Cancers

196 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe intracérébrale de cellules humaines de glioblastome lors d'une chirurgie stéréotaxique, suivie de trois séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur attend une neuroinflammation, un état fébrile temporaire, une perte d'appétit et une léthargie après l'injection. Il caractérise un biomarqueur d'imagerie du gliome et qualifie le recours à des animaux vivants d'"indispensable" pour le caractère translationnel des lignées humaines.

Objectifs

Les cancers du cerveau sont encore aujourd’hui de mauvais pronostic, et notamment le plus agressive le glioblastome qui est aussi le plus fréquent. Ces cancers sont classés et identifiés grâce à des analyses réalisées directement sur le tissu malade à partir de biopsies cérébrales. L’un des critères majeurs est la présence d’une mutation spécifique sur le gène appelé IDHmut. Cette mutation apporte des éléments pronostics important pour les patients puisque les tumeurs cérébrales IDHmut ont un meilleur taux de survie que les IDH non mutés. La greffe de cellules humaines de glioblastome est un modèle animal de cancer du cerveau largement utilisé depuis plusieurs décennies pour disséquer les mécanismes de croissance du cancer. Ce modèle permet aussi de tester et d’évaluer de nouvelles thérapies. Des lignées cellulaires portant la mutation IDHmut seront greffées sur des souris afin de créer un modèle se rapprochant des caractéristiques des cancers humains. Ce projet permettra de caractériser les différences entre les souris portant la mutation et des souris témoins et fournira de nouvelles méthodes d’imagerie in vivo. Ces nouvelles méthodes en imagerie médicale sur les souris seront utilisées pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les glioblastomes (GBM) sont les plus fréquents et les plus grave des gliomes diffus de l’adulte, avec une médiane de survie globale qui ne dépasse pas 15 mois. Ce projet permettrait de caractériser un nouveau biomarqueur d’imagerie (mesuré en spectroscopie par résonance magnétique) dans un modèle bien connu de GBM chez la souris. Ce biomarqueur sera ensuite associé à d’autres marqueurs fonctionnels (grâce aux ultra-sons ou aux biomarqueurs d’imagerie en tomographie d'emission de positrons) qui pourront servir pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques. En effet, la possibilité d’obtenir ces biomarqueurs sur des modèles précliniques sera une aide précieuse pour une évaluation précoce de nouveaux outils thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule chirurgie d'une durée de 30 minutes. Par la suite les animaux auront 3 examens d'imagerie non invasive de 1 heure maximum chacun pendant lesquels les animaux seront anesthésiés et endormis.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur ces animaux sont l’inflammation locale et en particulier le déclenchement de médiateurs de l’inflammation dans le cerveau. Cette neuroinflammation modérée et locale peut provoquer un état fébrile temporaire dans les heures suivant l’injection, se traduisant par une perte d’appétit et une léthargie. Cette nuisance exclusivement liée à l’injection stéréotaxique ne sera pas répétée et ne durera pas plus de 12 heures. Une douleur pendant la chirurgie et post-chirurgicale peut apparaître et sera anticipée, évaluée et traitée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de la procédure, afin de permettre des analyses post-mortem in vitro seront réalisées sur les échantillons de cerveaux. En effet, les données d’imagerie in vivo doivent être complétées par les analyses in vitro qui permettent d’apporter des mesures plus variées et précises sur les problématiques métaboliques et vasculaires.

Remplacement

Le projet a été construit après un passage en revue de la littérature actuelle et une comparaison détaillée des données expérimentales mises à notre disposition. Le projet contient des protocoles d’imagerie in vivo (TEP, IRM, ultrasons) permettant d’étudier le métabolisme tumoral au sein de son microenvironnement, ce qui implique l’utilisation d’animaux vivants. Les équipements d’imagerie (microTEP, microIRM et sonde ultrasonore) sont adaptés à la souris. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour assurer le caractère translationnel des résultats. En effet, les lignées utilisées sont d’origine humaine et les mesures en imagerie in vivo sont similaires à celle obtenues chez les patients. Ainsi, notre projet permet l’étude comparée des phénomènes physiopathologiques étudiés, et constitue un élément essentiel pour la recherche future de biomarqueurs et de thérapies utilisables chez l’humain.

Réduction

La réduction du nombre d’animaux est réalisée grâce au suivi longitudinal, en imagerie non invasive IRM, de la taille de la tumeur. Ce type de suivi augmente la puissance statistique et les tests statistiques permettent de réduire de 51 à 34 le nombre souris. Ce projet permettra de contrôler le bien-être des souris en rapport avec le volume de la tumeur cérébrale. Cette étude pilote guidera les étapes suivantes qui seront adaptées en fonction des résultats observés. L’ensemble du projet nécessite 196 souris. Les expérimentations se dérouleront en sous-groupes expérimentaux : l’ensemble de l’étude étant constitué de 2 groupes (un groupe contrôle et un groupe test), chaque groupe sera divisé en sous-groupes (de 5 à 7 souris) ce qui permettra d’analyser par des tests statistiques les résultats après les données obtenues sur chaque sous-groupe. Si les analyses montrent des données significatives, les blocs suivants ne seront pas utilisés, participant ainsi à la réduction du nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront surveillés régulièrement grâce à une grille d’évaluation neurologique et des points limites adaptés. La mutation portant sur le gène IDH n’apportera pas de changement majeur par rapport à la lignée sauvage, dite wild-type "wt", (si ce n’est une vitesse de croissance diminuée), les points limites seront les mêmes pour tous les animaux. Il a été démontré que la lignée utilisée dans ce protocole ne provoque pas de déficits moteurs chez les souris avant le jour 27 après injection intracérébrale en comparaison des souris contrôles. Les actes chirurgicaux (injection stéréotaxique) seront réalisés sous anesthésie générale avec analgésie adaptée (anti-inflammatoires), thermorégulation continue, et hydratation intra-péritonéale. La douleur sera réduite au maximum par l’administration répétées d’analgésiques en cas d’apparition de signes de souffrances. En cas de signes de détresse, la procédure sera interrompue et si nécessaire, l’euthanasie sera effectuée. Les séances d’imagerie avec ultra-sons seront réalisées avec une sonde de taille adapté aux crânes des souris.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris est optimale car l’organisation neurochimique du cerveau de la souris est proche de celle de l’humain. Ce modèle est aussi pertinent car le model de greffe de glioblastome humain chez la souris est très bien décrit. Enfin, l’imagerie par ultra-sons fonctionnels peut être réalisée chez la souris à travers le crâne directement car les os du crâne sont suffisamment fins pour ne pas provoquer d’atténuation du signal. De la même façon que l’échographie, le signal ultrasonor est atténué grandement par les os. Souris adultes de 2 mois afin de modéliser les gliomes diffus de l’adulte.

1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Privées de système immunitaire, elles reçoivent sous la peau des fragments de tumeurs pancréatiques de patients, une série de 750 d'entre elles étant traitée par cinq molécules de chimiothérapie avant prélèvement des tumeurs. Le projet compare des tumeurs de patients à survie courte et longue pour chercher des cibles et des marqueurs prédictifs, les tumeurs pouvant provoquer inconfort et ulcérations. Le porteur affirme que les souris immunodéficientes forment un modèle "qui ne peut être remplacé" pour conserver les caractéristiques des tumeurs humaines.

Objectifs

L’adénocarcinome pancréatique (ACP) est l’un des cancers les plus graves. Avec plus de 12000 décès par an en France qui lui sont imputés, il pose un problème majeur de santé publique. En dépit des importants efforts de recherche consentis au cours des dix dernières années, les traitements conventionnels n’ont qu’un impact limité. La chirurgie reste la seule stratégie potentiellement curative, mais seuls 20% des patients peuvent en bénéficier car la plupart du temps, au moment du diagnostic, ce cancer est déjà à un stade très avancé, la médiane de survie de ces patients restant inférieure à 6 mois et la survie à 5 ans inférieure à 3%. Pratiquement tous les patients souffrant d’un ACP développent des métastases (cellules cancéreuses qui ont migrées dans d’autres organes) et décèdent des conséquences dévastatrices de leur développement. Le point de départ de ce projet est la constatation que très peu de patients atteints d’ACP survivent longtemps ; de plus nous manquons de nouvelles molécules thérapeutiques capables de s’attaquer spécifiquement aux cellules cancéreuses pancréatiques en épargnant autant que possible les cellules non cancéreuses. De nombreux travaux de recherche ont montré que les tumeurs pancréatiques sont très hétérogènes d’un patient à un autre et que cette hétérogénéité est associée au niveau de résistance aux chimiothérapies et au temps de survie du patient. Nous avons donc émis l’hypothèse que les tumeurs des patients de courtes ou de longues survies présentent des mécanismes et des caractéristiques moléculaires différentes entre elles, ce qui nous a déjà permis, dans des travaux antérieurs, d’identifier des marqueurs biologiques capables de prédire la survie des patients. Notre projet a donc pour objectif de déterminer les caractéristiques moléculaires des tumeurs de patients de courtes survies et celles des patients de longues survies associées ou non à des protocoles de chimiothérapies, puis de les comparer entre elles ceci dans le but de mieux comprendre la biologie de l’ACP, de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques spécifiques à chaque groupe de patients et d’identifier des marqueurs biologiques capables de prédire la réponse aux traitements des patients.

Bénéfices attendus

Le point de départ de ce projet est la constatation que très peu de patients atteint d'ACP survivent longtemps. Notre projet a donc pour objectif de comparer les caractéristiques moléculaires des tumeurs de patients de courtes et longues survies obtenues par des analyses biologiques et moléculaires, lesquelles sont associées au niveau de résistance aux chimiothérapies et au temps de survie du patient. Les bénéfices attendus de ce projet seront donc l'identification de nouveaux mécanismes moléculaires activés par la cellule tumorale permettant ainsi le développement de nouvelles molécules thérapeutiques, de nouveaux marqueurs biologiques capables de prédire la résistance / sensibilité aux chimiothérapies et/ou de permettre un diagnostic précoce des patients. Il nous permettra ainsi de mieux comprendre la biologie du cancer pancréatique ainsi que les raisons de son pronostic sombre et de la réponse limitée des patients aux différents traitements.

Procédures

Pour atteindre les objectifs de ce projet, 3 procédures seront réalisées : Pour les procédures 1 et 2 les tumeurs seront découpées en petits morceaux et injectées sous anesthésie chez la souris en sous-cutanée entre les omoplates avec une aiguille. Une fois que la tumeur aura atteint le volume souhaité, la souris sera mise à mort puis la tumeur sera prélevée pour réaliser les différents analyses biologiques. Une 3ème procédure nous permettra de déterminer l’efficacité anti-tumorale des différentes chimiothérapies actuellement utilisées en clinique sur les xénogreffes de tumeurs pancréatiques de patients, puis d’identifier des signatures moléculaires prédictives de la sensibilité aux traitements, recherchées sur les tumeurs prélevées. Une série de souris porteuses d’une xénogreffe de tumeur pancréatique de patient établit selon la procédure n°2, sera traitée avec 5 molécules thérapeutiques différentes composées de 3 injections maximum par souris par traitement. Les souris témoins recevront une solution de sérum physiologique. Les animaux seront pesés avant injection et les tumeurs mesurées au pied à coulisse (instrument de mesures).

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sur les animaux comprennent les implantations de tumeurs faites en sous cutanée entre les omoplates sous anesthésie ; le développement de tumeurs sous-cutanées qui peuvent générer éventuellement un certain inconfort ou être la source d’ulcérations cutanées bien que ces effets n’ont jamais été observés dans nos expériences précédentes lors de notre vigilance quotidienne ; les injections de molécules chimiothérapeutiques qui peuvent générer une douleur, ces traitements peuvent être la source de différentes nuisances telles que la diminution du poids, l’absence d’activité bien que ces effets n’ont jamais été observés dans nos expériences précédentes ; la contention de l’animal vigile nécessaire pour les diverses injections ou les mesures des volumes tumoraux ou les manipulations de l’animal pour prise de poids corporel ou l’anesthésie peuvent être un facteur de stress éventuel.

Devenir

L'ensemble des animaux des 3 procédures seront mis à mort sous anesthésie afin de prélever les tumeurs qui serviront (1) à maintenir la bio-banque de tumeurs pancréatiques et à extraire le matériel biologique (ADN, ARN, protéines, …) de chaque tumeurs de patients pour des analyses moléculaires ultérieures, (2), à réaliser des coupes histologiques des tumeurs (anatomo-pathologie) afin d’identifier de nouveaux marqueurs biologiques prédictifs de la résistance / sensibilité aux chimiothérapies.

Remplacement

Au vu de la complexité du cancer du pancréas, l’utilisation des souris immunodéficientes, qui sont des modèles bien établis en cancérologie expérimentale, est justifiée et ne peut être remplacée car elles permettent d’une part la prise des xénogreffes de tumeurs pancréatiques dérivées de patients et éviter les phénomènes de rejets et d’autre part le maintien des caractéristiques moléculaires de la tumeur originelle du patient ; ces caractéristiques seront nécessaires pour identifier de nouvelles cibles diagnostiques et thérapeutiques et de nouveaux marqueurs biologiques capables de prédire la sensibilité aux différentes chimiothérapies spécifiques selon le profil « tumoral du patient ». Cependant, dans un souci de remplacement, les marqueurs biologiques qui seront identifiés et les informations de sensibilité /résistance aux chimiothérapies qui seront obtenues dans ce projet, auront pour avantage dans le futur de diminuer fortement l’utilisation d’animaux, en particulier en testant directement les marqueurs biologiques prédictifs de l’efficacité des traitements sur les tumeurs du patients. De plus, ce projet va nous permettre de cultiver les cellules tumorales pancréatiques de chaque tumeur de patients en 2 et 3 dimensions pour réaliser des études in vitro et ex vivo ce qui nous évitera l’utilisation d’animaux supplémentaires.

Réduction

Concernant les procédures 1 et 2, le nombre de souris nécessaires est fondé sur une estimation maximale du nombre de xénogreffes de tumeurs pancréatiques de patients à implanter et à la quantité de matériels biologiques nécessaires pour réaliser les différentes analyses moléculaires et biologique. Pour la procédure 3, nous n'utiliserons que le nombre d’animaux nécessaires pour l'exploitation statistiques des données, à savoir 750 animaux. Le nombre de souris de chaque groupe a été calculé avec un test statistique de puissance. Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons aussi mis au point un système de congélation de tissu qui nous permet de congeler les xénogreffes de tumeurs pancréatiques pour les conserver en "dormance" dans l'azote liquide. Ce système permet de conserver des tissus vivants pour des études futurs en dehors de la souris et limitera considérablement l'utilisation des animaux.

Raffinement

Dès réception, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation de 7 à 10 jours pendant laquelle ils seront familiarisés à la manipulation par les expérimentateurs. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux. Dans chaque cage, nous mettons plusieurs types d’enrichissement ; les litières sont changées toutes les semaines ; de petits groupes sociaux sont constitués afin d'éviter le stress de l’isolement ; La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Les souris sont endormies sous anesthésie pour tous les actes qui pourraient générer de la douleur (implantation de tumeurs), puis mises sous une lampe chauffante et surveillées jusqu'à leur réveil. Un contrôle quotidien des souris sera effectué en plus d'un contrôle approfondis bihebdomadaire de l'état clinique de nos animaux sera réalisé́, d’avantage si leurs état le nécessite.

Choix des espèces

Pour mener à bien notre projet, nous avons besoin d'une espèce de mammifère dépourvu de système immunitaire pour éviter les phénomènes de rejets des xénogreffes de tumeurs humaines. Ces souris qui sont des modèles bien établies en cancérologie expérimentale et qui ont fait l’objet de plusieurs centaines de publications, permettent la prise des xénogreffes de tumeurs pancréatiques, le maintien des caractéristiques moléculaires des tumeurs, et d’étudier au sein d’un organisme entier la stabilité et l’efficacité des molécules chimiothérapeutiques. De plus, la souris est facilement manipulable, de par sa petite taille, d’une utilisation simple et peu coûteuse, ce qui en fait un modèle expérimental de choix pour notre projet. Les souris seront reçues à 4 semaines. Cela permettra aux animaux de récupérer du stress engendré par le transport et de s'adapter à leur nouvel environnement. Nous les laissons s'habituer et s'adapter pendant 1 à 2 semaines avant de commencer les expérimentations. De plus, cela nous permettra de travailler chez le jeune adulte et de garder nos animaux sur une durée plus longue, certaines tumeurs mettent plusieurs semaines avant d’atteindre une taille compatible avec les besoins en matériels biologiques nécessaires à nos projets.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Privées de système immunitaire, elles subissent des chirurgies abdominales pour implanter des tumeurs du côlon ou du pancréas, parfois une ablation de la rate, puis une seconde chirurgie de résection guidée par fluorescence, avec risque de douleur, de perte de poids et d'infection. Le projet fait la preuve de concept d'anticorps couplés à une sonde pour mieux repérer et retirer les tumeurs pendant l'opération. Le porteur affirme que cette démonstration ne peut se faire que sur des animaux porteurs de ces tumeurs, les tests in vitro ayant déjà été réalisés.

Objectifs

Malgré l'émergence des thérapies personnalisées, la chirurgie joue toujours un rôle essentiel dans le traitement de nombreux cancers comme les cancers colorectaux et pancréatiques. Un problème majeur réside dans la difficulté de détecter les tumeurs et de visualiser les marges tumorales. La chirurgie guidée par fluorescence (FGS) permet aux chirurgiens une meilleure visualisation des structures anatomiques en temps réel. De plus, la FGS peut être améliorée en associant une imagerie pré-opératoire par imagerie nucléaire (SPECT) pour localiser avec précision les tumeurs. Dans le projet, nous proposons de faire la preuve de concept de l’intérêt d’utiliser des anticorps ciblant les tumeurs, conjugués à une sonde (Ac bimodaux) permettant de réaliser de l'imagerie bimodale (radionucléide/fluorescence) afin d'améliorer la stadification pré-opératoire (SPECT), la détection per-opératoire des tumeurs et leur résection (FGS) mais aussi d'améliorer le suivi post-opératoire (SPECT). Nous avons déjà montré dans des modèles de tumeurs sous-cutanées que ces Ac bimodaux étaient visualisables par imagerie in vivo (SPECT et fluorescence) et qu’ils nous permettaient de réaliser de la FGS. Pour prouver le potentiel thérapeutique de l’utilisation de ces Ac bimodaux en chirurgie par fluorescence, il nous faut maintenant utiliser des modèles précliniques mimant la pathologie humaine, tels que des modèles orthotopiques de cancer du côlon et du pancréas, mais aussi des modèles mimant la formation de métastases hépatiques ou de carcinomatoses péritonéales. L’objectif est d’optimiser la résection tumorale par l’utilisation de chirurgie assistée par fluorescence après injection de ces Acs bimodaux et de démontrer l’absence de reprise tumorale suite à l’acte chirurgicale. A terme nous nous attendons à démontrer que l’utilisation de ces Ac bimodaux permet une visualisation fine des tumeurs avant la chirurgie (imagerie SPECT) et une détection plus précise par fluorescence permettant de minimiser l'étendue de la résection. L'absence de récidive pourra être détectée en ré-injectant cet Ac bimodal quelques mois après la chirurgie pour visualiser l’absence de récidive (SPECT). Ce projet ce déroulera sur 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le but de ce travail est de pouvoir faire la preuve de concept de l’utilisation de la chirurgie assistée par fluorescence à l’aide d’Ac bimodaux afin d’éliminer les tumeurs primaires ou disséminées. Ce projet nécessite donc la mise au point des modèles précliniques mimant la pathologie humaine des cancers coliques et pancréatiques avec des tumeurs orthotopiques mimant des tumeurs primaires et des modèles mimant la formation de métastases hépatiques ou de carcinomatoses péritonéales d’origine colique. Ce projet devrait permettre une meilleure prise en charge chirurgicale des patients atteints de cancers primaires ou métastatiques en permettant une meilleure détection des tumeurs, facilitant leur élimination en épargnant le tissu sain et évitant ainsi une récidive tumorale.

Procédures

Trois des modèles nécessiteront l’utilisation d’une procédure chirurgicale (sous anesthésie gazeuse) afin d’implanter les cellules tumorales. Cet acte (30 min/souris) implique l’ouverture de la cavité abdominale, l’implantation des tumeurs (cellules ou fragment de tumeur), la fermeture de la cavité abdominale. Dans le cas du modèle de métastases hépatiques, la rate de ces souris sera enlevée suite à l’injection des cellules tumorales. Pour le modèle de carcinomatose péritonéale, les cellules tumorales seront injectées en intrapéritonéale après anesthésie gazeuse des souris (1-2 min/souris). Ce développement de modèles tumoraux aura lieu dans l’établissement utilisateur 1. Les souris seront alors transférées dans l’établissement utilisateur 2. Les souris recevront 1 injection intrapéritonéale (1-2 min/souris) tous les 7 jours (sous anesthésie gazeuse) du composé permettant l’imagerie des tumeurs. Ces souris seront ensuite anesthésiées à l’isoflurane pour être imagées. Tous les animaux porteurs de tumeurs (orthotopiques ou métastases) subiront une chirurgie d’exérèse assistée par fluorescence après injection des Ac bimodaux (30 min/souris).

Impact sur les animaux

Les modèles animaux mimant la formation de tumeurs primaires coliques ou pancréatiques (modèles orthotopiques) et métastatiques d’origine colique nécessitent un acte chirurgical. L’ouverture de la cavité abdominale des souris, l’injection des cellules tumorales dans le pancréas, la réalisation d’une splénectomie ou encore la ligature d’un morceau de tumeur sur le caecum sont des interventions pouvant entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales. Le développement des tumeurs primaires, ainsi que l’apparition des métastases peuvent également être à l’origine de souffrance et de gênes qui seront évaluées par observations fréquentes des animaux (3 fois par semaine) et estimation de la prise tumorale par imagerie de bioluminescence après injection I.P. de luciférine. Les séances d’imagerie courte étant réalisées sous anesthésie à l’isoflurane, cet acte n’induira pas de stress supplémentaires aux animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de pouvoir vérifier par autopsie l’absence de reprise tumorale.

Remplacement

La preuve de concept de l’utilisation de ces Acs bimodaux pour de la chirurgie assistée par fluorescence nécessite de pouvoir se rapprocher le plus possible de ce qui est retrouvé chez l’Homme et donc d’avoir les tumeurs primaires sur les organes d’origine et les métastases se disséminant. Le but est de montrer que les tumeurs sont plus facilement détectables, qu’elles peuvent être éliminées plus finement et ainsi permettre une meilleure récupération post-chirurgie et enfin qu’il y a moins de récidive. Cette preuve de concept ne peut donc être faite que sur des animaux présentant ce type de tumeurs et sur lesquels sera fait la FGS. Tous les tests in vitro préalables ont déjà été faits, tout comme la preuve de concept sur des modèles plus artificiels d’animaux porteurs de tumeurs sous-cutanée.

Réduction

Pour chaque Ac bimodal à tester (5), deux groupes de 5 souris (contrôle vs Ac bimodal) seront constitués afin de générer des groupes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer l’efficacité de la chirurgie tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. La visualisation de la récidive par imagerie SPECT après injection du même Ac bimodal permet de réduire le nombre d’animaux qui sont leur propre contrôle. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées (formation de niveau concepteur de projet avec soit une formation chirurgie du petit animal soit être chirurgien) afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les prises tumorales peuvent être différentes d’une chirurgie à l’autre, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes.

Raffinement

Les souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Les souris étant immunodéprimées, elles seront hébergées sous couvercle filtrant et une antibiothérapie préventive sera utilisée avant chaque chirurgie. La totalité des procédures chirurgicales impliquant les animaux (injection sous-cutanée, intraveineuse, imagerie, chirurgie abdominale) est réalisée sous anesthésie suivie d’un réveil sous lampe chauffante ou couveuse, réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Tout au long des opérations, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydratation (pli de peau) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Étant donné que la température ne peut pas être contrôlée et que le risque d’hypothermie est sévère lors d’une anesthésie, des tapis chauffants seront utilisés tous le long de l’expérimentation. Les animaux bénéficieront d’une réhydratation per- et post-opératoire ainsi qu’une prise en charge antalgique adaptée. Un système facilitant la prise alimentaire ainsi que la prise de boisson sera mis en place (nourriture gélifiée). Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Les injections intrapéritonéales (cellules pour le modèle de carcinomatose péritonéale et luciférine) seront réalisées sous anesthésie. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. Le développement des tumeurs (taille et nombre) sera estimé de manière non-invasive par imagerie de la bioluminescence après injection de luciférine.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles utilisés pour tester facilement les nouveaux outils permettant de faire de la chirurgie assistée par fluorescence. Nous utiliserons des souris immunodéficientes Swiss Nude, nous permettant d’implanter des cellules tumorales humaines (HCT116-luc et PANC-1-luc). Ces souris ont déjà été utilisées lors des premiers travaux avec des tumeurs humaines xénogreffées. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant (supérieur à 20g).

792 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent en intraveineuse une dose unique de candidats anticancéreux, subissent des prélèvements de sang répétés à la queue, puis un prélèvement terminal de grand volume par ponction cardiaque sous anesthésie "pouvant induire un arrêt cardiaque", les effets indésirables attendus allant de la perte d'appétit à la diarrhée. Le porteur précise que les souris écartées du protocole, trop légères ou mal injectées, servent d'abord à s'entraîner aux gestes techniques avant d'être tuées. Il affirme qu'un "organisme entier et vivant" est "nécessaire" pour ces analyses de tolérance.

Objectifs

Ce projet vise à déterminer la tolérance lors de l’administration des candidats de thérapie ciblée anticancéreuse. Les données de tolérance sont nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats anticancéreux dans la circulation sanguine en dose unique. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats de tolérance (projet actuel), seront objectivables entre l’humain et le modèle souris et serviront, à terme, à définir les modalités d'administration du médicament (dose et fréquences), lors des premiers essais cliniques. Ils permettront également d’objectiver des évènements indésirables. La première dose de cette étude sera déterminée en se basant sur une dose de référence connue, efficace et bien tolérée.

Bénéfices attendus

Les données de tolérance seront nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats anticancéreux dans la circulation sanguine. Ces études permettront de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité et ainsi, à terme, de déterminer les doses et les fréquences des premières études cliniques chez l’Homme.

Procédures

# Une contention et des prélèvement(s) sur animal vigile seront prévues sur chaque animal : -lors de l’injection par voie intraveineuse dans le veine de la queue des candidats anticancéreux J(0) (5minutes) -lors de chacun des prélèvements sanguins (en éraflant la veine de la queue pour ne prélever qu'une goutte de sang) à chaque temps (J(-3) , J(3) et J(9) post-traitement - 5 minutes). Une anesthésie générale sans réveil sera effectuée sur chaque animal en fin d’expérimentation et/ou atteignant les critères éthiques pour effectuer un prélevement sanguin final de grand volume, suivie d’une mise à mort (10 minutes).

Impact sur les animaux

# Les animaux subirons un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : (1) changes, (2) pesées, (3) contentions et (4) anesthésies. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de l’injection par voie intraveineuse des candidats anticancéreux (au temps J(0)), et (2) de chacun des prélèvements sanguins(en éraflant la veine de la queue pour ne prélever qu'une goutte de sang) à chaque temps (J(-3) , J(3) et J(9) post-traitement). # S’agissant d’une expérience de tolérance, les composés de la classe thérapeutique utilisée peuvent induire des évènements indésirables à haute dose (parmi les plus attendus : perte d’appétit, fatigue, diarrhées, perte de cheveux…), pouvant aller jusqu'à l'atteinte des critères ethiques. Il est à noter que ces effets sont généralement transitoires (environ une semaine pour les doses les plus fortes et culminant autour du 3ème jour post-traitement). # Un prélevement sanguin final de grand volume, pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiquée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil sur l’ensemble des animaux arrivant en fin d’expérience (à 28 jours post-traitement) ou en cas d'atteinte des critères éthiques.

Devenir

L’ensemble des animaux entrés en procédure seront euthanasié : - Tous les animaux ayant atteint les critères éthiques ainsi que les animaux arrivant en fin d’expérience à 28 jours post-traitement auront un prélèvement sanguin de grand volume (par piqure dans le coeur) effectuée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil. - Les animaux ayant atteint les critères éthiques et dont l’état ne permet pas de pratiquer ce prélèvement de grand volume , seront mises à mort par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse. - Les souris non entrées en protocole (problème à l'injection, poids inférieur à 24g...), seront reformées pour pouvoir pratiquer des entrainement aux geste techniques, puis mises à mort par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse.

Remplacement

S’agissant d’analyses de tolérance, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. De plus, les candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse étudiés dans ce projet ayant une efficacité comparable entre humains/souris aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris.

Réduction

Le procédé de micro-échantillonnage lors des prélèvements sanguins permet d’obtenir l’ensemble des valeurs pour un même animal en ne lui prenant que de très faibles quantités de sang. Le nombre d’animaux utilisés est ainsi considérablement réduit par rapport à un prélèvement sanguin classique et les variations inter-individus seront également mieux maîtrisées. En cas d’obtention de la dose maximum tolérée, les animaux prévus pour les doses suivantes seront annulés. Les animaux étant livrés chaque semaine pour les différents tests de dose, cela permettra de diminuer le nombre d’animaux entrés en protocole. Pas d’utilisation de groupe contrôle nécessaire par rapport aux échantillonnages de par l’utilisation d’un prélèvement sur les souris en expérience à J(-3) avant traitement par les candidats anticancéreux (permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux).

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels, bâtons à ronger, ou équivalents). Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Chaque essai de dose sera séparé du précédent d’une semaine, ce qui permettra d’ajuster au mieux les doses (ainsi que la souffrance résultant d’utilisation de doses trop élevées). Une surveillance comportementale et physiologique poussée des animaux ainsi que la définition d’une grille de score adaptée et suffisamment prédictive permettra d’anticiper et d’éviter au mieux toute souffrance animale. Les animaux seront observés sur critères physiques et comportementaux deux fois par jour pendant les trois premiers jours de traitement, puis une fois par jour jusqu’à la fin de l’expérience à J(28), et seront pesés une fois par jour pendant la première semaine, puis trois fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience à J(28). Un système de surveillance est mis en place au sein de l'établissement utilisateur pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le week-end et les jours fériés. Les animaux inclus dans la grille de score n'atteignant pas les critères éthiques de mise à mort recevront des soins adaptés (alimentation et abreuvement facilités, réchauffement...). Une pommade antalgique/anesthésique pourra également être utilisée en cas d’inflammation au site d’injection. Le prélèvement sanguin final de grand volume (par piqure dans le coeur) sera effectuée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil et les prélèvements d’organes seront réalisés après la mort de l'animal.

Choix des espèces

S’agissant d’analyses de tolérance, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. De plus, les candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse étudiés dans ce projet ayant une efficacité comparable entre humains/souris, aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études. En plus, les données d’efficacité anticancéreuses et de pharmacocinétique (le devenir du médicament dans le sang au cours du temps) seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux les doses et les fréquences d'administration de ces candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse chez l'Homme.. Les animaux seront livrés à 7 semaines de développement et inclus en expérience à 8 semaines . A cet âge-là, les animaux sont adultes avec un système immunitaire et des organes matures permettant une tolérance pertinente par rapport au type de thérapies utilisées dans ce projet.

552 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie abdominale sous anesthésie pour induire une tumeur du foie, des injections d'un anticorps deux fois par semaine pendant quatre semaines et des mesures de tumeur par imagerie, la tumeur pouvant provoquer gêne et douleurs. Le projet cherche à confirmer qu'un anticorps déjà développé freine le cancer du foie et l'associe à des immunothérapies existantes. Le porteur affirme qu'une "validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier" reste nécessaire avant tout passage chez l'humain.

Objectifs

Le cancer du foie qui est le 3ème cancer le plus meurtrier dans le monde. Le traitement de référence des formes graves fait appel à des anticorps ciblant le système immunitaire, mais seul un faible pourcentage de patients répond à ces traitements. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du foie dans un modèle de souris ne présentant pas de système immunitaire. Nous avons également montré que le traitement de cellules issues de patients par notre anticorps permet d’activer les cellules immunitaires. Ceci suggère que notre anticorps pourrait améliorer l’efficacité des thérapies existantes ciblant le système immunitaire pour le traitement du cancer du foie. L’objectif de notre projet est tout d’abord de valider nos résultats précédents en confirmant la capacité de notre anticorps à inhiber la progression tumorale dans des souris présentant un système immunitaire fonctionnel, mais également d’évaluer l’efficacité de notre anticorps en combinaison avec des anticorps ciblant le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Le cancer du foie est un cancer pour lequel le nombre de cas est en augmentation constante partout dans le monde, et les traitements actuels ne permettent de soigner qu’un faible pourcentage de malades. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies actuelles qui ciblent le système immunitaire et ainsi la prise en charge des malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologie du foie.

Procédures

Tous les animaux de ce projet seront soumis à une opération chirurgicale sous anesthésie générale d’une durée d’environ 20 minutes. Une fois par semaine, les animaux recevront une injection d’un composé permettant de mesurer la taille des tumeurs sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute. Puis les animaux seront anesthésiés afin de réaliser la mesure, qui dure au maximum 10 minutes. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 2 fois par semaine pendant 4 semaines par injection réalisée sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Notre modèle induit des tumeurs dans le foie, qui peuvent entrainer une gêne et des douleurs au cas où la tumeur dépasse une certaine taille. De même, les injections répétées peuvent parfois engendrer de l’inflammation, une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs, foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, en améliorant au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps par le biais d'une étude pilote sur une petite cohorte d'animaux afin de choisir la dose la plus éfficace. Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton et de la frisure de kraft pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimatation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections répétées.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte à partir de 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature.

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur colorectale leur est greffée sous la peau, puis elles reçoivent des traitements par gavage, des mesures répétées de la tumeur et des prélèvements de sang sous anesthésie, pour tester un composé inhibiteur associé à une immunothérapie. Les bénéfices annoncés pour les patients ne répondant pas à l'immunothérapie restent formulés au conditionnel. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ne reproduit encore les interactions de l'environnement tumoral et que ce modèle est "nécessaire".

Objectifs

Dans le microenvironnement tumoral, les fibroblastes associés à la tumeur favorisent la malignité en sécrétant des facteurs empêchant le système immunitaire de s'attaquer aux tumeurs fibreuses et favorisant ainsi les métastases. Des immunochemothérapies ont été testées, lors d'un précédent projet collaboratif, pour améliorer la réponse immunitaire naturelle qui reconnaît le cancer comme étranger. Cela n'a produit que peu d'effet dans ces cancers riches en fibroblastes. L'inhibition (par un de nos composés en développement clinique) d'une enzyme spécifique a permis de stopper la migration et invasion de cellules tumorales (métastases) et de cibler l’activation des fibroblastes pour aider le système immunitaire. Inhiber cette enzyme pour des cancers fibreux est alors devenu une voie de traitement envisagée. Le cancer du côlon est connu pour présenter des tumeurs solides présentant une enveloppe fibreuse exprimant fortement cette enzyme. Pour tester l’effet des composés inhibiteurs de cette enzyme spécifique sur les fibroblastes et la réponse de la tumeur à l’immunothérapie dans ce cancer précisément, nous allons utiliser le modèle murin sous-cutané de cancer du colon, qui développe des tumeurs immunogènes répondant à des anticorps inhibiteurs d’un contrôle immunitaire.

Bénéfices attendus

Un composé inhibant cette enzyme spécifique est important à tester dans le contexte de cancers fibreux, dans un objectif de ciblage des fibroblastes associés à la tumeur. Ceci pourra affecter les caractéristiques de la malignité, y compris la prolifération des cellules cancéreuses, l'invasion et les métastases, mais aussi l'effet sur le phénotype du myofibroblaste dans la tumeur et la réponse immunitaire anti-tumorale. Cela peut atténuer la réaction tissulaire stromale entourant les tumeurs solides, permettant la pénétration accrue des molécules de chimiothérapie dans le noyau tumoral pour faciliter la destruction des cellules cancéreuses. Le composé peut également permettre de rompre cette barrière fibreuse construite par les fibroblastes et de permettre à nouveau un environnement immunocompétent, conduisant le système immunitaire à voir les cellules cancéreuses comme étrangères pour augmenter la mortalité de ces cellules chez les patients qui n'ont pas répondu à l'immunothérapie.

Procédures

induction après rasage : une injection sous cutanée dans le bas du dos (moins de 30 secondes), pesées et traitements par gavage (voie orale, 2 maximum par jour, moins de 10 secondes chacun), mesure de la tumeur 2 fois par semaine - 30 secondes / prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse profonde (à J7 pour 4 animaux par groupe et en final pour tous) 3 minutes - et de la tumeur après la mort.

Impact sur les animaux

Les souris seront soumises à plusieurs types de contraintes engendrant du stress et douleur légère : injection de cellules tumorales en sous-cutané sous anesthesie gazeuse, traitements par voie orale grâce une sonde oesophagienne, injections intraperitonéales, contention pour la mesure de la tumeur et la pesée des souris.

Devenir

mise à mort pour prélevement de sang et de la tumeur.

Remplacement

Les progrès technologiques permettent de plus en plus le remplacement des animaux par des méthodes alternatives. Ces changements sont une bonne chose et dès que cela est possible nous réalisons des expériences in vitro dans le but d’identifier les composés les plus prometteurs, pour les tester par la suite in vivo. Dans le cadre de nos recherches, nous étudions l’effet des molécules sur le développement tumoral afin de traiter in fine des tumeurs humaines. L'environnement tumoral qui va se développer va interagir avec plusieurs éléments de l'organisme. Malheureusement, ce genre d’interaction ne peut pas encore être reproduite in vitro c’est pour cela que la recherche in vivo, et ce modèle en particulier, est nécessaire.

Réduction

Ce modèle a déjà été utilisé pour tester des inhibiteurs de Nox au sein de notre laboratoire. Les données obtenues précédemment ont été utilisées dans le but de déterminer le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. De plus, des tests in vitro sont réalisés au préalable afin de tester nos composés. Les données ADME des différents composés ainsi que leur profil pharmacocinétique seront obtenus avant le début des procédures. Nous ne testerons donc que les composés les plus puissants en pharmacologie primaire et ceux présentant les caractéristiques d’un potentiel futur médicament. Différents tests statistiques nous permettrons de démontrer l’efficacité de nos molécules par rapport à un contrôle ou un potentiel effet-dose.

Raffinement

Les composés testés seront administrés par voie orale. Cette technique, rapide et nécessitant une contention courte, est bien tolérée par les animaux. Après réception des animaux, ils seront placés dans des cages où des carrés de ouate seront mis à leur disposition pour la construction de leur nid. Un dôme rouge au minimum sera aussi présent afin que les animaux puissent se cacher. Leur comportement de rongeur sera encouragé par la présence d’un bâton de bois dur par animal. La nourriture et l’eau seront en libre accès tout au long de l’étude. Les animaux seront monitorés quotidiennement (à chaque traitement) pour la surveillance de signes cliniques éventuels et vérifier l'absence de souffrance.

Choix des espèces

Les souris sont une espèce de choix pour l’étude de modèles cancéreux de par les nombreuses études déjà réalisées. Ce modèle de xénogreffe est très bien décrit dans la littérature. Les souris femelles seront utilisées car nous avons une expérience antérieure d’études in vivo sur ce modèle avec des souris femelles. Nous utiliserons des animaux de 8 à 10 semaines. Il est maintenant prouvé que les processus de fibrose sont réversibles dans le jeune âge et les biomarqueurs associés à la fibrose ont un turnover plus faible en vieillissant. Il n’y a pas nécessité d’ajuster des doses ou de prendre des dispositions particulières liées au jeune âge ou au contraire à l’âge avancé.

2 476 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur pulmonaire leur est greffée par injection, puis elles reçoivent jusqu'à quatre vaccins ARN administrés dans le poumon sous anesthésie et subissent des séances répétées de tomographie et des prélèvements sanguins. Le porteur affirme sortir les animaux de l'expérimentation avant que les tumeurs n'atteignent leur physiologie, si bien qu'aucune modification du comportement ne serait détectable. Il présente comme espoir de "soigner un nombre important de patients" et revendique l'impossibilité de tester cette preuve de concept ailleurs que sur un système vivant complet.

Objectifs

Les vaccins à ARN messager ont permis de juguler la mortalité liée au SARS-COV2 dans les pays développés. Ces technologies basées sur les ARN ont permis pour la première fois de produire un vaccin efficace en un temps extrêmement court. Cette adaptabilité des technologies ARN les rend très attractives pour la lutte contre le cancer. Ce projet a pour objectif à court terme de prouver qu’il est possible d’induire une réponse immunitaire anti-tumorale spécifique dans le cancer du poumon en utilisant une nouvelle approche vaccinale. Notre stratégie expérimentale doit donc permettre de : 1) Fournir la preuve de concept qu’il est possible de soigner le cancer du poumon en utilisant une stratégie de vaccin ARN. 2) Caractériser précisément les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels cette nouvelle stratégie vaccinale pourrait fonctionner de façon optimale.

Bénéfices attendus

Par le développement de cette nouvelle technologie vaccinale, nous pensons être en mesure de soigner un nombre important de patients pour lesquels il n’existe pas de traitement efficaces sur le long terme à ce jour. Ces investigations réalisées chez la souris seront une pierre angulaire dans l’implémentation d’un vaste projet impliquant 7 équipes en Europe et visant à aboutir sur la validation d’une nouvelle stratégie vaccinale. En somme, si comme nous l’espérons, nous fournissons par ce projet la preuve que notre nouvelle formulation vaccinale peut permettre de lutter plus efficacement contre le cancer du poumon, nous serons en mesure de proposer cette technologie aux patients dans un temps très court.

Procédures

La transplantation des lignées tumorales sera effectuée par injection intraveineuses (une fois sur chaque animaux) ou sous-cutanée (une fois par animal). Cette injection nécessite une contention des souris de deux minutes maximum. Une petite proportion des animaux subira un prélèvement de sang par incision de la veine caudale. Ce geste ne sera répété qu’une fois avec un intervalle de deux semaines. Cela nécessite de placer les animaux sous une lampe chauffante durant 5 minute puis une contention de deux minute. La majorité des animaux subiront des tomographies (technique d’imagerie non invasive) permettant de suivre l’évolution de la croissance tumorale nécessitant une anesthésie gazeuse qui aura lieu à une fréquence d’une fois toutes les deux semaines et sera répétée 6 fois maximum. Les animaux seront anesthésiés par le gaz durant 15minutes maximum puis placés dans une cage de réveil pendant au moins une heure avant de retourner dans leur cage d’hébergement. L’administration dans le poumon de notre vaccin sera réalisée sans chirurgie mais demande une anesthésie des animaux. Pour réduire le nombre de d’anesthésies, nous combinerons la vaccination avec la tomographie. Il y aura un maximum de 4 vaccinations par animal espacées de deux semaines. Les animaux seront anesthésiés par le gaz durant 15minutes maximum puis placés dans une cage de réveil pendant au moins une heure avant de retourner dans leur cage d’hébergement.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables pour les animaux sont : - L’initiation et le développement du cancer du poumon. Nous avons adapté nos protocoles et mis en place des techniques de suivi des animaux de sorte que nous considèrerons les animaux seront sortis de l’expérimentation avant que la croissance des tumeurs ne cause une atteinte significative à leur physiologie. Suivant nos procédures, aucune modification du comportement des animaux ni de leur performance physique n’est détectable en lien avec le développement de la maladie car nous arrêtons les protocoles à un stade suffisamment précoce du développement de la maladie. - Une infection au site d’injection ou de prélèvement de sang - Les anesthésies répétées

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour les besoins expérimentaux nécessitant l’accès aux sang, rates, ganglions et au poumons.

Remplacement

Nous développons une approche vaccinale qui a pour objectif de changer les interactions en le l’hôte et la tumeur par le développement d’une réponse immunitaire anti-tumorale. La preuve de concept de notre stratégie ne pourrait donc être réalisée en système in vitro ou par simulation informatique car elle doit être intégrée dans un système physiopathologique complet. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, les différentes formulations de vaccins ont été ou sont en cours d’évaluation in vitro. A ce jour nous avons validé 13 formulations et continuons d’en identifier d’autres. Pour des raisons de éthiques et de faisabilité, nous ne dépasserons pas ce nombre de formulation différentes.

Réduction

Le nombre d’animaux sera au maximum de 2476 souris sur 5 ans, nous permettant d’évaluer de manière exhaustive les effets physiologiques (effets anti-tumoraux, croissance tumorale et survie) mais aussi mécanistiques (implication du système immunitaire et composantes cellulaires et moléculaires associées) de nos vaccins. Le nombre d’animaux a été évalué de manière à effectuer des tests statistiques relevant pour définir la significativité de nos résultats. Pour réduire le nombre d’animaux, notre projet est conçu de sorte à ce que les premières étapes de validation permettent de réduire le nombre de conditions possibles par l’optimisation des modèles et la sélection d’une seule formulation de vaccin à partir de 13 candidats validés in vitro. Enfin ce projet a pour but de fournir une preuve de concept dans un modèle préclinique justifiant le transfert de notre technologie chez les patients. Hors comme l’utilisation de ce modèle nécessite un parcours expérimental de 6 mois avec les animaux génétiquement modifiés, nous avons défini une construction de notre projet qui repose sur des étapes de validation de nos candidats vaccin sur des temps cours en privilégiant des procédures ne nécessitant pas d’intervention lourde sur les animaux. Ainsi, même si réduit au maximum le nombre d’animaux reste élevé, nous travaillerons à l’optimisation de l’utilisation de chaque animal.

Raffinement

Les animaux seront hébergés (5 par cage) en milieux enrichis, la durée d’hébergement des animaux est réduite au minimum. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement pour détecter tout signe de stress et d’agressivité. Si nécessaire un animal agressif pourra être isolé des autres mais pour une durée maximale de 5 jours. Un suivi de l’apparition d’autres signes cliniques sera effectué au cours de l’expérience. Ils seront reportés sur une fiche de suivi clinique, mise en place par la Structure du Bien-Etre Animal (SBEA). Dans les conditions expérimentales définies, les animaux ne souffriront d’aucune difficulté à se mouvoir et à s’alimenter. Même si l'ensemble de nos procédures sur lesquelles nous avons du recul ne devrait pas le nécessiter, l'utilisation d'analgésiques ou d'anti-inflammatoires pourra être envisagée. Au cours de nos expériences antérieures, nous n’avons jamais observé de signe de prostration, de diarrhée ou de déshydratation. Néanmoins, un arbre décisionnel basé sur le poids, la prostration, la détection de difficulté respiratoire, l’agressivité et l’isolement décidera de l’arrêt de toute expérimentation de l’utilisation d’analgésique voir de la mise à mort des animaux. Notre pratique vise à réduire le plus possible les contacts avec les animaux pour limiter les contentions et le stress qui y est associé.

Choix des espèces

Le modèle murin utilisé dans notre étude est le plus relevant pour atteindre les objectifs fixés et tester les effets de nos thérapies sur la réponse immunitaire anti-tumorale afin de mettre en évidence des effets vaccinaux sur le long-terme. Ces souris immunocompétentes sont greffées avec des tumeurs murines de même fond génétique. Les souris que nous utilisons offrent à ce jour le meilleur modèle de cancer du poumon autochtone pour adresser les questions biologiques que nous développons ainsi que pour fournir la preuve de concept de l'efficacité de notre nouvelle thérapie. En effet, dans ce modèle, le développement tumoral à lieux dans des individus présentant un système immunitaire intacte mimant parfaitement la maladie humane, non seulement d’un point de vue immunitaire mais aussi au regard des mutations conduisant à l’apparition des tumeurs.

20 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une tumeur colorectale humaine greffée sous la peau, elles reçoivent un peptide radiomarqué au fluor-18 puis passent en imagerie sous anesthésie, avant une ponction cardiaque terminale. L'objectif est d'évaluer la distribution de ce traceur pour le diagnostic du cancer du côlon. Le porteur affirme que les résultats in vitro sont insuffisants et qu'un modèle animal porteur de tumeur est "indispensable".

Objectifs

On estime, en 2018, à plus de 43 000 le nombre de nouveaux cas de cancer colorectal en France. Il s'agit du troisième cancer le plus fréquent et du deuxième cancer en termes de mortalité, avec plus de 17 000 décès par an en 2018. Le cancer du côlon est guérissable dans plus de 90% des cas lorsqu'il est diagnostiqué tôt. Ainsi, le diagnostic précoce de ces cancers est un enjeu majeur afin d'établir un traitement le plus tôt possible et par conséquent avoir un impact direct sur la survie du patient. Même s'il existe des tests biologiques de plus en plus performants, l'imagerie médicale, si elle est optimisée, reste un outil performant et quasi non invasif pour la détection précoce de ces cancers. Dans ce projet, nous nous sommes intéressés au récepteur de la neurotensine qui est exprimé au niveau du cancer du côlon (lignée HT 29). Aujourd’hui, il n’existe pas de médicament radiopharmaceutique ciblant le récepteur de la neurotensine utilisé en routine. Dans ce projet préclinique, 1 peptide radiomarqué au fluor-18 sera étudié sur 20 souris porteuses de tumeurs du colon (lignée HT-29).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une avancée en recherche préclinique sur la thématique des radiothéranostiques (diagnostiques et thérapeutiques). Si cet analogue de la neurotensine donne de bons résultats in vivo en imagerie PET, nous pourrons envisager une étude thérapeutique plus poussée (TRT : Targeted Radiotherapy) en utilisant ce même ligand radiomarqué avec un radionucléide thérapeutique tel que le Lutétium-177.

Procédures

Les différentes interventions sur les 20 souris Balb/c nude sont les suivantes : - 1 xénogreffe sous-cutanée de cellules tumorales (cancer colorectal) sur le flanc droit (5 min) - 2 Injections intraveineuses au niveau de la queue sous anesthésie gazeuse pour les 20 souris (5 min) - 2 imageries de 20 min sous anesthésie gazeuse - 1 ponction cardiaque terminale sous anesthésie gazeuse 3% (5min)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues seront : 1) l'inoculation des tumeurs au niveau du flanc droit pouvant engendrer un stress 2) une pousse de tumeur trop importante ou une nécrose potentielle de la tumeur peut entrainer une gêne localisée 3) les anesthésies pour les imageries ([18F]FDG et du radiopeptide étudié) peuvent impactées la souris. 4) la mise à mort en fin d'étude.

Devenir

A la fin de la procédure, les 20 souris seront mises à mort. Le sang et les organes seront prélevés pour un comptage radioactif et analyses immunohistochimiques ultérieures.

Remplacement

Les résultats in vitro ne sont pas suffisants pour valider le devenir de l’analogue de la neurotensine radiomarqué in vivo. L’utilisation de modèles animaux porteurs de tumeurs avec une forte expression du récepteur à la neurotensine est indispensable pour déterminer la faisabilité d’un ciblage oncologique par le peptide radiomarqué.

Réduction

Les expérimentations ont été conçues afin d’utiliser le moins d’animaux possibles. Pour l'étude de l'analogue de la neurotensine radiomarqué avec un radioisotope dédié au diagnostic PET, il est nécessaire de visualiser la biodistribution in vivo et d’identifier les organes présentant une forte expression des récepteurs à ce neuropeptide. Pour cette étude, un modèle murin présentant une xénogreffe sous-cutanée d'une lignée de cancer humain du colon sera utilisé. La présence du récepteur à la neurotensine sur cette lignée a été validée in vitro. La saturation de tous les récepteurs cibles par la neurotensine froide injectée en large excès (groupe dit de "blocking") permet une non fixation du peptide radioactif. Pour cette étude de validation de la biodistribution du radiopeptide, un t-test sera réalisé avec un nombre minimum de 10 souris xénogreffées par condition. Ce nombre permet de prendre en compte une pousse tumorale hétérogène. Ainsi, 10 souris seront injectées avec le radiopeptide seul et un groupe dit "blocking" incluant 10 souris injectées avec le radiopeptide + un large excès de neurotensine "froide".

Raffinement

Les souris étant immunodéprimées, celles-ci sont logées dans des cages ventilées adaptées au maintien d'un statut sanitaire exempt d'organismes opportunistes et pathogènes à l’intérieur des salles de stabulation de l’animalerie de recherche agréée où l’ambiance est parfaitement contrôlée (hygrométrie, température, ventilation, bruit). De plus les cages sont équipées d’enrichissement pour limiter le stress. Les souris immunodéprimées sont hébergées dans des cages ventilées adaptées au maintien d'un statut sanitaire exempt d'organismes opportunistes et pathogènes (SOPF). Une limitation du nombre de souris par cage est également requise. Les animaux sont nourris ad libitum et toute manipulation invasive sera précédée d’une anesthésie générale sous isoflurane 2%. Nous avons choisi des points limites clés qui permettent de prévenir une détérioration de l’état clinique générale de l’animal dans le but d’éviter une quelconque souffrance. Les points limites sélectionnés sont les suivants : perte de poids supérieure à 20%, déshydratation, immobilité de plus de 1h (signe d’une douleur aigüe), ulcération et limitation de la taille de la tumeur. Si un des points limites est atteint l'animal sera sorti de l'étude et la décision sera prise par le vétérinaire soit de soigner l'animal soit de l'euthanasier par dislocation cervicale.

Choix des espèces

Le modèle souris est communément utilisée en oncologie. La Balb/c nude est une souris d’une souche consanguine immunodéprimée et sans poil qui en fait l’un des meilleurs modèles pour la xénogreffe sous-cutanée de tumeur humaine. Des souris femelles seront utilisées pour cette étude car moins agressives que les mâles (moins de risques de blessures au niveau de la tumeur). Les souris seront réceptionnées à 8 semaines et mises en quarantaines pendant 2 semaines. Les études seront initiées à 10 semaines de développement. L’induction des tumeurs se fera à 10 semaines. A ce stade de développement, la souris est une jeune adulte. Les prises de greffe sont plus homogènes sur des individus jeunes. Lorsque les tumeurs atteindront un volume minimum de 150 mm3, l'étude de biodistribution pourra être initiée.