Cancers

Des cellules tumorales sont greffées à 2 427 souris, puis des formulations à libération prolongée leur sont injectées directement dans la tumeur ou dans la cavité péritonéale, d'autres traitements passant par voie orale. Toutes sont tuées à l'issue pour l'analyse des tissus tumoraux et des organes cibles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit que les prélèvements sanguins sont réalisés "toujours sous anesthésie afin d'éviter toute douleur", puis annonce parmi les effets attendus une douleur provoquée par la prise de sang, à côté de l'ulcération de la tumeur et de douleurs intestinales. Il qualifie la mise à mort d'"option la plus éthique et appropriée" au regard des objectifs scientifiques.

Objectifs

Ces dernières années, l’immunothérapie a transformé la prise en charge du cancer, permettant à de nombreux patients de vivre plus longtemps. Cependant, tous les patients ne répondent pas bien à ces traitements. Pour améliorer les résultats, les chercheurs associent l’immunothérapie à d’autres approches comme la chimiothérapie ou les médicaments de thérapie ciblée. Un domaine prometteur concerne les molécules qui activent le système de défense naturel de l’organisme. Ces molécules imitent des parties de virus ou de bactéries, déclenchant la libération de signaux par les cellules immunitaires pour combattre la maladie. Dans le cancer, ces molécules peuvent rendre l’environnement tumoral plus favorable au traitement. Nos travaux précédents ont montré que la combinaison d’un anticorps ciblant le système immunitaire avec une molécule immunostimulante aidait à contrôler la croissance du mélanome chez la souris. Nous avons utilisé une formulation spéciale à action prolongée qui libère lentement la molécule près de la tumeur, réduisant les effets secondaires et évitant des injections fréquentes. Cette approche a mieux fonctionné que la forme topique de la molécule (crème). Nous voulons maintenant approfondir ces études : • Utiliser un immunostimulant plus puissant sous une forme à action prolongée similaire. • Tester l’injection directe dans les tumeurs pour un effet maximal. • Étendre cette stratégie à d’autres cancers comme le cancer du sein et le cancer du poumon. Nous voulons également nous attaquer aux métastases péritonéales dans le cancer de l’ovaire et le cancer colorectal, qui sont très difficiles à traiter. Notre plan consiste à administrer les médicaments directement dans la cavité péritonéale en utilisant le même système à libération contrôlée. L’objectif est de maintenir des niveaux élevés de principe actif où ils sont nécessaires et faibles dans la circulation sanguine, réduisant ainsi les effets secondaires nocifs. Cela pourrait également faciliter la combinaison des traitements en toute sécurité. Les combinaisons futures pourraient inclure : • Médicaments de chimiothérapie • Thérapies ciblées • Thérapies immunitaires supplémentaires Objectif : un meilleur contrôle du cancer, moins d’effets secondaires et une meilleure qualité de vie pour les patients.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mettre au point un nouveau traitement contre le melanome en combinant plusieurs approches : un médicament qui cible directement la tumeur et d’autres qui aident le système immunitaire à mieux la combattre, avec une action prolongée dans le temps. Les patients atteints de mélanome qui ne répondent pas aux thérapies immunitaire (environ 40 %) ou réfractaires à l'ensemble des traitements de première ligne pourraient bénéficier de cette nouvelle approche thérapeutique. Dans la même optique, le traitement des metastases péritonéales actuellement utilisé chez l’homme, reposant sur des bains de chimiothérapie, pourrait être remplacé par des formulations à libération prolongée injectées directement dans la cavité péritonéale offrant une alternative plus sûre, plus simple et potentiallement plus efficace. Les formulations à libération prolongée permet de maintenir une concentration stable du médicament au niveau de la tumeur sans nécessiter d'administration répétées. Un autre avantage majeur des formulations à libération contrôlée réside dans la diminution du pic de concentration systémique du médicament, réduisant ainsi les effets secondaires associés. Cette strategie ouvre également la possibilité de combiner plusieur molécules afin de bénéficier d’effets additifs ou synergiques tout en limitant les toxicités supplémentaires associées. Cet aspect est particulièrement important chez les patients atteints de cancer dont l'état général est souvent fragilisé après des traitements lourds et intensifs. Ce projet pourrait donc nous aider à réduire les effets secondaires des thérapies combinées existantes et à explorer de nouvelles stratégies de combinaison qui pourraient bénéficier aux patients ne répondant pas ou ayant développé une résistance à tous les traitements standards. En outre, certaines molécules présentant une forte toxicité et suscitant des inquiétudes dans des études cliniques actuelles pourraient également tirer parti de ce système de libération contrôlée pour surmonter la toxicité aiguë tout en conservant l’efficacité thérapeutique. Dans cette étude, nous aborderons le problème de toxicité associé aux molécules de therapie ciblée et de chimiotherapie en dévéloppant des formulations à libération contrôlée de ces composés. L’efficacité thérapeutique de ces formulations sera évaluée seule ou en combinaison, dans le but d'identifier de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement des cancers avancés de l’ovaire et du côlon-rectum.

Procédures

Au total, 2427 souris seront utilisées dans ce projet. Certaines recevront des cellules tumorales afin de reproduire la maladie et permettre l’évaluation de différents traitements. Les traitements seront administrés selon des méthodes adaptées à leur nature et à leur mode d’action. Une partie des animaux recevra également des traitements sous différentes formes, dont certains par voie orale. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur un nombre limité d’animaux, toujours sous anesthésie afin d’éviter toute douleur. Aucune intervention chirurgicale n’est prévue et aucune procédure ne sera réalisée sur des animaux conscients.

Impact sur les animaux

De manière similaire aux effets secondaires observés chez les patients recevant des traitements de chimiothérapie, de thérapie ciblée et d’immunothérapie, les symptômes peuvent inclure une perte d’appétit et de poids; l’injection intra-tumorale peut provoquer une ulcération de la tumeur; la présence de tumeurs dans la cavité péritonéale peut entraîner des douleurs intestinales, des troubles digestifs. D'autres effets secondaires peuvent être des difficultés respiratoires ainsi que la douleur induiteé par la prise de sang.

Devenir

À l’issue de chaque procédure expérimentale, l’ensemble des animaux sera euthanasié. Cette euthanasie est justifiée par la nécessité de réaliser des analyses post-mortem indispensables aux objectifs scientifiques du projet, notamment l’analyse des tissus tumoraux et des organes cibles afin d’évaluer l’efficacité thérapeutique, la distribution des formulations et les effets biologiques associés aux traitements. L’euthanasie permet ainsi d’éviter toute souffrance prolongée et constitue l’option la plus éthique et appropriée au regard des objectifs scientifiques et du bien-être animal.

Remplacement

L’effet thérapeutique et la toxicité de la combinaison de différentes molécules anticancéreuses, avec ou sans système de libération contrôlée, doivent être évalués au-delà des études in vitro. Le test sur des souris greffées avec des tumeurs est actuellement le seul moyen d’évaluer l’efficacité de la thérapie ainsi que la toxicité associée. Les informations obtenues seront plus comparables et plus prédictives pour le traitement chez l’humain dans les phases ultérieures. L’utilisation de souris immunocompétentes permettra également d’étudier le rôle du système immunitaire, qu’il soit antitumoral ou pro-tumoral, pendant et après le traitement, ce qui est essentiel pour obtenir un effet anticancéreux durable et une protection immunitaire. L’impact de l’utilisation d’un système de libération contrôlée au sein d’un organisme complexe ne peut être étudié que dans un organisme entier. Ainsi le modèle animal est incontournable dans notre projet pour analyser la pharmacocinétique de la libération des médicaments à partir des différentes formulations et de la comparer aux formes libres.

Réduction

Ce projet nous permettra de confirmer ou infirmer les expérimentations in vitro préalablement réalisées au sein de notre unité. Pour les formulations à libération prolongée, des tests de libération in vitro seront effectués afin de sélectionner 4 formulations candidates pour l’étude pharmacocinétique chez la souris. Cela nous aidera à choisir la bonne formulation pour les études suivantes, et à établir une corrélation entre les profils de libération in vitro et in vivo, ce qui permettra à l’avenir de sélectionner des formulations sans devoir passer par des études in vivo.

Raffinement

En cas d’apparition de signes de malaise, un suivi spécifique sera mis en place et des soins adaptés pourront être administrés si nécessaire. Les traitements ont été conçus pour limiter le nombre d’interventions et réduire les effets indésirables. Bien qu’aucun signe de douleur n’ait été observé lors d’expériences précédentes, des médicaments contre la douleur ou l’inflammation pourront être utilisés si besoin. Tout au long de l’étude, une attention particulière sera portée à l’état général des animaux, notamment à leur activité, leur comportement, leur alimentation, leur respiration et l’aspect de la tumeur. Toute modification de ces paramètres sera surveillée afin de détecter précocement tout signe d’inconfort.

Choix des espèces

Ce projet vise à tester un nouveau traitement contre le cancer en étudiant son effet sur la croissance des tumeurs et sur les défenses naturelles de l’organisme. Pour cela, des souris sont utilisées car leur système immunitaire fonctionne de manière assez similaire à celui de l'humain. De plus, les modèles de tumeurs étudiés ont déjà été développés chez la souris, ce qui en fait le modèle le plus adapté. Afin d’obtenir des résultats fiables et comparables, les expériences sont réalisées dans les mêmes conditions que les études précédentes, avec des souris porteuses de tumeurs compatibles avec leur système immunitaire. Les animaux utilisés sont de jeunes adultes, à un âge où leur organisme et leur système immunitaire sont pleinement fonctionnels, ce qui permet d’obtenir des résultats plus homogènes et représentatifs.

Des cellules tumorales sont injectées sous la peau de 720 souris, puis un produit est injecté dans la tumeur et celle-ci est irradiée, le tout sous anesthésie générale. Toutes sont tuées à l'issue pour examen des tissus et des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique avoir retenu des lignées tumorales "réputés pour produire des tumeurs qui nécrosent rapidement, malgré leur petite taille", nécrose dont il annonce qu'elle provoque une douleur modérée à court terme, à quoi s'ajoutent des lésions cutanées dans la zone irradiée. Les bénéfices avancés, des traitements "plus efficaces et moins toxiques", restent au conditionnel, quand la nécrose et les lésions cutanées sont posées au présent.

Objectifs

L’objectif de ce projet et : 1) d’évaluer si l’association du produit étudié et de la radiothérapie FLASH ou conventionnelle permettrait d’obtenir un meilleur contrôle tumoral, dans des modèles tumoraux murins syngéniques, 2) évaluer la préservation des tissus sains, avoisinant la tumeur à irradier, et 3) caractériser la modulation du microenvironnement immunitaire.

Bénéfices attendus

En adoptant cette approche, nous visons à minimiser les limitations des thérapies utilisées seules, à améliorer les résultats thérapeutiques et à augmenter la réponse globale des tumeurs en limitant les toxicités liées aux traitements. Cette stratégie de traitement à multiples facettes non seulement promet d'améliorer les résultats thérapeutiques actuels mais pourrait également nous conduire à développer de nouvelles stratégies de traitement antitumoral plus efficaces et moins toxiques. Ce projet espère fournir une base solide et des nouvelles perspectives pour optimiser les traitements cliniques futurs tout en réduisant les effets secondaires des thérapies en question. L’association du produit étudié avec la radiothérapie constitue une approche prometteuse pour surmonter les limitations liées à l’oxygénation des tumeurs et améliorer l’efficacité tumoricide, en particulier dans les tumeurs solides hypoxiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de cellules tumorales en sous cutanées (une fois, durée environ 10-20 secondes) et à une injection du produit étudié en intra-tumoral (une fois, durée environ 20 secondes) sous anesthésie générale. Les animaux recevront une irradiation localisée de la tumeur (un cycle d'irradiation dure environ 1-5 minutes en fonction de la dose) sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

En raison de la croissance des tumeurs ou des effets secondaires des traitements, les animaux peuvent présenter des changements de comportement modérés, tels qu'une diminution de l'appétit et/ou une réduction de l'activité. Les modèle utilisés sont réputés pour produire des tumeurs qui nécrosent rapidement, malgré leur petite taille. Cette nécrose peut entraîner une douleur modérée à court terme. Ainsi, des lésions cutanées induisant une douleur modérée peuvent apparaitre dans la zone irradiée.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés à l'issue de chaque procédure pour examen post-mortem sur tissus et organes.

Remplacement

Ce projet a pour but d’évaluer l'effet thérapeutique d’un modulateur de l’hypoxie dans les tissus/tumeurs, combinés à la radiothérapie. Ceci exige donc un système biologique dynamique et complet en interaction direct avec le stroma tumoral. Ceci nécessite le recours à un modèle animal vivant entier et ne peut pas être modélisé in vitro ni in silico.

Réduction

Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux à utiliser nous permettant d’atteindre les objectifs du projet, nous avons réalisé une analyse statistique à priori, afin de calculer le nombre d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives pour chaque procédure expérimentale. Le critère de jugement principal pour le calcul de puissance est la taille tumorale.

Raffinement

Une anesthésie générale sera faite lors des injections des injections du produit étudié en intra-tumoral ainsi que lors des irradiations. Les conditions d'hébergement des animaux seront optimisées, en fournissant l'environnement et la nourriture nécessaire. Leur environnement sera enrichi avec du coton ou des maisons en carton afin de diminuer leur angoisse. Le comportement et l'état de santé des animaux seront surveillés quotidiennement, pour identifier et traiter toute anomalie. Les souris seront élevées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Une pesée sera effectuée régulièrement, au minimum de façon hebdomadaire. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Un aliment appétent et énergétique sera proposé en cas de nécessité.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie et l'étude de la croissance tumorale. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez la souris en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui facilite le transfert des résultats obtenus chez la souris en clinique. Les souris seront utilisées à un âge de 7 à 9 semaines, âge auquel les souris sont adultes.

Des cellules cancéreuses mammaires sont greffées dans le coussin graisseux de 500 souris, la tumeur primaire est mesurée au pied à coulisse jusqu'à 500 mm3, puis retirée chirurgicalement pour laisser les métastases se développer. Les souris, immunocompétentes, immunodéficientes ou porteuses d'un système immunitaire humanisé, sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes et de sang. Le porteur attend des pertes de poids, des prostrations, des vocalisations, des tremblements ou des convulsions liées aux métastases cérébrales, et prévoit jusqu'à dix prélèvements de sang par jour par une incision de la veine de la queue. L'étendue réelle de ces gestes n'est pas arrêtée par le protocole, le document indiquant qu'elle dépendra des demandes des clients.

Objectifs

Ce projet consiste à évaluer chez la souris de nouveaux traitements pour les métastases des cancers du sein dont les besoins thérapeutiques sont non satisfaits. La dissémination métastatique constitue la principale cause de mortalité liée au cancer du sein, impliquant un enchaînement complexe d’événements biologiques incluant l’invasion locale, l’intravasation (entrée dans la circulation sanguine), la survie circulante, l’extravasation (sortie de la circulation sanguine) et la colonisation d’organes distants. Dans ce contexte, le développement de modèles précliniques pertinents est essentiel pour comprendre les mécanismes de la progression métastatique et pour évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Parmi ces modèles, les modèles murins orthotopiques avec exérèse de la tumeur primaire représentent aujourd’hui une approche particulièrement pertinente pour se rapprocher de la situation clinique observée chez les patientes. Pour ces modèles, des lignées cellulaires cancéreuses du sein, soit d’origine murine (syngénique) soit d’origine humaine (xénogreffe) seront inoculées directement dans le coussin graisseux mammaire des souris. En fonction des cellules injectées, des souris immunocompétentes, immunodéficientes ou humanisées pour le système immunitaire seront utilisées. Une fois la tumeur primaire bien développée, elle sera retirée chirurgicalement pour permettre le développement de métastase. Les études consistent à administrer des traitements à potentiel thérapeutique à ces souris porteuses de métastases de cancer du sein, puis à mesurer les niveaux de biomarqueurs, les concentrations sanguines ou tissulaires du composé d’intérêt et/ou la croissance métastatique. Les mesures de concentrations permettront d’établir un modèle entre la pharmacodynamie et la pharmacocinétique du composé, indispensable pour la détermination des doses à utiliser dans les études d’efficacité préclinique, de toxicologie réglementaire et enfin pour prédire les doses en développement clinique chez l’homme.

Bénéfices attendus

Historiquement, de nombreuses études précliniques ont utilisé des modèles expérimentaux basés sur l’injection intraveineuse ou intracardiaque de cellules tumorales, permettant de générer rapidement des métastases. Toutefois, ces modèles court-circuitent des étapes clés de la cascade métastatique, notamment l’échappement à partir du site primaire et les interactions précoces avec le microenvironnement tumoral. De plus, dans les modèles spontanés sans intervention chirurgicale, la croissance de la tumeur primaire conduit souvent à l’euthanasie précoce des animaux, empêchant l’étude des phases tardives de la maladie métastatique. Ainsi, ces limitations compromettent la capacité de modéliser fidèlement la progression clinique du cancer du sein, en particulier dans le contexte du traitement adjuvant, qui intervient après exérèse de la tumeur primaire chez les patientes. Les modèles murins combinant implantation orthotopique de cellules tumorales mammaires et exérèse chirurgicale de la tumeur primaire permettent de surmonter ces limites. Dans ces systèmes, les cellules tumorales se développent initialement dans un environnement anatomique et stromal approprié, puis disséminent spontanément vers des sites distants, tels que les poumons, le foie, les ganglions lymphatiques ou les os, reproduisant fidèlement les schémas métastatiques humains. En conclusion, les modèles murins de cancer du sein intégrant une exérèse de la tumeur primaire constituent une avancée majeure pour la recherche translationnelle. En reproduisant de manière plus fidèle la progression clinique de la maladie et les conditions thérapeutiques auxquelles sont exposées les patientes, ils permettent une meilleure compréhension des mécanismes métastatiques et une évaluation plus pertinente des stratégies thérapeutiques. Ces modèles apparaissent ainsi comme des outils essentiels pour combler le fossé entre recherche préclinique et application clinique dans le traitement du cancer du sein métastatique.

Procédures

1) Les gestes techniques concernent tous les animaux : • Pesées : durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Greffe des cellules tumorales à l’aide d’une aiguille réalisées dans le coussin graisseux mammaire sous anesthésie gazeuse : durée 30 secondes 1 seule fois pendant l’étude. • Mesure des tumeurs primaires avec un pied à coulisse, max 2 fois par semaine pendant 6 semaines max (jusqu’à ce que la taille de la tumeur permettent sa résection entre 150 et 500 mm3) • Résection chirurgicale des tumeurs primaires, max 1 fois, durée 10 min sous anesthésie gazeuse. • Mesure des tumeurs avec l’appareil de bioluminescence : durée 15 minutes sous anesthésie gazeuse maximum 2 fois par semaine pendant max 8 semaines. • Administration de luciférine pour imagerie de bioluminescence par voie intrapéritonéale : durée 30 secondes sur animaux vigiles (maximum 2 fois par semaine pendant une à plusieurs semaines, max 8 semaines). • Administrations des composés à potentiel thérapeutique o par voie orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique, (max2xjour), , sous-cutanée (max1xjour), intramusculaire (max1xjour) ou intradermique (1 injection/jour) : durée 30 secondes sur animaux vigiles, d’un seul traitement à 4 semaines de traitement. OU o par voie intraveineuse à la veine caudale : durée 2 minutes sur animaux vigiles, maximum 1 fois par jour pendant 3-4 jours (dépendant des veines de l’animal). 2) Les gestes techniques concernant tous les animaux ou en partie (dépendra des demandes clients) : • Prélèvements de sang sur animal vigile o via la veine saphène : durée 30 secondes (max 1xjour) o via la veine faciale : durée 30 secondes (max 1xjour) o via une incision de la veine latérale de la queue (1 seule incision d’environ 2 mm réalisée pour la totalité des prélèvements) durée 1 min (max 10xjour).

Impact sur les animaux

Ces procédures peuvent engendrer une dégradation de l'état de santé de l'animal pouvant se traduire par une perte de poids, une hypo- ou hyperthermie, un comportement anormal (animal prostré, ne répondant pas aux stimuli), des vocalisations. Les animaux étant opérés et ayant des métastases, il est possible que les animaux présentent des signes d’origine neurologique comme des tremblements et/ou des convulsions (métastases cérébrales) ou pulmonaires (métastases pulmonaires). Ces effets seront très limités dans le temps par la mise en place de critères d'arrêt anticipés et de suivi très rigoureux des animaux. Tous ces effets seront dans la majorité des cas liés au modèle. La perte de poids peut, quant à elle, être due au produit testé ou au modèle. Les animaux sont observés quotidiennement à minima et jusqu’à 2 fois par jour lors des traitements pour réagir au plus vite à l’inconfort des animaux et y apporter des solutions (arrêt des traitements, réhydratation, raffinement). Des animaux à phénotype potentiellement dommageable (immunodéprimés) sont utilisés ; pour la bonne santé des animaux, l'absence d'expression de ce phénotype est contrôlée grâce à des conditions d'hébergement adaptées garantissant l'absence de contact avec des germes pathogènes ou opportunistes pouvant altérer leur santé.

Devenir

Les animaux sont mis en mort en fin de procédure pour prélèvements d’organes/de sang.

Remplacement

Deux approches sont principalement utilisées pour mimer les événements biologiques associés aux processus de cancer : une approche in vitro, basé sur l’utilisation de lignées cellulaires ou de cellules cancéreuses isolées et des approches in vivo, basées sur l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques, chez lesquels des cellules cancéreuses sont inoculées. Les modèles in vitro ne recréent ni la diversité de l’environnement des tumeurs, ni la difficulté pour une molécule testée d’atteindre les cellules cibles. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouvelles molécules antitumorales. De plus, selon la littérature, il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de modéliser la relation pharmacodynamique et pharmacocinétique dans un contexte tumoral et encore moins dans un contexte métastatique. L’écosystème nécessaire pour la pharmacodynamie et la pharmacocinétique intègre de nombreux tissus et organes : système digestif, système circulatoire, système rénal, système immunitaire intégral, système nerveux périphérique et central. Seul un modèle animal peut permettre 1) d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes 2) d’obtenir un modèle pertinent de processus métastatique comparable à ce qui se passe chez l’humain.

Réduction

La prise et la croissance métastatiques seront suivies au cours du temps par imagerie de bioluminescence. L’utilisation de cette technique non-invasive permet d’observer au cours du temps un seul animal simplement anesthésié, là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade d’une seule étude permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. De plus, d’une manière générale, les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme) et de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex : un récepteur, une enzyme). De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d’observer une activité sur les modèles de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet se base sur les données de la littérature et les données de mise en place des modèles, notamment des analyses de puissance statistique et de détermination de la taille des groupes expérimentaux. Nous évaluons à 500 le nombre de souris maximal utilisé pour ce projet.

Raffinement

Les locaux d’hébergement font l’objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux, des systèmes d’hébergement et d’animaux sentinelles. Les animaux seront groupés dans des cages de 5 animaux contenant de l’enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Le nombre de manipulations sur l’animal sera réduit au strict nécessaire. Les procédures générant douleur, inconfort ou stress se feront systématiquement sous anesthésie. Pour les anesthésies longues (instillation des cellules tumorales ou traitement des animaux) les animaux seront placés sur un tapis chauffant avec contrôle de la température corporelle pour éviter toute hypothermie. A noter qu’afin de protéger la sécheresse oculaire durant la phase d’anesthésie, du gel ophtalmique est déposé sur les yeux de l’animal à l’aide d’un coton-tige. Pour éviter l’apparition de potentielle douleur lors de la résection de la tumeur primaire, une injection en sous-cutanée d’analgésique sera réalisée 30 minutes avant l’instillation des cellules. Cette injection sera répétée en cas d’apparition de signe de douleur. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Elle permet d’établir un score pour évaluer l’état général de l’animal et en fonction du total des scores des mesures sont appliquées. En fonction de l’état des animaux la surveillance sera renforcée et si les points limites anticipés sont atteints, l’animal sera immédiatement euthanasié. Pour les souches à phénotype potentiellement dommageable (immunodéprimés), les animaux sont hébergés en conditions adaptées pour garantir leur bonne santé par absence de contact avec des germes pathogènes ou opportunistes.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rongeur. De nombreuses données sur les modèles de cancer du sein/métastases du cancer du sein chez la souris existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets (doses de cellules, effets de molécules de références etc.. La souris est un modèle d’étude de choix car : 1) sa petite taille facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo (ou plusieurs souris peuvent être placées en même temps dans l’appareil d’imagerie), et 2) la disponibilité des souris immunodéficientes (nécessaires pour l’utilisation de cellules humaines). Les données de la littérature indiquent clairement que les rongeurs adultes représentent des modèles fiables pour l’évaluation de l’efficacité de composés dans le domaine du cancer, c’est pour cela que nous utiliserons des souris adultes

Pour déterminer à quelle vitesse une tumeur cérébrale greffée se développe et quand commencer à tester un traitement, 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever cerveau et tumeur. Des cellules cancéreuses leur sont greffées dans le cerveau au cours d'une chirurgie de quarante-cinq minutes, puis la tumeur est suivie jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie sur soixante jours au plus. Le porteur indique que la croissance de la tumeur peut entraîner des effets neurologiques selon la structure cérébrale visée, et classe l'ensemble en souffrance modérée. Il retient six souris par groupe et emploie des souris dépourvues de système immunitaire pour greffer des cellules humaines, ou des souris immunocompétentes lorsque la réaction immunitaire doit être observée.

Objectifs

Les cancers du cerveau (et plus particulièrement les glioblastomes qui représentent 30% de ces cancers) sont des maladies graves qui touchent de nombreuses personnes, et les traitements actuels ne permettent pas d’apporter une solution thérapeutique efficace aux patients. Pour développer de nouveaux médicaments, il faut d'abord les tester sur des modèles qui reproduisent la maladie le plus fidèlement possible avant tout essai chez l’humain. Ce projet vise à améliorer la recherche de traitements contre certains cancers du cerveau, encore difficiles à soigner aujourd'hui. Il a pour objectif d’étudier les meilleures conditions pour reproduire et suivre des tumeurs cérébrales chez la souris. L'objectif est de savoir si les cellules cancéreuses s'installent correctement, à quelle vitesse la tumeur se développe, et quel est le bon moment pour commencer à tester un traitement. Concrètement, des cellules cancéreuses sont greffées dans le cerveau de la souris sous anesthésie générale et anti-douleurs, puis la croissance des tumeurs est observée régulièrement grâce à des techniques d’imageries qui permettent de visualiser la tumeur de façon non invasive. Les souris utilisées seront dépourvues de système immunitaire pour éviter le rejet de la greffe lorsque les cellules tumorales utilisés seront d’origines humaines. Dans le cas où l’impact du système immunitaire serait important dans nos hypothèses, des souris immunocompétentes seront utilisés et des tumeurs de souris seront greffées pour modéliser une tumeur dans son microenvironnement sans risque de rejet de greffe. Ce travail permettra de choisir les meilleurs modèles pour tester de futurs médicaments et comprendre leurs mécanismes d’actions.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de disposer de modèles de recherche fiables qui reproduisent fidèlement la maladie. Habituellement, les cellules tumorales sont implantées sous la peau des animaux, mais cette méthode a des limites importantes : l'environnement autour de la tumeur n'est pas le même que dans le cerveau, et la barrière naturelle (barrière hématoencéphalique) qui protège le cerveau n'est pas présente. En étudiant la tumeur directement dans le cerveau, là où elle se développe réellement, ce projet vise à mieux comprendre comment le cancer se développe dans un organisme vivant. Cela permettra d'adapter les conditions de test pour évaluer plus efficacement les futurs médicaments. À court terme, ces connaissances sont essentielles pour développer des modèles d’études pertinents et identifier à moyen terme des traitements plus efficaces, dans le but d'améliorer la survie et la qualité de vie des personnes atteintes de cancer du cerveau.

Procédures

Intervention chirurgicale pour la greffe des cellules tumorales sous anesthésie générale gazeuse et locale avec injection d’analgésie (45 min) – 1 fois Imagerie sous anesthésie gazeuse (20min) – 1 fois par semaine jusqu’à 8 fois au cours de l’étude après injection d’un substrat dont la transformation émet des photons détectables par imagerie durant 60 jours maximum.

Impact sur les animaux

Une potentielle source de stress ou douleur peut survenir lors : − de la phase chirurgicale sous anesthésie nécessaire à l’administration des cellules (d’une durée d’environ 45 minutes) et du suivi post-opératoire (Stress et douleur modérée) -de la phase de pousse de la tumeur (60 jours maximum). L’évolution de la tumeur pourrait potentiellement avoir des effets neurologiques lié à la pousse de la tumeur et la structure cérébrale ciblée. Ce qui pourrait engendrer une douleur et un stress modéré. - de l’anesthésie gazeuse pour l’évaluation de la taille de la tumeur par de l’imagerie par bioluminescence d’une durée de 20 min hebdomadaire maximum sur une durée de deux mois maximum (Stress léger) - des injections d’anesthésiques et d’analgésiques lors des soins pré- péri- et post-opératoire, et également lors de la mise à mort en fin d’étude mais également l’injection hebdomadaire durant deux mois du substrat dont la transformation émet des photons détectable lors des mesures par imagerie. La contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent également générer du stress

Devenir

À la fin des procédures, tous les animaux sont mis à mort. Cette étape est nécessaire pour prélever et analyser les tissus (cerveau, tumeur) afin de valider les caractéristiques du modèle et de comprendre précisément le développement de la maladie à l'échelle cellulaire et de l’organe. Ces prélèvements permettent également de générer des échantillons pour des analyses complémentaires, optimisant ainsi l'utilisation de chaque animal.

Remplacement

Ce projet a pour but de déterminer des conditions de greffe et de croissance de tumeurs implantées dans le cerveau chez la souris immunodéficiente ou immunocompétente. Dans un premier temps les lignées d’intérêts sont sélectionnées in vitro lors d’études dites de validation de cible (surexpression ou suppression du gène cible). Puis une fois validée, l’implantation des cellules permet ainsi à la tumeur de se développer dans le microenvironnement d’origine d’un cancer du cerveau (Glioblastome) permettant ainsi une récapitulation des nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine. De plus, cette localisation ajoute une complexité au développement du médicament qui se doit d’avoir des propriétés physico-chimiques spécifiques pour atteindre la tumeur et franchir la barrière hématoencéphalique tout en interagissant avec la cible. Il est impossible à l’heure actuelle de reconstituer in vitro les interactions d’une tumeur avec le micro-environnement, et donc il n’y a pas de méthodes substitutives. Pour pouvoir effectuer ces évaluations in-vivo, il est indispensable d’utiliser en premier lieu un modèle tumoral maitrisé et bien caractérisé en recréant la pathologie par implantation de cellules tumorales chez la souris. Par la suite, l’animal porteur de tumeur devient ainsi un bon modèle expérimental pour évaluer les composés anti-cancéreux.

Réduction

• Un accompagnement par le service biostatistique sera réalisé pour estimer la variabilité de la pousse de la tumeur pour chaque lignée cellulaire étudiée dans le cadre de ce projet. Cette étape permettra d'établir le nombre d'animaux nécessaires par groupe pour les études futures d'efficacité de traitement et de pharmacodynamie. En accord avec les données de la littérature et les données générées en interne ainsi que les recommandations du service biostatistique qui nous accompagne, 6 animaux par groupe est le minimum nécessaire • Lorsque les souris seront euthanasiées, des prélèvements de tumeurs seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…). Cette approche permet donc d’optimiser les études et de réduire le nombre d’animaux en évitant de refaire des études pour obtenir des échantillons. • L’imagerie permet une détection des tumeurs non visibles à l’œil nu. Cette technique permet de suivre l’évolution des tumeurs au cours du temps et fait de l’animal son propre témoin (Suivi longitudinal), ce qui concourt directement à la réduction du nombre de souris nécessaires dans une même étude.

Raffinement

• La procédure de greffe tumorale dans le cerveau est réalisée selon les bonnes pratiques de chirurgie sous anesthésie générale gazeuse et avec analgésie pré, péri et post-opératoire, avec un maintien de la température corporelle dès l’anesthésie jusqu’au réveil total de la souris. • Les souris seront replacées en hébergement groupé après la chirurgie. • Mise en place de gel nutritif en préventif systématiquement 3 à 5 jours avant la chirurgie, dans un but d’habituation des animaux à l’aliment pour favoriser la prise en postopératoire ainsi que la récupération post chirurgie, puis tout au long de l’étude. • L’habitat des souris est enrichi de matériel adapté pour leur permettre d’exprimer leurs comportements naturels comme ronger, se réfugier ou nidifier et favoriser le comportement de fouissage. • Les animaux font l’objet d’une observation clinique en post chirurgie et tout au long de l’étude par les expérimentateurs et par les zootechniciens pour s’assurer de leur rétablissement, de leur bien-être et de l’absence de signe clinique. En cas de signe clinique, le vétérinaire est alerté et les recommandations de la Structure chargée du bien-être des animaux et les points limites seront appliqués. • Les animaux peuvent être hébergés dans des cages connectées. Ce mode d’hébergement permet de suivre, au cours de l'étude, d’éventuelles altérations de l’activité cumulée des souris dans une cage. Avec ce système l’analyse des résultats fournira une meilleure documentation des modèles. • Le suivi de la croissance tumorale par l’imagerie sous anesthésie gazeuse est une méthode non invasive et sans douleur pour l’animal qui permet de suivre un même animal tout au long de l’étude sans procéder à l’examen macroscopique de la tumeur en systématique. Les tumeurs sont mesurées par l’intensité du signal émis par les cellules tumorales 1 fois par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais aussi pour limiter le stress ressenti par les animaux .

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans la littérature pour la recherche pré-clinique. De plus, la greffe de cellules tumorales dans le cerveau chez la souris est décrite comme hautement pertinente La souris est le modèle de référence grâce à sa structure cérébrale et sa barrière hémato-encéphalique proches de celles de l'humain. La diversité des souches de souris disponibles permet aussi bien l'étude du système immunitaire sur des tumeurs murines (souris immunocompétentes) que la xénogreffe de cellules humaines sans risque de rejet (souris immunodéprimées). Le phénotype dommageable des souris immunodéprimées est maitrisé par les conditions strictes d’hébergement de notre animalerie protégée dans les études précliniques d’oncologie. La souris est le modèle de référence grâce à la structure de son cerveau et sa barrière physico chimique « hémato-encéphalique » proches de celles de l'humain. La diversité des souches de souris disponibles permet aussi bien l'étude du système immunitaire sur des tumeurs murines (souris immunocompétentes) que la xénogreffe de cellules humaines sans risque de rejet (souris immunodéprimées). Le phénotype dommageable des souris immunodéprimées est maitrisé par les conditions strictes d’hébergement de notre animalerie protégée Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 7 semaines. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans les protocoles d’efficacité et de pharmacodynamie en oncologie, il permet d’atteindre un poids corporel suffisant de l’animal pour assurer une bonne récupération post- chirurgicale. De plus à cet âge les souris présentent un cerveau développé et accessible pour l’implantation de tumeurs.

Des cellules tumorales sont injectées dans la muqueuse intestinale par voie rectale sous endoscopie, geste répété chaque semaine pour suivre la croissance de la tumeur. 2 752 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever rate, ganglions, intestins et tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des traitements anticancéreux par voie orale, rectale, intramusculaire, intrapéritonéale, intraveineuse ou par gavage, avec des prélèvements de sang à la veine faciale jusqu'à une fois par semaine. Le porteur affirme que l'effectif est calculé "au plus juste" à partir d'expériences antérieures en greffe sous-cutanée, sans donner un seul chiffre à l'appui de ces 2 752 animaux.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans la continuité de projets déjà existants et ayant donné des résultats très prometteurs. Il consiste à mettre au point des modèles de greffe de cellules tumorales dans la muqueuse intestinale afin de se rapprocher au plus près de ce qui se passe chez l’homme dans le cas de personnes atteintes de cancer digestif. En effet des expériences préliminaires ont été réalisées en greffant des cellules tumorales sous-cutanées afin de développer et de tester de nouvelles approches de thérapies de vaccination anti-cancer. Afin de continuer et d’optimiser ces thérapies, il est intéressant et judicieux d’améliorer les modèles d’études. La localisation des cellules tumorales est un paramètre important à prendre en compte dans nos études. En effet, celle-ci peut modifier la réponse aux thérapies due à un différentiel de biodistribution du médicament selon les organes, le microenvironnement, une réponse immunitaire différente selon les organes. C’est pour cela qu’il est important de développer des modèles murins de greffe de cellules tumorales au niveau de l'instestin. De plus dans le cancer colo-rectal les immunothérapies sont peu efficaces, cette étude a pour objectif de tester un traitement local in-situ afin d’augmenter les efficacités de traitements. La stratégie de vaccination des lésions in-situ permettrait d’empêcher les lésions pré-cancéreuses de se développer.

Bénéfices attendus

Malgré les progrès importants dans la prise en charge des patients atteints de cancer digestifs, un certain nombre ne répondent pas aux différente de traitement ou récidivent. Il est donc essentiel de développer de nouvelles thérapies ou d’optimiser les traitements existants. Pour cela, nous avons besoin de modèles se rapprochant au plus près de la pathologie humaine. L’utilisation du modèle murin de greffe de cellules tumorales issues de cancer digestifs au niveau de l'intestin permettra de créer un environnement au plus proche de celui des cancers digestifs chez l’Homme et pourra ainsi répondre à des interrogations auxquelles nous ne pouvons pas répondre dans les modèles traditionnels de greffe tumorale en sous-cutané.

Procédures

Les animaux subiront une endoscopie sous anesthésie afin d'injecter des cellules tumorales dans la muqueuse intestinale. Ces animaux subiront ensuite d'autres endoscopies sous anesthésie afin de suivre l'évolution de la tumeur (une par semaine). Pour les animaux ayant reçu une lignée cellulaire dont le suivi peut être réalisé par imagerie une fois par semaine, une injection intra-péritonéale de produit de traçage sera réalisée suivi par une anesthésie gazeuse pour le placement dans l’appareil d’imagerie. Les animaux recevront ensuite différents traitements anti-cancer (un traitement par animal). Ceux-ci seront administrés soit par voie orale, rectale sous endoscopie, intra-musculaire, intra-péritonéale, inra-veineuse ou par gavage. Les animaux, au cours de la procédure pourront subir des prélèvement de sang veineux périphérique au niveau de la veine faciale après anesthésie gazeuse à l’isoflurane au maximum une fois par semaine.

Impact sur les animaux

La greffe des cellules tumorales sera réalisée sous anesthésie gazeuse par endoscopie dans la muqueuse intestinale ce qui peut induire un stress de l’animal. Le développement des tumeurs peut être à l’origine de souffrance et de gênes qui seront évaluées par observations fréquentes des animaux (poids, état général) 3 fois par semaine et estimation de la prise tumorale par imagerie de bioluminescence après injection IP de luciférine lors de l’utilisation de lignées cellulaire possédant la luciférase ou par endoscopie.

Devenir

A l'issu de la procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de prélever certains organes (rate, ganglions, intestins, tumeurs...) et ainsi réaliser des analyses immunologiques complémentaires. Ces analyses sur les organes permettront de mieux comprendre les mécanismes de développement tumoral ainsi que les mécanismes d'actions et les conséquences des traitements.

Remplacement

Un modèle animal, et plus précisément mammifère doté d’un système immunitaire complexe, est nécessaire pour étudier les acteurs des réponses immunes dans le cancer. En plus des éléments apportés par les expériences réalisées préalablement à l’aide de modèles de culture cellulaire in vitro, le modèle vivant est essentiel à la preuve d’efficacité des thérapeutiques développées dans ce projet. Les études de délivrance et de biodistribution nécessitent forcément d’avoir recours à l’expérimentation animale. Il n’est pas possible de créer in vitro la complexité du système immunitaire avec tous les acteurs cellulaires entrant en jeu. Préalablement à ces expériences in vivo des études in vitro ont été réalisées afin de définir des conditions optimales de croissance tumorale et de conditions d’administration des traitements.

Réduction

Ces expériences in vivo sont réalisées pour soutenir et compléter des résultats qui ont été obtenus in vitro. Le nombre d’animaux est calculé au plus juste afin de pouvoir montrer des différences significatives ainsi que la reproductibilité et la répétabilité des résultats obtenus. Ces effectifs sont calculés à partir des résultats que l’on a pu obtenir par le passé sur des expériences utilisant des modèles de greffe sous cutanée ainsi que les données de la littérature sur le sujet.

Raffinement

Après une semaine d’acclimatation, les souris seront habituées au geste de la contention et à la pesée dès leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les animaux sont hébergés en groupe dans un environnement enrichi (abris, matériaux de nidification, contrôle du cycle lumineux, de l’hygrométrie et de la température). Ils bénéficient d’un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et sont manipulés exclusivement par du personnel formé et habilité. Les animaux seront suivis de façon adaptée à l’intensité de la pathologie afin d’évaluer les nuisances causées ainsi que la sévérité de la pathologie. Les procédures expérimentales potentiellement douloureuses seront encadrées par une anesthésie. L’apparition d’une potentielle douleur en lien avec les procédures expérimentales sera appréciée par une échelle d’évaluation de la douleur. Lorsque cela sera possible, des techniques d’imagerie par bioluminescence seront privilégiées pour le suivi de la maladie à la place des endoscopies. Enfin, des points limites seront mis en place, prenant en compte plusieurs paramètres tels que la perte de poids, l’état du pelage, la capacité de locomotion et la présence d’une douleur qui sera évaluée grâce à une grille de score précise. Ces points limites permettront, lorsqu’ils sont atteints, de mettre à mort immédiatement les animaux.

Choix des espèces

La souris présente un système immuno-physiologique très proche de celui de l’humain, idéal pour l’évaluation des thérapeutiques. Les modèles utilisés dans ce projet sont les modèles de références unanimement validés par la communauté scientifique internationale. La souris présente également l’avantage d’être disponible avec différentes mutations génétiques permettant d’étudier plus profondément certains mécanismes cellulaires. Des souris âgées de 4 à 12 semaines seront utilisées. Ce stade de développement a été retenu car le système immunitaire est pleinement mature permettant d'obtenir une réponse inflammatoire reproductible après implantation de la tumeur. L'utilisation d'animaux adultes limite également les variations physiologiques observées au cours de la croissance ou liées au vieillissement, susceptibles d'influencer les paramètres étudiés. Par ailleurs, la majorité des données publiées concernant le modèle de greffe orthotopique de cellules tumorales au niveau de l’intestin a été obtenue chez des souris jeunes adultes, ce qui permet de comparer les résultats générés dans ce projet avec ceux de la littérature scientifique et d'assurer la reproductibilité des expériences.

Mises en accouplement pendant environ six mois, leurs petits anesthésiés pour un prélèvement de tissu destiné au génotypage, 279 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles appartiennent à quatre lignées qui développent spontanément une fibrose des voies biliaires et une hypertension portale, entretenues pour étudier une cible thérapeutique dans la cholangite sclérosante primitive. Le porteur ne compte parmi les dommages que la douleur transitoire du prélèvement, alors que la pathologie hépatique, ictère compris, tient à la lignée elle-même et se déclare sans intervention. Les reproducteurs sont tués à huit mois, avant l'apparition de signes cliniques significatifs, et les jeunes rejoignent d'autres projets expérimentaux.

Objectifs

Ce projet a pour but la gestion de 4 lignées qui développent spontanément une maladie hépatique caractérisée par une fibrose biliaire et une hypertension portale. Ces 4 modèles de souris vont nous permettre d’étudier l’implication d’une cible thérapeutique sur le développement de la cholangite sclérosante primitive. La cholangite sclérosante primitive est une maladie inflammatoire chronique des voies biliaires qui entraîne une fibrose et une destruction progressive des canaux biliaires, menant à des complications très sévères, telles qu’une insuffisance hépatique et des tumeurs hépatobiliaires. La cholangite sclérosante primitive est relativement rare, touchant environ 1 personne sur 10 000 dans la population générale. Elle est plus fréquente chez les hommes que chez les femmes et est souvent diagnostiquée chez les patients atteints de colite ulcéreuse. À l’exception de la greffe du foie, qui est réservée aux patients les plus gravement touchés, il n’existe actuellement aucun traitement pour cette maladie. Ainsi l’objectif de ce projet est la gestion de deux lignées de souris qui permettrons d’étudier la cholangite sclérosante primitive afin de comprendre cette pathologie et optimiser la prise en charge des patients.

Bénéfices attendus

La gestion de ces lignées permettra d’optimiser l’élevage et donc leur reproduction pour nos projets scientifiques. L’utilisation de ces deux lignées vise à évaluer l’implication de l’expression d’une cible thérapeutique sur le développement de la CSP. Les résultats permettront de comprendre comment cette cible participe à l’évolution de la maladie et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les souris seront mises en accouplement durant 6 mois environs afin de produire les souris nécessaires pour réaliser nos projets scientifiques. Les petits générés par ces croisements pourront subir un prélèvement de tissus pour caractériser leur génotype. Ce prélèvement se fera sur animaux anesthésiés et prendra moins d’une minute à être réalisé.

Impact sur les animaux

Ce modèle de souris développe spontanément une maladie hépatique caractérisée par une cholestase intrahépatique avec ictère, une fibrose biliaire, une hypertension portale. Une diarrhée peut être observée à partir de 12 semaines d’âge (5% des cas). Le prélèvement de tissu induit une douleur aigüe transitoire.

Devenir

Utilisation continue : utilisation vers le projet scientifique prévu pour ces animaux. Les souris produites au fur et à mesure seront utilisées pour les projets scientifiques et les couples seront utilisés en continus pour les prochains accouplements. Les reproducteurs seront mis à mort lorsqu’ils auront atteint 8 mois d’âge (avant apparition de signe clinique significatif).

Remplacement

L’étude de cellules isolées ne permet pas de reproduire la complexité d’un organisme entier, où plusieurs organes interagissent entre eux. Une étape supplémentaire chez l’animal est donc nécessaire pour comprendre précisément les mécanismes biologiques impliqués et évaluer la sécurité et l’efficacité du traitement avant toute application chez l’être humain.

Réduction

La production est basée sur les besoins expérimentaux établis de façon statistiques. Les tailles d’effectifs ont été déterminées en se basant sur le strict minimum dont nous avons besoin pour la reproduction de nos souris pour générer le nombre de souris nécessaire à nos projets scientifiques. Toutes les données recueillies seront analysées avec des méthodes statistiques adaptées afin d’exploiter au maximum les informations obtenues et d’éviter toute utilisation animale supplémentaire inutile.

Raffinement

L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble à ronger, un tunnel pour se cacher, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques actuellement prescrites chez l’homme. C’est actuellement le modèle le plus pertinent en termes d’homogénéité et de reproductibilité dont nous disposons pour l’étude de cette pathologie. De plus le modèle de souris que nous utilisons est génétiquement modifiée pour ne pas exprimer notre cible thérapeutique au niveau du foie afin de compléter nos études sur cette cible. À présent, ce modèle n’est donc disponible que dans la souris. Les animaux seront utilisés à partir d’un âge adulte de 7-8 semaines minimum pour les reproductions afin d’optimiser l’élevage.

1 500 souris, toutes tuées à l'issue, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales sous la peau, puis de vingt à trente administrations du composé testé, jusqu'à soixante en cas de deux prises quotidiennes, avec une contention tous les deux jours pour mesurer la tumeur qui pousse sous sa peau. Les inhibiteurs testés visent le mélanome et les cancers du côlon et du pancréas, en combinaison avec les immunothérapies existantes. Le porteur écrit que ces expériences sont "cruciales pour l'avancée du projet et les levées de fond nécessaires" dans le cadre d'une collaboration avec une start-up, et qualifie la souris d'"indispensable" pour répondre à la question posée.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de traitements utilisant des inhibiteurs de la protéine NFkB Inducing Kinase (NIK) et leurs dérivés sur les cancers solides tels que le mélanome et les cancers du côlon et du pancréas en monothérapie ou en combinaison avec les immunothérapies actuelles sur des modèles de cancers chez la souris. Ceci permettra de proposer des solutions à des patients en échec thérapeutique. En effet si les Immunothérapies ont été une avancée majeure pour le traitement de certains types de cancers une proportion de patients ne répond pas à ces traitements et des combinaisons avec des molécules permettant de restaurer cette réponse aux immunothérapies seraient une avancée majeure.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont la mise en évidence de l'efficacité in vivo de nos inhibiteurs de NFkB Inducing Kinase (NIK) contre la croissance tumorale ainsi que de l'intérêt de leur utilisation pour potentialiser l'effet des immunothérapies dans des modèles ayant des taux de réponse variables en fonction des modèles cellulaires utilisés. Dans le cadre de notre collaboration avec une start-up, ces expériences sont cruciales pour l’avancée du projet et les levées de fond nécessaires au passage vers les études pré-cliniques puis cliniques.

Procédures

Les animaux subiront : - 1 injection de cellules tumorales (5 secondes) - 1 injection/ jour avec nos molécules ou 1 à 2 traitement oral/ jour avec nos molécules (5 secondes) pendant la durée du traitement. - 1 contention pour mesurer la taille des tumeurs tous les deux jours. Ceci sur une durée de traitement de 2 à 3 semaines, 3 à 4 semaines pour les modèles de cancer du pancréas. Les souris recevront de 20 à 30 injections/administrations selon le modèle et de 40 à 60 en cas d'administrations 2 fois par jour.

Impact sur les animaux

Lors des injections des cellules tumorales en sous-cutané, il peut y avoir un risque d’irritation et de gonflement aux zones d’injection. Les souris vont ensuite subir une croissance tumorale sous-cutanée. Pour les traitements en injection intrapéritonéale, il peut y avoir un risque d’irritation, gonflement, infection aux zones d’injection et absence de toilettage. Pour les traitements par voie orale, les risques sont des fausses routes et de légers saignements.

Devenir

A la fin de chaque expérimentation, les animaux seront mis à mort. Nous prélèverons la tumeur et les organes (foie, rate, poumons) afin de réaliser les études qui nous apporterons le plus de renseignements possibles sur le fonctionnement de nos nouvelles molécules thérapeutiques.

Remplacement

Nous avons tout d’abord caractérisé et testé nos composés in vitro et sélectionné les plus efficaces sur les cellules tumorales et vérifier leur innocuité sur des cellules normales. Il est maintenant nécessaire de passer chez le rongeur afin d’avoir une approche plus physiologique et étudier les combinaisons avec les immunothérapies. Nous pourrons ainsi déterminer lesquels de ces traitements sont les plus efficaces dans les modèles cancéreux utilisés (mélanome, cancer du côlon et pancréas) pour diminuer la croissance tumorale et potentialiser une réponse immunitaire antitumorale. Le passage chez l’animal est crucial avant le développement potentiel de ces molécules chez l’homme, ce qui permettrait une alternative à l’échec thérapeutique des traitements actuels.

Réduction

Des statistiques prédictives ont été réalisées. Nous avons choisi de faire des groupes de 10 souris et de refaire l’expérimentation 3 fois. Si après 2 expériences, les résultats sont significatifs, nous ne reproduirons pas une 3ème fois (réduction du nombre d’animaux). Les données de volume tumoral seront analysées statistiquement (comparaison de la croissance tumorale suivant les différents traitements).

Raffinement

Nous réaliserons aussi un suivi attentif des animaux par observation, et une pesée des souris deux fois par semaine, qui permettra l’arrêt de l’expérience dès que les souris présenteront un mal-être ou une souffrance. Les souris seront réparties aléatoirement dans les différents groupe de traitement afin de ne pas biaiser l'analyse. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie.

Choix des espèces

La souris représente le modèle préclinique le plus pertinent pour ce projet, car elle possède un système immunitaire complet, fonctionnel et étroitement comparable à celui de l’homme. L’étude des interactions entre tumeur, immunité et modulation pharmacologique — notamment via les inhibiteurs de NFkB Inducing Kinase (NIK) — nécessite impérativement un organisme immunocompétent. Les mécanismes de surveillance immunitaire et la réponse aux immunothérapies sont conservés chez la souris, permettant de modéliser fidèlement les phénomènes étudiés. Aucun autre modèle animal ou in vitro ne permettrait de reproduire de manière aussi fiable la complexité de ces interactions, rendant la souris indispensable pour répondre à la question scientifique. Les souris seront utilisées à l’âge de 5 semaines. Elles seront commandées à 4 semaines et acclimatées pendant 1 semaine. La croissance tumorale est optimale pour les souris à cet âge-là et ceci est scientifiquement cohérent avec les expériences déjà effectuées au laboratoire ainsi qu’avec les données de la littérature.

Génétiquement modifiées pour exprimer un gène humain, les souris de ce projet sont élevées et transportées dans des cages séparées pour ne pas être mêlées à d'autres lignées. 400 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales sous la peau, puis une chimiothérapie ou des anticorps par voie intrapéritonéale, la croissance de la tumeur étant suivie jusqu'à cinq semaines, avec mise à mort le jour même si le score de douleur atteint 8 ou si la tumeur s'ulcère. Toutes sont tuées par inhalation de CO2, pour une ponction cardiaque post mortem et le prélèvement des ganglions, de la rate et de la tumeur.

Objectifs

De nombreux mécanismes suppresseurs déjouant la surveillance du système immunitaire ont été mis en évidence lors du développement des tumeurs. Parmi ceux-ci, les points de contrôles immunitaires notamment ceux exprimés par les cellules myéloïdes représentent donc des cibles thérapeutiques intéressantes pour restaurer une réponse immunitaire efficace et éradiquer les tumeurs. La compréhension de ces points de contrôles immunitaires représente ainsi un enjeu crucial en sante pour les patients atteints de cancer et permettent de développer l'immunothérapie pour bloquer ces points de controle qui a révolutionné les traitements des patients cette dernière décennie. Aussi, il est important de déterminer le rôle de ces points de contrôles dans des modèles in vivo de tumeurs chez la souris par le blocage à l'aide d'anticorps thérapeutiques pour établir la preuve de concept de leur potentiel thérapeutique.

Bénéfices attendus

Le blocage de la molécule chez le rongeur permettrait de mettre en évidence l'importance de la molécule étudiée dans le développement du cancer et ainsi de générer à long terme de nouveaux médicaments pour les patients atteints de cancers.

Procédures

Les animaux (400 au total) seront injectées par des cellules tumorales par voie sous cutanée (en 15 secondes) et seront traités par de la chimiothérapie ou des anticorps thérapeutiques en intrapéritonéal en 5 secondes). Le suivi des souris (croissance de la tumeur) sera suivi sur 5 semaines maximum et certaines souris seront prélevées pour leurs organes 14 jours après l'injection des cellules tumorales.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent subir une souffrance au niveau de la peau injectée par la tumeur en sous cutanée mais il est rarrement observé de dégradation de leur état général (attitude prostrée, poils hérissés, etc..).

Devenir

A l'issue de chaque procédure, nous prélèverons le sérum du sang (ponction cardiaque après la mort), les ganglions, rate et la tumeur à jour 14 après euthanasie de l'animal par inhalation de CO2. Les animaux seront tous mis à mort à la fin des procédures experimentales car ces animaux ayant reçu des injections de cellules tumorales ne peuvent pas être réutilisés pour d'autres expérimentations.

Remplacement

Le meilleur modèle pour regarder l'effet d'une molécule sur la croissance tumorale et la survie est in vivo et en utilisant des animaux génétiquement modifiés; il existe une alternative de modèles tumoraux en 2 dimensions, ou organoïdes. Cependant, à ce stade avec des organoïdes, il ne serait pas possible d'analyser le rôle de cette molécule dans ce contexte tumoral car pour l'instant les études sur les organoides de tumeurs permettent uniquement de regarder des molécules exprimées par les lymphocytes T et non des molécules exprimées par des cellules myéloides comme c'est le cas ici. Par ailleurs, la réponse immune anti-tumorale est complexe et fait intervenir de multiples acteurs cellulaires qu'il est difficile à reproduire à l'heure actuelle dans les modèles in vitro lorsque l'on souhaite étudier la réponse immune anti-tumorale dans sa globalité.

Réduction

Pour les expériences in vivo, le calcul de la taille de l'échantillon a été effectué à l'aide du logiciel en ligne « Experimental Design Assistant » (https://eda.nc3rs.org.uk/eda/login/auth) en fonction de l'ampleur estimée de l'effet et de l'écart-type (variabilité basée sur les données antérieures obtenues) pour les différents tests non paramétriques, avec un seuil de signification p < 0,05 et une puissance fixée à 0,90. La taille de l'échantillon avec EDA indique un total de 10 souris par groupe (controle et injecté par anticorps) par procédure respectivement, dans au moins 2 expériences distinctes. Les données seront analysées à l'aide de GraphPad Prism. La mise en évidence de différences éventuelles entre ces groupes sera effectuée à l’aide de tests statistiques non paramétriques, sur des séries non appariées, puisque ni la normalité des distributions parentes, ni l’analyse de l’égalité des variances ne peuvent être réalisées dans de tels protocoles sans sacrifier un nombre important d’animaux. Les analyses statistiques porteront majoritairement sur des comparaisons de moyenne à l’aide du test U de Mann-Whitney.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans l'animalerie selon les normes qui leur sont propres afin de ne pas ajouter un stress supplémentaire au protocole utilisé. Les animaux sont suivis tous les 3 jours pour la croissance tumorale dans les modèle sous cutanés d'adénocarcinome du colon et de fibrosarcome afin de suivre la croissance tumorale et détecter le plus précocement une douleur et d’y mettre un terme, soit par traitement antalgique, soit par sacrifice de l’animal si la souffrance ne peut pas être contrôlée. L’observation d’une perte de poids et/ou d’une attitude indiquant un état non naturel (attitude prostrée, poils hérissés, etc..) et de souffrance conduira à l’euthanasie de l’animal selon le système de score indiqué en tableau en annexe et si le score est supérieur ou égal à 8, l’animal sera retiré de l’étude et euthanasié le jour même par inhalation de CO2. Par ailleurs, l'animal sera systématiquement euthanasié si une ulcération de la tumeur est observée.

Choix des espèces

Pour étudier le rôle de CLEC-1, nous devons utiliser des souris hCLEC-1 (Knock In KI) pour tester son rôle dans des modèles expérimentaux de développement tumoral. Ces souris ont été génétiquement modifiées pour exprimer le gène humain clec1a. Ces souris sont donc spécifiquement confinées dans des cages bien répertoriées lors de l'élevage et du transport et ne sont pas mélangées à d'autres types de souris. La preuve de concept in vivo de l'effet de l'anticorps est essentielle et ces souris qui ont cette modification génétique avec le CLEC-1 humanisé permettent de réaliser ce type d'expérience in vivo pour mimer ce qui se passe en clinique. Les souris receveuses de tumeurs seront utilisées entre 8 et 12 semaines d'âge (souris adultes) car il faut un système immunitaire adulte. Les souris seront également prélevées pour leurs organes lymphoïdes secondaires ou leur moelle osseuse à 8-12 semaines (âge adulte). Pour les chimères, les souris seront utilisées entre 10-12 semaines après reconstitution pour que le repeuplement hématopoïétique soit optimal.

Greffées sous la peau de cellules tumorales, puis gavées deux fois par semaine pendant trois semaines au maximum, 75 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour mesurer le volume des tumeurs. Le projet teste des plantes utilisées par les tradipraticiens au Cameroun, dans l'idée de valider celles qui auraient un effet antiprolifératif et d'ouvrir un accès aux soins à des patients qui ne peuvent pas payer la chimiothérapie. Le porteur écrit que ces plantes ne causeront aucun effet indésirable chez les souris parce que des humains en consomment déjà, tout en admettant que la tumeur sous la peau peut gêner leurs déplacements. Sur treize plantes déjà testées en culture cellulaire, quatre paraissent intéressantes, et ce sont ces résultats qui servent à justifier le passage à l'animal par groupes de cinq.

Objectifs

La prise en charge des cancers est différente dans le monde. En fonction du développement des pays, l’accès aux soins y est différent. Ces dernières années L’OMS encourage l’intégration de la médecine traditionnelle dans le système de soins conventionnels dans les pays en voie de développement. En Afrique, les traitements de référence comme la chirurgie et la chimiothérapie sont proposées, mais de façon limitée car l'accès à ces soins est hors de prix. De ce fait, les patients auront souvent un accès plus facile à d’autres traitements, issus de la médecine traditionnelle. La médecine traditionnelle au Cameroun utilise des plantes, souvent associées entre elles, pour aider ou remplacer les traitements anticancéreux. Or celle-ci propose des traitements, variable d’un praticien à un autre, dans certains cas sous forme de plantes ingérées ou d’infusion et dont l’efficacité est fondée sur des niveaux de preuve faible, au regard de nos mode d’analyse. La seule donnée issue de cette médecine est la non toxicité de ces plantes, y compris conjuguées entre elles, car elles sont utilisées depuis de très nombreuses années, sans toxicité rapportée. Déterminer un effet antiprolifératif d’une des plantes utilisées permettrait de la sélectionner et ainsi d’orienter cette médecine et de diffuser un savoir plus solide. Notre but est de pouvoir diffuser des informations confirmant un effet scientifique observable de certaines de ces plantes pour aider à l’utilisation de la pharmacopée traditionnelle au Cameroun et permettre l'accès aux soins au plus grand nombre.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont de pouvoir identifier une ou plusieurs plantes connues des tradipraticiens au Cameroun et les reconnaitre comme étant efficaces scientifiquement dans le traitement du cancer afin qu’ils puissent mieux traiter les patients qui n’ont pas les moyens de payer le traitement conventionnel.

Procédures

Les souris seront soumises à une injection au niveau de la peau de cellules tumorales (10sec), puis 2fois par semaine à une administration par voie orale du traitement (10secondes) durant maximum 3 semaines. A la fin, les souris seront soumises à une injection au niveau de la peau d'analgésique (10sec).

Impact sur les animaux

Les animaux recevront une injection sous la peau de cellules cancéreuses à J0 puis deux administration par voie orale par semaine. Ils seront manipulés 2 fois par semaine pour le suivi de la croissance tumorale afin de mesurer le volume tumoral. Ces manipulations peuvent engendrer du stress aux animaux. Aussi, la croissance de la tumeur sous la peau peut engendrer une gène pour se déplacer. Il n'y a pas d'effets indésirables attendus sur les animaux traités par les plantes puisque ces plantes sont déjà utilisées chez les hommes.

Devenir

Ils seront mis à mort à la fin de la procédure car ce sera la fin de la procédure expérimentale et cela permettra d'évaluer la croissance tumorale et donc l'efficacité des traitements.

Remplacement

Plusieurs expériences in vitro sont en cours et ont déjà mis en évidence un éventuel effet anti-prolifératif de 4 plantes. En effet, sur les 13 plantes testées in vitro pour le moment, 4 plantes semblent intéressantes.

Réduction

Afin de diminuer le nombre d’animaux au minimum, nous utiliserons 5souris par groupe. Notre modèle expérimental est conçu pour mettre en évidence de manière robuste l'efficacité du traitement et permettre d'obtenir des résultats fiables à partir de 5 animaux seulement. Aussi, afin de diminuer le nombre d'animaux également, nous avons choisi d'effectuer ces expériences uniquement sur des femelles, d'autant plus que nous utilisons une lignée de cancer ovarien et du sein.

Raffinement

Les souris auront une période d'acclimatation de 7 jours minimum. Différents points limites spécifiques ont été défnis et seront surveillés.

Choix des espèces

Il s’agit de souris immunocompétentes (BALB/c) ou C57BL/6 car les 3 lignées de cellules cancéreuses utilisées sont espèce dépendante. Ce type de souris est utilisé largement dans la recherche en cancérologie pour sa capacité à développer des tumeurs après injection des cellules cancéreuses. Les souris seront utilisées à l’âge de 7-8 semaines pour ne pas interférer avec les processus de vieillissement. Cet âge permet aussi d’augmenter le taux de prise de greffe tumorale, ce taux diminue avec l’âge.