Cancers

273 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un fragment de tumeur ovarienne humaine leur est greffé sous la peau, puis celles qui développent une tumeur subissent une ponction intracardiaque avant la mise à mort et le prélèvement de la tumeur. Le porteur indique que la tumeur peut s'ulcérer, provoquer une perte de poids ou une gêne au déplacement, la mise à mort intervenant quand elle dépasse 12 mm. Il affirme le recours à la souris "indispensable" faute de modèle alternatif, tout en annonçant que les tumeurs entretenues sur ces souris serviront ensuite à démontrer l'intérêt des organoïdes tumoraux.

Objectifs

Les cancers de l’ovaire restant particulièrement meurtriers du fait de leur capacité à développer une résistance aux chimiothérapies conventionnelles (association carboplatine/paclitaxel), le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques susceptibles de surmonter la chimiorésistance constitue un enjeu majeur pour l’amélioration de leur prise en charge. Il est donc indispensable de s’appuyer sur des modèles expérimentaux qui représentent de façon pertinente la pathologie afin d’identifier et valider de nouvelles cibles thérapeutiques, évaluer de nouveaux médicaments et leurs biomarqueurs associés, ainsi qu’étudier les mécanismes de résistance. Il existe donc un réel besoin de s’appuyer sur des modèles expérimentaux capable de refléter au mieux la situation chez les patientes atteintes de cancer de l’ovaire. Il est maintenant largement reconnu que les tumeurs dérivées de patients ou patient-derived tumor xenografts (PDXs) sont très proches de la tumeur du patient et constituent les modèles de référence dans l’industrie pharmaceutique. Ces modèles sont obtenus en implantant des morceaux de tumeurs de patients chez des souris avec un système immunitaire déficient pour permettre la croissance de la tumeur, puis la tumeur est maintenue in vivo par passage successifs de souris en souris. L’objectif de ce projet est de finaliser l’établissement d’un panel de modèles de PDX (22 sont déjà établis et 13 sont en cours d’établissement) afin de pouvoir disposer d’une cohorte représentative de l’hétérogénéité intra- et intertumorale de la maladie.

Bénéfices attendus

Nous attendons de ce projet en premier lieu qu’il permette de mettre en place un panel de PDX de cancer de l’ovaire qui puisse être utilisé pour les différents projets de recherche du laboratoire. Ces modèles seront utilisés pour tester l’efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques identifiées par le laboratoire, permettre l’évaluation de leur biodistribution et de leur toxicité, et identifier/valider des biomarqueurs (dans le sang ou dans la tumeur). Ces modèles seront aussi pour démonter l’intérêt de nouveaux modèles alternatifs tels que les organoïdes tumoraux.

Procédures

Un petit fragment tumoral de cancer de l’ovaire sera implanté en sous-cutané sur un nombre maximal de 273 souris immunodéprimées sous anesthésie générale et après administration d’un dérivé morphinique (analgésie). La plaie est refermée ensuite à l’aide de 3 agrafes. Cette procédure est très rapide (5 minutes maximum). Pour les animaux développant une tumeur, une ponction intracardiaque sous analgésie morphinique et anesthésie profonde sera réalisée préalablement à la collecte de la tumeur et à l’euthanasie de l’animal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables potentiels à la suite de l’implantation de fragment tumoraux humains sont : le développement d’un abcès (assez rare en raison de la localisation de tumeur d’origine et de l’expertise du laboratoire dans la réalisation de la chirurgie), la cachexie (perte de poids liée à la tumeur qui est limitée puisque les souris seront euthanasiées dès lors que la tumeur atteindra un diamètre de 12 mm x 12 mm), la formation de métastases (peu fréquentes dans le cadre d’implantations sous-cutanées), ou l’ulcération de la tumeur.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie jusqu’au développement d’une tumeur atteignant la taille éthique. En cas d’absence de pousse tumorale après 12 mois, les animaux sont euthanasiés.

Remplacement

Le recours au modèle animal est indispensable dans le cadre de notre étude puisqu’à l’heure actuelle, il n’existe pas de modèle alternatif pertinent permettant l’évaluation de la toxicité, de la biodistribution et de l’efficacité de traitements anticancéreux innovants.

Réduction

Afin d’éviter d’avoir à maintenir les tumeurs sur les souris, des fragments de tumeurs prélevées après euthanasie des animaux seront congelés au fur et à mesure pour permettre de futures réimplantations. Un test de décongélation sera réalisé 2 mois après congélation de fragments tumoraux afin de valider la bonne cryopréservation de ces échantillons. Par ailleurs, à plus long terme, ces modèles pourront être utilisés pour démontrer la pertinence de modèles aternatifs tels que les organoïdes tumoraux, des microtumeurs cultivées dans des boites, étant donné que plusieurs modèles de PDXs et organoïdes tumoraux ont été établis à partir de la même tumeur de patiente. De plus, les molécules à tester pourront être présélectionnés en premier lieu sur les organoïdes tumoraux appariés avant de passer chez l’animal pour réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans une animalerie nude dédiée à raison de 3 souris par cage. Les cages sont insérées dans un portoir ventilé, permettant le maintien d’un statut sanitaire exempt d’organismes opportunistes et pathogènes et d’éviter l’apparition d’infections. Les souris peuvent s’accrocher à la grille de nourriture, aux tétines de biberons, à des balançoires et grimper sur un rebord dans la cage. Les animaux sont hébergés dans des cages avec de la litière en copeaux de peuplier à laquelle y est ajoutée différents matériaux pour permettre aux animaux de confectionner un nid. Des batonnets à ronger et des tunnels en cartons sont également mis à disposition des animaux. Les conditions de cet hébergement répondent aux normes de la directive européenne 2010-63. La surveillance des animaux est réalisée quotidiennement (7J/7) et 2 fois par jour pendant la période critique : 2 jours suite à l’implantation afin de vérifier le comportement de l’animal. Concernant la procédure chirurgicale (implantation de fragments tumoraux), les souris seront injectées avec un analgésique (dérivé de la morphine) afin de réduire la douleur péri- et post-opératoire. Une anesthésie générale est ensuite réalisée lors de l’implantation sur une table chauffante. Le réveil des souris s’effectue sous lampe rouge afin d’éviter la baisse de température de l’animal. Pour les animaux développant une tumeur, une ponction intracardiaque sous analgésie morphinique et anesthésie profonde sera réalisée préalablement à la collecte de la tumeur et à l’euthanasie de l’animal. Une inspection détaillée et quotidienne de chaque animal est effectuée afin d’observer le comportement et les symptômes cliniques de l’animal. Une souffrance visible liée au développement tumoral (poids tumoral supérieur à 10% du poids de la souris, diamètre supérieur à 12 mm, ulcération de la tumeur ou gêne au déplacement/motricité) est considérée comme point limite. De même, une détresse caractérisée par une perte de poids supérieure à 15% ou une prostration de l’animal sont considérées comme des points limites.

Choix des espèces

L’implantation de cellules tumorales d’origine humaine n’est possible que chez des animaux immunodéprimés ; les souris immunodéprimées sont fréquemment utilisées dans ce type d’étude. Nous avons préalablement comparé différentes souches de souris et constaté que les souris nude de 4 semaines permettait une prise tumorale optimale (en termes de délai de prise tumorale et d’homogénéité entre les animaux).

Implantées de cellules de glioblastome dans le crâne, 864 souris immunodéficientes reçoivent ensuite deux à trois injections de lymphocytes T humains, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyser leur cerveau. Deux des trois voies d'injection testées passent par une nouvelle chirurgie intracrânienne de vingt-cinq minutes. Le porteur attend des douleurs post-opératoires, une cicatrisation difficile, une perte de masse musculaire, un comportement qu'il qualifie de névrotique, de l'agressivité, de la prostration et un penchement de la tête. Après une première phase sur 324 souris, la voie retenue sera appliquée à 540 souris supplémentaires.

Objectifs

Les glioblastomes sont les tumeurs du cerveau les plus fréquentes, affectant 3 personnes sur 100 000. Elles sont caractérisées par leur grande agressivité, et leur résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique conduit à une survie inférieure à 15 mois chez la moitié des patients atteints. La mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques est donc primordiale. Les immunothérapies, basées sur l’exploitation du système immunitaire du patient, sont extrêmement prometteuses dans le traitement des glioblastomes, et contribuent au développement actuel de nouvelles thérapies. Dans ce projet, nous nous intéressons a une sous-population spécifique de cellules immunitaires, appelés lymphocytes T γδ Vδ2 négatifs, qui a déjà montré son potentiel pour le traitement de différents cancers, mais n’a pas été exploitée jusqu’ à présent pour le traitement des glioblastomes. Nous avons effectué de nombreuses expériences préliminaires in-vitro montrant que ces lymphocytes T sont capables d’éliminer des cellules cancéreuses provenant de tumeurs cérébrales de patients. Néanmoins, pour compléter ces études in-vitro, il nous faut valider et approfondir les résultats, notamment en déterminant si les lymphocytes T γδ Vδ2 négatifs sont capables d’infiltrer et d’éliminer durablement les tumeurs de cerveau dans un organisme vivant (in-vivo), et ce en utilisant des modèles animaux. L’objectif de cette étude est donc de mettre en évidence les propriétés anti-glioblastome de ces lymphocytes T γδ in-vivo, pour permettre ensuite leur utilisation en essais cliniques.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d’améliorer la connaissance fondamentale des propriétés anti-tumorales de cette sous-population de cellules immunitaires, les lymphocytes T γδ Vδ2 négatifs. Il nous permettra notamment de mieux comprendre comment ces cellules peuvent atteindre la tumeur, la reconnaitre spécifiquement, et l’éliminer. D’autre part, ce projet constituera la première évaluation de l’efficacité de cette thérapie cellulaire chez des organismes vivants. Cette évaluation préliminaire est nécessaire avant tout développement d’essai clinique chez les patients atteints de glioblastome. Ainsi, si les résultats obtenus dans ce modèle sont satisfaisants, on s’attend à des bénéfices sur le long terme en essais cliniques et plus généralement pour la prise en charge des patients atteints de glioblastomes. Améliorer la survie de ces patients est actuellement un enjeu de santé public majeur.

Procédures

La totalité des animaux de ce projet (864 souris) seront soumis à une procédure chirurgicale unique d’implantation intracrânienne de cellules de glioblastome. Cette chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale plus locale, sur une durée de dix minutes par souris. Suite à cette chirurgie, la taille des tumeurs sera suivie par une méthode d’imagerie non invasive, qui dure 20 minutes environ, et sera réalisée 2 fois par semaine, entre le jour 0 et le jour 28 d’expérimentation (post-implantation). Suite à l’implantation de cellules de glioblastome, les animaux seront injectés 2 à 3 fois par la thérapie cellulaire de lymphocytes T (aux jours 7 puis 14 puis après implantation). Cette injection sera faite selon trois procédures différentes. Les deux premières seront des procédures chirurgicales d’implantation intracrânienne de lymphocytes T, soit au niveau de la tumeur, soit au niveau du ventricule, réalisées sous anesthésie générale plus locale, sur une durée de 25 minutes par souris. La troisième procédure d’injection sera intraveineuse. Ces trois méthodes d’injection de lymphocytes T concerneront chacune 108 souris dans un premier temps (324 souris au total). Puis, dans un second temps, la méthode associée au meilleur bénéfice pour les souris sera sélectionnée, et concernera alors 540 souris supplémentaires.

Impact sur les animaux

Suite à l'implantation dans le cerveau des souris de cellules de glioblastome puis de lymphocytes T, les effets indésirables suivants peuvent être attendus : des douleurs post-opératoires, des points sautés suite à la chirurgie, une cicatrisation difficile, un comportement anormal (dont agressivité, perte de masse musculaire, comportement névrotique, prostration), ou encore un penchement de la tête. Par ailleurs, sur la durée totale des expérimentations, une perte de poids des animaux peut être attendue.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, toutes les souris concernées par ce projet (864 animaux) devront être euthanasiées pour permettre l'analyse de leur cerveau et ainsi l'étude des lymphocytes T injectés et du bénéfice apporté par cette thérapie sur la progression de la tumeur et la survie des souris.

Remplacement

La capacité des lymphocytes T utilisés ici à éliminer des cellules tumorales de glioblastomes issues de différents patients a déjà été démontrée in vitro, posant ainsi de solides bases pour cette étude in vivo. L’utilisation de ce modèle animal répondra uniquement aux questions ne pouvant être élucidées in vitro, notamment en déterminant si les lymphocytes T peuvent migrer jusqu’à la tumeur, l’infiltrer, éliminer les cellules tumorales et améliorer significativement la survie des souris.

Réduction

Grâce à des analyses bioinformatiques et statistiques, nous utiliserons le minimum nécessaire d’animaux pour être statistiquement significatifs et scientifiquement irréprochables. Par ailleurs, un suivi longitudinal de la croissance des tumeurs sera effectué par imagerie, ce qui permettra de réduire le nombre de souris par groupe expérimental. Enfin, nous utiliserons toutes les femelles et tous les mâles issus de croisements, ce qui réduit de 50% l’utilisation des animaux.

Raffinement

Afin de respecter la notion de raffinement, et éliminer ou réduire toute douleur, souffrance, angoisse, ou tout dommage durable susceptible d’être infligé aux animaux, leur bien-être sera pris en compte quotidiennement de leur naissance à leur mort et évalué par le personnel zootechnique expérimenté. Notamment, afin de réduire les douleurs liées aux chirurgies d'implantation de tumeurs et aux procédures de transfert de lymphocytes T, des protocoles analgésiques et antalgiques seront mis en place. Un suivi quotidien des animaux permettra aussi de prévenir leur affaiblissement et de prendre une décision rapide quant à leur sacrifice. Enfin, le suivi non invasif de la croissance des tumeurs par imagerie participera à maximiser le bien-être animal.

Choix des espèces

Un modèle de souris (Mus musculus) immunodéficientes est utilisé. Leur système immunitaire ne possède pas de lymphocytes. Ce modèle présente un double intérêt pour ce projet : -Les tumeurs de glioblastomes issues de patients s’y développent de manière très reproductible, permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés. Ce modèle est très pertinent d’un point de vue préclinique, car les tumeurs y reconstituent les caractéristiques complexes observées chez les patients humains. - Ce modèle immunodéficient permet le transfert de lymphocytes T humains sans que ceux-ci ne soient rejetés par le système immunitaire de la souris receveuse. Nous utiliserons des souris âgées de 7 à 9 semaines, qui permettent une croissance tumorale optimale en s’affranchissant de l’affaiblissement d’individus plus âgés.

Pour tester des nanoparticules poreuses censées porter des gaz et des médicaments jusqu'aux tumeurs, 1 692 souris et 504 rats sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous mis à mort pour prélever leurs organes. Une partie reçoit une implantation de cellules tumorales dans le cerveau sous anesthésie, puis trois séances d'irradiation de 4 Gy et des injections intraveineuses trois jours de suite. Le porteur s'attend à une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux porteurs d'une tumeur cérébrale, ainsi qu'à une dégradation de l'état général jusqu'à une semaine après l'irradiation du crâne, avec pelades sur la tête et sécrétions au museau. Il justifie le projet par le "besoin d'améliorer" des thérapies dont il constate le manque d'efficacité, et présente le nombre annoncé comme un maximum susceptible d'être réduit si les seuils statistiques sont atteints plus tôt.

Objectifs

Ce projet a pour but de caractériser l’intérêt de nanoparticules (NPs) poreuses comme vecteur de thérapies (gazeuses et médicamenteuses) pour les tumeurs hypoxiques, décrites dans la littérature comme résistantes aux traitements actuels. En effet, un meilleur ciblage de la tumeur par ces NPs permettrait d’améliorer l’efficacité des traitements actuels tels que la radiothérapie (RT), les chimiothérapies (CT) ou encore les immunothérapies (IT). Devant le manque d’efficacité des thérapies standards, ce projet se justifie par le besoin d’améliorer, par des approches innovantes, les thérapies actuelles.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est une amélioration des stratégies thérapeutiques actuelles en utilisant comme vecteur des NPs qui ont montré, par nos études précédentes, leur capacité à s’accumuler dans la tumeur tout en préservant le tissu sain environnant .

Procédures

Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - Chirurgie (implantation cérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale) : 30 minutes maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal. - Injection intraveineuse de cellules tumorales (animal vigile) : 1 fois à l’injection des cellules ; 5 minutes maximum par animal. - Injection sous-cutanée de cellules tumorales (animal vigile) : 1 fois à l’injection des cellules ; 5 minutes maximum par animal. - Injection intraveineuse des NPs (animal vigile) : 3 fois sur 3 jours consécutifs ; 5 minutes maximum par animal. - Injection intraveineuse des CT ou IT (animal vigile) : 3 fois sur 3 jours consécutifs ; 5 minutes maximum par animal. - Irradiation (sous anesthésie générale) : 3 séances de 4 Gy sur 3 jours consécutifs : 10 minutes maximum par animal. - Injection sous-cutanée de buprénorphine (animal vigile) : 1 fois avant la mise à mort pour tous les animaux et 3 fois pour les animaux avec des tumeurs cérébrales qui auront deux injections supplémentaires en péri-opératoire ; 2 minutes maximum par animal.

Impact sur les animaux

Parmi les procédures expérimentales, les injections intraveineuses (cellules tumorales, NP, CT ou IT) ou les injections sous-cutanées effectuées sur un animal vigile peuvent causer un stress à l'animal lors de l'intervention, ce qui peut être considéré comme une nuisance légère. De plus, au regard de l’expérience du laboratoire concernant les différentes procédures expérimentales, nous nous attendons à avoir des effets indésirable modérés avec une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de tumeur cérébrale. Également, sur ces modèles de tumeur cérébrale, nous nous attendons à une fatigue et une dégradation de l’état général (porphyrine autour des yeux et de la bouche, sécrétions au niveau du museau, pelades sur la tête) induit par l'irradiation cérébrale jusqu’à une semaine après l’irradiation.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour prélèvement d'organes.

Remplacement

Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, c'est-à-dire qu’au-delà du simple compartiment de la cellule tumorale existent la vascularisation, l’hypoxie et l’inflammation qui influent fortement sur la cellule tumorale. L’utilisation de modèles in vivo complets permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et à la réponses aux différents traitements. Ce projet intervient après plusieurs étapes de validation in vitro ayant permis de retenir les meilleures NPs (taille, aspect de toxicité, oxygénation) mais ne peut pas s’effectuer intégralement sur des modèles de remplacement in vitro ou in silico.

Réduction

L’utilisation des méthodes d’imagerie non invasive et des modèles de tumeur sous-cutanés se conforment à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité d’euthanasier plusieurs animaux à chacun des temps. Chaque animal est dans ce cas son propre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. Toutefois, dans tous les protocoles d’imagerie, d’irradiation, les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane, non sans risque pour l’animal. Afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques, nous estimons qu’au minimum, 12 animaux par groupe au départ sont nécessaires afin de réaliser des tests statistiques puissants, et ainsi comparer les effets des différents traitements et ce, en fonction du temps. Ces 12 animaux sont calculés sur la base d’un test de puissance connaissant la variabilité intrinsèque des modèles tumoraux basés sur nos travaux antérieurs. Il est important de noter ici que le nombre d’animaux calculés est un nombre maximal. En effet, les expériences seront réalisées par plusieurs lots et si les seuils statistiques sont atteints alors le protocole sera stoppé.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux (4 souris par cage et 3 à 2 rats par cage) dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation de 7 jours minimum avant toutes expérimentations et bénéficierons également d’enrichissement (roue d’activité, tunnel en carton, stimulation sensorielle par différents objets). Les animaux seront surveillés de leur arrivée à la fin du protocole par un personnel compétent afin de déterminer leur état (poids, apparence physique) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée quotidiennement pendant les phases critiques (implantation, irradiation) et 3 fois par semaine par la suite. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents. Pour les animaux immunodéprimé, la procédure est identique à l’exception de l’hébergement. En effet, les animaux sont placés dans des cages ventilées individuellement par des portoirs spécifiques, ces deniers étant eux-mêmes dans une zone spécifique et dédiée à la manipulation des animaux immunodéprimés pour la recherche en cancérologie.

Choix des espèces

La souris et le rat immunodéprimés sont des espèces de choix pour évaluer l’évolution du volume tumoral dans le temps dès lors que les cellules tumorales utilisées sont d’origine humaine. Notre expertise des différents modèles de tumeurs cérébrales, nous a permis d’établir que suivant le type cellulaire, nous obtenons des tumeurs plus ou moins hypoxiques et plus ou moins vascularisés (Corroyer-Dulmont et al., Biol Chem. 2013). Ces deux composantes, influençant la croissance tumorale et l’efficacité des traitements actuels, il est nécessaire de travailler avec ces différents modèles in vivo, afin de se rapprocher de la situation clinique. Lorsque les cellules tumorales (cérébrales et pulmonaires) sont d’origine murine (issues de souris C57Bl/6) alors nous pouvons utiliser des animaux immuno-compétents de même souche (souris C57Bl/6) dans ce projet afin de prendre en compte l’ensemble du système immunitaire et le contexte inflammatoire du micro-environnement étudié et connus pour participer à la réponse aux traitements. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes, mâles et femelles, âgés de 8 à 12 semaines en début de protocole. Cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. De plus, à ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps longs. Cet âge leur confère également une résistance aux protocoles expérimentaux utilisés.

Irradiées vigiles puis greffées avec des cellules leucémiques par voie intraveineuse, 3400 souris seront toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur décrit pourtant une maladie qui s'installe en quelques semaines, avec amaigrissement, paralysie des membres postérieurs empêchant l'animal de se déplacer et de s'alimenter, prostration et hypothermie. Certaines souris subissent en plus une ponction de moelle osseuse au fémur et des prélèvements sanguins répétés à la joue. L'étude porte sur les raisons de la colonisation d'autres organes par la leucémie aiguë myéloïde, avec des applications cliniques présentées comme lointaines.

Objectifs

Depuis ces dernières années, la recherche biomédicale s’est attachée à explorer « à grande échelle » la complexité liée aux gènes et aux différentes sous-populations de cellules cancéreuses, sans pour autant parvenir à saisir précisément les mécanismes à l’œuvre lors de la propagation des cellules cancéreuses dans l’organisme. Pourtant, celles-ci pourraient acquérir des caractères d’autant plus malins lorsqu’elles migrent d’un organe primaire (l’organe où se développe initialement ce cancer) vers des sites secondaires (organes qui sont colonisés dans un second temps). Pour comprendre si l’infiltration d’un site secondaire peut conférer aux cellules cancéreuses de nouvelles capacités malignes, nous avons choisi comme modèle d’étude la leucémie aiguë myéloïde (LAM) : les cellules leucémiques n’accumulent que peu de mutations (changements au niveau des gènes) et sont capables intrinsèquement de se déplacer dans le sang. Le projet que nous proposons ici cherche à comprendre quel est le bénéfice pour les leucémies aiguës de sortir de la moelle osseuse, site où la pathologie prend initialement place, pour aller infiltrer, non pas aléatoirement, mais bien spécifiquement des organes en particulier, comme le foie, la rate, ou le système nerveux central (SNC) et le cerveau. Nous allons tenter de répondre à ces questions en les considérant sous l’angle – encore peu abordé – de la dimension métabolique (soit la manière dont la cellule choisit de produire de l’énergie qu’elle utilise) et épigénétique (modifications affectant un gène sans en changer sa composition) qui pourrait moduler grandement l’aptitude des blastes leucémiques (cellules leucémiques)à infiltrer les organes à distance.

Bénéfices attendus

Ce projet permet d’interroger les fondements biologiques de l’infiltration blastique (la colonisation d’un organe/tissu par des cellules leucémiques) vers des sites secondaires dans les LAM dont la cause est encore méconnue et qui contribue à l’apparition de cette maladie. Cette connaissance précise permettra d’identifier de nouvelles combinaisons thérapeutiques (association de plusieurs traitements permettant d’avoir un meilleur résultat) avec des chimiothérapies ou thérapies ciblées (médicament qui cible un élément impliqué dans l’apparition ou la progression de la maladie réduisant les effets secondaires) existantes qui pourront alors émerger dans le but d'améliorer la prise en charge et le traitement des patients atteints de LAM.

Procédures

Les animaux vigile (c’est-à-dire non endormis) seront tout d’abord irradiés. L’irradiation, introduction des souris dans une machine à rayon X (semblable à une radiographie),permet d’éliminer les cellules de la moelle osseuse afin de pouvoir injecter en une seule fois les cellules leucémiques par voie intraveineuse dans la veine de la queue (durée de l'injection: 1 min). Des prélèvements de sang au niveau d’une veine de la joue de moins de 1 minute espacés d’au moins 1 semaine (4 au maximum) seront réalisés pour évaluer la prise tumorale et récolter du matériel biologique pour des analyses ultérieures. En cas de non-détection des cellules leucémiques dans le sang périphérique, nous ferons une ponction de cellules au niveau du fémur (durée du prélèvement: 5 minutes; sous anesthésie et analgésie). Une fois l'invasion des cellules cancéreuses établie, les animaux recevront un traitement quotidien de durée variable selon le type de thérapie (injection sur souris éveillée soit dans la cavité abdominale pendant 5 jours et/ou par gavage). De plus, certaines souris recevront un antibiotique soit dans leur alimentation soit dans l'eau de boisson, qui ici joue le rôle d’interrupteur, permettant d’exprimer de molécules capables d'éteindre les gènes.

Impact sur les animaux

Les animaux traités avec les différentes molécules (gavage, intra-péritonéal, intra veineux), greffés (administration de cellules leucémiques) ou prélevés en vue d’examens biologiques pourraient être confrontés à des effets indésirables (stress et/ou perte de poids). Une gêne physique en cas d'administration orale quotidienne peut également survenir. La greffe de cellules leucémiques va, comme attendu, permettre l’établissement de la maladie et donc entrainer au bout de quelques semaines un amaigrissement, une paralysie des membres postérieurs empêchant l’animal d’être mobile et de s’alimenter, une perte d’activité, une prostration, une déshydratation et/ou une hypothermie. De manière plus exceptionnelle, en cas de ponction osseuse (introduction d’une aiguille dans la moelle osseuse pour récupérer de la moelle osseuse), les animaux peuvent ressentir une gêne temporaire au niveau de la mobilité. Très rarement, il peut y avoir également apparition de masses tumorales solides (amas de cellules cancéreuses forment une masse), d’origines leucémiques, dans diverses localisations (organes, tête), à distinguer avec les infiltrats de cellules leucémiques (colonisations des cellules leucémiques d’un tissu donné) sur lesquels ce projet repose et qui ne font pas de masse solide.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélever la moelle osseuse, le foie, la rate et le cerveau afin de définir les caractéristiques des cellules cancéreuses.

Remplacement

Pour comprendre pourquoi les cellules leucémiques sortent de la moelle osseuse pour aller coloniser des organes à distance, des tests chez l’animal sont nécessaires car il n’existe pas de modèles in vitro permettant de reproduire de façon fidèle l’évolution du cancer au sein d’un organisme entier. Bien que certains modèles in vitro (expériences pratiquées au laboratoire sans utilisation d'être vivant) permettent d’obtenir un premier niveau de compréhension, ils ne sont pas suffisants car ils ne tiennent pas en compte de l’environnement des cellules cancéreuses qui peut les influencer. Afin d’appliquer nos résultats au stade clinique chez l’homme, il est indispensable d’avoir des preuves d’efficacité dans des modèles pré-cliniques murins.

Réduction

Le nombre minimum de souris nécessaires par groupe a été établi grâce aux études antérieures du laboratoire et à l’utilisation de tests statistiques appropriés.

Raffinement

En vue de réduire le stress subit par les animaux, le confort des cages sera optimisé par des buchettes en bois que les souris aiment ronger, des tunnels en carton où elles trouvent refuge et des nids en papier. Les animaux seront observés quotidiennement en faisant particulièrement attention aux signes cliniques et comportementaux tels que : niveau d’activité, agressivité, attitude/posture, réaction à la manipulation, toilettage/ consommation alimentaire et hydrique mais aussi des signes mesurables non subjectifs : perte de poids (une première pesée sera réalisé aux 9 eme jours après injection des cellules leucémiques, puis chaque 3 jours), rythme respiratoire, déshydratation (plis de la peau). Suivant la grille de suivi des souris et l’arbre décisionnel préalablement établi. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l'animal, en optimisant le mode et le volume d'injection et la durée de traitement. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée lors des ponctions osseuses car il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à cette procédure. De plus, les études antérieures ont permis de mieux appréhender les points limites (points qui permettent d’éviter une souffrance accrue et ou prolongée de l’animale) et d’établir d’une liste de différents points limites qui seuls ou cumulés vont nécessiter une intervention de l’expérimentateur afin de soulager l’animal. Une décision rapide et raisonnée sera prise pour éviter toute souffrance animale. En effet, si une douleur est constatée un antalgique sera administré à l’animal chaque fois que cela ne compromet pas les résultats attendus de l’expérience, si un antalgique ne peut être administré et/ou n’est pas suffisant à calmer la souffrance de l’animal, une mise à mort de l’animal sera réalisée.

Choix des espèces

Le modèle souris est à la base de la compréhension du développement du cancer chez l’homme. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine (prolifération anormale de cellules sanguines anormales) et aident à comprendre pourquoi les cellules leucémiques sortent de la moelle osseuse pour aller infiltrer des organes à distance. Dans cette étude, nous utiliserons des souris âgées d’environ 6 à 11 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe.