Cancers

Irradiées vigiles puis greffées avec des cellules leucémiques par voie intraveineuse, 3400 souris seront toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur décrit pourtant une maladie qui s'installe en quelques semaines, avec amaigrissement, paralysie des membres postérieurs empêchant l'animal de se déplacer et de s'alimenter, prostration et hypothermie. Certaines souris subissent en plus une ponction de moelle osseuse au fémur et des prélèvements sanguins répétés à la joue. L'étude porte sur les raisons de la colonisation d'autres organes par la leucémie aiguë myéloïde, avec des applications cliniques présentées comme lointaines.

Objectifs

Depuis ces dernières années, la recherche biomédicale s’est attachée à explorer « à grande échelle » la complexité liée aux gènes et aux différentes sous-populations de cellules cancéreuses, sans pour autant parvenir à saisir précisément les mécanismes à l’œuvre lors de la propagation des cellules cancéreuses dans l’organisme. Pourtant, celles-ci pourraient acquérir des caractères d’autant plus malins lorsqu’elles migrent d’un organe primaire (l’organe où se développe initialement ce cancer) vers des sites secondaires (organes qui sont colonisés dans un second temps). Pour comprendre si l’infiltration d’un site secondaire peut conférer aux cellules cancéreuses de nouvelles capacités malignes, nous avons choisi comme modèle d’étude la leucémie aiguë myéloïde (LAM) : les cellules leucémiques n’accumulent que peu de mutations (changements au niveau des gènes) et sont capables intrinsèquement de se déplacer dans le sang. Le projet que nous proposons ici cherche à comprendre quel est le bénéfice pour les leucémies aiguës de sortir de la moelle osseuse, site où la pathologie prend initialement place, pour aller infiltrer, non pas aléatoirement, mais bien spécifiquement des organes en particulier, comme le foie, la rate, ou le système nerveux central (SNC) et le cerveau. Nous allons tenter de répondre à ces questions en les considérant sous l’angle – encore peu abordé – de la dimension métabolique (soit la manière dont la cellule choisit de produire de l’énergie qu’elle utilise) et épigénétique (modifications affectant un gène sans en changer sa composition) qui pourrait moduler grandement l’aptitude des blastes leucémiques (cellules leucémiques)à infiltrer les organes à distance.

Bénéfices attendus

Ce projet permet d’interroger les fondements biologiques de l’infiltration blastique (la colonisation d’un organe/tissu par des cellules leucémiques) vers des sites secondaires dans les LAM dont la cause est encore méconnue et qui contribue à l’apparition de cette maladie. Cette connaissance précise permettra d’identifier de nouvelles combinaisons thérapeutiques (association de plusieurs traitements permettant d’avoir un meilleur résultat) avec des chimiothérapies ou thérapies ciblées (médicament qui cible un élément impliqué dans l’apparition ou la progression de la maladie réduisant les effets secondaires) existantes qui pourront alors émerger dans le but d'améliorer la prise en charge et le traitement des patients atteints de LAM.

Procédures

Les animaux vigile (c’est-à-dire non endormis) seront tout d’abord irradiés. L’irradiation, introduction des souris dans une machine à rayon X (semblable à une radiographie),permet d’éliminer les cellules de la moelle osseuse afin de pouvoir injecter en une seule fois les cellules leucémiques par voie intraveineuse dans la veine de la queue (durée de l'injection: 1 min). Des prélèvements de sang au niveau d’une veine de la joue de moins de 1 minute espacés d’au moins 1 semaine (4 au maximum) seront réalisés pour évaluer la prise tumorale et récolter du matériel biologique pour des analyses ultérieures. En cas de non-détection des cellules leucémiques dans le sang périphérique, nous ferons une ponction de cellules au niveau du fémur (durée du prélèvement: 5 minutes; sous anesthésie et analgésie). Une fois l'invasion des cellules cancéreuses établie, les animaux recevront un traitement quotidien de durée variable selon le type de thérapie (injection sur souris éveillée soit dans la cavité abdominale pendant 5 jours et/ou par gavage). De plus, certaines souris recevront un antibiotique soit dans leur alimentation soit dans l'eau de boisson, qui ici joue le rôle d’interrupteur, permettant d’exprimer de molécules capables d'éteindre les gènes.

Impact sur les animaux

Les animaux traités avec les différentes molécules (gavage, intra-péritonéal, intra veineux), greffés (administration de cellules leucémiques) ou prélevés en vue d’examens biologiques pourraient être confrontés à des effets indésirables (stress et/ou perte de poids). Une gêne physique en cas d'administration orale quotidienne peut également survenir. La greffe de cellules leucémiques va, comme attendu, permettre l’établissement de la maladie et donc entrainer au bout de quelques semaines un amaigrissement, une paralysie des membres postérieurs empêchant l’animal d’être mobile et de s’alimenter, une perte d’activité, une prostration, une déshydratation et/ou une hypothermie. De manière plus exceptionnelle, en cas de ponction osseuse (introduction d’une aiguille dans la moelle osseuse pour récupérer de la moelle osseuse), les animaux peuvent ressentir une gêne temporaire au niveau de la mobilité. Très rarement, il peut y avoir également apparition de masses tumorales solides (amas de cellules cancéreuses forment une masse), d’origines leucémiques, dans diverses localisations (organes, tête), à distinguer avec les infiltrats de cellules leucémiques (colonisations des cellules leucémiques d’un tissu donné) sur lesquels ce projet repose et qui ne font pas de masse solide.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélever la moelle osseuse, le foie, la rate et le cerveau afin de définir les caractéristiques des cellules cancéreuses.

Remplacement

Pour comprendre pourquoi les cellules leucémiques sortent de la moelle osseuse pour aller coloniser des organes à distance, des tests chez l’animal sont nécessaires car il n’existe pas de modèles in vitro permettant de reproduire de façon fidèle l’évolution du cancer au sein d’un organisme entier. Bien que certains modèles in vitro (expériences pratiquées au laboratoire sans utilisation d'être vivant) permettent d’obtenir un premier niveau de compréhension, ils ne sont pas suffisants car ils ne tiennent pas en compte de l’environnement des cellules cancéreuses qui peut les influencer. Afin d’appliquer nos résultats au stade clinique chez l’homme, il est indispensable d’avoir des preuves d’efficacité dans des modèles pré-cliniques murins.

Réduction

Le nombre minimum de souris nécessaires par groupe a été établi grâce aux études antérieures du laboratoire et à l’utilisation de tests statistiques appropriés.

Raffinement

En vue de réduire le stress subit par les animaux, le confort des cages sera optimisé par des buchettes en bois que les souris aiment ronger, des tunnels en carton où elles trouvent refuge et des nids en papier. Les animaux seront observés quotidiennement en faisant particulièrement attention aux signes cliniques et comportementaux tels que : niveau d’activité, agressivité, attitude/posture, réaction à la manipulation, toilettage/ consommation alimentaire et hydrique mais aussi des signes mesurables non subjectifs : perte de poids (une première pesée sera réalisé aux 9 eme jours après injection des cellules leucémiques, puis chaque 3 jours), rythme respiratoire, déshydratation (plis de la peau). Suivant la grille de suivi des souris et l’arbre décisionnel préalablement établi. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l'animal, en optimisant le mode et le volume d'injection et la durée de traitement. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée lors des ponctions osseuses car il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à cette procédure. De plus, les études antérieures ont permis de mieux appréhender les points limites (points qui permettent d’éviter une souffrance accrue et ou prolongée de l’animale) et d’établir d’une liste de différents points limites qui seuls ou cumulés vont nécessiter une intervention de l’expérimentateur afin de soulager l’animal. Une décision rapide et raisonnée sera prise pour éviter toute souffrance animale. En effet, si une douleur est constatée un antalgique sera administré à l’animal chaque fois que cela ne compromet pas les résultats attendus de l’expérience, si un antalgique ne peut être administré et/ou n’est pas suffisant à calmer la souffrance de l’animal, une mise à mort de l’animal sera réalisée.

Choix des espèces

Le modèle souris est à la base de la compréhension du développement du cancer chez l’homme. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine (prolifération anormale de cellules sanguines anormales) et aident à comprendre pourquoi les cellules leucémiques sortent de la moelle osseuse pour aller infiltrer des organes à distance. Dans cette étude, nous utiliserons des souris âgées d’environ 6 à 11 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe.

128 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation de 90 secondes sans anesthésie, puis une injection de cellules souches humaines modifiées et des prélèvements sanguins mensuels à la joue, également sans anesthésie. Le porteur reconnaît qu'une prolifération incontrôlée des cellules peut causer perte de poids, diarrhées et souffrance, et prévoit une euthanasie douze semaines après l'injection. Il affirme que la culture in vitro ne reproduit pas le microenvironnement des patients, ce qui rend selon lui la souris "indispensable".

Objectifs

La leucémie aiguë lymphoblastique B est un cancer du sang affectant les lymphocytes B, un type de globule blanc de notre système immunitaire. Nous cherchons à améliorer la prise en charge de certaines leucémies dîtes de haut-risque, puisqu’elles présentent une très mauvaise réponse aux traitement actuels. Nous cherchons à comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans le développement de la cellule leucémique et d’identifier des vulnérabilités exploitables avec des molécules ciblées, dans l’optique de s’éloigner de la chimiothérapie. Afin de mieux comprendre les effets fonctionnels causés par ces altérations, nous voulons les rajouter à des cellules souches humaines. Pour cela, nous allons modifier génétquement ces cellules afin d’induire l’expression des altérations d’intérêt et injecter ces cellules à des souris pour évaluer les conséquences dans un modèle vivant. Nous espérons pouvoir reproduire les conséquences biologiques observées chez les patients et identifier les processus biologiques directement impliqués dans le développement leucémique.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans la transformation des cellules normales en cellules cancéreuses. Ceci devrait nous permettre de trouver un traitement ciblé plus efficace que la chimiothérapie actuelle, et à plus long terme, d’améliorer le devenir de ces patients.

Procédures

Les souris receveuses sont immunodéficientes, modifiées génétiquement afin de présenter un déficit de certaines cellules immunitaires ; ce qui les rend donc plus susceptibles aux infections. Les animaux seront ensuite soumis à une irradiation sans anesthésie de 90 secondes afin de réduire le nombre de cellules sanguines murines et permettre la greffe, survie et prolifération des cellules humaines injectées. Le lendemain, il y aura une injection unique de cellules souches humaines par voie intra-veineuse dans la veine de la queue sans anesthésie. Des prélèvements sanguins seront réalisés une fois par mois au niveau de la veine de la mâchoire, sans anesthésie Ceci permettra de suivre la prise de greffe des cellules injectées et anticiper toute prolifération massive. L’injection et le prélèvement sanguin sont des procédures rapides qui ne durent qu’entre 30s et 1 minute par souris.

Impact sur les animaux

Les procédures réalisées sont rapides et non invasives. Cependant, l’irradiation peut causer des diarrhées et l’injection en elle-même peut causer une douleur brève au niveau du site d’injection. Les cellules souches humaines modifiées peuvent éventuellement causer une prolifération massive des cellules et nous ne pouvons pas anticiper l’effet des altérations étudiées dans les cellules injectées, avec potentiellement une prolifération accélérée. Ceci peut causer une souffrance pour l’animal qui pourra se manifester par une modification du comportement, ou de l’apparence physique en cas de manque de toilettage, le plus souvent la perte de poids et des diarrhées précèderont ces évènements.

Devenir

Afin d’analyser le devenir des cellules humaines modifiées injectées, les animaux seront euthanasiés 12 semaines après leur injection pour permettre la collecte et l’analyse des différents organes tels que la moelle osseuse et la rate.

Remplacement

A ce jour, certains modèles de culture en milieu artificiel (in-vitro) permettent l’étude du développement de la leucémie mais leur pertinence reste partielle car la différenciation in vitro est très artificielle, et ne récapitule pas complétement la différenciation humaine normale. L’utilisation d’un modèle animal assure la présence du microenvironnement complexe récapitulant ce qui se passe chez les patients. Cela rend donc indispensable l’utilisation d’un modèle animal pour conduire des études fonctionnelles et précliniques.

Réduction

Pour ce projet, nous prévoyons 8 groupes d’animaux qui seront injectés avec des cellules différentes. Afin d’obtenir des différences statistiques significatives tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons réalisé une estimation du nombre d’animaux nécessaires et suffisants définie à l’aide d’une analyse statistique. Afin d’obtenir des différences significatives, chaque groupe comptera 4 animaux pour s’assurer d’une bonne reproductibilité ce qui représente au total 32 animaux par expérience qui pourra être répétée au maximum 4 fois. Pour des questions organisationnelles, afin de limiter la taille de l’expérience et de s’assurer de la robustesse des résultats obtenus, nous séparons en 3 répétitions, en anticipant une 4eme en cas de soucis techniques ne permettant pas d’observer de différences statistiquement significatives. L’analyse des résultats obtenus se fera au moyen de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Une surveillance quotidienne visuelle sera réalisée par l’animalier ou l’expérimentateur. Nous serons également attentifs en veillant à ce que tous les animaux soient maintenus autant que possible en groupe et que l’enrichissement du milieu soit adapté, notamment pour les animaux qui se retrouveraient isolés en cours d’expérience. Toutes les cages auront un enrichissement (papier kraft, tunnel, buchette de bois). Les animaux immunodéficents seront hébergés dans des cages ventilées et toutes les manipulations seront réalisées sous hotte afin de limiter tout risque d’infections. Une surveillance clinique hebdomadaire du poids, de l’apparence (pelage, sécrétions, présence de masse tumorale) et du comportement (interactions sociales, posture, mobilité, respiration) sera effectuée par l’expérimentateur dès l’injection des cellules humaines et jusqu’à la fin de la procédure (12 semaines après injection). En cas de détection de certains signes cliniques la surveillance clinique pourra être faite plus fréquemment. Une surveillance biologique mensuelle par prélèvement de sang sera également effectuée afin de détecter une prolifération anormale des cellules injectées. Le suivi des animaux se fera en suivant une grille de points limites définis, suffisamment précoces et prédictifs. Toute souris présentant des signes de souffrance pendant la durée de l’expérience (poil hérissé, prostration, perte de poids, tumeur palpable) sera euthanasiée sans attendre et analysée.

Choix des espèces

Le modèle souris utilisé dans ce projet présente deux avantages : (i) Les souris immunodéficientes sont décrites dans la littérature scientifique depuis de nombreuses années comme étant le meilleur modèle pour greffer les cellules sanguines humaines, et étudier le développement des lymphocytes dans un microenvironnement se rapprochant le plus de la physiologie humaine. (ii) Nous avons une bonne connaissance des signes de douleur et souffrance des souris et donc de leur prise en charge. Les souris seront injectées à partir de 7 semaines, lorsqu’elles auront atteint l’âge adulte, afin de garantir une prise de greffe optimale des cellules sanguines humaines.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules de mélanome enrobées dans du collagène d'âges différents, puis des mesures et des injections de traitement trois fois par semaine sous anesthésie gazeuse pendant une cinquantaine de jours, pour tester si le vieillissement de l'environnement tumoral réduit l'efficacité d'une thérapie ciblée. Le porteur classe la procédure en modérée en raison d'un risque de métastases ou d'ulcération qu'il ne peut exclure. Il affirme que les méthodes in vitro ne prennent pas en compte la complexité d'un organisme et qu'il est "indispensable" de confirmer l'hypothèse sur un modèle vivant.

Objectifs

Le mélanome est le cancer de la peau le plus mortel du fait de son agressivité. Environ la moitié de ces cancers développent une protéine anormale responsable de cette agressivité. De nouvelles thérapies ont été développées, elles ciblent spécifiquement cette protéine anormale afin de bloquer son effet. Elles ont permis d'améliorer la survie globale des patients en stoppant la progression du cancer. L’effet anticancéreux de cette thérapie ciblée est rapide mais, après quelques semaines de traitement la tumeur peut développer une résistance. La résistance à cette thérapie est peu étudiée dans les cancers chez des patients âgés. Pourtant, le facteur vieillissement pourrait être impliqué dans l'échec de la réponse à ces nouvelles thérapies ciblées et, plus précisément, le vieillissement de l’environnement dans lequel se trouvent les cellules cancéreuses. En effet, la peau en vieillissant subit processus naturel qui modifie son organisation et qui pourrait empêcher le bon fonctionnement de la thérapie anticancéreuse. La population âgée étant en constante augmentation, il est indispensable d’évaluer les bénéfices/risques de cette nouvelle thérapie sur des organismes vivants tels que des souris. Les techniques d’étude du vieillissement du collagène en laboratoire se sont améliorées pour s’approcher au mieux de ce qu’il se passe dans le corps humain. Cependant, ces techniques ne tiennent pas compte de la complexité d'un organe ou d'un organisme vivant complet. C'est pourquoi nous devons confirmer nos hypothèses en utilisant des modèles vivants. Notre projet de recherche se concentre sur l'impact du vieillissement sur l'efficacité d'un traitement. Nous avons plusieurs objectifs : d'abord, confirmer que nous pouvons effectuer nos observations sur notre modèle vivant ; ensuite, comprendre comment l'environnement autour des tumeurs change avec l'âge et comment cela affecte leur évolution ; enfin, examiner comment le vieillissement de cet environnement influence la réaction des tumeurs à un traitement médicamenteux.

Bénéfices attendus

Ce protocole est un nouveau modèle d’étude mimant le vieillissement de l’environnement tumoral. En effet si le protocole d'injection de cellules cancéreuses enrobé de collagène a déjà été décrit, l'injection de ces mêmes cellules enrobées dans du collagène de différents âges n'a jamais été réalisée. Le bien-être animal sera amélioré avec un temps d’expérimentation réduit. Ce protocole représente donc une approche innovante dans l’étude de l’efficacité de traitements anticancéreux dans un organisme âgé.

Procédures

Injections des cellules cancéreuses (1 fois, sous anesthésie gazeuse), mesure des tumeurs (3 fois par semaine sous anesthésie gazeuse) , injections pour le traitement tumoral (3 fois par semaine pendant 4 semaines, sous anesthésie gazeuse). L'anesthésie gazeuse 3 fois par semaine pendant maximum 50 jours consiste en un flash anesthésique durant quelques secondes et permettant de réaliser nos mesures et nos injections en diminuant le stress chez la souris.

Impact sur les animaux

L'injection des cellules cancéreuses et l'injection du médicament pour traiter les tumeurs peut entrainer chez les souris de la douleur et du stress. La manipulation pour l’anesthésie peut entrainer du stress. Il n’est pas rapporté d’impact propre à notre protocole d'injection de cellules cancéreuse. Nous utilisons un protocole sans substance irritante ou inflammatoire. Cependant, le nombre d'étude reste relativement pauvre sur le sujet. Le suivi que nous mettrons en place, conforme aux exigences de l’éthique animale sera à même d’identifier de manière précoce le possible impact de notre protocole. Les cellules cancéreuses sont agressives, la procédure a été classée en catégorie modérée du fait d’une possibilité de survenue de métastases ou d'ulcération qui ne peut être exclue. Nous surveillerons ce risque. Les observations mises en œuvre durant la première partie du protocole nous permettront de réduire si justifié la durée de la procédure pour limiter la prévalence de métastases à l’origine de souffrances.

Devenir

L’euthanasie des animaux sera rendue nécessaire car les tumeurs seront prélevées afin d’être analysées. Dans le cas où le traitement anticancéreux administré serait seul efficace (réponse complète), la réutilisation de l’animal ne serait pas possible du fait du traitement préalable et du risque de moindre réponse à un nouveau traitement (source de variabilité inter-individuelle des sujets).

Remplacement

Les méthodes d’étude du vieillissement du collagène en laboratoire se sont perfectionnées afin de rendre les recherches in vitro plus proche de la réalité in vivo. Certaines d’entre elles connues et utilisées dans notre laboratoire ont permis d’obtenir de premiers résultats. Cependant elles ne prennent pas en compte la complexité d’un organe ou d’un organisme et ne peuvent être la méthode unique de remplacement de l’animal. Il est donc indispensable de confirmer notre hypothèse sur des modèles in vivo pertinents.

Réduction

Nous testerons dans un permier temps 2 lignées de souris différentes soit 1 male et 1 femelle par lignée (donc 4 souris). Ceci nous permettra de choisir le type de souris le plus adapté à notre protocole. Ceci s'intègre à terme dans la démarche de réduction. Après validation de la lignée de souris, Un nombre de 8 animaux par groupe sera nécessaire afin de pouvoir interpéter les résultats. Les expérimentations seront réalisées en deux temps, dans un premier temps ce protocole étant très peu réalisé nous souhaitons confirmer son efficacité sur un petit nombre de souris. En cas de résultats concluant dans cette première partie d’expérimentation, 4 lots de 8 souris seront nécessaires afin de répondre au dernier objectif : étude de l’impacte du vieillissement de l’environnement des tumeurs sur la réponse au traitement anti-cancéreux. Ce programme en 2 temps permet de réduire le nombre de souris, et de l’adapter préalablement aux expérimentaitons en fonction des résultats obtenus.

Raffinement

L'hébergement des souris sera adapté à la de lignées des souris (Armoire ventilées) en groupe de 4 stables et harmonieux, nous surveillerons le risque d’agression entre congénères. Les cages seront enrichies en copeaux de papier permettant aux souris de se faire un nid / se cacher. Elles présenteront également des tunnels en carton leur permettant de ronger / se cacher, ainsi qu’un dôme avec une roue leur permettant de se dépenser (mobilité/exercice). Afin de réduire la perte de chaleur due à l’absence de poil, du coton sera ajouté dans la cage et la température de la table de manipulation sera augmentée d’un degré. Les souris seront stabulées en bas du portoir ventilé afin de limiter l’agression lumineuse. Les expérimentations ont été pensées pour être très courtes, permettant de diminuer les risques de chutes de températures et de stress de l’animal. L’injection des cellules cancéreuses, l’injection du médicament et la mesure des tumeurs se feront sous anesthésie gazeuse (flash anesthésie de quelques secondes) ceci permettra de réduire le stress lié à la procédure. La xénogreffe sera réalisée en sous cutanée sur le flanc des souris, ce site d’implantation étant considéré comme causant le moins de stress chez l’animal.

Choix des espèces

Des travaux antérieurs utilisant un protocole proche de celui que nous utiliserons ont été réalisés sur ces souris, ce qui justifie l’utilisation de cette espèce. Le traitement que nous allons tester a déjà été utilisé chez ces souris, aucun effet indésirable n’a été montré. Ces souris ont une éspérance de vie courte (8 à 9 mois), ce qui ne permet pas d’étudier le vieillissement naturel, mais qui justifie notre modèle. A notre connaissance il n’existe pas d’autre modèle animal rongeur adapté à ce protocole. Les tumeurs étudiées sont de tumeurs de l’adulte, c’est pourquoi dans le but de se placer dans conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité clinique, les souris seront âgées de 8 semaines ce qui correspond à un stade adulte. C’est l'âge de l’environnement qui sera injecté avec les cellule cancéreuses qui reproduira le vieillissement de l'environnement autour de la tumeur.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales puis jusqu'à trois injections de virus oncolytiques modifiés, avant un prélèvement de tumeurs et d'organes. Le porteur indique surveiller d'éventuels effets auto-immuns et fixe des points limites détaillés, dont une tumeur pouvant atteindre 1000 mm³. Il décrit disposer de cultures en trois dimensions et de puces microfluidiques, mais affirme que l'étude des effets sur "l'organisme entier" impose le recours à l'animal.

Objectifs

Les virus "oncolytiques" sont de nouveaux agents thérapeutiques capables de détruire spécifiquement les cellules tumorales sans attaquer les cellules saines. Deux virus oncolytiques sont actuellement approuvés comme traitements contre le mélanome métastatique (cancer de la peau) et le glioblastome (cancer du cerveau). Les virus oncolytiques présentent trois modes d’actions principaux, à savoir la capacité à 1) tuer directement les cellules tumorales, 2) induire une réponse immunitaire anti-tumorale et 3) vectoriser des protéines thérapeutiques qui seront produites uniquement dans les tumeurs. Cette dernière propriété fait actuellement l’objet de nombreuses recherches au niveau international mais des questions importantes demeurent quant aux protéines à utiliser et aux conditions dans lesquelles les virus doivent être administrés in vivo. Notre projet vise ainsi à étudier, chez la souris immunocompétente, les effets thérapeutiques de virus oncolytiques codant pour différentes protéines impliquées dans la formation de structures lymphoïdes. Ces structures sont constituées de cellules immunitaires et permettent la mise en place de réponses anti-tumorales. Si les virus oncolytiques donnent des résultats très encourageants in vitro, l’évaluation des différents mécanismes impliqués requiert l'utilisation de modèles animaux vivants qui reproduisent la physiologie des tumeurs et les réponses immunitaires associées avant d'envisager un transfert vers la clinique.

Bénéfices attendus

Les efforts réalisés pour comprendre la biologie des tumeurs ainsi que l’amélioration continuelle des traitements tels que la chimiothérapie, la radiothérapie, et plus récemment l’immunothérapie ont déjà permis d’augmenter la survie des patients atteints de cancers. Cependant, dans de nombreux cas ces traitements présentent une efficacité limitée. De nouvelles molécules thérapeutiques potentiellement très efficaces nécessitent une vectorisation appropriée pour profiter de leur efficacité tout en limitant les effets secondaires. Il a ainsi été montré qu’une vectorisation des agents anti-cancéreux permettait de diminuer la morbidité associée au traitement mais aussi d’en améliorer l’efficacité et de limiter l’établissement d’une résistance dans les cellules tumorales. Ce type de stratégie thérapeutique est d’autant plus intéressant dans le cas de cancers très agressifs pour lesquels nous ne disposons pas encore d’options thérapeutiques satisfaisantes. L’utilisation de virus oncolytiques pour vectoriser des molécules au sein même des tumeurs est une approche innovante destinée à répondre à ces problématiques. En créant de nouveaux virus oncolytiques immunoactivateurs, nous espérons pouvoir apporter des réponses thérapeutiques à des problèmes actuels en cancérologie.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections sous-cutanées de cellules tumorales puis à des injections intraveineuses, intra-péritonéales et/ou intra-tumorales répétées de traitements. Chaque injection durera une trentaine de secondes, à raison d'un maximum de 4 injections (1 challenge + 3 traitements) par animal.

Impact sur les animaux

Nous avons préalablement pu vérifier que l’injection de virus oncolytiques aux doses prévues n’entraîne pas de morbidité particulière ou de douleur chez les animaux. Concernant les protéines thérapeutiques codées par ces virus, il s’agit de cytokines et chimiokines connues. Les données de la littérature suggèrent que des effets secondaires auto-immuns pourraient être observés. Une attention particulière sera apportée au suivi de ces effets éventuels (peau, intestin et foie notamment). Chacune des procédures nécessitera la réalisation d'injections intraveineuse, intra-péritonéales et/ou intra-tumorales qui peuvent être à l'origine d'une douleur légère et générer un stress modéré et ponctuel chez les animaux. Dans toutes les procédures, l'établissement et la croissance des tumeurs pourra aussi générer des douleurs qui seront détectées précocement grâce aux points limites préalablement établis pour chaque procédure.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour prélever des échantillons (tumeurs, rate, ganglions, autres tissus) qui serviront à obtenir des données supplémentaires sur ces expérimentations.

Remplacement

Notre laboratoire a développé au cours des dernières années des systèmes de culture in vitro complexes (sphéroïdes, puces microfluidiques) qui nous permettent de nous affranchir de l'utilisation d'animaux pour une majorité de nos expériences. L'approche sur organisme entier nous permet cependant d’évaluer l’effet thérapeutique des virus et de leurs transgènes mais également les effets toxiques potentiels sur divers tissus tels que le compartiment hématopoïétique par exemple. Une telle complexité n’est malheureusement pas encore reproductible in vitro. Dans la mesure où nous souhaitons étudier le ciblage in vivo des cellules tumorales dans un environnement complexe après administration des virus oncolytiques, ces expériences nécessitent d’être réalisées sur l’animal. Nous avons déjà validé la spécificité de nos virus sur un large panel de lignées cellulaires, en 2D et en 3D. Cependant, ces expériences ne permettent pas de présumer de la biodistribution réelle et des effets systémiques de nos traitements une fois injectés dans un organisme, en particulier les effets immunitaires.

Réduction

Les différents paramètres mesurés seront comparés par des tests statistiques adaptés aux très petits échantillons (n

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages ventilées (5 souris maximum par cage) en milieu enrichi (copeaux de litière, lambeaux de papier) dans des salles à température et hygrométrie contrôlées. Les litières sont changées chaque semaine par le personnel qualifié de l’animalerie. Toutes les procédures prévues dans ce projet sont de classe modérée. L’utilisation d’antalgiques morphiniques n’est pas envisagée car les animaux seront immédiatement euthanasiés en cas d’absence de réponse au traitement ou d’atteinte d’un point limite. Des points limites adaptés à l’espèce utilisée ont été prévus pour chaque procédure. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel zootechnique et les expérimentateurs. En cas d’atteinte d’un des points limites suivants un signalement sera fait au responsable de la SBEA ainsi qu’au responsable de l’étude ou à son suppléant. Les animaux seront alors euthanasiés directement afin de prévenir toute douleur au stade le plus précoce possible et d’éviter la collecte de données altérées en raison d’un stress chez les animaux. •Critères cliniques : - Mauvais état du pelage (diminution du toilettage, poil ébouriffé, perte excessive de poils, plaies) - Faciès contracté et position anormale des vibrisses - Yeux clos et larmoyant - Gonflement abdominal pouvant être causé par l’accumulation de liquide d’ascites en raison des tumeurs - Fèces liquides ou absence de fèces - Taille de tumeur égale ou supérieure à 1000mm3 •Critères comportementaux : - Position recourbée (dos voûté, prostration) - Diminution de la mobilité interférant avec l’activité de base de l’animal (alimentation, toilettage) - Réduction de l’activité, isolement - Signes de stress (hyper-sensibilité aux bruits, agressivité, stéréotypie) •Critères zootechniques - Perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids initial de l’animal ou comparativement au poids moyen des individus soumis au même protocole expérimental

Choix des espèces

L’objectif principal étant d’évaluer les effets immunitaires de nos nouveaux virus oncolytiques, l’utilisation de souris immunocompétentes et de modèles tumoraux syngéniques est essentielle. L’implantation sous-cutanée des cellules tumorales se justifie par le suivi facilité de la croissance tumorale et la comparaison avec les données de la littérature qui utilisent des approches similaires. Nous utiliserons des animaux âgés de 7 à 10 semaines (jeunes adultes). Le stade de développement est justifié par la nécessité d'avoir des animaux adultes ayant un système immunitaire mature.

1584 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome sous la peau, puis des injections de traitement trois fois par semaine sur animal vigile, la tumeur étant laissée croître jusqu'à un volume défini, avec perte de poids, altérations cutanées et nécroses possibles. Le porteur cherche à re-sensibiliser des mélanomes résistants au moyen d'une molécule ciblant le cuivre, ces validations étant présentées comme "indispensables" à un développement clinique. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit des interactions aussi complexes.

Objectifs

Le mélanome est un cancer très agressif qui risque fortement de développer des métastases, au niveau du foie ou des poumons par exemple. Si il est découvert assez tôt, le mélanome peut se soigner en retirant la partie cancéreuse par chirurgie. En revanche, si des métastases sont déjà présentes lors du diagnostic, le pronostic est souvent mauvais et il est alors nécessaire de traiter de manière systémique, c’est-à-dire sur tout le corps, afin de tuer les cellules de la tumeur d’origine ainsi que les métastases. En termes de traitements, il existe deux familles de médicaments qui sont utilisés aujourd’hui pour traiter le mélanome métastatique, les thérapies ciblées et les immunothérapies. Les thérapies ciblées, dont fait partie le PLX4032, (aussi appelé le Vemurafenib), sont utilisées en première intention et sont efficaces mais seulement chez les 50% de patients qui présentent une mutation spécifique (B-Raf). Cependant, après une période de traitement, le mélanome va se modifier pour devenir résistant au traitement, ce qui va entrainer une rechute. L'autre famille de traitements utilisés est l'immunothérapie, dont font partie les inhibiteurs de point de contrôle ou anti-PD1. Ils sont également utilisés pour traiter les patients atteints de mélanomes métastatiques et fonctionnent en interférant avec le système immunitaire pour induire la mort des cellules cancéreuses mais entrainent cependant une réponse positive dans seulement 10 à 30% des cas. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes cellulaires qui entrainent l’apparition de résistance aux traitements actuellement sur le marché. Pour cela nous étudierons une nouvelle molécule qui interfère avec les changements cellulaires induits par la résistance aux traitements dans le but que le traitement redevienne efficace afin d’éviter les rechutes. L’idée de ces expériences est de traiter la combinaison de cette nouvelle molécule avec les traitements utilisés aujourd’hui afin d’observer une resensibilisation des cellules de mélanome envers ces traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une validation in vivo, chez la souris, des observations faites in vitro, sur la capacité d'une molécule ciblant le cuivre ainsi que d’autres inhibiteurs du métabolisme du cuivre, à re-sensibiliser les cellules de mélanomes résistantes aux thérapies ciblées. Il permettra également de vérifier les effets de ces drogues dans le contexte du système immunitaire et d’évaluer leurs rôles dans la résistance aux immunothérapies. Ces validations sont indispensables pour envisager un développement clinique de nos approches thérapeutiques (inhibiteurs en association avec les thérapies ciblées ou les immunothérapies) et permettre d’ajouter une nouvelle ligne de traitement aux patients atteints de mélanomes résistants aux traitements déjà existants.

Procédures

Les souris seront toutes injectées en une fois en sous-cutané (sous la peau) sur le flanc avec des cellules de mélanome (humaines ou murines). Après observation de la croissance tumorale, les souris sont traitées trois fois par semaine avec les différents produits décrits, par injection intra-péritonéale (au niveau de l'abdomen) en alternant les côtés à chaque injection. La durée de traitement sera définie par la croissance tumorale et l’expérience sera arrêtée lorsque la tumeur aura atteint un volume défini. Ces interventions ne nécessitent pas d’anesthésie et seront effectuées sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous seront très attentifs. Au niveau des expérimentations spécifiquement, les nuisances que subiront les animaux seront des contentions pour injecter les cellules tumorales ou les traitements, ainsi que des injections sous cutanées pour les cellules ou des injections intra-péritonéales (dans l'abdomen) pour les traitements. En ce qui concerne la croissance tumorale, la présence de la tumeur grossissante sur le flanc de la souris pourra être une nuisance. La croissance de la tumeur pourra entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance (poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, prostration), ainsi que des altérations visibles de la peau (nécrose…). L’injection des traitements pourra également entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose...).

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de procéder à l’analyse des tissus et cellules récupérés de la tumeur formée ou des éventuelles métastases.

Remplacement

Pour ces expériences, il n'est pas possible de s'affranchir de l'utilisation de souris car il n'existe pas de méthodes alternatives qui permettent de reproduire des interactions physiologiques aussi complexes. Les études in vitro que nous avons réalisées dans un premier temps ont montré l’efficacité de la molécule ciblant le cuivre dans la resensibilisation de cellules de mélanome résistantes aux traitements utilisés aujourd'hui chez des patients.

Réduction

En termes de réduction, le nombre d'animaux nécessaires à cette étude a été déterminé à l'aide d'un test statistique indiquant la quantité minimale d’animaux qui permet d’observer une différence significative. Pour la réalisation de ce projet, il faudra 1584 souris. L'utilisation de ces animaux sera optimisée en prélevant les tumeurs, les métastases et les organes (comme le foie, la rate ou les poumons) pour des analyses histologiques et biochimiques ultérieures.

Raffinement

En termes de raffinement, les souris seront hébergées à plusieurs par cage avec un environnement enrichi (igloo) au sein de l’animalerie et surveillées quotidiennement. L'expérience ne commence qu'après une semaine d'acclimatation à l'animalerie et d'habituation aux expérimentateurs. Les souris seront observées trois fois par semaine par les demandeurs du projet afin de prendre en charge tout signe de douleur, de stress ou d’inconfort. Les manipulateurs sont en possession du niveau opérateur ou concepteur qui permet d’avoir une bonne vision et une excellente capacité à détecter les problèmes de santé, stress ou malaise. Le suivi est régulier et s'effectue par des méthodes non invasives (mesure des tumeurs sous cutanées au pied à coulisse, pesée des animaux régulières). Des points limites précis sont définis dans chaque procédure ainsi que la démarche à effectuer en fonction du point limite observé tels que la désinfection d'une plaie ou le changement des points d'injection en cas de gêne ou signes d'infections par exemple.

Choix des espèces

La souris est un mammifère ayant des similitudes avec l’homme. Elle a un cycle de vie court, un cycle de reproduction bien établi ainsi qu’une petite taille ce qui permet d’avoir des conditions d’hébergement plus faciles. Les deux modèles de souris que nous utiliserons dans ce projet sont commercialisés, bien connus et de nombreuses études ont déjà été réalisées à partir de ces modèles. Pour les procédures expérimentales, les souris sont utilisées au stade adulte (7 semaines). Elles sont commandées à 6 semaines, puis l’expérience commence après une semaine d’acclimatation à l’animalerie. Ceci est scientifiquement cohérent avec les expériences déjà faites dans l’équipe et les données de la littérature.

2000 souris et 200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une greffe de cellules tumorales, des traitements répétés par voies orale, intraveineuse ou intracardiaque, des prélèvements de sang et de moelle osseuse, et pour certains une mesure de mécanique pulmonaire par trachéotomie sous anesthésie profonde avant euthanasie. Le porteur prévoit une cinquantaine d'études sur cinq ans pour évaluer des médicaments anticancéreux sur des cancers disséminés, en admettant que les modèles alternatifs in vitro restent "marginaux" et difficilement transposables. Le développement tumoral peut provoquer perte de poids, difficultés locomotrices et respiratoires, la mise à mort étant déclenchée à des points limites définis.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux. En 2020, quelques 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer disséminés déjà mis en place ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la maladie humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour les traiter. Ces modèles permettront d’étudier des nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte physiologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une réelle évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers disséminés de type leucémie ou bien le développement des métastases chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques sur des leucémies ou des métastases. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera ainsi possible d’étudier dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme : -les mécanismes de dissémination des métastases, -les mécanismes d’évolution des leucémies, -les mécanismes de résistance à des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, - l’impact du développement de métastases pulmonaires sur les paramètres ventilatoires fonctionnels (pléthismographie) Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

Induction tumorale sous anesthésie (moins de 10 minute s, généralement unique, mais pourra être répétée pour vérifier que la thérapie administrée peut empêcher des récidives). Si necessaire,en fonction de des cellules tumorales : transport vers le site où est réalisée l’irradiation (une seule fois, 5 heures aller, 5 heures retour). Pose d’un implant Sous Cutané (une seule fois, 1 heure). Test de composés chimiques, biologiques ou traitement par rayons ionisant administrés sous anesthésie générale (moins de 10 minutes) . Administration orale, intraveineuse, intrapéritonéale et sous cutanée sous contention sans anesthésie (moins de 10 minutes). Ces administrations peuvent être uniques ou répétées, comme peut l’être la prise de médicament chez le patient. Pesée des animaux (moins de 10 minutes) Prélèvements de sang potentiellement répétés en respectant les volumes maximum tolérés : -Prélèvements peu invasifs sous anesthésie générale (moins de 1 minute). -Prélèvement par piqûre à la veine caudale et marginale de la patte sous anesthésie, possible sous contention (moins de 3 minutes). -Prélèvements potentiellement répétés de moelle osseuse sous anesthésie (moins de 5 minutes). -Recueil d’urine individuel (potentiellement répété, avec isolement (moins d’une heure)). Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, des mesures de paramètres mécaniques pulmonaires pourront être réalisées. Cette mesure impliquera la réalisation d’une trachéotomie. La mesure prendra environ 15 minutes avant l'euthanasie.

Impact sur les animaux

Les gestes techniques suivants induiront un stress léger à l’animal : -Transport vers le site où est réalisée l’éventuelle irradiation ou l’éventuelle imagerie ou l’éventuelle radiothérapie -Pose d’un implant Sous Cutané -Induction tumorale par IV -Traitements -Suivi des animaux par imagerie (sous anesthésie) Les gestes suivants induiront une douleur plus marquée. -Les traitements par voie intramusculaire/intradermique -Induction en intraartérielle et intracardiaque. Si nécessité d’incision Au début de l’étude, les animaux seront randomisés. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress léger. La prise de mesure des animaux (poids) induira un stress pouvant être considéré comme faible qui diminuera avec l’habituation Les prélèvements de sang en cours d’expérience induiront un stress plus important chez l’animal : -Prélèvements de sang par ponction dans une veine. -Prélèvements de sang sous contention. -Prélèvement de moelle osseuse Les prélèvements de moelle osseuse pourraient générer des fractures dans de rares cas (point limite). Le développement tumoral induira une perte de poids, des difficultés locomotrices. En cas de développement de métastases pulmonaires, des difficultés respiratoires pourraient éventuellement apparaître. Concernant les mesures de paramètres mécaniques par ventilation forcée, elles impliqueront une trachéotomie, donc l’anesthésie inclura l’administration de buprénorphine et un alpha-2 agoniste. Par ailleurs, elles seront réalisées sous anesthésie profonde et suivies d’une euthanasie sans réveil.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort afin de collecter de grands volumes de sang et les organes pertinents.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais restent toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Nous prévoyons environ 50 études sur 5 ans. Le nombre d’animaux utilisés est le plus faible possible en fonction des objectifs de l’étude et de la puissance statistique nécessaire. Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations des paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individuelles. L’analyse statistique sera effectuée au moyen d’un test d'analyse de la variance (ANOVA). Près de 10 études sont réalisées chaque année , mais le nombre peut varier en fonction des demandes. Une étude peut être composée de 1 (dans le cas d’un développement d’un nouveau modèle) à 20 groupes. Le nombre d’animaux par groupe varie généralement entre 6 et 15 par dose de produit, ce nombre sera adapté en fonction de la connaissance interne du modèle ou en fonction des études réalisée dans la littérature. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal. En général, en oncologie et du fait de la randomisation, le nombre d’animaux greffés est supérieur au nombre d’animaux utilisés randomisés dans chaque groupe. Pour les modèles disséminés ce nombre d’animaux surnuméraire est réduit à un maximum de 10% (pour 100 animaux, 110 seront greffés). Au-delà, une dérogation sera demandée et le modèle sera expertisé pour évaluer si plus de 10% des animaux sont réellement nécessaires. Dans tous les cas, il sera recommandé l’utilisation d’un minimum d’animaux surnuméraires La taille des groupes nécessaires pour obtenir des modifications statistiquement significatives de paramètres mécaniques pulmonaires ou de saturation en oxygène sera optimisée suite à des études pilotes utilisant ces technologies. En première approximation, 10 animaux par groupe seront utilisés, s’agissant du nombre qui a été déterminé pour les mesures similaires dans d’autres modèles. S’agissant d’une mesure terminale, s’il est nécessaire d’évaluer la mécanique pulmonaire à plusieurs points de temps, un groupe d’animaux par point de temps sera constitué.

Raffinement

Les procédures techniques sur les animaux seront réalisées selon les standards validés par la SBEA. Toutes les procédures seront réalisées par des techniciens formés et dont les compétences ont été validées. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Chaque animal sera observé quotidiennement. Les animaux présentant des signes de douleur ou de souffrance seront suivis et des antalgiques pourront être prescrits. Dans la mesure du possible, les animaux seront achetés déjà irradiés. Cependant, dans ce cas, la période d’acclimatation devra être réduite à 24h minimum, avec implantation dans les 24-72h suivant l’irradiation. Pour les traitements dont l’administration est douloureuse (Intradermique, intramusculaire), les animaux recevront une antalgie adaptée. L’induction en intraartérielle et intracardiaque se fera sous anesthésie En cas d’ouverture chirurgicale, une administration de buprénorphine (30 minutes avant minimum) sera prévue. Les injections intracardiaques seront accompagnées d’une analgésie (alpha2 agoniste et un opiacé).. Des soins opératoires (maintien de la température) seront apportés, et feront l’objet d’une surveillance et de soins post opératoires adaptés. Les injections/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations de la SBEA en termes de volume, fréquence et antalgie. Ces prélèvements seront réalisés sous anesthésie avec l’analgésie appropriée (administration d’anti-inflammatoires non-stéroïdiens et/ou d’antalgiques opiacés/alpha-2 agoniste). Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal permettant d’atteindre l’objectif de l’étude plus tôt et de sortir l’animal de la procédure. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. A partir de 10% de perte de poids, la fréquence de pesée sera augmentée pour tous les animaux et un scoring sera mis en place. Dans toutes les cages, un gel nutritif sera rajouté, la quantité de nourriture en fond de cage sera augmentée. Chaque animal avec une perte de poids de 10% sera réhydratés. Les scores cliniques les plus élevés constitueront des points limites, ainsi que l’accumulation de scores intermédiaires (cf procédure). Les pertes de poids élevées ou prolongées constitueront un point limite. Des points limites adaptés et prédictifs permettant de limiter la souffrance des animaux sont indiqués dans les procédures.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines (modèles xénogéniques) dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (6 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’injection des cellules tumorales. Les animaux adultes pourront mieux supporter les effets secondaires des composés à tester. Les effets du développement tumoral sera plus facilement supporté par des animaux adultes.

756 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe des tumeurs pancréatiques humaines, puis on injecte des molécules par la veine de la queue avant de les mettre à mort pour prélever tumeurs et organes, afin de tester un traitement à base d'ARN transporté par un dendrimère. Le porteur suit la taille des tumeurs et prévoit une mise à mort dès qu'un point limite est atteint. Il affirme avoir essayé des approches cellulaires en deux et trois dimensions sans pouvoir se passer de l'animal, invoquant l'étude au sein d'un "organisme entier", les retombées contre ce cancer restant conditionnées à l'efficacité du modèle.

Objectifs

Le cancer du pancréas est un cancer de très mauvais pronostique. A l’heure actuelle, il n’existe pas de traitement efficace, et l’espérance de vie du patient excède rarement 6 mois. L’urgence à laquelle la recherche est confrontée nous a amené à développer le traitement personnalisé à base de l’ARN, car l'utilisation de petits ARN interférents (siARN) et de petits ARN d'activation (saARN) pour réguler l’expression des oncogènes et des gènes suppresseurs de tumeur émerge comme un traitement précise, offrant une thérapie efficace et personnalisée.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est l’évaluation et la validation d’un nouveau traitement pour le cancer du pancréas, une maladie de très mauvais pronostic sans traitement efficace à ce jour. Si notre stratégie thérapeutique se révèle efficace sur ce modèle tumoral, nous pourrions envisager de tester cette approche sur d’autres cancers résistants à la chimiothérapie classique ou à la radiothérapie, ou sur d’autres maladies pour lesquelles il n'existe pas de traitement efficace.

Procédures

Pour atteindre les objectifs de ce projet, les souris seront étudiées pour la biodistribution et l’efficacité anti tumorale après injection intraveineuse, dans la veine de la queue, de molécules fluorescentes sous anesthésie générale. À terme, les souris seront mises à mort afin de prélever le sang, les tumeurs et les organes.

Impact sur les animaux

Les souris seront sous anesthésie générale par gaz lors de l'implantation des tumeurs afin de faciliter la manipulation tout en réduisant le stress et la douleur des animaux. Les animaux recevront, si nécessaire, un antidouleur. L’efficacité et la toxicité de des combinaisons seront étudiées en mesurant les tailles des tumeurs, les poids et les comportements des souris. À terme, les souris seront mise à mort afin de prélever le sang, les tumeurs et les organes pour l’analyse biochimique et histologique

Devenir

Les animaux seront mise à mort sous anesthésie générale à la fin de cette étude ou lorsqu’un des points limites suscités sera atteint (voir annexe I). Le sang et les tumeurs seront prélevées, tout comme le cœur, le foie, la rate, les poumons, les reins, le pancréas et le cerveau afin de chercher des lésions éventuelles sur ces organes.

Remplacement

Dans le respect de la règle des 3R et concernant le remplacement, nous avons tenté d'utiliser toutes les méthodes substitutives possibles notamment les approches cellulaires 2D et 3D, mais nous ne pouvons pas nous passer du recours à l’animal pour l’étude de l’efficacité et la bio-distribution de nos traitements. Au vu de la complexité du cancer du pancréas, l’utilisation de souris immunodéficientes, qui sont des modèles bien établis en cancérologie expérimentale et ont fait l’objet de plusieurs milliers de publications, est justifiée et ne peut être remplacée pour plusieurs raisons. Le fait que ces souris ai un système immunitaire diminué facilite la prise de la greffe de cellules tumorales pancréatique humaine, et limite le phénomène de rejet. De plus, l’utilisation de ces modèles de souris immunodéficientes permettent le maintien des caractéristiques moléculaires, histologiques, phénotypiques et génotypiques des tumeurs pancréatiques d’origine, ce qui ne peut pas être obtenu in vitro. Ces souris nous permettront d’étudier au sein d’un organisme entier l’efficacité et la bio-distribution de nos nanomédicine, et obtenir des résultats fiables représentatifs de la tumeur d’origine.

Réduction

Concernant la réduction dans le respect de la règle des 3R, nous réduirons le nombre d’animaux grâce à l’utilisation de tests statistiques permettant d’optimiser la taille des effectifs. Nous n'utiliserons que le nombre d’animaux nécessaires pour l'exploitation statistiques des données. Le nombre de souris de chaque groupe a été calculé avec un test statistique de t de Student. En conséquence, des effectifs de 8 individus par groupe devraient permettre d’obtenir des résultats statistiques fiables pour l’évaluer l’efficacité, et des effectifs de 5 individus par groupe pour étudier la bio-distribution de chaque, soit sur chaque modèle de tumeur, il faut 12 groupes de 8 souris (en total 96 souris) pour l’évaluer l’efficacité de chaque nano-médicine, et 6 groupes de 5 souris (en total 30 souris) pour étudier la bio-distribution de chaque combination. Le nombre total d’animaux pour ce projet est estimé à 756 souris : 576 souris pour évaluer l’efficacité (procédure 1) et 180 souris pour la bio-distribution (procédure 2) sur les ensembles de 6 modèles de cancer pancréas primaire.

Raffinement

Dès réception, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation de 10 jours pendant laquelle ils seront familiarisés à la manipulation par les expérimentateurs. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux. Dans chaque cage, nous mettons plusieurs types d’enrichissement (rouleaux de papier, dôme de cellulose, carrés de coton, etc.) ; les litières sont changés toutes les semaines ; de petits groupes sociaux sont constitués afin d'éviter le stress de l’isolement (groupe de 5 souris pour une cage de 530cm²) ; La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum Les souris sont endormies sous anesthésie gazeuse Vetflurane pour tous les actes qui pourraient générer de la douleur (implantation de tumeurs), puis mises sous une lampe chauffante et surveillées jusqu'à leur réveil. Un contrôle quotidien des souris sera effectué en plus d'un contrôle approfondis bihebdomadaire de l'état clinique de nos animaux sera réalisé́, d’avantage si leurs états le nécessitent, Une grille de score a été mise en place pour évaluer les signes de souffrance, identifier les points limites et indiquer la conduite à tenir en fonction de l’état de santé de l’animal.

Choix des espèces

Pour mener à bien notre projet, nous avons besoin d’une espèce de mammifère dépourvu de système immunitaire pour éviter les phénomènes de rejets des greffes de tumeurs humaines. Ces souris qui sont des modèles bien étbalies en cancérologie expérimentale et qui ont fait l’objet de plusieurs centaines de publications, permettent le maintien des caractéristiques moléculaires des tumeurs, et, d’étudier au sein d’un organisme entier la stabilité des agents thérapeutiques. De plus, la souris est facilement manipulable, de par sa petite taille, d’une utilisation simple et peu couteuse, ce qui fait un modèle expérimental de choix pour notre projet.