt de l’utilisation des anticorps radiomarqués dans le diagnostic de pathologies tumorales, telles que le mélanome. Cette étude préclinique permettra de pouvoir évaluer par la suite nos anticorps radiomarqués chez l’homme afin de développer de nouveaux outils diagnostiques qui permettront d’identifier les biomarqueurs et ainsi, déterminer le meilleur traitement à employer.

Procédures

Les animaux seront soumis à une induction des tumeurs par injection intradermique de cellules cancéreuses et à des injections intrapéritonéales de traitement, basé sur des anticorps. Quel que soit le modèle, l’administration du radiotraceur, sous anesthésie à l’isoflurane, par voie intraveineuse. Prélèvement sanguin transthoracique terminal réalisé sur l’animal anesthésié sans réveil. L’établissement des tumeurs avant immunoTEP sera réalisé dans l’EU1. Toutes les sessions d’ImmunoTEP seront réalisés dans l'EU2.

Impact sur les animaux

L’injection d’anticorps radiomarqués n’influera pas sur l’état de l’animal. Les quantités injectées d’anticorps sont à doses traceuses, c’est-à-dire inférieure à la dose nécessaire à un possible effet thérapeutique. Quant au radioélément, il n’influera pas sur l’état de santé de l’animal car les activités administrées restent faibles et il s’agit de radioéléments émetteurs béta+ à usage diagnostic. Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Les conditions d’hébergement seront optimisées par ajout d’enrichissement adapté pour assurer le bien-être des animaux. L’induction de modèles tumoraux peut entrainer une perte de poids de l’animal qui sera surveillée et qui fait partie des points limites. De plus, les tumeurs pourraient éventuellement induire des troubles fonctionnels chez l'animal (points limites). Une observation visuelle quotidienne des animaux pour l’apparition des signes de douleurs sera faite par l’expérimentateur et le personnel animalier. Tout animal présentant des signes de souffrance ou de léthargie, décrit dans les points limites des procédures, sera exclu de l’étude et mis à mort.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issu de chaque procédure. La procédure d’étude de biodistribution des anticorps radiomarqués permettra de sélectionner les temps pertinents pour l’étude post mortem. Le protocole sera optimisé afin coïncider l’euthanasie des animaux avec l’étude post mortem. Les animaux malades ne peuvent pas être gardés et l’euthanasie est nécessaire au vu des modèles de maladie induits. Pour les animaux sains, si cela est possible, ils seront conservés pour d’autres manipulations afin de réduire au maximum le nombre d’individus nécessaires.

Remplacement

Une étude préalable in vitro des anticorps radiomarqués a été préalablement effectué pour vérifier l’intérêt des anticorps avant l’injection chez l’animal. Il a été testé la stabilité in vitro, l’affinité et l’immunoréactivité des anticorps radiomarqués sur un modèle cellulaire adapté. Cependant, il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro capable de prendre en compte la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du développement de cancers.

Réduction

Une étude complète de la littérature a été effectuée pour ne pas reproduire des expériences. Nous utiliserons des tests statistiques afin de valider nos résultats et limiter le nombre d’expériences. Par ailleurs, le suivi longitudinal des animaux sur 24 à 170h permis par l’imagerie non invasive TEP permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux impliqués dans l’études par comparaison avec la méthode plus classique de biodistribution ex vivo qui nécessiterait la mise à mort de lots d’animaux à chaque temps d’observation.

Raffinement

Nous porterons une attention particulière à la souffrance et au stress des animaux ainsi qu’à anticiper l’atteinte des points limites. Le suivi de l’état général des souris sera effectué quotidiennement par le porteur de projet et le personnel. Pour diminuer la souffrance liée au procédures expérimentales et au développement du cancer, un traitement analgésique en locale (lidocaïne). L’angoisse et la souffrance seront évaluées par des observations comportementales. Si un changement chez l’animal traduit un point limite, l’animal sera mis à mort, en accord avec le vétérinaire désigné. Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel ou paper wool).

Choix des espèces

L’utilisation de modèles animaux de cancer est incontournable si nous voulons préciser les mécanismes sous- jacents à son développement. L’utilisation de modèles murins déjà établis dans la littérature et décris pour leur pertinence dans ce domaine de la recherche biomédicale est une étape nécessaire pour valider l’efficacité thérapeutique et la tolérance de nouvelles molécules ou thérapies candidates en clinique humaine. Les expériences seront réalisées sur des jeunes adultes (6-16 semaines). Avant le système immunitaire est immature et après il est affaibli, de plus la croissance tumorale n'est pas la même sur des souris jeunes adultes que sur des souris âgées.

La suspension tumorale greffée aux lapins est prélevée sur deux ou trois d'entre eux, déjà porteurs de la tumeur VX2, pour quinze receveurs. 80 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit cinq anesthésies générales, une mini-laparotomie pour la greffe intrapéritonéale, trois cœlioscopies pour aérosoliser de la chimiothérapie sous pression, une dernière pour la mise à mort et les prélèvements. Le porteur décrit un abdomen qui gonfle sous l'ascite et un transit perturbé, et borne pour cette raison la manipulation à onze semaines. Il écarte la souris, trop petite pour supporter la surpression de la cœlioscopie, et retient le lapin pour son anatomie abdominale proche de celle de l'humain.

Objectifs

Des modèles existants de lapins présentant des métastases après injection de tumeur VX2 (carcinome à cellules squameuses de lapin transplantables) vont être traités par chimiothérapie intrapéritonéale pressurisée par aérosol par voie coelioscopique (PIPAC) via des dispositifs médicaux ou des traitements. L’objectif principal est d’évaluer la réponse histologique après la 3ème PIPAC entre les groupes de lapins avec métastases péritonéales (MP) traitées. Les objectifs secondaires consistent en l’évaluation comparée des critères suivants sur ces mêmes groupes : la réponse radiologique, le peritoneal cancer index (PCI), le volume d’ascite, la réponse immunitaire (immunomarquage), la profondeur de pénétration de la chimiothérapie au sein des MP dans les tissus et analyse 3D de l'environnement tumoral par microscopies multiphotonique et électronique.

Bénéfices attendus

Aucun résultat ne peut être prédit en faveur de l’une ou l’autre buse de pulvérisation. Néanmoins, un dispositif médical a été retiré du marché en France récemment pour défaut et risque de toxicité pour le patient. Il est nécessaire de faire une étude objective réalisées par des scientifiques et médecins sans conflit d’intérêt pour répondre à cette question polémique qui est souvent abordée dans les congrès et groupes de recherche.Les buses actuelles ont eu toutes un marquage CE mais elles n’ont pas été comparées entre elles sur un modèle animal avec métastases péritonéales. De même, nous espérons que la réduction du temps de pause puisse permettre une efficacité identique. L’assistance avec electrothérapie devrait apporter une meilleure régression tumorale. Enfin, des molécules chimiothérapeutiques innovantes sont régulièrement mises sur le marché pour une efficacité anti-tumorale améliorée (nanoparticules, nouvelles molécules) de même que de nouveau protocole de traitement (adjonction de chimiothérapie systémique lors de la PIPAC) Nous souhaitons évaluer l’efficacité de chaque plan expérimental sur un modèle animal avec métastases péritonéales. Ainsi, la réponse histologique, radiologique, le score PCI seront analysés pour répondre à cet objectif. L’impact de cette étude sera réel si les résultats conduisent à une différence d’efficacité de l’un des protocoles. Au-delà de la valorisation scientifique, les applications en santé humaine seront facilement transposables en raison de l'absence d'études dans ce domaine.

Procédures

Tous les animaux sont soumis à 5 anesthésies générales d'une durée totale d’envrion 1h30. La 1ere : Greffe des cellules VX2 en intrapéritonéale : mini-laparotomie médiane, greffe d’une suspension tumorale de VX2 issue de lapins porteurs (2 ou 3 lapins porteurs pour 15 receveurs), sur différents sites péritonéaux (Péritoine viscéral et pariétal). Phase de traitement : tous les lots de lapins bénéficient des mêmes gestes chirurgicaux (incision, insertion de trocart, biopsie et aérosolisation) durant les 3 autres anesthésies par coelioscopie pour chaque PIPAC. La seule différence est le type de dispositif médical d’aérosolisation/le traitement/la procédure PIPAC (ePIPAC) utilisée, le type de molécules chimiothérapeutiques (Intrapéritonéale ou systémique) ou sérum physiologique, le temps de pause de la PIPAC… Une dernière et 5ème anesthésie générale aura lieu en fin d'expérimentation (pour euthanasie).

Impact sur les animaux

Une anorexie et une perte de poids peuvent apparaître, ainsi qu’une altération de l’apparence physique et du comportement en conséquence. Une augmentation du diamètre abdominal est à prévoir en raison de l'accumulation du liquide d'ascite dans la cavité péritonéale, en particulier les dernières semaines post greffe, d'où la décision de limiter la durée de la manipulation jusqu’à 11 semaines maximum. Le fonctionnement du transit intestinal peut aussi être perturbé (selles liquides).

Devenir

À l'issue de la procédure, les animaux sont euthanasiés pour effectuer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques, de biologie moléculaire ou de microscopie.

Remplacement

Des études in vitro ont déjà été effectuées sur ce sujet mais ont montré leurs limites. Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser la complexité de la réponse histologique d’un organisme entier face à l’administration de thérapeutiques, et encore moins en prenant en compte l'environnement tumoral (une métastase en 3 dimensions ne répondra pas aux traitements chimiothérapeutiques de la même façon qu'une culture en 2 dimensions) et la coopération avec le système immunitaire. Ils sont aussi insuffisants pour envisager des essais cliniques chez l’Homme. Les modèles de lapins de MP sont bien décrits (Mei et al 2010) et permettent de mimer le phénomène observé chez l’Homme.

Réduction

Le modèle de MP est maitrisé par l’équipe et les porteurs de ce projet, ce qui permet de limiter des étapes de mises au point. Pour chaque étude, de 3 à 5 lapins seront utilisés par condition (pour un dispositif et/ou par traitement testé). Ce nombre prend en compte la fréquence potentielle d’échec du modèle et de la procédure (qui reste faible). Nous estimons avoir besoin de 80 lapins afin de tester 20 conditions expérimentales différentes (suivies d'analyses de la variance). De plus, nous travaillons en étroite collaboration avec l'entreprise qui maîtrise et commercialise le modèle de lapin avec greffe de tumeurs VX2 et métastases dans différents sites (gastrique, intrapéritonéal, ovarien, ...). Des expériences in vitro ont déjà permis de définir les valeurs de la gamme de concentration des cellules selon leur cinétique de croissance. Les expériences in vivo sont organisées dans un ordre précis, avec des témoins choisis de sorte à limiter la répétition d’expériences.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions d’hébergement (nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. Une attention particulière sera apportée à l'hydratation des animaux pour surveiller d'éventuels troubles du transit. De plus, l’ensemble des procédures sera réalisé de manière à limiter le stress et la souffrance des animaux (anesthésie, tapis ou lampe chauffante pendant la chirurgie, analgésique post opératoire). Les animaux seront suivis quotidiennement et évalués selon une grille de score décrite dans le document annexe. Des points limites ont été définis et justifieront d’une intervention (troubles du comportement, signes d’occlusion intestinale (arrêt du transit), troubles respiratoires...)

Choix des espèces

Pour l’étude des métastases péritonéales, la souris est l’animal le plus couramment utilisé. Néanmoins, la coelioscopie et la surpression dues à la PIPAC ne sont pas compatibles avec la taille de la souris à ce jour. Le modèle de lapin est ainsi le plus approprié pour étudier les métastases péritonéales gastriques. Le lapin est un animal avec une durée de vie plus longue que la souris, ce qui permet de réaliser des plans expérimentaux répétés sur de plus longues périodes. Il a une anatomie abdominale et une physiopathologie péritonéale proche de celle de l’homme, ce qui en fait un modèle stratégique en cancérologie digestive. Il s’agit ici d’un projet intégrant plusieurs études exploratoires permettant de fournir des éléments de faisabilité, de comparaison et de sécurité de la procédure PIPAC. Nous utiliserons des jeunes lapins adultes pour de meilleures conditions de santé et éviter de cumuler avec d'autres pathologies liées au vieillissement.

Greffées de cellules de cancer ovarien humain, 800 souris immunodéficientes reçoivent ensuite un candidat médicament, jusqu'à une fois par jour pendant quatre semaines, avec quatre prises de sang sous anesthésie et une imagerie hebdomadaire. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et sont toutes tuées à l'issue, pour caractériser l'effet du traitement sur leurs organes et sur la tumeur. Le laboratoire réalise ces essais comme prestataire, pour des partenaires publics ou privés, et met en avant la reproductibilité et la robustesse de ses modèles. Il écrit dans le même paragraphe que ces modèles "demandent à être améliorés" et que les thérapies innovantes qu'ils laissent espérer relèvent d'un "futur proche".

Objectifs

Malgré les progrès de la chirurgie et de la chimiothérapie, le cancer de l'ovaire reste l'une des principales causes de décès par cancer chez les femmes, avec le cancer du poumon et le cancer du sein. Le cancer de l'ovaire développe souvent une résistance aux thérapies conventionnelles, ce qui rend son traitement difficile à un stade avancé. La mise en œuvre de nouvelles approches thérapeutiques est donc nécessaire pour améliorer le traitement de la maladie. Dans ce contexte, nous avons pour objectif de réaliser des tests précliniques chez la souris afin d'évaluer l'efficacité de candidats médicaments innovants.

Bénéfices attendus

En tant que prestataire de services, nous réalisons ces études pour des laboratoires partenaires publics ou privés. Dans ce projet, nous offrons la possibilité à la communauté scientifique de pouvoir évaluer l’efficacité de nouveaux candidats médicaments à l’aide de modèles précliniques dont nous assurons la reproductibilité et la robustesse nécessaires au développement des projets en immuno-oncologie. Bien que ces modèles demandent à être améliorés, ils ont permis de reproduire chez la souris certains aspects des pathologies humaines et, en complément des autres modèles expérimentaux, ils laissent ainsi espérer le développement dans un futur proche de thérapies innovantes.

Procédures

L’ensemble des animaux subira une transplantation de cellules tumorales ovariennes humaines (1 injection durant 1 min / animal) puis recevra des administrations de candidats thérapeutiques dont la fréquence et la route seront dépendantes de la pharmacocinétique du composé à évaluer. Une partie des animaux subira des prélèvements sanguins (au maximum 4) réalisés sous anesthésie volatile (5 min/souris), en alternant les sites de prélèvement et espacés d’au minimum 7 jours afin de favoriser la cicatrisation. Enfin, le suivi du développement tumoral sera effectué hebdomadairement par imagerie optique par bioluminescence, un procédé non invasif mais nécessitant l’anesthésie des souris (durée= 6 à 10 minutes/souris).

Impact sur les animaux

Les animaux développeront une pathologie tumorale humaine potentiellement grave pouvant engendrer une détresse modérée. La transplantation des cellules cancéreuses et l’administration (voie spécifique de chaque candidat thérapeutique) du traitement à évaluer (au maximum quotidien durant 4 semaines) engendreront une brève douleur légère. Les anesthésies associées aux prélèvements sanguins (au maximum 4) et à l’imagerie optique (hebdomadaire) seront une source potentielle d’un stress de courte durée. L'ensemble des manipulations ainsi que les pesées peuvent être source d'angoisse.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de pouvoir caractériser ex-vivo l’effet de l’administration des candidats médicaments sur les organes et/ou la tumeur.

Remplacement

Notre projet se fera dans la continuité d'études in vitro. Le passage au modèle in vivo est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez les patients. Nous avons besoin d’un modèle permettant de reproduire d’un point de vue phénoménologique toute la complexité de la croissance tumorale. Un organe isolé ou une espèce, autre que les mammifères, ne permettra pas d’évaluer la biodistribution du candidat thérapeutique évalué, ni le role du système immunitaire dans la réponse anti-tumorale ou les éventuels phénomènes de résistance. La souris est alors le modèle rongeur le plus utilisé permettant de modéliser cette pathologie humaine et qui permet en plus de faire un suivi de l’évolution du développement tumoral par des mesures cinétiques non invasives par bioluminescence.

Réduction

Les études in vivo ne seront réalisées que sur les molécules candidates qui auront démontré une efficacité maximale in vitro. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet, à savoir démontrer que l’effet de nos molécules est significatif par rapport aux groupes contrôles. De plus, lorsque ce sera possible, nous mutualiserons les groupes contrôles. La comparaison de différentes conditions expérimentales se fera par des tests statistiques adaptés aux petits échantillons.

Raffinement

Dans un souci de raffinement, le suivi du développement tumoral se fera par des mesures cinétiques utilisant un procédé non invasif à savoir des acquisitions de bioluminescence par imagerie optique sous anesthésie volatile. L'hébergement des animaux est effectué conformément aux réglementations locales et européennes, sous le contrôle d'un vétérinaire et avec l'aide d'un personnel technique qualifié. Les animaux seront ainsi hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvèlement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour/12h nuit) et la nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. De plus, afin de respecter leur instinct grégaire et d'assurer une absence de peur et d'anxiété, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de copeaux de bois compactés, de dômes en carton et/ou de coton. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne et une pesée à minima bihebdomadaire, par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance, de blessure ou de maladie nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l'apport d'un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.

Choix des espèces

Le recours à l’expérimentation animale se justifie par l’impossibilité réglementaire de conduire ce type d’études chez l’homme sans données précliniques solides. Nous avons retenu le modèle murin car l’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de tumeurs humaines chez un individu hôte d’une espèce différente. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature et dans nos propres études, pour ce type de modèle d’injection de cellules tumorales humaines, c’est à dire des souris « jeunes adultes » âgées de 6 à 12 semaines au moment de la greffe.

1 872 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une greffe de cellules tumorales, des injections de vecteurs viraux dans la tumeur et deux prélèvements de sang sous anesthésie, la taille de la tumeur étant mesurée au pied à coulisse sur animal éveillé. Le porteur reconnaît que les cellules injectées peuvent former des métastases, entraîner une perte de poids importante et dégrader l'état général, et que les vecteurs peuvent déclencher une inflammation générale. Sur le remplacement, il affirme que seuls les modèles animaux permettent de tester la collaboration entre cellules immunitaires et cellules tumorales, et qu'une nouvelle approche thérapeutique "ne peut se faire que chez l'animal".

Objectifs

L'immunothérapie apparaît comme une nouvelle stratégie de traitement du cancer, en témoigne le succès des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires. Cependant, seuls certains patients ayant ces thérapies en retirent un bénéfice et l'efficacité varie beaucoup selon les cancers. Alors que les mécanismes de résistance primaires et secondaires ont été identifiés au cours des dernières années, il apparait que pour les tumeurs faiblement immunogènes et/ou avec un faible infiltrat immunitaire, de nouvelles stratégies doivent être développées afin de stimuler les réponses immunitaires anti-tumorales. On sait que l’efficacité d’une réponse inflammatoire dépend de la qualité et de la quantité de médiateurs inflammatoires tels que cytokines et chimiokines produites dans le microenvironnement tumoral (MET). Dans ce contexte, les vecteurs viraux adéno-associés (AAV) ciblant les cellules tumorales et/ou immunitaires semblent un outil idéalement adapté à des approches de vaccination/immunothérapie. L'objectif du projet est d’utiliser de nouveaux AAV codant pour des cytokines d’intérêt afin de stimuler les réponses immunitaires dirigées contre la tumeur. Nous avons développé des AAV codant pour l’une des 4 cytokines murines suivantes : IL-12sc (protéine de fusion entre les sous-unités IL-12p40 et IL-12p35) qui module l’activité des lymphocytes T et cellules NK, IFN-α ayant des activités anti-tumorales, GM-CSF (facteur stimulant granulocytes et macrophages) et IL-15sushi (protéine de fusion entre le domaine sushi de la chaine α du récepteur à l’IL-15 avec la cytokine IL-15) dont le rôle anti-tumoral est établi. Nous pensons que l’injection intra-tumorale des AAV codant pour une cytokine donnée ou plusieurs (combinaison d’AAV codant pour des cytokines différentes ou un AAV codant pour plusieurs cytokines à la fois) entrainera une production locale et aiguë de ces cytokines favorisant le recrutement et l’activation des cellules immunitaires dans le MET, ce qui permettra de générer une réponse immunitaire anti-tumorale efficace permettant une diminution de la croissance tumorale, voire un rejet de la tumeur. Nous envisageons également de combiner cette stratégie thérapeutique avec 1) les immunothérapies utilisant des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires (CTLA-4 et PD-1/PDL1) et 2) avec des AAV codant pour des protéines capables d’induire une mort cellulaire immunogénique (ou mort cellulaire inflammatoire capable d'induire la stimulation du système immunitaire).

Bénéfices attendus

L'immunothérapie apparaît comme une nouvelle stratégie de traitement du cancer, comme en témoigne le succès des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires. Cependant, seuls certains patients bénéficiant de ces thérapies en retirent un bénéfice et l'efficacité varie considérablement entre les différents cancers. De nouvelles thérapies innovantes ont donc besoin d'être mise en place. Pour ce faire, nous attendons que l'injection intra-tumorale des AAV codant pour les différentes cytokines (IL-12sc, IFN-α, GM-CSF et IL-15sushi), induise une réponse immunitaire permettant un rejet de la croissance tumorale et l'augmentation de la survie des animaux traités. De plus, l'utilisation de nos vecteurs codant pour ces différentes cytokines seule, mais aussi en combinaison avec d’autres immunothérapies déjà bien connues (tels qu’un anti-PD1, anti PD-L1 ou anti-CTLA-4) et/ou en cours de développement dans le laboratoire (l’utilisation d’AAV codant pour des protéines capables d’induire une mort cellulaire immunogénique et de permettre l’initiation d’une réponse immunitaire antitumorale), aura pour but : (1) d’apporter des effets à long terme chez nos animaux avec la mise en place d'une réponse immunitaire amplifiée et (2) de permettre le contrôle voire le rejet à long terme des différents modèles tumoraux. Les vecteurs AAVs possèdent de nombreux avantages et ont déjà été approuvés en clinique en Europe et aux Etats-Unis. Il est donc envisageable de produire ces vecteurs pour une utilisation chez l'homme, si nos stratégies se montrent convaincantes.

Procédures

- Prélevements de sang sur souris anesthésiées : 2 prélevements par souris à 10 jours d'intervalle, 15 secondes - Injections de cellules tumorales et de vecteurs AAV sur souris anesthésiées, 10 secondes - Mesures de la taille de la tumeur au pied à coulisse sur souris vigile, 45 secondes

Impact sur les animaux

Une fois injectées, les cellules tumorales peuvent former des tumeurs secondaires (métastases) dans différents tissus causant de la souffrance animale. Pour limiter cet écueil, le nombre des cellules tumorales à injecter est bien documenté dans la littérature, minimisant de ce fait ce phénomène. Les modèles tumoraux peuvent aussi induire une perte de poids importante et un mauvais état global de l'animal. De plus, l'injection d'AAV pourrait induire une inflammation systémique si les différents AAV vont transduire différents organes ou tissus de l'animal. Cependant, nous limitons cet effet secondaire par une injection intra-tumorale avec un volume d'injection limité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, afin de prélever le sang et des organes pour analyse. Aucun animal ne peut donc être replacé, adopté ou réutilisé.

Remplacement

Seuls les modèles animaux permettent de tester la collaboration qui existe entre les différents compartiments cellulaires (cellules du système immunitaire, cellules tumorales, etc.). Ainsi la faisabilité et l’efficacité d’une nouvelle approche à visée thérapeutique ne peut se faire que chez l’animal. Dans ce cadre la souris est utilisée.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux, une étude exhaustive de la littérature a été menée pour optimiser les protocoles expérimentaux et s’assurer de la non-obtention de résultats déjà publiés. Le nombre d’animaux utilisés sera déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les procédures expérimentales peuvent engendrer une douleur modérée qui peut être limitée en se basant sur une grille d’observation visant à définir des points limites à partir desquels l’expérience sera arrêtée immédiatement. Si les animaux présentent des signes de douleur, de la buprénorphine sera administrée (0,05 mg/kg). Un enrichissement est également apporté par des abris de cellulose et des carrés de coton vierge.

Choix des espèces

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des populations lymphocytaires et le suivi des réponses immunitaires. Le modèle de souris permet aussi l’utilisation de modèle transgénique, des modèles de Knock-Out qui peuvent être intéressants dans la compréhension des mécanismes impliqués dans le cancer. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque expérience tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan de l’analyse statistique. Nous utiliserons de jeunes souris adultes (animaux âgés entre 6 et 8 semaines au début du protocole) afin que le système immunitaire soit mature au moment de l’inoculation de la tumeur et de l’injection intra-tumorale des différents AAV.