Cancers

4 608 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit des cellules tumorales injectées dans le poumon après incision de la peau, sous anesthésie générale, les autres portent des tumeurs sous-cutanées, et toutes passent par une irradiation localisée de cinq minutes, réalisée sur animal vigile maintenu en contention un quart d'heure. Le porteur décrit l'irradiation comme indolore et annonce une perte de poids inférieure à 5 % liée au passage des rayons sur l'intestin ou l'œsophage. Le bénéfice avancé, réduire les doses de radiothérapie chez des patients, est renvoyé à un transfert clinique lointain, quand les tumeurs greffées et les mini-chirurgies pulmonaires, elles, sont immédiates.

Objectifs

Le cancer du poumon est l'un des cancers les plus répandus. La radiothérapie est un outil puissant qui fait partie de l’arsenal de traitements anticancéreux. De nombreuses études précliniques et cliniques montrent que l’efficacité antitumorale de la radiothérapie dépend du système immunitaire et du microenvironnement tumoral de l’hôte. Nous voulons évaluer un nouveau traitement.Nous pensons que la combinaison radiothérapie + traitement spécifique peut s’avérer être très efficace. Par ailleurs, de nombreuses données précliniques et cliniques suggèrent que la combinaison de radiothérapie + traitement classique est prometteuse. Toutefois, les données cliniques en faveur sont encore parcellaires et de nombreux modèles murins restent résistants à ce traitement. Nous évaluerons donc la triple combinaison radiothérapie + traitement classique+ traitement spécifique pour voir si l’ajout ce traitement spécifique peut sensibiliser les tumeurs au traitement radiothérapie + traitement classique. Il a été observé que la radiothérapie pouvait induire des effets antitumoraux « abscopaux », c’est-à-dire en dehors du champ d’irradiation. Ainsi, l’irradiation d’une tumeur primaire peut entraîner un effet antitumoral sur une tumeur secondaire ou une métastase placée hors du champ d’irradiation. Cet effet « abscopal » est augmenté par les modulateurs de l'immunité. Nous testerons la triple combinaison thérapeutique dans un contexte de tumeurs multisites (plusieurs tumeurs portées par le même hôte) pour évaluer si le traitement spécifique peut augmenter l’effet abscopal.

Bénéfices attendus

50% des patients traités pour un cancer reçoivent une radiothérapie au cours de leur traitement. Le but de la radiobiologie est de permettre l’amélioration de l’efficacité des radiations ionisantes sur les tumeurs (en diminuant la radiorésistance), et de minimiser les effets secondaires sur les tissus sains traversés par les rayons. L’amélioration de la réponse tumorale à l’irradiation pourrait permettre de réduire les doses d’irradiation et ainsi les effets secondaires sans affecter l’efficacité du traitement anti tumoral. Les progrès en immunologie ont révolutionné le pronostic de maladies métastatiques autrefois incurables et de nombreuses études montrent des combinaisons prometteuses entre radiothérapie et immunothérapie chez l’humain. L’effet à distance induit par l’irradiation qui provient du système immunitaire est également un thème de recherche actif en radiothérapie. A court terme, notre étude permettra l’apport de connaissances scientifiques supplémentaires pour mieux appréhender les interactions radiothérapie/immunité mais elle constituera surtout un socle de données précliniques permettant d’envisager à plus long le transfert en clinique de cette combinaison lors d’essais cliniques et donc potentiellement permettra la mise au jour d’un nouveau traitement.

Procédures

Les souris pourront avoir des injections (1 à 4) sous anesthésie locale, durée 1 minute maximum. Injection de cellules tumorales dans le poumon après incision de la peau, sous anesthésie générale, n=1, durée 1 minute. Irradiation localisée sur souris vigiles, durée 5 minutes.

Impact sur les animaux

Le type d’irradiation utilisée dans notre étude est une irradiation localisée. Elle a lieu sans anesthésie pour les tumeurs sous-cutanées. Les souris sont placées dans un système de contention pendant une quinzaine de minutes ce qui peut générer du stress et de l’anxiété légers et transitoires. Elle a lieu sous anesthésie gazeuse pour l’irradiation du thorax dans le cas des tumeurs pulmonaires. L’irradiation en elle-même est indolore et, comme elle est localisée et à dose raisonnable, elle n’induit pas une perte de poids conséquente (perte de poids de moins de 5% due à l’irradiation d’une partie des intestins ou de l’œsophage qui sont proches de la tumeur). L’administration traitements peut engendrer un stress transitoire léger. Les tumeurs peuvent gêner la souris modérement. L Pour les prélèvements de sang, les souris seront d’abord anesthésiées ce qui peut générer un stress léger et transitoire. La principale nuisance réside dans l’implantation en orthotopique des cellules cancéreuses pulmonaires qui se fait au cours d’une mini-chirurgie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales afin de réaliser les prélèvements de sang et tumeurs pour analyses ultérieures, ou pour respecter les points limites dans le cadre des études d'efficacité.

Remplacement

Le recours à des modèles animaux nous permettra d’étudier les effets d’une nouvelle combinaison thérapeutique dans un contexte qui inclut le micro environnement tumoral et le système immunitaire. Ceci permet donc l’interaction des cellules tumorales avec leur environnement naturel. Ces interactions jouant un grand rôle dans les effets de la radiothérapie, il apparaît donc indispensable d’avoir une évaluation sur un modèle animal pour déterminer exactement les effets de ces immunomodulateurs avant d’envisager un passage en thérapie humaine. Aucun modèle in vitro ne permet actuellement d’obtenir la complexité présente dans un animal vivant (immunité, vascularisation, organo-dépendance,…).

Réduction

Uune analyse statistique à priori a été effectuée afin de calculer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives de croissance tumorale. L’analyse de la croissance tumorale se fera avec une analyse de la variance pour tester la significativité des différences obtenues pour les différents groupes, suivie d’un test de comparaisons multiples pour tester la significativité du traitement triple combinaison par rapport aux doubles combinaisons. La dernière procédure ne sera menée que si les résultats des procédures précédentes sont prometteurs.

Raffinement

Au cours de notre projet, les nuisances aux animaux sont de la douleur et du stress. Pour les injections, un anesthésique local sera utilisé. La mise en contention pour l’irradiation sera réalisée par une personne entraînée qui effectue déjà geste depuis des années au sein du laboratoire pour réduire le temps de la contention et le stress induit. La chirurgie pour l’implantation du tumeur dans le poumon se fera sous anesthésie gazeuse, également par une personne très entraînée et un analgésique sera administré avant et après le geste opératoire pour limiter au maximum la douleur induite. Les prélèvements de sang se feront sous anesthésie générale. Les animaux seront observés quotidiennement (vérification de l’état général) et pesés 3 fois par semaine (pour surveiller la survenue d’une éventuelle perte de poids, même si elle est non attendue dans ce projet. Un complément alimentaire énergétique sera donné en cas de perte de poids. De l’enrichissement est introduit dans les cages tout au long de l’expérience. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Les souris C57BL/6 ont été choisies pour leur capacité à développer rapidement et efficacement des tumeurs et pour l’homogénéité et donc la fiabilité des résultats que l’on peut générer avec ce modèle (souris congéniques, avec recul important sur les données antérieures). Les animaux auront 8 semaines. Souris après sevrage.

Après une période d'acclimatation, chacun des six macaques à longue queue reçoit par voie intraveineuse, à quatre reprises espacées d'une semaine, des doses croissantes de molécules destinées à activer les récepteurs Toll-like. Des prélèvements de sang jalonnent le protocole, complétés par des prélèvements de nœuds lymphatiques sous anesthésie, après une mise à jeun pouvant atteindre seize heures. Le porteur mentionne des hématomes, des œdèmes, des douleurs au site de prélèvement et, plus rarement, une réouverture de plaie ou une infection, le tout classé d'un niveau de souffrance modéré. Les six animaux sont tués à la fin pour récolter leurs organes et mesurer la distribution et la toxicité des trois candidats-médicaments.

Objectifs

Cette étude permettra d’évaluer la toxicité aigue de trois molécules capables d’activer les récepteurs « Toll-like » (TLR) des cellules immunitaires administrés par voie intraveineuse à dose croissante chez le singe cynomolgus. Ce projet s'incrit dans le cadre du développement de plusieurs candidats médicaments novateurs capables d’imiter les acides nucléiques d'un rétrovirus afin d’activer la stimulation des cellules immunitaires du patients. Cette activation va permettre d’obtenir une réponse systémique des cellules anti-tumorales. À terme, l’objectif est de combiner l'immunothérapie utilisée contre les cancers avec une ou plusieurs de ce molécules améliorant ainsi la réponse des patient contre le cancer.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont, à terme, la validation et la mise sur le marché de nouveaux médicaments humain pour des indications tels que les cancers de la peau, de l'estomac, du colon etc… De plus, ces études génèrent des données scientifiques qui permettront d’affiner les protocoles de futures études règlementaires sur le macaque. Ainsi les connaissances acquises permettront de réduire le nombre d’animaux mais aussi d’adapter les méthodes de suivi et de raffinement spécifiques aux macaques.

Procédures

Avant tout acte et dans le but de diminuer leur stress, les animaux bénéficieront d'une période d'acclimatation. Ils recevront à quatre reprises un candidat médicament à doses croissante par voie intra veineuse avec un temps de repos d’une semaine entre chaque administration. Des prélèvements de sang, et un suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) seront réalisés à intervalles de temps définis afin d'étudier l’effet du candidat médicament aux différentes doses. Les volumes prélevés et administrés aux animaux tout au long du projet ainsi que les temps de repos accordés entre ces différents actes respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Les prélèvements de nœuds lymphatiques seront réalisés sous anesthésie et courverture analgésique après une période de mise à jeun. Les administrations des candidats médicaments et les prélèvements de sang sont moins traumatisants pour les animaux qu'une anesthésie et seront donc réalisés sur animal vigile. Une sédation pourra être envisagée en cas de besoin.

Impact sur les animaux

Des réactions locales au niveau des sites d'administration peuvent éventuellement apparaître les jours suivant les administrations répétées (hématome, œdème léger, etc). La réalisation de prélèvements sanguins pourra également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction. Les prélèvements de nœuds lymphatiques peuvent provoquer des douleurs au niveau de la zone de prélèvement ainsi qu’un hématome et dans de très rare cas une déhiscence de plaie ou infection de la zone de prélèvement. L'anesthésie des animaux pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort lié à la mise à jeun (maximum 16h), à la procédure d'induction (contention, administration, perte de conscience...) ou lié au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet dans le but de récolter les organes et d’évaluer la distribution et la toxicité des candicats médicaments.

Remplacement

Les études de toxicité in vivo chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. En effet, celles-ci permettent de déterminer la toxicité de la molécule en fonction de la dose administrée et affine la connaissance des caractéristiques de l’effet principal et des effets indésirables éventuels. Les modèles animaux permettent dans ce cas d'objectiver l'apparition des signes cliniques et donc de mettre en évidence une éventuelle toxicité de la molécule en test. Actuellement, aucune méthode alternative à l'utilisation des animaux (ex: in-vitro, in silico...) n'est susceptible d'apporter le même niveau d'information qu'un organisme vivant entier et complexe dans ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux inclut dans cette étude sera réduit au minimum sans compromettre les objectifs scientifiques du projet. 3 lots de 2 animaux seront utilisés. Ce nombre permettra d’obtenir des résultats fiables, interprétables et transposables.

Raffinement

Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux sont hébergés en groupes sociaux de même sexe dans des volières respectant les recommandations de la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'eau fraîche ad libitum est mise à leur disposition et un aliment adapté à l'espèce et au poids de chaque individu est distribué quotidiennement. Les paramètres environnementaux de l'animalerie sont également suivis et contrôlés afin de répondre aux exigences physiologiques de l'espèce. En parallèle, un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprend: 1) Des enrichissements structuraux (perchoirs, barres transversales, grillages...) ; 2) De la litière pour leur permettre de fourrager ; 3) Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine ; 4) Des friandises (ex: céréales, fruits secs) et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; 5) De la musique d'ambiance diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation de plusieurs semaines sera mise en place avant le début de l'étude pour permettre aux animaux de se familiariser avec leur environnement. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associées à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (contention, prise de sang, de température rectale...). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire. L’arrêt du protocole sera envisagé si l’animal ne répond pas au traitement ou que son état se dégrade (sous la responsabilité du vétérinaire).

Choix des espèces

Les candidats médicaments étudiés dans ce projet étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. En raison de sa proximité phylogénétique et physiologique avec l'Homme, le macaque cynomolgus (macaca fascicularis) a été retenu dans le cadre de ce projet. De plus, ces médicaments ont pour objectif de stimuler des cellules agonistes des récepteurs TLR. Or, contrairement aux rongeurs, les primates partagent de nombreuses similitudes avec l’Homme en termes d’expression de ces récepteurs, de cinétique de réponse, de voie de signalisation en aval ainsi que d’activation du complément. Par conséquent, les données obtenues avec ce modèle sont communément les plus prédictives des réponses observées chez l'Homme vis à vis de ces candidats médicaments. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses histologiques. Sachant que des prélèvements d’organes seront réalisés post-mortem dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.

10 800 souris vont recevoir une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des molécules radioactives fournies par des clients, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées, soit à la fin de l'étude, soit dès qu'un point limite est atteint. Le protocole prévoit jusqu'à sept pesées par semaine, trois tontes, jusqu'à quatre administrations du composé et jusqu'à quatre prélèvements de sang par voie rétro-orbitaire, le dernier étant terminal. L'effectif n'est pas fixé par le laboratoire mais par le client selon sa molécule, et le porteur précise que 10 800 représente le maximum réalisable en fonction des demandes reçues.

Objectifs

Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la 2ème cause de décès dans le monde. Les modèles animaux sont encore aujourd’hui indispensables en cancérologie notamment pour comprendre la physiopathologie de ces maladies, trouver des thérapies innovantes et évaluer leur efficacité. L’utilisation de radiopharmaceutiques (molécules ciblant les cellules cancéreuses et entrainant ainsi leur destruction par l’émission de rayonnements ionisants) est une nouvelle approche thérapeutique prometteuse. Notre projet vise donc à quantifier l’efficacité thérapeutique de molécules fournies par nos clients couplées à différents radioéléments pour le traitement de différents modèles tumoraux greffés chez la souris en sous-cutanée et ainsi d’évaluer le retard de croissance tumorale ou sa régression. Ces molécules doivent viser spécifiquement les cellules tumorales pour permettre au médicament d’y accéder et in fine de les détruire.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de tester différentes molécules thérapeutiques couplées à des radioéléments et de trouver de nouvelles pistes thérapeutiques ciblées et spécifiques de certaines cellules tumorales afin de les transférer en clinique en fonction de leur efficacité.

Procédures

Sur animal vigile : Pesée (de 1 à 7 fois/semaine, 20 s) ; Tonte du flanc en vue de la greffe ou de la mesure du volume tumoral (1 à 3 fois, 10 s) ; Greffe de cellules tumorales en sous-cutanée (1 injections, 15 s) ; Administration de composés thérapeutiques en SC , IP ou en gavage (maximum 1 fois /jour et 4 fois, 15 s) Sur animal anesthésié : Tonte de l’omoplate en vue de la greffe (1-3 fois, 10 s) ; Greffe de cellules tumorales en sous-cutanée (omoplate) (1 injection, 1 min) ; Prélèvement de sang par voie rétro-orbitaire (3 fois maximum, 30 s) ; Prélèvement de sang terminal par voie rétro-orbitaire (1 fois, 1 min) ou en intracardiaque sous analgésie (1 fois, 5 min) ; Administration de composés thérapeutique en IV (maximum 1 fois/ jour ; maximum 4 fois, 15 s) ;

Impact sur les animaux

Stress et douleur légère liés à l’administration des cellules tumorales en sous cutanées ; stress et douleur légère liés à l’administration des molécules radiothérapeutiques en sous cutanée, gavage oral ou intraveineuse ; stress lié à l’anesthésie à l’isoflurane ; stress lié à la manipulation vigile pour les pesées ou les mesures de tumeurs au pied à coulisse.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux de chaque procédure lorsque l’une des conditions ci après est remplie : Atteinte d’un point limite justifiant la mise à mort de l’animale ; Fin de l’étude

Remplacement

Evaluer l’efficacité de molécules couplées à des radioéléments nécessitent d’être en présence d’un système biologique complexe. En effet, il est nécessaire dans le cadre de notre projet de vérifier que le candidat cible les cellules tumorales et de suivre son évolution dans d’autres tissus où il n’est pas souhaitable qu’il soit en trop grande quantité. Il n’est pas possible aujourd’hui de faire ce suivi in vitro, l’animal semble donc être un modèle pertinent pour ce type de traitement.

Réduction

Toutes les molécules évaluées dans cette étude ont été au préalable testées dans des modèles in vitro. De nombreuses molécules ont donc été mises de ce côté à cette étape. La pousse tumorale a été caractérisée dans des études vivo préalables. Le nombre d'animaux utilisé par groupe est donc déterminé par le client par des méthodes classiques statistiques en fonction des résultats préalables qu'il a obtenu avec sa molécule d'intérêt et du modèle tumoral sélectionné (homogénéité de la croissance des tumeurs SC). Ce nombre est réduit au minimum utilisable afin d'obtenir des données statistiquement relevantes. Enfin ce nombre est un maximum que nous pouvons réaliser en fonction des demandes de nos clients.

Raffinement

Afin de réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse au maximum, les animaux sont surveillés quotidiennement et des points limites les plus précoces possibles sont mis en place. Les animaux sont également hébergés en groupes sociaux harmonieux de 6 par cage maximum dans un environnement enrichi comme la réglementation l'exige. Les injections et les prélèvements de sang effectués sur l’animal vivant le seront selon les bonnes pratiques de bien-être animal en termes de volumes, de matériel utilisé, d’anesthésie éventuelle et de préhension des animaux.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies anti-cancéreuses. Les souris seront utilisées à un âge compris entre 6 et 12 semaines lors de leur entrée en étude, âge auquel le système immunitaire de ces animaux est décrit comme mature.

Les premiers essais de chirurgie se feront sur des souris récupérées à la sortie d'autres projets, pour que les expérimentateurs maîtrisent le geste avant de l'appliquer aux animaux dédiés. 1 320 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une stéréotaxie de 45 minutes pour recevoir des cellules de gliome directement dans le cerveau, puis jusqu'à six séances d'imagerie sous anesthésie, six prélèvements sanguins sur animal vigile, des injections répétées de composés à tester, et une ponction intracardiaque terminale suivie d'une dislocation cervicale. Le porteur fixe le point limite à 20 % de perte de poids et une durée maximale de 100 jours, et annonce que 320 souris serviront à mettre au point huit modèles tumoraux avant même le début des tests d'efficacité.

Objectifs

Les différents types de gliomes sont des cancers au pronostique sombre qui touchent préférentiellement les enfants et adolescents (cancer pédiatrique). Le gliome a pour origine les cellules gliales du cerveau et est représenté par 3 types majeurs : l'astrocytome, l'épendynome et l’oligodendrogliome. Le glioblastome est une des formes agressives du gliome malin dérivant du sous- type astrocytome à un stade 4. Le gliome est un cancer localisé dans le cerveau ce qui confère une difficulté supplémentaire de part cette localisation pour l’accès des traitements à la zone malade. La thérapie du gliome/glioblastome repose sur une ablation chirurgicale aussi étendue que possible, une radiothérapie et, pour certaines tumeurs, une chimiothérapie. L'exérèse de la zone tumorale est rarement curative et nécessite de poursuivre la thérapie. Ainsi, il est important de développer de nouveaux traitements pour ce cancer afin d’améliorer la survie et la qualité de vie des patients. Dans le cadre de la recherche de nouveaux médicaments, après avoir été sélectionnés grâce à des tests in vitro, les composés de recherche sont évalués in vivo chez des souris porteuses de tumeurs humaines greffées sous la peau pour y déterminer leur activité et leur efficacité anti-tumorale vis-à-vis de la cible. Pour autant, la localisation des gliomes ajoute une complexité thérapeutique qui est de passer la barrière hématoencéphalique. En complément, un modèle orthotopique de greffe de cellule (différentes lignées de type gliomes ou glioblastomes) dans le cerveau sera induit par stéréotaxie de manière à complexifier le modèle d’étude et recréer une tumeur dans son site primaire. Cette localisation spécifique constitue une barrière physique aux traitements et permet aussi l’ajout du microenvironnement tumoral spécifique de ce type de tumeur. Ce projet sera réalisé avec différentes lignées tumorales rendues bioluminescentes (exprimant la luciférase) de manière à obtenir des modèles d’études pertinents et dont la croissance est compatible avec le suivi des traitements. L’activité anti-tumorale de traitements candidats sera ensuite évaluée sur ces différents modèles à l’aide d’un suivi par un système d’imagerie in vivo permettant de visualiser la bioluminescence appelé IVIS. La mise en place d’un ou plusieurs modèles orthotopiques de gliomes va permettre d’évaluer de manière plus pertinente des candidats médicaments pour ce type de tumeurs dont la localisation est un frein au progrès thérapeutique.

Bénéfices attendus

Actuellement, les études pharmacologiques pour les pathologies du gliome et du glioblastomes sont réalisées sur de modèles de xénogreffes de cellules tumorales humaines sous la peau de souris (greffe ectopique ou hétérotopique). Mais ces modèles ne récapitulent pas toutes les caractéristiques spécifiques associées à ces pathologies qui sont localisées dans le cerveau. Notamment il existe une différence au niveau du microenvironnement tumoral mais également au niveau de la sélection des médicaments car sur des modèles sous cutanés il n’est pas possible de sélectionner la capacité des médicaments à passer la barrière hématoencéphalique et aller interagir avec la cible au site de la pathologie. En complément de ses modèles de routine néanmoins utile, la greffe de cellules tumorales de type gliomes/glioblastomes dans le cerveau de souris permet d’enrichir le microenvironnement tumoral, d’ajouter la barrière physique qu’est la barrière hématoencéphalique et est donc considérée plus pertinente pour l’évaluation de nouveaux traitements anti-tumoraux. Il est bien décrit que le modèle orthoptique montre une bonne réponse aux traitements actuellement administrés aux patients que sont la chimiothérapie et la radiothérapie. L'objectif est de compléter les modèles existants qui seront gardés pour les premières phases de tests des produits (efficacités ou activité) et permettront de ne sélectionner que les produits prometteurs à tester sur ce modèle orthotopique. Le modèle orthotopique est essentiel pour évaluer l'activité et l'efficacité des produits candidats dans un contexte de passage de barrière hématoencéphalique. Ainsi les bénéfices de ce projet seraient de mettre au point un modèle plus prédictif de la pathologie humaine et ainsi de mieux prédire l’efficacité de candidats médicaments chez l’homme.

Procédures

Intervention chirurgicale (stéréotaxie) sous anesthésie générale gazeuse et locale avec analgésie (45 min de la préparation de l’animal et fin de chirurgie) – 1 fois Imagerie IVIS sous anesthésie gazeuse (20min) – 1 fois par semaine jusqu’à 6 fois au cours de l’étude Prélèvement sanguin vigile (microsampling) jusqu’à 6 fois durant 2 min de contention et 30s de prélèvement Injection d’analgésie, anesthésique et de produit à tester en IP (intrapéritonéale), SC (sous-cutanée), PO (orale), IV (intravéneuse) vigile pouvant aller jusqu’à plusieurs jours consécutifs, durant 30s, 2 min pour IV Prélèvement sanguin terminal par ponction intracardiaque sous anesthésie gazeuse, puis dislocation cervicale – 1 fois Prélèvement final (perfusion du cœur) sous anesthésie générale injectable (Ketamine Xylazine), analgésie – 1 fois

Impact sur les animaux

Une potentielle source de stress ou douleur légère à modérée peut provenir lors : − Douleur modérée : de la phase chirurgicale (stéréotaxie)nécessaire à l’administration des cellules (d’une durée d’environ 30 minutes) et du suivi post-opératoire. - Douleur modérée : de la phase de pousse de la tumeur. Un suivi quotidien permettra de mettre en évidence l’éventuelle douleur et les points limites comme la perte de poids qui sera limitée à 20% maximum du poids de l’animal (100 jours maximum). − stress et douleur légère : de l’administration de composés testés réalisée par voie sous cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse ou per os. La contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent également générer du stress. − stress et douleur légère : des prélèvements de sang au niveau de la veine marginale de la patte. La contention d’une durée maximale de 2 min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress. − des signes cliniques observables associés à l’injection des composés (troubles du comportement, altération de l’état général). - de l’anesthésie gazeuse pour l’évaluation de la taille de la tumeur par de l’imagerie (IVIS) d’une durée de 20 min hebdomadaire maximum. - des injections d’analgésiques lors du sacrifice de fin d’étude réalisées en SC, IP. La contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent également générer du stress.

Devenir

Lorsqu’un point limite est atteint, l’animal concerné est alors euthanasié. A la fin de chaque étude, tous les animaux sont euthanasiés pour réaliser des prélèvements de sang, de tumeur et d’autres organes (si d’intérêt pour analyse). Ces prélèvements seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…) ou pour des analyses de biomarqueurs dans le cadre des études d’efficacités.

Remplacement

Ce projet a pour but de mettre au point un modèle de greffe orthotopique chez la souris de cellules tumorales de cellules de la glie. L’implantation des cellules dans le cerveau permet ainsi à la tumeur de se développer dans le microenvironnement d’origine d’un cancer du cerveau permettant ainsi une récapitulation des nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine. De plus, cette localisation ajoute une complexité au développement du médicament qui se doit d’avoir des propriétés physico-chimiques spécifiques pour atteindre la tumeur et franchir la barrière hématoencéphalique tout en interagissant avec la cible. Il est impossible à l’heure actuelle de reconstituer in vitro les interactions d’une tumeur avec le micro-environnement, et donc il n’y a pas de méthodes substitutives. En amont de l'activité vivo un screen vitro sur BBB (Blood Brain Barrier dit barrière hématoencéphalique en français) test de passage de la barrière hématoencéphalique sera réalisé. Des campagnes d'environ 10 composés seront réalisés et les produits capables de passer la barrière seront sélectionner pour être testés vivo sur des modèles orthotopique pour vérifier leur activité sur les cellules tumorales et la cible. Cela permettra de diminuer le nombre de produits à tester in vivo.

Réduction

• Un accompagnement par le service biostatistique sera réalisé pour estimer la variabilité de la pousse de la tumeur pour chaque lignée cellulaire étudiée dans le cadre de ce projet. Cette étape permettra d'établir le nombre d'animaux nécessaires par groupe pour les études futures d'efficacité de traitement et de pharmacodynamie en évaluant la robustesse des designs de ces études à sera utilisé pour évaluer l’efficacité des candidats médicaments. • Lorsque les souris seront euthanasiées, des prélèvements de tumeurs seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…). Cette approche permet donc d’optimiser les études et de réduire le nombre d’animaux en évitant de refaire des études pour obtenir des échantillons. • Dans les phases d’entrainements, les premiers essais se feront sur des souris non utilisées sorties d’autres études (issues d’autres projets) afin de maitriser le/les site et les volumes d’injections avant de valider le geste sur des souris dédiées au projet. De plus la mise au point des techniques et sélection de la plus pertinente se fera par un seul expérimentateur expérimenté à la chirurgie et à la stérotaxie afin de réduire le nombre d’animaux. Ensuite le second expérimentateur sera formé par le premier sur des animaux issus des 320 cités pour mise en place des 8 modèles (en plus des souris non utilisées sorties d'études). • De plus, afin d’inclure toutes les souris greffées nous utiliserons l’imagerie pour randomiser tous les animaux au fur et à mesure du développement de la tumeur sur la base d'un volume tumoral similaire permettant ainsi de maximiser le taux d'inclusion. • Lors des études d’efficacité de candidats traitements, il sera possible d’effectuer des analyses de pharmacocinétique c’est-à-dire d’évaluer, en fonction du temps, le devenir d’un médicament dans l’organisme (via des prélèvements sanguins de faibles volumes et répétés au maximum sur 6 points) évitant la réalisation d’une seconde étude dédiée.

Raffinement

•La procédure de greffe orthotopique est réalisée selon les bonnes pratiques de chirurgie sous anesthésie générale gazeuse et avec analgésie pré, péri et post-opératoire, avec à un maintien de la température corporelle dès l’anesthésie jusqu’au réveil total de la souris. •Les souris seront placées en hébergement seule après la chirurgie jusqu’au lendemain matin suivant la chirurgie (max 18h) afin de suivre individuellement leur récupération post chirurgie vis-à-vis du processus de nidification. •L’habitat des souris est enrichi de matériel adapté pour leur permettre d’exprimer leurs instincts naturels comme ronger (bâtonnet de bois), se réfugier (tube ou dôme) ou nidifier (cocoon, sizzle dry) et de l’aliment est distribué dans la cage pour favoriser le comportement de fouissage. •Les animaux font l’objet d’une observation clinique en post chirurgie et tout au long de l’étude par les expérimentateurs et par les zootechniciens pour s’assurer de leur rétablissement, de leur bien-être et de l’absence de signe clinique. En cas de signe clinique (comme la perte de poids et le dos vouté), le vétérinaire est alerté et les recommandations de la SBEA et les points limites seront appliqués. • Les animaux peuvent être hébergés dans des cages connectées. Ce mode d’hébergement permet de mettre en évidence le changement de comportement à la suite du développement de la tumeur cérébrale. Pour certains modèles de glioblastomes les signes cliniques connu en plus de la perte de poids sont une démarche modifiée, la rotation ou l'inclinaison de la tête et des étapes de ralentissement des mouvements. Changements capturables par les cages connectés dont l’analyse des résultats permettra une meilleur documentation des modèles et des réponses aux médicaments. • Le suivi de la croissance tumorale par l’imagerie sous anesthésie gazeuse est une méthode non invasive pour l’animal et sans douleur qui permet de suivre un même animal tout au long de l’étude sans procéder à l’examen macroscopique de la tumeur en systématique. Les tumeurs sont mesurées par l’IVIS 1 fois par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais aussi pour limiter la souffrance et appliquer les points limites Des prélèvements par microsampling peuvent être mis en œuvre afin d’obtenir des informations complémentaires comme le profil d’exposition plasmatique.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans la littérature pour la recherche pré-clinique. De plus, la greffe orthotopique de cellules tumorales dans le cerveau chez la souris est couramment utilisée dans les études précliniques d’oncologie. Ainsi la souris est le modèle de choix. Les souches utilisées seront des souris immunodéprimées présentant un phénotype dommageable pour permettre la prise de greffe de cellules humaines d’intérêt. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 7 semaines. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans les protocoles d’efficacité et de pharmacodynamie en oncologie.

Jusqu'à neuf injections par animal pour 390 d'entre elles : 980 souris au système immunitaire affaibli vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des cellules cancéreuses prélevées sur des patients atteints de cancer du poumon, du foie, des reins, du côlon ou du pancréas, puis des produits de thérapie cellulaire dont l'effet antitumoral est mesuré. Le porteur attend une perte de poids, des troubles de la mobilité et des troubles du comportement liés à la croissance de la tumeur. Il retient des souris immunodéficientes pour éviter le rejet des cellules humaines, en présentant cette absence de rejet comme épargnant aux souris un choc cytokinique.

Objectifs

La chimiothérapie, la radiothérapie, les anticorps et depuis peu les thérapies cellulaires font partie de l'arsenal thérapeutique actuel pour traiter le cancer. Les thérapies cellulaires sont composées de cellules humaines capables de cibler puis détruire les cellules cancéreuses. Il est possible d'améliorer leur effet en les associant avec des anticorps. L’objectif de ce projet est d'évaluer l'effet anti-cancéreux de ces produits. Des cellules cancéreuses collectées chez des patients atteints de cancer du poumon, du foie, des reins, du colon ou du pancréas seront greffées chez la souris. La capacité des produits à cibler et détruire ces cellules ainsi que leur non toxicité seront évalués.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont scientifiques et humains. Premièrement, les résultats obtenus seront diffusés à la communauté scientifique. Par conséquent, ils permettront d'améliorer les connaissances scientifiques dans le domaine des thérapies cellulaires. Si les résultats sont positifs et que nos produits sont efficaces comme attendu, ces données permettront de poursuivre leurs développements afin de pouvoir, dans le futur, proposer de nouveaux traitements efficaces et non toxiques aux patients atteints de cancer.

Procédures

135 animaux seront soumis à 1 injection (la durée de l'injection est d'1 minute). 455 animaux seront soumis à 2 injections (la durée de chaque injection est d'1 minute). 390 animaux seront soumis à 9 injections (la durée de chaque injection est d'1 minute). Pas de chirurgie ou de prélèvements, seulement des prélèvements post-mortem (après anesthésie puis euthanasie).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont liés au stress lors des injections ainsi que de potentielles douleurs ressenties au site d’injection. Les animaux greffés avec des cellules humaines cancéreuses seront également sujets à des effets pouvant être induits par la croissance de la tumeur. Ces effets sont connus allant de la perte de poids jusqu’à des problèmes de mobilité ou encore des problèmes comportementaux. Dans tous les cas, les animaux seront étroitement suivis et examinés tout au long des expériences selon notre fiche de suivi clinique.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure (toutes les procédures) afin de réaliser les analyses et les prélèvements d'organes.

Remplacement

L’alternative non animale, pour étudier les nouveaux traitements contre le cancer, consiste à les tester sur des cellules en culture. Cependant, cette méthode reste artificielle et loin des effets pouvant être observés chez un animal. En effet, par cette méthode, les produits anti-cancer sont mis en présence de cellules cancéreuses sans autres paramètres extérieurs (pas d’autres cellules, pas de barrières à traverser, pas d’organes et tissus dans lesquels migrer …). Il est donc reconnu et validé par la communauté scientifique, que même si l’utilisation d’animaux doit être réduite et si possible évitée, celle-ci reste une étape obligatoire dans le développement des produits contre le cancer. Les modèles de cancer chez la souris sont donc les seuls aujourd’hui permettant d’évaluer l’efficacité de ces nouveaux traitements.

Réduction

Ce projet, d’une durée maximale de 5 ans, impliquera l’utilisation de souris avec un système immunitaire affaibli (nombre total maximal d’animaux = 980). Ce nombre d’animaux est le nombre maximal que nous envisageons d’utiliser. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous avons décidé de commencer par des études préliminaires avec le plus faible nombre d’animaux possible. Ces études permettront non seulement de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour les études suivantes mais également, de s’assurer des conditions expérimentales optimales pour les réaliser.

Raffinement

A réception des animaux, une première phase d’acclimatation et d’habituation à la manipulation (1 semaine), permettra d’atténuer tout stress lié au transport et de s’assurer du retour à l’état normal de l’animal. Cette période servira également pour habituer les animaux à la méthode de distribution des aliments et de l’eau et à leur nouvel environnement. Le fait d’habituer les souris à être manipulées permettra également de réduire les répercussions nuisibles de la manipulation. L’observation des animaux et de leur environnement se fera quotidiennement (pendant la période d’acclimatation et pendant les différentes études) afin d’évaluer leur santé et leur comportement. Un score clinique complet sera calculé pour déterminer la conduite à tenir. Toute souris présentant un score cumulé supérieur à 6 ou une perte de poids supérieure à 20% sera mise à mort. Pour toute souris présentant des blessures ou dont le score cumulé est supérieur à 3, elle sera isolée et nous procèderons à un enrichissement de la cage.

Choix des espèces

Pour tester l'effet d'un nouveau traitement contre le cancer, la greffe de cellules cancéreuses chez la souris est l'expérimentation standard et la plus pertinente. L’utilisation de souris avec un système immunitaire affaibli garantira l’absence de rejet des cellules cancéreuses humaines greffées et l’absence de souffrances associées pour les souris (choc cytokinique, inflammation au site d’injection, …). Souris adultes (6 - 7 semaines à la réception pour une entrée dans l’étude à 7 - 8 semaines) – âge standard pour 1- greffer des cellules cancéreuses et 2- évaluer l’efficacité de nouveaux traitements anti-cancer

Trois prélèvements de sang dans le sinus rétro-orbitaire, onze mesures de tumeur, trois injections dans la veine de la queue en tube de contention et trois sessions de mesure de l'haleine de 30 à 60 minutes : 63 souris athymiques nude vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trente-neuf d'entre elles reçoivent en plus une greffe sous-cutanée de cellules cancéreuses du col de l'utérus. Le projet teste un promédicament censé libérer un anticancéreux dans la tumeur et, du même coup, une molécule volatile expirée dans l'haleine qui signalerait que le traitement agit. Le porteur écrit que ces souris immunodéprimées ont un phénotype dommageable, tout en affirmant que les conditions d'hébergement empêchent ce phénotype de s'exprimer.

Objectifs

Le cancer représente un problème de santé publique mondial et les outils thérapeutiques actuels ne permettent pas encore d’éradiquer sélectivement et efficacement les tumeurs solides. De plus, il est difficile de suivre l’efficacité d’une molécule anticancéreuse en temps réel, quel que soit la nature du cancer traité. La conception de molécules capables de traiter cette pathologie tout en émettant un signal témoignant de l’efficacité du traitement représente une alternative extrêmement prometteuse. Dans ce projet, nous souhaiterions introduire un nouveau concept qui repose sur un système d’administration d’un promédicament appelé le vecteur 1. Ce dernier est capable de se lier avec certaines molécules du sang de manière stable et il sera sélectivement activé par une enzyme présente en concentration élevée dans l’environnement de la plupart des tumeurs solides, libérant l’agent anticancéreux. L’agent anticancéreux libéré pénètre dans les cellules tumorales pour exercer son effet cytotoxique alors que la substance volatile est exhalée dans l’haleine des animaux. La mesure de la molécule volatile dans l’haleine et le sang des animaux traités pourrait constituer un traceur attestant la libération de l’agent anticancéreux. Afin de connaître le potentiel thérapeutique du vecteur 1, il est nécessaire d’évaluer ce concept sur des modèles animaux sains ou des individus ayant subi une greffe de cellules tumorales. Les modèles animaux sont indispensables à l’application de notre étude car la méthode de détection des substances volatiles dans l’haleine et le sang témoignant de l’efficacité de l’agent anticancéreux n’a nul équivalent in vitro ou in silico. La mesure simultanée du sulfure de carbonyle et une corrélation positive dans l’air expiré et dans le sang permettra de vérifier qu’une augmentation de sulfure de carbonyle libérée dans l’un ou l’autre compartiment est bien liée à l’activation de l’agent anticancéreux. Nous émettons l’hypothèse que l’administration intraveineuse du vecteur 1 permettra (1) le traitement sélectif des tumeurs grâce à la libération intratumorale de l’agent anticancéreux et (2) l’évaluation de l’efficacité du traitement au cours du temps par mesure des niveaux de molécules volatiles dans l’haleine et le sang des animaux. Ces deux aspects devraient uniquement être détectés chez les souris malades possédant un environnement tumoral riche en enzyme retrouvée autour de la plupart des tumeurs solides et absents chez les souris saines.

Bénéfices attendus

Notre étude menée in vivo démontrera à court terme que le suivi de la molécule volatile dans l'haleine et le sang des animaux permettra (1) la discrimination des souris porteuses de tumeurs par rapport aux individus sains, (2) la preuve de l'activation des vecteurs dans les tumeurs par l’enzyme retrouvée dans l’environnement de la plupart des tumeurs solides, (3) la prédiction de l'efficacité du traitement anticancéreux et (4) l'identification des animaux guéris ainsi que ceux avec une tumeur résiduelle tout au long du protocole thérapeutique avec le vecteur 1. Notre étude pourrait être profitable dans le domaine de la santé humaine car la molécule volatile ainsi que l’enzyme intratumorale étudiées dans ce projet constitueront des traceurs caractéristiques de l'état de santé du patient ce qui offrira de nombreux avantages. Ainsi, il sera possible de (1) suivre et d’expliquer les variations des niveaux de substance volatile présente dans l’air expiré des patients et dans la circulation sanguine en fonction du stade d’évolution de la maladie et (2) le concept global sera également étudié à des fins pronostiques.

Procédures

Une injection sous cutanée de cellules tumorales (J0) et 11 mesures de masses tumorales (2 fois par semaine) et 3 prélèvements sanguins seront réalisées sur les animaux greffés (39 souris) sous anesthésie gazeuse avec une durée de 5 min par acte. De plus, la pose d’une bague sur l’oreille (pour l’identification des souris) sera réalisée sur tous les lots d’animaux (63 souris) sous anesthésie gazeuse avec une durée de 5 min par acte. La totalité des animaux vigiles (63 souris) seront pesés 2 fois par semaine avec une durée de moins de 1 min par pesée. De plus, 3 injections intraveineuses dans la veine de la queue seront réalisées sur tous les lots d’animaux vigiles (63 souris) sous anesthésie locale dans des tubes de contention avec une durée de 5 min par acte. La substance volatile retrouvée dans l’haleine des animaux sera mesurée pendant 30 à 60 min 3 fois sur tous les animaux vigiles (63 souris) au cours de l’étude.

Impact sur les animaux

Les souris athymic nude immunodéprimées ont un phénotype dommageable. Néanmoins, les conditions d’hébergement de notre animalerie sont adaptées et compatibles pour le maintien de ces animaux génétiquement modifiés, ce qui permet que le phénotype dommageable ne s’exprime pas. La protubérance de la tumeur sous- cutanée peut être responsable d’une légère gêne dans la locomotion des animaux greffés. Les données récoltées au cours des précédentes études in vivo menées dans le laboratoire révèlent que la greffe de cellules tumorales du col de l’utérus n’entraîne aucune perte de poids chez les animaux. De plus, l’anesthésie gazeuse nécessaire lors de la greffe, des prélèvements sanguins et des mesures de la masse tumorale peut entraîner un stress léger et transitoire au cours du réveil des animaux. Les prélèvements sanguins peuvent provoquer un stress passager et des lésions potentielles du système veineux rétro-orbitaire qui sera réduit par la réalisation du geste sous anesthésie gazeuse et après application d’un anesthésiant local oculaire (tétracaïne 1%) avant le geste et ils seront espacés de 7 jours en alternant l’œil prélevé, permettant 15 jours de repos pour chaque œil. La pesée des animaux vigiles peut également engendrer un léger stress transitoire mais ce dernier n’est pas une nuisance car les animaux vont s’habituer aux manipulateurs pendant 15 jours avant le début de l’étude. Les injections vigiles seront réalisées en utilisant des tubes de contention ce qui pourra entraîner un stress passager pour les animaux. Néanmoins, les injections dureront 3 à 5 min, elles seront espacées au minimum de 7 jours et elles seront réalisées dans la veine de la queue en présence d’un anesthésique local (lidocaïne à 2%).

Devenir

Mise à mort sous anesthésie gazeuse pour prélèvements tissulaires et analyses histologiques.

Remplacement

Nous avons déjà réalisé tous les tests in vitro indispensables à la validation du concept en mesurant la réponse des cellules cancéreuses du col de l’utérus (cellules KB) au vecteur 1. En effet, nous avons stimulé ces cellules avec des doses croissantes de vecteur 1 et les résultats démontrent une baisse importante de la survie des cellules cancéreuses proportionnelle à la concentration de vecteur utilisée. De plus, nous avons pu détecter la présence de la molécule volatile en utilisant une fibre sur des cellules cancéreuses stimulées avec le vecteur 1. Enfin, nous avons identifié la présence de l’agent anticancéreux dans les cellules tumorales lorsque ces dernières sont en présence du vecteur 1. A présent, les expériences in vivo sur souris sont indispensables à la réalisation de notre projet scientifique. En effet, il n’existe pas de test in vivo ou in silico pour confirmer l’action de ce médicament « nouvelle génération ».

Réduction

Certaines études antérieures confirment que les vecteurs sensibles aux enzymes sont stables et non toxiques lorsqu’ils sont dans le sang. De plus, ils sont sélectivement ciblés au contact de l'enzyme retrouvée dans l'environnement de la plupart des tumeurs solides pour permettre la libération des agents anticancéreux. Il n’est donc pas nécessaire de réaliser une étude de toxicité en amont ni d’augmenter le nombre d’animaux nécessaires dans ce projet. Les données recueillies lors de ces précédentes expériences ont été utilisées pour affiner au mieux les procédures expérimentales. La « Règle des 3R » établie par Russel et Burch a été prise en compte et un test statistique a été réalisé afin de réduire au maximum le nombre d'animaux nécessaires à l'expérimentation, tout en assurant un nombre suffisant pour une étude optimale dans le but d’éviter de reproduire ces expériences.

Raffinement

Les souris athymic nude sont des animaux possédant un système immunitaire déficient. Les conditions d’hébergement contrôlées de l’animalerie sont compatibles et adaptées pour le maintien du statut sanitaire de ces animaux immunodéprimés, ce qui va permettre la non expression du phénotype dommageable. De plus, les actes chirurgicaux effectués sur les souris seront réalisés en conditions stériles pour éviter toute contamination. Les souris seront hébergées dans un environnement de température et d’hygrométrie répondant à la réglementation afin de s'assurer du bien-être des animaux tout au long de l’étude. Pour satisfaire leurs interactions sociales, elles seront maintenues en groupe de 5 individus par cage ventilée (500 cm²) dans un milieu enrichi avec des structures (nids...) et des outils adaptés (jouets, rognage de matériaux) afin de satisfaire leurs exigences comportementales. Avant de débuter les expérimentations, une période d’acclimatation de 15 jours permettra d’habituer les animaux aux expérimentateurs et au matériel. La fibre nécessaire à la mesure de la molécule volatile sera située en hauteur dans la cage et elle sera non invasive pour les animaux. Au cours de ce projet, la majorité des actes effectués sur les animaux (implantation des cellules cancéreuses, pose de la bague d’identification à l’oreille, mesure de la masse tumorale, prélèvements sanguins) seront réalisés sous anesthésie gazeuse en condition de température contrôlée (tapis chauffant) afin de réduire au maximum le stress et la douleur ressentis par les animaux. De plus, pour les prélèvements sanguins, un anesthésiant local oculaire sera administré en plus de l’anesthésie gazeuse pour limiter la douleur et ils seront espacés de 7 jours en alternant l’œil prélevé, permettant 15 jours de repos pour chaque œil. Les injections seront réalisées sur les animaux vigiles (veine de la queue) sous anesthésie locale pour minimiser la douleur. En effet, certains tests ont montré que le gaz utilisé lors de l’anesthésie perturbe les mesures de molécules volatiles. Tout au long de l’étude, l’état de chacun des animaux et leur comportement seront scrupuleusement vérifiés lors de visites quotidiennes en se référant à une grille d’évaluation des signes cliniques gradés établie pour chacun des individus permettant de définir des points limites suffisamment précoces pour prendre en charge l’apparition de signes de souffrance et de mal-être.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler avec l’espèce souris car le développement tumoral est rapide et bien caractérisé chez ces animaux. Nous avons choisi de travailler avec le modèle des souris athymic nude car ces animaux se caractérisent par la présence d’une mutation qui engendre une déficience immunitaire, ce qui permet de limiter les réactions de rejet lors de la greffe des cellules tumorales. De plus, c’est un modèle de choix pour ce projet car d’après les résultats obtenus précédemment, ces souris immunodéprimées expriment des concentrations élevées d’enzyme retrouvée dans l’environnement de la plupart des tumeurs solides qui est indispensable à l’activation du promédicament (vecteur 1). Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines que nous allons acclimater aux manipulateurs et au matériel qui sera utilisé lors des expérimentations pendant 15 jours supplémentaires dans l’animalerie. Dans ces conditions et à cet âge de 10 semaines, les animaux auront fini leur croissance et se seront remis du stress du transport permettant ainsi d’avoir un poids stable qui est un critère important témoignant de leur état de santé.

316 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection de cellules tumorales pancréatiques leur donne des métastases au pancréas, aux poumons et au foie, avant jusqu'à neuf scanners sous anesthésie, quatre prises de sang et trois injections intraveineuses sur animal vigile. Le porteur signale une possible insuffisance respiratoire ou hépatique liée aux métastases, ainsi qu'une irritation de l'œil après prélèvement rétro-orbitaire. Sur le remplacement, il écrit que seul un modèle vivant reproduit la complexité de la réponse immunitaire antitumorale et conclut au caractère "nécessaire" du recours aux animaux non-humains.

Objectifs

D’un point de vue épidémiologique, le cancer du pancréas est projeté pour devenir, d’ici à 2040, la 4ème cause de décès par cancer. La majorité des patients présentent donc des pathologies avancées ou avec progression métastatique au moment du diagnostic. La survie globale à 5 ans des patients est inférieure à 10%. La plupart des approches thérapeutiques actuellement disponibles ciblent directement les cellules tumorales. Or d’un point de vue clinique, les cellules tumorales sont entourées par un tissu très dense appelé stroma tumoral, dont l’impact a été sous-évalué. Récemment, la présence de ce stroma massif a émergé en tant qu’acteur et contributeur à la fois à l’initiation et à la progression tumorale. Notre hypothèse est que le remodelage du stroma pourrait représenter une nouvelle opportunité thérapeutique dans le cadre du cancer du pancréas métastatique. Les objectifs de notre étude sont donc les suivants (1) Évaluer la croissance tumorale, caractériser le stroma tumoral et l’infiltrat immunitaire dans deux modèles murins métastatiques (2) Évaluer le potentiel thérapeutique d’une combinaison d’anticorps dans ces modèles métastatiques.

Bénéfices attendus

A court terme, les bénéfices du projet sont multiples : (1) Élucider les mécanismes impliqués dans la formation et le maintien du stroma tumoral dans le cancer du pancréas (2) Démontrer le remodelage du stroma tumoral via l’utilisation d’anticorps thérapeutiques (3) Proposer une nouvelle opportunité thérapeutique dans les cas de cancer du pancréas métastatique en démontrant l’impact du remodelage du stroma dans la prévention des mécanismes d’échappement. A long terme, les objectifs de ce projet ont pour but de conduire au développement de nouvelles thérapies dans le contexte préclinique et clinique appliqué à l’immuno-oncologie. En effet, le développement de modèles murins pour le cancer du pancréas en préclinique permet une meilleure représentativité de la pathologie en clinique et ainsi favorise la transposition d’informations scientifiques entre la préclinique et la clinique.

Procédures

Les animaux pourront subir le(s) effet(s) indésirable(s) suivant(s) : - Injection de cellules tumorales induisant des métastases pouvant entraîner une atteinte des organes cibles (pancréas, poumons, foie) - Prélèvements sanguins, sous anesthésie (durée maximale 2 minutes, une fois par semaine, 4 répétitions maximum) - Examens d’imagerie (scanner), sous anesthésie (durée maximale de 10 minutes, une fois par semaine, 9 répétitions maximum) -Injection intra-veineuse sur animaux vigiles (durée maximale 2 minutes, une fois par semaine, 3 répétitions maximum)

Impact sur les animaux

Les deux anticorps thérapeutiques, déjà utilisés dans de précédents protocoles pour d’autres types tumoraux n’induisent pas d’effet secondaires indésirables. Les nuisances attendues sont l’apparition de métastases pouvant induire une insuffisance respiratoire ou hépatique. Le prélèvement rétro-orbitaire pourra aussi provoquer une irritation de l’œil.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les organes cibles pour analyses histologiques et moléculaires

Remplacement

Seul un modèle in vivo chez l’animal peut permettre d’étudier la capacité tumorigénique et l’impact de traitements. En parallèle des analyses complémentaires seront réalisées in vitro à l’aide de lignées de cancer du pancréas métastatique. Cependant, ces modèles ont des limites et ne permettent pas de reproduire la complexité de la réponse immunitaire antitumorale observée in vivo, c’est pourquoi le recours aux modèles animaux est nécessaire dans notre projet.

Réduction

Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet a été calculé au minimum pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles.

Raffinement

La bonne connaissance des modèles expérimentaux, le suivi adapté de points limites précoces et clairement définis, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum toute douleur ou souffrance des animaux. Dans le cadre du présent projet l'apparition de signes généraux (par exemple : difficultés respiratoires, hypothermie, perte de poids >20% du poids maximal) constituent des points limites qui conduirais à la mise à mort afin de limiter toute souffrance des animaux. Nous évaluerons l’état de bien être ou de souffrance des animaux au minimum 2x/semaine.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour l’étude du cancer du pancréas. Bien qu’il existe des différences entre l’immunologie murine et humaine, de nombreuses découvertes effectuées chez la souris sont transposables chez l’homme. Dans le cadre de ce projet, des souris âgées entre 6 et 7 semaines seront utilisés car ce stade de développement est standard pour les études visant à comprendre des mécanismes au niveau du système immunitaire.

Cinq injections quotidiennes pour déclencher des polypes intestinaux, puis pour d'autres lots une greffe de polype sous la peau ou une injection de cellules tumorales dans le rectum irrité ou le cæcum : 630 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le porteur annonce des mises à mort avant l'apparition de gros polypes susceptibles d'altérer la santé, tout en reconnaissant que ces polypes peuvent provoquer un mal-être plus tôt que prévu. Il affirme par ailleurs que ces deux lignées transgéniques ne développeront jamais de cancer, alors que le projet vise à repérer les polypes capables de se transformer en cancer et de métastaser au foie. Les souris sont tuées à la fin de chaque procédure pour prélever les tumeurs intestinales, et immédiatement si un point limite est atteint.

Objectifs

L'objectif du projet est de caractériser de façon très approfondie l'hétérogénéité des polypes (tumeur benigne) intestinaux pré-cancéreux afin d'identifier des marqueurs de prédiction de leur progression ou non en cancer. Pour ce projet, nous utiliserons des modèles de souris qui développent spontanément des polypes dans l'intestin. Ces modèles sont très pertinents pour la bonne réalisation de notre projet grâce ils représentent très bien ce qu'il se passe chez l'homme. Dans un premier temps, nous caractériserons les différences entre les polypes selon leur localisation et leur taille. Certains polypes seront utilisés pour l'étude de l'expression de gènes, d'autres seront utilisés pour la caractérisation de la présence de vaisseaux sanguins et lymphatiques, de fibroblastes et de cellules immunitaires. Dans un deuxième temps, nous identifierons le profil de facteurs protéiques produits localement par ces polypes ainsi que ceux libérés dans la circulation sanguine. Puis, nous avons pour objectif d'identifier quels sont les polypes qui ont la capacité à se transformer en cancer et à migrer dans d'autres organes vitaux tels que le foie, site préférentiel de métastases dans le cancer du côlon.

Bénéfices attendus

Grâce à la caractérisation approfondie de l’hétérogénéité des polypes intestinaux avec l’identification de signatures géniques, l’infiltration inflammatoire et de facteurs protéiques solubles locaux mais aussi dans la circulation, nous espérons identifier un ou des marqueurs sanguins spécifiques qui permettront de distinguer les polypes qui ont ou non le potentiel de se transformer en cancer. Ce projet est très pertinent en cancérologie puisqu’à l’heure actuelle, il n’y a pas de marqueurs sanguins spécifiques qui permettent de différencier les polypes à faible risque de ceux à haut risque de progresser en cancer du côlon. Si nous arrivons à mettre en évidence un ou des marqueurs sanguins qui permettent de savoir si le patient est en train de développer un adénome qui a le potentiel de se transformer en cancer, cela permettra d’éviter des coloscopies de dépistage inutiles et sûrement une compliance plus importante grâce à ce test de dépistage sanguin, pas seulement par rapport à la coloscopie mais aussi par rapport au dépistage Hemocult. D’après la littérature et les cliniciens, il y a un réel besoin de trouver une méthode alternative de dépistage précoce qui sera rapide, non invasive, peu couteuse et qui pourra être utilisée sur une plus grande population, pour dépister un adénome douteux même chez des patients asymptomatiques.

Procédures

Les animaux trangéniques (nous utilisons 2 modèles différents, 330 animaux au total) vont recevoir des injections d'une molécule à des doses non toxiques afin d'induire le développement de polypes spécifiquement dans l'intestin (durée de l'injection par animal : 10 sec). Les animaux recevront 5 injections au total, 1 par jour pendant les 5 premiers jours. Afin de déterminer le potentiel des polypes à se transformer en cancer et à former des métastases, les souris contrôles vont être soumis à des procédures chirurgicales de quatre types différents : Injection sous la peau de cellules issues de polypes (50 souris, chirurgie de 10-15min), greffe sous la peau d'un polype entier (50 souris, chirurgie de 10-15min), injection de cellules issues de polypes dans le rectum" irrité" (100 souris, chirurgie de 10-15min) et finalement injection de cellules de polypes dans le cecum (100 souris, chirurgie de 10-15min) (25-30min).

Impact sur les animaux

Le développement de polypes dans l'intestin sera induit chez les souris transgéniques qui seront euthanasiées avant que les souris ne commencent à développer de gros polypes qui peuvent vraiment altérer la santé de l'animal. Mais la présence de ces polypes dans l'intestin peuvent induire chez certains animaux un mal être plus tôt que prévu. La molécule aux doses utilisées n'est pas toxique pour les animaux mais son injection va induire un léger stress et une douleur de courte durée au point d'injection. Les injections de cellules de polypes en sous-cutanée va induire un léger stress et une douleur de courte durée au point d'injection. Les autres nuisances proviendront des actes chirurgicaux : des douleurs pré et post-chirurgicales. Si les cellules de polypes poussent et se transforme en masse ou tumeur, cela peut induire de la douleur.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure pour effectuer les prélèvements nécessaires au projet tels que les tumeurs intestinales. Si un des points limites est observé avant le temps suggéré pour chaque procédure, l'animal sera immédiatement euthanasié. Une grille de scoring pour chaque procédure sera mise en place.

Remplacement

L'utilisation des modèles murins de tumorigenèse intestinale précoce tels que les modèles décrits dans ce projet, est le seul moyen pour répondre au mieux aux questions posées dans ce projet. Il n'existe pas aujourd'hui de modèle in vitro pouvant récapituler l'hétérogénéité et la complexité des adénomes.

Réduction

Le nombre de souris que nous devons inclure dans nos expériences a été calculé rigoureusement pour réduire un maximum le nombre d'animaux tout en gardant une puissance statistique adaptée. Pour le projet, nous avons besoin de prélever plusieurs adénomes sur la même souris, des adénomes de tailles différentes et surtout à des localisations différentes dans l'intestin dans les 2 modèles animaux transgéniques. Parfois certaines souris développent moins d'adénomes que d'autres ou sont localisées à un certain endroit de l'intestin et moins dans les autres. Pour l'étude de la progression tumorale, nous avons des mises au point à faire pour déterminer quel modèle sera le plus adapté pour étudier la progression tumorale (injection de cellules ou greffe d'adénome en sous-cutanée) et métastatique (caecale ou rectale). Cependant, si nous voyons qu'une procédure fonctionne et est appropriée pour répondre à notre question pour le projet, nous arrêterons les autres procédures et n'utiliserons pas toutes les souris demandées. De plus, pour ce projet, nous pouvons utiliser les mâles et les femelles.

Raffinement

En plus des bonnes conditions d'hebergement, nous éviterons les animaux isolés et si un mâle doit être isolé, une femelle de compagnie agée sera rajoutée dans la cage. Une grille de scoring avec des points limites adaptés à chaque procédure sera utilisée pour éviter des douleurs inutiles aux animaux. Pour les chirurgies, les animaux seront anesthésiés et recevront des analgésiques (locaux et sous-cutané) en pré- et post-opératoire.

Choix des espèces

Notre projet utilisera deux modèles de souris transgéniques car il sont les plus pertinents pour répondre à nos questions. Dans ces 2 modèles de souris, les animaux vont développer des polypes spécifiquement dans l'intestin et ne développeront jamais en cancer. C'est pour cela que nous avons choisi ces 2 modèles qui sont très proches de ce qu'il se passe chez l'homme pour essayer de déterminer un ou des marqueurs de prognostique de risque à développer un cancer. Les animaux recevront la molécule pour induire les polypes à 8 semaines (quand l'intestin est mature) et seront ensuite utilisées pour le projet 5 mois après l'administration du produit. Concernant les chirurgies, les souris contrôles seront utilisées entre 6 et 8 semaines.

Immunodéprimées pour accepter la greffe de cellules cancéreuses humaines, 80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de carcinome à cellules de Merkel leur sont injectées sous la peau, suivies d'une injection intrapéritonéale quotidienne pendant quatre semaines, molécule testée ou solvant. Le porteur affirme que ces tumeurs ne sont pas douloureuses chez l'humain et qu'aucun signe de douleur n'a été observé lors des études précédentes. Toutes sont tuées à l'issue, la pesée finale des tumeurs imposant leur mise à mort.

Objectifs

Le carcinome à cellules de Merkel (CCM) est un cancer cutané agressif avec une survie estimée à 50 ans de seulement 40%. Il survient principalement chez le sujet agé de plus de 65 ans et le patient immunodéprimé (hémopathies, greffes d'organe, infection par le VIH). Dans 80% des cas les CCM sont dit viro-positifs et sont dus à l'intégration du Polyomavirus à cellules de Merkel (MCpV), les 20 % restants sont dis viro-négatifs et sont principalement dus aux expositions UV. Actuellement, au stade métastatique inopérable, une seule option thérapeutique efficace est disponible, l'Avelumab, mais des phénomènes de résistances primaires et acquises à ces traitements entrainent une réponse objective durable chez seulement 25% des patients, soulignant la necessité d'identifier des nouvelles stratégies thérapeutiques dans ce domaine. Des méthylations abérrantes de l'ADN ont été démontré comme étant des modifications importantes et fréquemment retrouvées dans les cellules cancéreuses. Il a été démontré dans plusieurs types de cancers que l'utilisation de molécules hypométhylant l'ADN permettait de reprogrammer les cellules tumorales vers un état "normal", re sensibilisant ces cellules à la chimiothérapie et à l'immunothérapie. Par exemple, les premières générations d'agent hypométhylant l'ADN, tel que l'azacitabine et la decitabine sont utilisés en routine pour le traitement des leucémies myeloïdes. Une nouvelle molécule hypométhylante, la guadecitabine, est actuellement en essai clinique. Nos données préliminaires démontrent que cette molécule est capable in vitro de diminuer la prolifération cellulaire et la viabilité des CCM. L'objectif de ce projet est donc d'évaluer in vivo l'efficacité anti tumorale de cette molécule sur les CCM.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre d'évaluer l'efficacité anti tumorale d'un agent hypométhylant, la guadecitabine, dans l'indication Carcinome à cellules de Merkel. Actuellement, au stade métastatique inopérable, seul l'immunothérapie, Avelumab est efficace, mais l’utilisation de ce traitement, du fait des mécanismes de résistance innés ou acquis, ne permet d’obtenir une réponse objective durable que chez 25% des patients. La capacité à ré induire une expression des immunes check point, tel que PDL-1, cible de l'immunothérapie par l'Avelumab, sera également évaluée. Ainsi la guadecitabine pourra ensuite être évaluée en combinaison avec des inhibiteurs d'immune checkpoint (Avelumab) dans le cas du CCM.

Procédures

Les souris recevront par voie sous-cutanée des cellules de CCM (carcinome à cellules de Merkel) afin d'établir le modèle tumoral. Les animaux seront injectés 1 fois par jour en intrapéritonéal avec la molécule ou le véhicule pendant 4 semaines. Ces deux types de gestes ne durent que quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir un stress lors des différentes contentions pratiquées : une contention pour l’injection des cellules tumorales en sous cutané et une contention quotidienne pour l'injection en intrapéritonéale. Une gêne ou légère douleur pourra être subies par les souris lors des injections en sous cutanées ou en intrapéritonéale. Les tumeurs étudiées sont non douloureuses chez l’Homme, chez la souris aucun signe de douleurs n’a été observé durant les études in vivo précédentes. Une sédation avec injection en intrapéritonéal d'acépromazine sera effectuée avant la mise à mort par élongation cervicale afin de limiter toutes douleurs chez l'animal.

Devenir

L'évaluation de la masse finale des tumeurs impose la mise à mort de l'ensemble des souris tumorisées.

Remplacement

L’efficacité de la guadécitabine a été préalablement démontrée in vitro en lignées cellulaires de CCM. L'obtention de l'efficacité de la molécule sur ces différentes lignées et les données déjà publiées sur des molécules similaires de première génération dans l'indication des CCM, limitent le nombrer de souris à utiliser, en nous permettant de tester une dose unique de guadécitabine. Cette étude apportera des informations clés pour la détermination de l'efficacité de cette nouvelle molécule sur la réponse anti-tumorale et sur sa capacité à re sensibiliser les cellules à de l'immunothérapie. Ces éléments, essentiels pour la validation de l'utilisation de cette molécule dans l'indication CCM nécessitent le passage par un modèle in vivo.

Réduction

La détermination du nombre de groupes et les doses testées sont basées sur les résultats des tests de cytotoxicité in vitro préalablement réalisés au laboratoire réduisant ainsi le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Les injections en intrapéritonéales sont rapides et peu douloureuse, le geste technique est déjà maitrisé par les personnes qui manipuleront les souris. De plus, bien que les injections soient quotidiennes, elles se feront en alternance entre le côté gauche et le côté droit pour éviter d'engendrer des douleurs répétées au même point d'injection. Une friandise sera proposée aux souris après chaque injection en intrapéritonéal. Tout au long de l'étude, le bien être des animaux sera évalué à l'aide d'une grille de score, si les animaux atteignent les points limites définis antérieurement, ils seront sortis de l'étude afin de limiter toutes souffrances. De plus, pour éviter tout stress inutile, lors de la mise à mort un sédatif, sera injectée en intrapéritonéal avant l'euthanasie.

Choix des espèces

Le seul modèle disponible étant des lignées carcinomateuses humaines, l’utilisation d’un modèle murin immunodéficient est indispensable. Les souris utilisées sont un modèle de référence dans les études de xénogreffes. Les souris seront receptionnées à 6 semaines de vie, et utilisées à 7 semaines après 1 semaine d’acclimatation. Elles seront ainsi dans un stade physiologique de croissance, stade utilisé usuellement dans ce modèle de carcinome et optimal pour évaluer toute toxicité pouvant être liée au traitement par la molécule.