Cancers

50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever les tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après greffe de cellules cancéreuses sous la peau, chaque animal reçoit jusqu'à quatre traitements par ultrasons sous anesthésie, susceptibles de provoquer une brûlure au niveau de la tumeur, plus des injections d'immunothérapie et un gavage d'hormonothérapie. Le projet teste si les ultrasons désorganisent l'environnement de la tumeur pour rendre le traitement plus efficace dans un cancer du sein. Les bénéfices sont annoncés pour la santé humaine "à long terme" et "en cas de succès".

Objectifs

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez les femmes dans le monde. L’hormonothérapie est un traitement efficace du cancer du sein mais pas pour tous les types de cancer ni pour toutes les patientes. L’environnement de la tumeur semble être responsable de cet échec. Il est proposé ici d’utiliser les ultrasons pour désorganiser cet environnement tumoral et permettre à un traitement combiné hormonothérapie et immunothérapie de pouvoir atteindre la tumeur de manière plus efficace.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. Ce projet permettra par la suite que la stratégie ultrasons + traitement anti cancéreux soit testée en clinique. En cas de succès, ce serait une réelle avancée en termes de prise en charge des patientes atteints de cancer du sein.

Procédures

- une injection sous cutanée au niveau du flanc gauche, 30 secondes maximum - 4 traitements par ultrasons maximum 15 minutes sous anesthésie à raison d’un par semaine - 4 injections intrapéritonéales d'immunothérapie à raison d’un par semaine dans l’abdomen, 30 secondes - 4 injection sous cutanée d’antidouleur dans l’abdomen (30 secondes) - Au maximum 8 pesées et mesures de la taille de la tumeur (1 min) à raison de deux par semaine – 5 gavage d’hormonothérapie, 30 secondes.

Impact sur les animaux

Une perte de poids peut être envisagée (cumul de la pousse tumorale et des traitements). Une injection de cellules en sous cutané entrainant une croissance de tumeur peut rarement entrainer une gêne à la locomotion. Les injections intrapéritonéales hebdomadaires vont entrainer du stress (contention) et une douleur à l’injection. Le suivi tumoral au pied à coulisse sera réalisé sur les animaux en contention et donc générera du stress et éventuellement une douleur au niveau de la tumeur. Les animaux seront soumis à une anesthésie générale gazeuse et un traitement aux ultrasons une fois par semaine, les ultrasons pouvant induire une brûlure au niveau de la tumeur. Le traitement avec l’immunothérapie et l'hormonothérapie n’ont pas montré jusqu’à présent d’effets indésirables chez la souris (pas de réaction auto-immune).

Devenir

Suite à la procédure les animaux en études seront mis à mort pour les prélèvements de tumeurs pour analyses

Remplacement

Plusieurs informations ont été données via des études culture de cellules : les effets des ultrasons sur l’élasticité de la tumeur, amélioration de la diffusion de drogue après traitement aux ultrasons. Les paramètres de traitement aux ultrasons ont été évalués par simulations informatiques. Cependant, les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes (la rate, les ganglions), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité). L’étude de l’efficacité de la combinaison ultrasons et immunothérapie ne peut se faire qu’au niveau de la tumeur dans son micro-environnement et avec ses interactions avec l’organisme entier.

Réduction

Les procédures seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de façon statistiquement fiable. Le calcul du nombre d’animaux a été déterminé par un outil statistique et les résultats seront interprétés grâce à des tests statistiques. Cela nous a permis de déterminer qu'il nous faudra 8 animaux par groupe en suivi de l'efficacité et de la survie.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x)manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en leur faisant une contention une fois par jour pendant 5 jours. Les expérimentateurs sont expérimentés et sont à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. L’état général des souris sera aussi suivi et annoté dans le cadre de l’expérimentation. Tous les animaux seront mis à mort au plus tard 60 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a pas été atteint avant ce délai. Par ailleurs, le personnel animalier inspecte quotidiennement les animaux et renseignent une grille de suivi basé sur des critères comportementaux (activité, isolement…), physiques (poils hérissés, dos vouté…) qui permettent de détecter rapidement une souffrance ou l’atteinte d’un point limite. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour se cacher et se reposer). En prévision d’éventuelles brûlures cutanées à cause de la cavitation, les souris recevront une injection d’antalgique au préalable du traitement aux ultrasons. Pour les composés administrés en gavage, des sondes de gavage flexibles et à usage unique seront utilisées.

Choix des espèces

La souris est la plus petite espèce qui développe des tumeurs suffisamment grosses pour être traitées par ultrasons. La souche est choisie car nous avons besoin d’animaux présentant un système immunitaire compétent. La souris immunocompétente est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs murines représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Nous avons choisi des souris âgées de 6 semaines au moment de l’implantation du modèle, car d’une part la prise tumorale est meilleure sur les individus jeunes, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux à utiliser. D’autre part, le traitement débutera entre 7-8 semaines, 7 semaines étant l’âge auquel leur système immunitaire est mature, et donc actif.

40 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans d'autres études après une période de repos. Sous anesthésie générale, chaque animal peut subir jusqu'à cinq fois sur deux ans des prélèvements de moelle osseuse, de liquide cérébrospinal, des lavages broncho-alvéolaires ou des prises de sang. L'objectif est de fournir du matériel biologique de primate pour mettre au point des techniques d'analyse. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal, la proximité des primates avec l'humain étant présentée comme sans équivalent.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mettre à disposition de la communauté scientifique du matériel biologique de primate (liquide cérébrospinal, échantillons pulmonaires ou de moelle osseuse, accompagnés ou non de prélèvement sanguin), qui ne peut être collecté que sous anesthésie générale des animaux. Ces prélèvements sont nécessaires à la mise au point de techniques d'analyses sur ces échantillons, à la sélection d'animaux sur certains critères physiologiques, ou encore à la réalisation de test in vitro afin d’appréhender la toxicité ou l'efficacité d’un produit, au lieu de ou avant de le tester chez l’animal. Ce projet vise donc à pouvoir prélever certains échantillons biologiques de primate sous anesthésie, dans le but de réaliser des tests préliminaires ou en remplacement d'études in vivo sur cette espèce.

Bénéfices attendus

Tout test de matériel biologique obtenu lors de protocoles expérimentaux utilisant l'animal nécessite au préalable d'être mis au point, affiné, voir validé selon un certain cadre réglementaire. Ces mises au point nécessitent elles-mêmes l'utilisation de matériel biologique, qui doit être obtenu sur la même espèce. Beaucoup de tests sont basés sur des produits sanguins, mais certains nécessitent d'autres matrices biologiques plus difficile d'accès, comme la moelle osseuse, le liquide cérébrospinal ou les lavages pulmonaires. La moelle osseuse pourrait par exemple être utilisée dans le cadre de la mise au point d'un test visant à caractériser les cellules progénitrices du sang, pour le développement d'une thérapie contre des maladies héréditaires. Le liquide cérébrospinal pourrait être utilisé pour mettre au point une méthode de mesure d'un produit injecté dans le sang d'un patient, pour évaluer sa capacité à passer dans le cerveau. Cela peut avoir des implications pour évaluer la potentielle neurotoxicité d'un produit, ou au contraire sa capacité à atteindre le cerveau pour lutter contre des maladies neurodégénératives. Finalement, les lavages pulmonaires permettent d'avoir accès à du liquide et à des cellules de poumons, sans pour autant sacrifier l'animal : cela permettrait d'étudier le microbiote pulmonaire d'animaux, ou encore d'utiliser ces échantillons pour mettre au point des méthodes d'investigation de virus pulmonaires comme le SARS-CoV-2 (ex: PCR). Ces prélèvements sous anesthésie de matrices biologiques spécifiques pourront potentiellement être accompagnés de prélèvements sanguins dans la limite des recommandations de volume et fréquence pour l'espèce. Ces prélèvements de sang pourront être réalisés seulement s'il est jugé scientifiquement ou éthiquement pertinent de les faire sur le même animal plutôt que sur une cohorte différente. Dans certains cas, ces échantillons pourraient être utilisés pour réaliser des tests in vitro remplaçant l'utilisation de l'animal, comme par exemple dans le cadre de tests de toxicité d'un produit sur les cellules progénitrices de la moelle. Dans ce contexte, les différents prélèvements réalisés sont nécessaires pour mettre au point ou améliorer des méthodes d'analyses existantes. Ce projet contribuera donc à réduire le nombre d’animaux utilisés en étude, en permettant le développement de méthodes d'analyses plus fines ou de test in vitro remplaçant l'animal lors de phases expérimentales précoces.

Procédures

Les animaux seront manipulés afin de réaliser une injection d’anesthésique. Les procédures se déroulent entièrement sous anesthésie générale. Les animaux pourront être soumis à une parmi les 4 procédures différentes, chacune nécessitant entre moins d’une minute et trois minutes . Les prélèvements possibles seront : prélèvement de moelle osseuse, prélèvement de liquide cérébrospinal, lavage broncho-alvéolaire et prélèvements sanguins. Le temps entre l’induction de l’anesthésie de l’animal et son réveil est d’environ 1h.

Impact sur les animaux

Le prélèvement de liquide cérébro-spinal est réalisé sous anesthésie. Une légère gêne au lieu de ponction peut être ressentie au réveil par l’animal. Le lavage broncho-alvéolaire peut provoquer une gêne chez l'animal suite à l'administration de liquide dans les poumons. De plus, dans le cadre de ce protocole, les prélèvements seront par définition ponctuels et donc non répétés dans le temps. Le prélèvement de moelle osseuse peut quant à lui provoquer des douleurs au niveau de la zone de prélèvement. ire un hématome sur la zone de prélèvement.

Devenir

Après une période de repos adéquate, les animaux seront disponibles pour intégrer d'autres études, sur avis vétérinaire.

Remplacement

Il n'est pas possible de remplacer l'animal dans le cadre de ce projet. L'utilisation de celui-ci est indispensable afin d'obtenir le matériel biologique nécessaire à la mise au point, la calibration et la validation de méthodes d'analyses biologiques. Ces méthodes visent en effet directement les cellules de l'espèce animale concernée (cytométrie en flux, tests de stimulation de cellules immunitaires, caractérisation de l'expression de certains gènes…), ou peuvent être fortement influencées par le milieu biologique dans lequel elles sont réalisées (mesure de la quantité d'un anticorps ou d'une protéine exogène par ELISA ou spectroscopie de masse). Le raffinement de ces méthodes d'analyses sert d'une part à transférer des protocoles d'analyses d'une espèce à l'autre, et à améliorer leurs sensibilité et spécificité, réduisant ainsi potentiellement le nombre d'animaux nécessaires lors d'études subséquentes. De plus, la disponibilité de matériel biologique permet de la réalisation d'étude d'efficacité ou de toxicité in vivo, qui pourront potentiellement permettre de remplacer ou réduire le besoin d'études in vivo.

Réduction

Afin de ne pas surestimer le nombre d'animaux utilisés, le nombre d’animaux pour ce projet a été défini par une analyse rétrospective des prélèvements de liquide cérébrospinal et de prélèvements pulmonaires fait au sein de l’entreprise au cours des dernières années, modulée par la trajectoire de croissance de notre activité . Afin d’assurer un nombre minimum d’animaux, les animaux pourront être prélevé un maximum de 5 fois sur une période de 2 ans dans le cadre de cette DAP.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux (mâles et femelles hébergés séparément) sur de la litière pour leur permettre de fourrager. Des jouets sont mis à leur disposition (rotation des jouets une fois par semaine). Des friandises sont distribuées quotidiennement aux animaux (après les manipulations et fin de journée) dans la litière et dans des dispositifs à friandises (tube, jouets...). Les fruits et légumes frais qui leurs seront fournis seront variés d'un jour à l'autre, tout comme la façon de les préparer, afin de stimuler les animaux. Un fond musical sera diffusé dans l'animalerie tout au long de la journée afin d'habitue les animaux à la voix humaine et de masquer les sons liés à l'utilisation quotidienne de l'animalerie. Toutes les procédures décrites dans ce protocole auront lieux sous anesthésie, accompagnées de mesures de soutien en fonction de la procédure en question. Par exemple, les prélèvements de moelle osseuse ou de liquide cérébrospinal seront précédés d'injection d'analgésique, les prélèvements pulmonaires seront accompagnés de monitoring dédié et de supplémentation en oxygène. Les animaux seront gardés sur coussin chauffant durant la procédure afin de ne pas occasionner d'hypothermie. Les volumes maximum de matrice biologique à prélever sont basés sur une analyse de la littérature disponible, ou sur les pratiques utilisées en clinique humaine le cas échéant. L'animal sera suivi par le personnel d’étude tout au long de l'anesthésie et surveillé au moment de son réveil ainsi que durant les heures suivantes. Un suivi clinique quotidien ainsi que la mise en place de points limites spécifique à chaque procédure permet d’évaluer quotidiennement le bien-être de l’animal. En fonction de la procédure réalisée, un score neurologique pourra aussi être réalisé, si nécessaire, les jours suivant les prélèvements afin d’assurer qu’il n’y ait pas de dommage neurologique.

Choix des espèces

Par leur origine phylogénétique, les primates non humains présentent une forte proximité avec les humains en termes de patrimoine génétique, de processus épigénétiques, d’organisation fonctionnelle de leur système nerveux et immunitaire, et de leurs principales caractéristiques physiologiques, cognitives et comportementales. Cette proximité permet de les utiliser dans le cadre de développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et/ou prophylactiques. Cette espèce est donc particulièrement utilisée pour tester l'efficacité ou la toxicité de drogues visant des processus biologiques spécifiques à l'homme ou aux espèces proches. Ces études peuvent couvrir les thérapies géniques ou cellulaires visant à corriger l'expression de gènes défectueux, les études infectieuses sur des virus n'infectant que l'homme ou certains primates, ou encore les thérapies visant le système nerveux central (la barrière hémato-encéphalique de l'humain étant très proche de celle du singe). Ce type d'étude nécessites la mise au point de méthodes d'analyses dédiées, pour lesquelles l'accès au matériel biologique de l'espèce cible est nécessaire. Ainsi, des études visant des maladies génétiques ou des leucémies auront besoin d'analyser la moelle osseuse des animaux, les études infectieuses de virus respiratoire (le singe étant le modèle de référence pour l'infection au SARS-CoV-2) auront besoin d'échantillons pulmonaires, et les études visant le système nerveux auront besoin d'échantillons de liquide cérébrospinal pour mettre au point leur méthode de dosage. Les mises au point et/ou test préliminaires de ce projet concerneront des candidats médicaments humains. Les animaux pourront être des juvéniles à mature, en fonction des besoins de l’étude. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou des matures en fonction des objectifs des études. Par exemple, des prélèvements de moelle osseuse peuvent chercher certaines populations de cellules précurseurs plus fréquentes chez le juvénile que chez l'animal mature.

800 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un régime contenant de la charcuterie pendant dix-huit jours puis passent jusqu'à 48 heures seuls en cage à métabolisme, source de stress, pour recueillir urines et fèces. À l'issue, le porteur indique que 150 rats seront adoptés, environ 250 réutilisés en formation et le reste tué. Il affirme qu'aucune étude in vitro ne permet d'évaluer l'effet des nitrites sur l'"organisme entier".

Objectifs

Les études épidémiologiques réalisées chez l’Homme montrent une association entre la consommation de charcuteries et le développement du cancer colorectal. Les additifs nitrés (nitrites et nitrates) sont utilisés dans les charcuteries pour limiter le développement de bactéries pathogènes mais aussi pour retarder la date limite de consommation. Les charcuteries contiennent également du fer héminique, constituant important des muscles ou viandes. Les études épidémiologiques et celles réalisées chez le rat montrent que ces additifs nitrés et le fer héminique pourraient être responsables de cet effet néfaste, car pendant la digestion, ils favorisent la formation de composés toxiques. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de la diminution ou du retrait des additifs nitrés dans les charcuteries sur la formation des composés toxiques. Les doses de nitrites et nitrates seront choisies pour évaluer l’effet d’une diminution importante de l’utilisation de ces additifs dans les charcuteries les plus consommées en France. Les charcuteries représentatives des 20 charcuteries les plus consommées seront produites avec quatre doses d’additifs nitrés : la dose actuellement utilisée dans la production des charcuteries, deux doses plus faibles et une charcuterie sans additif. En plus d’un groupe sans charcuterie, l’effet du retrait ou de la diminution des additifs nitrés sera testé en ajoutant ces différentes charcuteries à la ration des rats. Dans ce projet, 800 rats seront nourris avec un régime contenant ou non de la charcuterie pendant 18 jours. Leurs urines et leurs fèces seront récupérées. Ces échantillons permettront des mesures des produits toxiques formés pendant la digestion de ces charcuteries contenant un gradient d’additifs nitrés.

Bénéfices attendus

L’objectif est d’identifier une dose d’additifs nitré la plus basse possible afin de préconiser des doses faibles voire nulle d’additifs dans les charcuteries. Ainsi cela aurait comme bénéfice de proposer un levier de prévention du risque du cancer colorectal associé à la consommation de charcuterie.

Procédures

Pour les prélèvements des fèces et urines de 24 h, tous les rats seront hébergés en cage individuelle spécifique pendant maximum 48h en continu. Les rats seront en habituation pendant 3h dans ces mêmes cages la veille. Les prélèvements sont en fait des recueils dans des réceptacles sous la cage à métabolisme. Nous recueillons toute la production de 24h en fèces et en urine séparément, 2 fois, au bout de 24 et 48h à J17 et J18. Les rats ne sont pas manipulés.

Impact sur les animaux

Le projet comporte un passage en cage spécifique pendant 48h (après 3h d’habituation) ce qui peut générer du stress chez le rat (rat isolé). Nous sommes très attentifs au suivi des animaux pendant cette période (ouverture d’une fiche de suivi sanitaire scoré avec 9 points de contrôle en 2.5 jours). Pour compléter, nous réaliserons une mesure de la consommation alimentaire et d’eau de boisson le deuxième jour et une mesure de poids corporel.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux rentreront dans un processus de don après une période de 7 jours d'adaptation à une alimentation conventionnel, afin que - 150 rats maximum soient adoptés via une association d'adoption d'animaux. - qu’environ 250 rats soient réutilisés lors de formation. - Le reste des animaux sera euthanasié.

Remplacement

Aucune étude in vitro ne permet d'évaluer les répercussions des doses de nitrites dans les charcuteries d'un organisme entier, sur la physiologie, sur le métabolisme et sur les formations des composés toxiques au niveau de la lumière colique. Seule une approche in vivo permet de prendre en compte la complexité de l’écosystème colique.

Réduction

Dans l'objectif de réduire au strict minimum l'utilisation d'animaux de laboratoire, pour ces études nutritionnelles, sur la base un test statistique, le nombre d'animaux a été limité au maximum (n=8 animaux/lot) et la durée de l’étude au maximum (18 jours). Notre expérience, nos publications et une analyse statistique montrent que ce nombre de 8 animaux par lot est nécessaire pour observer un effet sur les indicateurs précoces du cancer colorectal.

Raffinement

L’environnement des rats sera enrichi avec une niche. Les cages utilisées seront transparentes pour maintenir un contact visuel et le suivi sanitaire sera plus fréquent. Pour les interventions potentiellement stressantes (hébergement individuelle pendant 48h), les rats seront habitués au préalable. Les interventions des opérateurs seront minimales hors observation sanitaire, de manière à les maintenir dans un lieu d’hébergement le plus calme possible.

Choix des espèces

Le rat Fisher est un bon modèle pour étudier la modulation de la cancérogenèse colorectale associée à la consommation d’un régime riche en charcuteries et pour étudier le rôle des nitrites et du fer héminique. Les mâles sont privilégiés pour analyser le développement des pathologies à l’âge adulte afin d’éviter les effets hormonaux liés aux cycles de la femelle (observés sur la cancérogenèse). Les études se feront sur des rats adultes. Ils seront âgés de 5 à 6 semaines à leur arrivée et leurs organes seront matures en particulier ceux de l'appareil digestif et l’écosystème colique L'ensemble des études précédentes du laboratoire ont été menées sur des rats adultes du même âge dont la fonction digestive est totalement fonctionnelle. Afin de rester en accord avec ces études précédentes, il est important de rester au même stade de développement.

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques, des traitements et une radiothérapie qui peut provoquer diarrhées et saignements digestifs, avant d'être tuées pour des prélèvements d'organes. Le porteur décrit une évaluation de médicaments avant passage chez l'homme, bénéfices situés au long terme. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode de substitution et que l'animal constitue un passage "indispensable".

Objectifs

Ce projet vise à évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux médicaments dans des modèles murins pertinents de leucémie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de démontrer que les traitements testés sont actifs dans un modèle de cancers du sang et aussi d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage chez l'homme. Ainsi, à long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouvelles thérapeutiques pour traiter ce type de cancers.

Procédures

Greffe de cellules tumorales (durée de l'injection inférieur à 1 min). Application / Administrations des traitements (moins de 2min pour les injections et environ 5 min pour la radiothérapie). En cas de prélèvement de sang (moins de 2min) ceux-ci seront réalisés sous anesthésie et limités à 1 par semaine et à un volume inférieur à 10 %. Un suivi par imagerie pourra être réalisé sous anesthésie comme par exemple par Bioluminescence (durée moyenne < 10 min) ou encore par IRM (durée moyenne = 30 min).

Impact sur les animaux

Stress lié à l’anesthésie par agent chimique en inhalation et/ou injection lors des administrations / imageries. Stress lié à la contention pour l'implantation de cellules tumorales dans la veine caudale et lors des suivis clinique. Le développement de tumeurs chez la souris pourra à terme être associé à des effets délétères (ex: présence d'une tumeur associé ou non à de la perte de poids). Traitements par différentes voies d'administration (douleur équivalente à la piqure d’une aiguille) - De même, l’utilisation de traitements novateurs pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères. Les effets de la radiothérapie, notamment sur les aspects digestifs (diarhée, saignement).

Devenir

Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal. Euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués le développement de la tumeur ou encore par le produit / modèle chez les animaux.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur ces cancers. De plus, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage indispensable pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’une nouvelle thérapeutique. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : classiquement 10 par groupe en fonction de l’effet thérapeutique attendu. L’analyse statistique sera par la comparaison des groupes d'animaux en fonction du traitement réalisé.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le suivi des signes cliniques et la détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • des conditions d'hébergements garantissant la non-contamination des animaux immunodéficients

Choix des espèces

La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées notamment pour évaluer l’efficacité de traitements anti-tumoraux, de par leurs facilités d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Animaux adultes (à partir de 3 semaines). Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris immunodéprimées reçoivent une greffe de mélanome humain, une résection de la tumeur et des traitements, avec un suivi par imagerie, avant le prélèvement des organes. Le porteur indique vouloir caractériser une protéine limitant l'invasion métastatique, retombée pour les patients formulée au conditionnel. Il affirme que seul le modèle animal reproduit la complexité de la métastase du mélanome.

Objectifs

Le laboratoire a identifié une protéine comme régulateur des métastases de mélanome, cause principale des décès liés à cette maladie. Plus précisément, cette protéine diminue les capacités invasive et migratoire des cellules, diminuant le potentiel métastatique de la tumeur. Ce projet cherche donc à caractériser les effets de notre protéine sur la migration, l’invasion et les métastases de mélanomes, permettant à terme d’améliorer la prise en charge thérapeutique de cette maladie.

Bénéfices attendus

Le mélanome métastatique est particulièrement létal : à ce jour, le taux de survie à 5 ans de cette maladie est de 22,5%. L’objectif est de mieux comprendre le rôle de notre protéine dans les mécanismes de migration et d’invasion métastatique du mélanome. Des résultats préliminaires montrent que notre protéine inhibe les capacités migratoires et invasives du mélanome métastatique. Ainsi, promouvoir l’expression et/ou l’activité de cette protéine dans la tumeur pourrait être bénéfique pour améliorer la survie des patients.

Procédures

Lors de l’implantation tumorale nous réalisons une anesthésie en intrapéritonéale (2 secondes) puis nous procédons à l’implantation des cellules tumorales en sous cutanée (20 secondes). Lors de la résection tumorale nous procédons à une analgésie en sous-cutanée (2 secondes) 30 minutes avant l’anesthésie qui elle est en intrapéritonéale (2 secondes), puis nous réalisons la résection tumorale (3 minutes). La suture de la peau est réalisée à la fin de l’implantation avec du fil de suture (2 minutes). Les traitements sont réalisés par voie intrapéritonéales (2 secondes). . Un suivi par imagerie pourra être réalisé sous anesthésie comme par exemple par Bioluminescence (durée moyenne

Impact sur les animaux

Stress lié à l’anesthésie par agent chimique en inhalation et/ou injection lors des administrations / imageries. Stress lié à la contention pour l'implantation de cellules tumorales et lors des suivis clinique. Le développement de tumeurs chez la souris pourra à terme être associé à des effets délétères (ex: présence d'une tumeur associé ou non à de la perte de poids). Traitements par différentes voies d'administration (douleur équivalente à la piqure d’une aiguille) - De même, l’utilisation de traitements novateurs pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères.

Devenir

En fin de procédure les organes seront prélevés afin de réaliser des analyses immunohistologiques

Remplacement

La migration et l’invasion peuvent être étudiées via des modèles in vitro, mais celles-ci ne peuvent récapituler aussi fidèlement les métastases du mélanome observées in vivo. L’environnement tumorale, notamment vasculaire et immunitaire étant absent, aucun modèle cellulaire ne permet de reproduire la complexité de la métastase du mélanome, et seul le modèle animal permet de conduire ce projet. La souris est un animal très adapté à ce travail avec une littérature validant ce choix.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour être statistiquement significatif et scientifiquement irréprochable. Pour ces études les tests statistiques non seront utilisés en cohérence avec le nombre de groupes analysés et d'animaux. Au total 520 souris maximum seront nécessaires pour cette étude.

Raffinement

Afin de raffiner les conditions de vie des souris, un suivi adapté des animaux sera instauré afin de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'ils pourraient éprouver. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux et bénéficieront d’un enrichissement adapté. Des soins pré-, per- et postopératoires adéquats seront réalisés. Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie générale et des traitements analgésiques sont systématiquement utilisés pour prévenir toute douleur.

Choix des espèces

Nous utiliserons un modèle immunodéprimé (NSG) permettant le développement de mélanomes humains. L’utilisation de ce modèle va nous aider à mieux appréhender la croissance tumorale et surtout avoir un modèle animal très proche de ceux rencontrés chez les patients. Les cellules utilisées nous permettent de contrôler la croissance tumorale par bioluminescence et de mieux visualiser les métastases. Nous utiliserons des souris de 8 à 10 semaines pour avoir une croissance tumorale optimale. En effet, les expériences peuvent s’étaler sur plusieurs semaines, donc l’implantation sur des jeunes animaux permet de s’affranchir de l’affaiblissement d’individus plus âgés.

8 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à trois injections de virus ou de vésicules extracellulaires, la moitié une greffe de cellules tumorales, une partie des injections répétées d'immunothérapie sur trente et un jours, avec prélèvements de sang, pour caractériser la réponse immunitaire à ces candidats médicaments anticancéreux. Le porteur indique que les souris greffées peuvent voir leur état s'altérer (prostration, amaigrissement) et que les injections répétées sont source de stress. Il affirme qu'aucune alternative non animale n'existe pour étudier ces processus complexes, sans détailler de test comportemental au-delà du suivi clinique.

Objectifs

Le cancer est la deuxième cause de décès dans les pays développés après les maladies cardiovasculaires. Les traitements conventionnels de nombreux cancers tels que la radiothérapie, la chimiothérapie et la chirurgie ont démontré des limites d’efficacité nécessitant un besoin urgent de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les virus ou les vésicules extracellulaires (EV) libérées par des cellules infectées par un virus sont une nouvelle classe d’agent thérapeutique pouvant être une alternative au traitement des cancers. Les virus candidats vont servir de vecteurs pour permettre l’expression d’agents thérapeutiques et bioactifs au sein des tumeurs pour lesquelles il y a un fort besoin médical en clinique humaine. Sachant que le développement clinique de ces virus prévoit de les combiner avec de l’immunothérapie afin de potentialiser l’activité anti-tumorale, le projet se propose d’explorer dans les modèles murins les combinaisons de ces virus (ou EV) avec des traitements d’immunothérapie pour le traitement de cancers de différentes origines. Le but de ce projet sera d’évaluer l’effet sur le système immunitaire des virus candidats-médicaments en association ou non avec de l’immunothérapie. Ce projet vise à déterminer la production et l‘efficacité du médicament apporté par les vecteurs viraux et mettre en évidence la qualité de la réponse immunitaire suite à l’injection d’un virus ou EV en combinaison ou non avec un produit d’immunothérapie. Les données générées nous permettront d’améliorer notre compréhension des mécanismes d’action dans un organisme complexe et d’envisager le développement de ce candidat en déterminant sa chronologie d’action et son efficacité.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à caractériser la réponse immunitaire suite à l’injection de virus recombinants ou de vésicules extracellulaires de cellules infectées en combinaison ou non avec des produits d’immunothérapie. Il s’agit de mieux comprendre l’impact de l’injection de vecteurs viraux sur le type de cellules immunitaires recrutées dans l’organisme et le microenvironnement tumoral. Cette connaissance devrait nous permettre de mettre en place de nouvelles thérapies anti-cancéreuses chez l’Homme.

Procédures

Toutes les souris recevront au maximum 3 injections de virus. Chaque injection sera réalisée sur souris vigile mais geste rapide de l’ordre de la minute. Les injections seront séparées de 2 jours ou 8 jours maximum selon le virus ou EV candidat. La moitié des souris recevra une greffe de cellules qui sera effectuée sur souris vigile, durée environ 1 minute. 3840 souris recevront des injections de produits d’immunothérapie qui seront réalisées sur souris vigile, durée des injections environ 1 minute, maximum 3 injections par semaine durant 31 jours maximum. Sur toutes ces souris, lorsque cela sera nécessaire, il sera possible de prélever du sang. Trois prélèvements maximum sont envisagés à raison de 1 prélèvement maximum par semaine. Cette intervention sera de courte durée de l’ordre de la minute. Elle se fera sur souris anesthésiées ou vigiles.

Impact sur les animaux

Il n’est pas attendu d’observer de nuisances chez la souris naïve injectée avec des virus ou EV car ceux-ci n’ont pas donné de signes de toxicité dans les études antérieures. Les souris greffées avec des cellules tumorales en sous-cutanée pourront potentiellement voir leur état général s’altérer avec des signes cliniques d’affaiblissement (prostration, poils hirsutes, amaigrissement…) Les injections répétées chez la souris peuvent également être source de stress et d’angoisse mais tout est mis en œuvre pour limiter cette nuisance (gestes rapides inférieurs ou égaux à 1minute par du personnel formé, utilisation tunnel de change, …). Le prélèvement de sang peut générer un stress et de la douleur mais le geste sera de courte durée (environ 1 minute) et le stress que transitoire. Une anesthésie pourra être réalisée. On ne peut pas exclure un effet secondaire des produits d’immunothérapie seuls ou en combinaison avec nos virus ou EVs. Si c’est le cas on peut s’attendre à une perte de poids transitoire ou un effet sur le comportement mais les doses seront choisies en fonction des données pharmacologiques publiées ou obtenues antérieurement.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes (organes lymphoides et tumeur s'il y a lieu).

Remplacement

L’étude de l’effet thérapeutique de candidats médicaments sur des processus complexes tels que l’oncologie et le système immunitaire ne peut se faire sans l’utilisation de modèles animaux. En effet, des mécanismes complexes sont mis en place dans la réponse immunitaire et la croissance tumorale. Aucune alternative non animale n’est encore connue à ce jour permettant le remplacement.

Réduction

Avant d’être testés chez l’animal, les virus-candidats médicaments auront été évalués in vitro sur des modèles cellulaires de tumeurs humaines et murines établies et caractérisées, ainsi que dans des cellules primaires (non tumorales) pour sélectionner les virus candidats médicaments ayant une activité antitumorale et ne présentant pas de cytotoxicité. Le nombre d’animaux nécessaire à la réalisation des expériences a été déterminé en se basant sur les résultats obtenus lors de nos expériences antérieures. Nous avons retenu et validé le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention de résultats fiables et robustes. Les virus (ou EV) qui ne devraient pas avoir une activité suffisante et concluante ne seront pas testés ultérieurement. Leur étude sera stoppée.

Raffinement

Tout au long de leur vie, une attention particulière est portée au bien-être des animaux en particulier par un enrichissement de leur milieu de vie (matériel de nidification : bâtonnet et carré de coton dans chaque cage) qui leur permet d’assouvir les comportements liés à leur espèce. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux pendant toute la durée des expérimentations, dans le but de préserver les interactions sociales entre congénères. A la réception des souris une phase d’acclimatation de 15 jours est prévue. Durant la première semaine les souris seront laissées dans leur nouvel environnement afin qu’elles se familiarisent avec celui-ci. Puis, au bout de 8 jours, l’expérimentateur habituera l’animal à la contention et aux gestes utilisés. L’utilisation d’un tunnel de change permettra également de réduire le stress et l’angoisse chez l’animal. La réalisation par des techniciens rompus à ses manipulations garantissent la bonne reproductibilité des expériences et un suivi optimal du bien-être des animaux. Les effets dus au traitement seront surveillés et des critères d’interruption de l’expérimentation en fonction de l’aspect clinique des animaux (volume tumoral, l’apparence de la tumeur, l’évolution pondérale, l’apparence physique générale, le comportement) sont mis en place afin de limiter le stress et la souffrance des animaux. Enfin, lorsqu’un prélèvement de sang sera envisagé, le recours à l’anesthésie pourra supprimer la douleur et l’angoisse sera réduite grâce à des gestes rapides et maitrisés.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence en oncologie. Il s’agit de mammifères au système immunitaire assez proche de l’homme pour pouvoir utiliser des données générées dans une approche translationnelle valide. Il existe de nombreux outils permettant de caractériser les réponses immunitaires chez cette espèce. Animaux adultes de 4 à 5 semaines minimum (à la réception), soit 6 semaines minimum au début de l’étude (avec 2 semaines de stabulation). Six semaines est l’âge où le système immunitaire est considéré comme suffisamment mature pour la réalisation de l’étude