Cancers

1 191 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation suivie d'une greffe de moelle osseuse, quatre gavages, des prélèvements de sang et l'implantation d'une pompe osmotique sous anesthésie, pour reproduire une myélofibrose que 100 % des animaux développent. Le porteur indique que la maladie provoque une splénomégalie, une perte d'appétit et un amaigrissement. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut réunir ces paramètres et conclut à la nécessité de la souris pour étudier la maladie dans un "organisme dans sa globalité".

Objectifs

Les néoplasmes myéloprolifératifs sont des cancers du sang caractérisés par la prolifération excessive des cellules myéloïdes tels que les globules rouges, les mégacaryocytes (donnant naissance aux plaquettes) et des granulocytes et peuvent aboutir au développement de leucémies, dont la plus grave est caractérisée par les mutations dans des gènes régulant la production de plaquettes. Elle conduit à une amplification anormale de plaquettes dans la moelle osseuse qui vont s’activer et libérer différents cytokines et facteurs de croissance. Ces derniers vont agir sur les cellules stromales de la moelle osseuse ce qui conduira à la production de collagène en excès et à une dégénerescence par fibrose. Aujourd’hui, il n'existe aucun traitement efficace dans cette maladie, à l'exception de la greffe de moelle osseuse. Chez les patients atteints de cette maladie, les meiilleurs traitements sont inefficaces.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, il n'existe aucun traitement efficace de la myélofibrose. Ici nous proposons un nouveau modèle préclinique au développement de la MF rapide et homogène (100% d'animaux développent la maladie contre 60% avec les modèles précédemment décrits) qui nous permettra non seulement de décrypter les mécanismes physiopathologies de la maladie mais aussi de tester des drogues identifiées pendant une pédiode courte et sur un nombre d'animaux diminué car ce nouveau modèle est très reproductible. Les bénéfices potentiels sont le développement de traitements pour cette pathologie grave.

Procédures

Gavages 4 fois, durée 1 minute. Irradiations: 1 fois (13 minutes) et greffes (durée 5 minutes), sous anesthésie générale. Prélèvements de sang (nombre 3), durée 2 minutes sous anesthésie générale. Injections des médicaments (1 ou 2 injections) durée 1 minute, anesthésie locale. Implantation de pompes osmotiques, durée 8 minutes, une fois, sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Le gavage induit une contrainte légère. Les irradiations suivies de greffe induisent une contrainte modérée pour les animaux: fatigue transitoire, possibilité de diarrhée transitoire. Les injections et les prélèvements de sang induisent une contrainte légère et transitoire du fait de la préhension des animaux. L'implantation de pompes osmotiques est une peite chirurgie légère qui est très bien tolérée. Le modèle proposé conduit au développement de la myélofibrose accompagnée de la diminution de cellules hématopoïétiques au niveau de la moelle osseuse et leur augmentation au niveau de la rate (splénomégalie). Les animaux peuvent présenter des signes cliniques du fait de la perturbation de la formule sanguine, avec perte d'appétit et amaigrissement.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour analyses sur les organes hématopïétiques.

Remplacement

Le développement de la myélofibrose survient dans un environnement qui nécessite la présence de différentes cellules, les cellules hématopoïétiques porteuses de la mutation causale de la maladie, différents types de cellules de l'environnement qui seront activées après la libération de cytokines par les cellules hématopoïétiques et le confinement de la moelle osseuse. Il est impossible de réunir ces paramètres in vitro. De plus, la maladie ne touche pas uniquement la moelle osseuse, on observe la splénomégalie et la fibrose au niveau de la rate. Seuls les traitements de souris mimant les symptômes hématologiques des patients atteints de NMP permettront d’analyser leur efficacité dans l’organisme dans sa globalité, incluant la réponse immunitaire contre les cellules mutées.

Réduction

Le nombre d'animaux par lot a été minimisé et s'est basé sur la littérature et l’expérience du laboratoire sur ce modèle de maladie. Le nombre indiqué ne sera atteint que si tous les médicaments présentent un effet sur la myélofibrose. Si un médicament n'a pas d'effet, le test sera arrêté précocément.

Raffinement

Toutes les interventions (greffes, prélèvement de sang) seront faites sous anesthésie générale. Une surveillance clinique quotidienne sera effectuée pour s'assurer de leur santé physique et comportementale. Une alimentation adaptée sera ajoutée dans les cages en cas de diminution de la prise alimentaire et les points limites précoces seront strictement appliqués. Les animaux bénéficieront d'un environnement enrichi en tout temps (abri en carton, papier, coton, ...).

Choix des espèces

L'utilsiation de souris nous permets dans un temps très court l'obtention d'un nombre d'animaux à expérimenter. Nos modèles miment parfaitement les pathologies humaines (Thrombocytémie Essentielle et Polyglobulie De Vaquez) qui mènent à la myélofibrose. Ce sont donc de bons modèles, statistiquement solides et probant pour les études proposées. Ces souris modèlisent au plus près les conditions pathologiques humaines. Le modèle conduit à un développement rapide de la myélofibrose et ceci de façon très homogène ce qui permet de réduire le nombre d'animaux et le temps de traitement.

1566 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe des cellules cancéreuses par voie sanguine ou sous-cutanée sous anesthésie, puis elles reçoivent divers traitements par injection ou gavage et des prélèvements de sang à la joue, pour évaluer un traitement sur cinq types de cancers. Le porteur indique que le développement tumoral peut entraîner une gêne pour se déplacer, un amaigrissement et un isolement, et que toutes les souris sont tuées pour analyser leurs organes. Il affirme que seul un modèle vivant entier permet d'étudier l'évolution tumorale et les récidives.

Objectifs

Pour traiter leucémie et tumeurs solides, il est important de trouver de nouvelles façons de soigner les patients tout en minimisant les effets secondaires. Récemment, il a été développé un médicament spécifique des cellules qui prolifèrent rapidement (comme les cellules cancéreuses). Aujourd’hui, ce traitement est testé en essai clinique sur des patients atteints de leucémie, et nous souhaitons élargir l’utilisation de notre traitement à d’autres cancers agressifs, comme celui du poumon, du sein, du pancréas et le mélanome. Dans des expériences préliminaires de laboratoire, ces cellules cancéreuses sont tuées efficacement par le médicament. L’utilisation de la souris nous permet de confirmer l’efficacité du médicament dans un environnement physiologique et vivant avant de tester le produit en clinique, chez l'homme. Dans une seconde partie du projet, comme il est souvent difficile de traiter totalement le cancer avec un seul médicament, nous souhaitons combiner notre traitement avec d’autres agents couramment utilisés en cliniques aujourd’hui. Ces combinaisons de plusieurs thérapies sont de plus en plus utilisées en clinique pour augmenter l’efficacité de traitement, réduire le risque que le cancer se redéveloppe et surtout réduire les effets secondaires. Nous avons déjà testé ces combinaisons en laboratoire et avons obtenus de résultats prometteurs. Avant de pouvoir appliquer notre traitement chez les patients atteints de cancers, seul ou en combinaison, il est nécessaire de valider nos résultats sur des modèles animaux qui récapitulent fidèlement ce que l'on observe chez l’homme. Ce projet nous aidera à mieux comprendre comment le cancer peut développer une résistance, comment notre traitement interagit avec le corps humain et d’ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement du cancer.

Bénéfices attendus

Le processus de développement d’un nouveau traitement, de sa conception initiale jusqu’à son autorisation de mise sur le marché, peut nécessiter en moyenne entre 15 et 20 années. Il est donc impératif d’optimiser au maximum l’utilisation de chaque avancée thérapeutique. Ce projet permettra d’une part d’optimiser le développement de notre traitement en l’appliquant sur différents modèles de cancer agressifs, notamment sur un modèle de cancer de pancréas pour lequel seules la chirurgie et la chimiothérapie conventionnelle existent. D’autre part, ce projet apportera une meilleure compréhension de la résistance thérapeutique, et dans la récidive du cancer. Cette compréhension favorisera la découverte de nouvelles combinaisons thérapeutiques, qui permettront de réduire la dose administrée de chaque traitement, et par conséquent réduire le coût, les effets indésirables, et surtout la résistance au traitement. En effet, ces bithérapies permettront d’offrir une alternative thérapeutique aux patients résistants à un agent, et donc cibler une plus large partie de la population. Ainsi, ce projet ouvrira de nouvelles perspectives dans le traitement des leucémies aiguës, de cancers solides, et offrira une alternative aux patients en quête de traitements plus efficaces et mieux tolérés.

Procédures

Les animaux seront soumis à des greffes de différentes cellules cancéreuses pour développer la maladie, par voie sanguine ou sous cutanée. Avant et pendant chaque greffe, les souris sont endormies. Les responsables du projet suivront l’évolution de la maladie 2 fois par semaine. Pour une des procédures, les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins au niveau de la joue pour surveiller l’évolution de la maladie. Ces prélèvements seront effectués sur des animaux endormies une fois par semaine au maximum, soit un total de 3 à 12 prélèvements totaux selon la procédure. Les animaux seront divisés en plusieurs groupes pour leur administrer différents traitements par voie sanguine, sous-cutanée ou par gavage. L’administration de traitements ne nécessite pas le recours à l’anesthesie. Selon les procédures, les différents traitements seront administrés par voie orale, par injection sous-cutanée ou par injection sanguine. Toutes interventions sur la souris (injections de cellules tumorales en sous cutanée, gavages, injection du traitement et prélèvements) effectuées par des membres qualifiés dureront 1 à 5 minutes maximum par souris. Le temps de developpement de la maladie (en sous cutanée ou par voie sanguine) est estimé à deux semaines. Au moins 2 fois par semaine, les responsables du projet observeront les animaux pour détecter tout inconfort ou signe de douleur.

Impact sur les animaux

Les transplantations de cellules, les prélèvements de sang, et les administrations de traitement par voie intraveineuse se feront sous anesthésies gazeuses, ce qui peut occasionner un stress de courte durée à l’induction et au réveil. Certains traitements sont administrés par voie orale avec une technique appelée gavage qui peut entrainer une gêne physique en cas d’administration quotidienne. Comme attendu dans ce projet, les greffes de cellules vont aboutir à un développement tumoral, qui, à un certain stade, peut occasionner une gêne pour se déplacer, un amaigrissement, une isolation, une perte d’activité.

Devenir

A l'issue des expérimentations, tous les animaux seront sacrifiés pour réaliser des analyses sur les organes et évaluer la présence éventuelle de cellules cancéreuses résiduelles.

Remplacement

Nous avons déjà effectué plusieurs tests de laboratoire (qui ne nécessitent pas l'utilisation d'animaux) qui ont confirmé l’efficacité antitumorale de notre anticorps seul et en combinaison avec d’autres médicaments. Cependant, ces modèles ne permettent pas d’étudier en profondeur l’évolution tumorale, les récidives, et la réponse de l’organisme au traitement. De plus, il est important d’évaluer consciencieusement les potentiels effets secondaires de notre traitement et s’assurer de la non-toxicité avant son application chez l’homme. Enfin, nous souhaitons étudier l’effet de notre traitement sur la survie des individus. Pour ces raisons, seul un modèle vivant entier pourra répondre entièrement à notre projet. La souris reste donc aujourd’hui le modèle le plus pertinent pour répondre à nos objectifs scientifiques.

Réduction

Grâce à des études déjà réalisées au sein de notre laboratoire et à des tests statistiques réalisés on sait que pour interpréter les résultats obtenus, il faut utiliser au moins 8 animaux par conditions. Ces calculs sont confirmés aussi par d’autres laboratoires, et sont également présents dans la littérature. En plus, nous utiliserons les mâles et les femelles pour généraliser la réponse au médicament chez les deux sexes.

Raffinement

Toutes les procédures seront soumises au respect du bien-être animal. Les animaux seront hébergés en groupe pour privilégier leurs interactions sociales, dans des cages propres et contrôlées, contenant des jouets. Les animaux seront observés quotidiennement par le personnel de l’animalerie et 2 fois par semaine par les responsables du projet. Les protocoles ont déjà été optimisés pour limiter au maximum le stress et la douleur. Les injections et prélèvements dures 5 minutes et sont réalisés par des membres qualifiés, sur les animaux endormis permettant la réduction du stress et douleur. En cas de douleur qui peut se développer à cause de l’évolution du cancer, des anti-douleurs leur seront administrés. Un score de douleur sera établi 2 fois par semaine selon une grille très spécifique. En cas de non-réponse aux antidouleurs, les animaux seront immédiatement euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est considérée aujourd’hui comme un modèle pertinent pour étudier et comprendre l’évolution du cancer et la réponse aux traitements observée chez l’homme, notamment du fait de la similarité biologique. Pour ce projet nous utiliserons des souris adultes (>6 semaines) pour refléter l'âge de développement de ces tumeurs chez l'homme.

1 200 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur met au point une greffe de cellules de cancer du pancréas directement dans le pancréas, par chirurgie abdominale ou par injection échoguidée, avec suivi de la tumeur et prélèvements sanguins répétés. Les souris sont euthanasiées lorsque la tumeur approche 1 500 mm3 ou en fin d'étude, pour prélever sang, tumeur et organes. Le porteur affirme qu'il est "impossible" de reconstituer in vitro les interactions de la tumeur avec son microenvironnement.

Objectifs

Le pancréas est un organe localisé à l’arrière de l’estomac. Il contient 2 types de cellules : les cellules exocrines dont la fonction est de libérer des enzymes et des sucs participant à la digestion et les cellules endocrines qui produisent des hormones notamment impliquées dans l’homéostasie glucidique. Avec 14000 nouveaux cas de cancers diagnostiqués par an, le cancer du pancréas est le 6e cancer le plus fréquent en France. Parmi les différents types de cancer du pancréas, l’adénocarcinome canalaire pancréatique (ACP), qui se développe dans le compartiment exocrine, représente 90-95% des cancers pancréatiques. L’ACP est un cancer très agressif et létal, avec un pourcentage de survie des patients à 5 ans inférieur à 10% (et seuls 20% des patients souffrant d’ACP survivent plus d’un an). Les traitements classiques de l’ACP sont la chirurgie qui permet de retirer la partie tumorale tout en conservant la partie saine du pancréas, la chimiothérapie et l’irradiation, mais ces traitements ne permettent pas d’améliorer significativement les résultats cliniques. Ainsi, il est important de développer de nouveaux traitements pour ce cancer afin d’améliorer la survie et la qualité de vie des patients. Dans le cadre de la recherche de nouveaux médicaments, les composés, après avoir été sélectionnés grâce à des tests in vitro, sont évalués in vivo chez des souris porteuses de tumeurs pour déterminer leur efficacité anti-tumorale. Les modèles les plus couramment utilisés sont des modèles de greffes de cellules tumorales sous la peau des souris. Mais ils ne récapitulent pas toutes les caractéristiques spécifiques associées à l’ACP et notamment le microenvironnement tumoral qui peut constituer une barrière physique aux traitements. La greffe de cellules tumorales pancréatiques directement dans le pancréas, (greffe orthotopique pancréatique), permet de retrouver ce microenvironnement tumoral et est donc considérée d’intérêt pour la recherche de nouveaux traitements. Ce projet vise à mettre au point des techniques de greffe orthotopique de cellules tumorales d’origine pancréatique chez la souris via une méthode dite classique de chirurgie ainsi que par une méthode d’échoguidage non invasive – les deux techniques seront réalisées en différents sites du pancréas pour déterminer quelle approche permet de générer un modèle le plus ressemblant à la tumeur humaine. L’activité anti-tumorale de traitements candidats sera ensuite évaluée.

Bénéfices attendus

Actuellement, les études pharmacologiques dans le cadre de l’ACP sont effectuées sur des modèles de xénogreffes de cellules tumorales humaines sous la peau de souris (greffe ectopique ou hétérotopique). Mais ces modèles ne récapitulent pas toutes les caractéristiques spécifiques associées à l’ACP et notamment le microenvironnement tumoral. La greffe de cellules tumorales pancréatiques dans le pancréas de souris immunocompétentes permet de retrouver ce microenvironnement tumoral et est donc considérée plus pertinente pour l’évaluation de nouveaux traitements anti-tumoraux. Bien que l’approche de la greffe orthotopique au niveau de la queue du pancréas soit la plus décrite, nous allons mettre au point l’injection orthotopique dans la tête du pancréas. En effet, ce site d’injection, bien que moins simple d’un point de vue de l’approche chirurgicale, est plus relevant scientifiquement vis-à-vis de la pathologie humaine. De plus, la greffe orthotopique dans le pancréas nécessite un acte de chirurgie dont nous allons essayer de nous affranchir par la mise en place d’une approche d’implantation per cutanée échoguidée. L’utilisation de l’échographie pour évaluer la progression tumorale au cours des études permet de raffiner l’utilisation des animaux en les incluant progressivement dans l’étude. Ainsi les bénéfices de ce projet seraient de mettre au point un modèle plus prédictif de la pathologie humaine et ainsi de mieux prédire l’efficacité de candidats médicaments chez l’homme. Ce projet vise également à développer si possible ce modèle avec une méthode non chirurgicale moins invasive afin de favoriser le bien-être animal.

Procédures

- Puçage : afin d’identifier chaque animal, un dispositif sous cutané est implanté en vigile par trocart quelques jours avant l’étude (environ 10 secondes/souris) - Chirurgie pour l’implantation des cellules tumorales dans le pancréas : cette chirurgie durera 30 minutes maximum et sera réalisée une seule fois sur l’animal avec mise en œuvre des bonnes pratiques chirurgicales (asepsie, protocole analgésique pré-post opératoire, surveillance et réveil en enceinte chauffée). - Echoguidage sous anesthésie gazeuse pour l’implantation de cellules tumorales dans le pancréas : cette procédure sera réalisée une seule fois sur l’animal et durera 10-15minutes. - Mesure du volume tumoral par échographie sous anesthésie gazeuse. Réalisé une fois avant la greffe puis après rétablissement complet de l’animal suite de la chirurgie (7 à 10 jours), à raison de 1 mesure échographique par semaine. La durée d’une mesure est déterminée à environ 30 minutes par souris et la mesure se fera sur une durée maximale de 8 semaines - « Microsampling » : prélèvements de sang, en cinétique, à la veine marginale latérale du membre inférieur sur animal vigile, au maximum 1 fois par semaine, à raison de 15% du volume total de sang sur 28 jours (pour le suivi de marqueurs caractéristiques de la cachexie) (environ 20 secondes/souris) - Prélèvement de sang en fin d’étude sur animal anesthésié et sans réveil consécutif par ponction cardiaque.

Impact sur les animaux

-Stress physique léger lié à la contention de l’animal lors de de la mesure de la composition corporelle -Stress physique léger lié à la contention de l’animal lors de l’administration des traitements en quotidien ou biquotidien ou triquotidien, avec une durée d’environ 30 secondes /souris/ administration) -Stress physique léger lié à la contention de l’animal lors des prélèvements sanguins par microsampling d’environ 20 secondes /souris -Douleur très légère lié à la piqûre lors des prélèvements sanguins par microsampling -Douleur légère due à la pathologie et possiblement associée à une perte de poids et/ou formation d’ascite et/ou cachexie -Douleur modérée liée à la chirurgie lors de la greffe orthotopique avec une petite ouverture de l’abdomen

Devenir

Lorsque le volume tumoral total est proche de 1500 mm3, ceci constitue un point limite et l’animal concerné est alors euthanasié. A la fin de chaque étude, tous les animaux sont euthanasiés pour réaliser des prélèvements de sang, de tumeur et d’autres organes. Ces prélèvements seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…) ou pour des analyses de biomarqueurs dans le cadre des études d’efficacités.

Remplacement

Ce projet a pour but de mettre au point un modèle de greffe orthotopique de cellules tumorales d’origine pancréatique. L’implantation des cellules dans le pancréas permet ainsi à la tumeur de se développer dans le microenvironnement d’origine d’un cancer du pancréas, fournissant ainsi une récapitulation des nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine. Il est impossible à l’heure actuelle de reconstituer in vitro les interactions d’une tumeur avec le microenvironnement, et donc il n’y a pas de méthodes substitutives.

Réduction

- Un accompagnement par le service biostatistique sera réalisé pour estimer la variabilité de la pousse de la tumeur pour chaque lignée cellulaire étudiée dans le cadre de ce projet. Cette étape permettra d'établir le nombre d'animaux nécessaires par groupe pour les études futures d'efficacité de traitement et de pharmacodynamie en évaluant la capacité des designs de ces études à l’aide d’un test statistique. Un modèle statistique longitudinal sera utilisé pour évaluer l’efficacité des candidats médicaments. - Lorsque les souris seront euthanasiées, des prélèvements de tumeurs seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…). Cette approche permet donc d’optimiser les études et de réduire le nombre d’animaux en évitant de refaire des études pour obtenir des échantillons. - Dans les phases d’entrainements, les premiers essais se feront sur des souris mortes issues d’autres projets afin de maitriser les voies d’abords et les volumes d’injections avant de valider le geste sur des souris dédiées au projet. De plus la mise au point des techniques et sélection de la plus pertinente se fera par un seul expérimentateur afin de réduire le nombre d’animaux - Afin d’inclure toutes les souris greffées dans les études, nous utiliserons l’échographie pour randomiser tous les animaux au fur et à mesure avec un volume tumoral similaire ainsi le taux d’inclusion sera maximisé. - Lors des études d’efficacité de candidats traitements, il sera possible d’effectuer des analyses de pharmacocinétique c’est-à-dire d’évaluer, en fonction du temps, le devenir d’un médicament dans l’organisme (via des prélèvements sanguins de faibles volumes et répétés maximum 6 points) évitant la réalisation d’une seconde étude dédiée.

Raffinement

- Les souris sont maintenues en groupes sociaux tout au long de l’étude. L’habitat des souris est enrichi de matériel adapté pour leur permettre d’exprimer leurs instincts naturels comme ronger ou nidifier (tube ou dôme, cocoon, sizzle dry) et de l’aliment est distribué dans la cage pour favoriser le comportement de fouissage. - Les animaux font l’objet d’une observation clinique tout au long de l’étude par les expérimentateurs et par les zootechniciens pour s’assurer de leur rétablissement, de leur bien-être et de l’absence de signe clinique. En cas de signe clinique, le vétérinaire est alerté et les recommandations de la SBEA et les points limites seront appliqués. - La procédure de greffe orthotopique est réalisée selon les bonnes pratiques de chirurgie, avec : - des espaces séparés pour la préparation des animaux et pour la chirurgie - une anesthésie et une analgésie adaptées à la chirurgie - une asepsie maintenue pendant toute la chirurgie - L’analgésie post-opératoire pourra être adaptée en termes de traitement administré et de durée en fonction des signes de douleurs observés et en concertation avec le vétérinaire. - Une seconde méthode de greffe orthotopique « non chirurgicale » par échoguidage percutané sera évaluée, ceci en vue de s’affranchir de douleurs opératoires et réduire les risques de pertes lors de la chirurgie. L’implantation cellulaire s’effectuera sous échographie par injection échoguidée en percutanée ne nécessitant pas de pré ou post médication. Le suivi de la croissance tumorale par échographie est une méthode non invasive pour l’animal et sans douleur. Cette mesure est réalisée sur des souris anesthésiées à l’isoflurane. Les tumeurs sont mesurées par échographie 1 fois par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais aussi pour limiter la souffrance et appliquer les points limites. En cas de volume tumoral s’approchant des 1500 mm3 lors d’une lecture, les souris seront euthanasiées. - La cachexie, signe clinique associé à la progression tumorale du cancer du pancréas, sera suivie via l’établissement d’une grille de scoring. La prise alimentaire, l’activité générale, la mesure de la composition corporelle par scanner non invasif EchoMRI (pourcentage de masse grasse, masse maigre et eau totale), de paramètres métaboliques (albumine, triglycérides) et hématologiques seront monitorés tout au long de l’étude.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans la littérature pour la recherche pré-clinique. De plus, la greffe orthotopique de cellules tumorales dans le pancréas chez la souris est couramment utilisée dans les études précliniques d’oncologie. Ainsi la souris est le modèle de choix. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 7 semaines. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans les protocoles d’efficacité et de pharmacodynamie en oncologie.

904 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe des tumeurs pulmonaires sous la peau ou en suspension, puis on leur administre de une à quatre injections d'un vaccin et des prélèvements sanguins, pour tester une immunothérapie combinée contre le cancer du poumon. Le porteur décrit une douleur légère, une perte de poids modérée et une gêne à la mobilité liée aux tumeurs sur le flanc. Il affirme que l'effet d'un vaccin combiné à des anticorps ne peut être vérifié que sur un "organisme vivant entier".

Objectifs

L'objectif du projet est de développer et d'optimiser un vaccin thérapeutique contre le cancer du poumon puis de le combiner avec les immunothérapies anti-PD-1 existantes dans les cancers pulmonaires.

Bénéfices attendus

Le vaccin thérapeutique seul a demontré un effet bénefique, in vitro et in vivo, sur certains lymphocytes en les activant. La combinaison que nous proposons est d'ajouter des anticorps de type anti points de blcage immunitaire qui viseront à maintenir l'état d'activation des de ces lymphocytes, specifiquement induits par le vaccin, plus longtemps. Cette combinaison thérapeutique dévrait demontrer un bénéfice anti-tumoral et à terme pourrait améliorer la prise en charge thérapeutique des patients.

Procédures

En fonction de la procédure expérimentale appliquée, les souris seront soumises à des greffes de lignées cellulaires en suspension: durée 5 minutes, sous anesthésie locale ou des greffes sous-cutanées de tumeurs solides: durée 10 minutes sous anesthésie locale et générale - Chaque souris sera greffée qu'une seule fois durant toute la procédure expérimentale - Selon les porcédures, les animaux auront entre 1 et 4 injections de vaccin, sous aensthésie locale, durée 3 minutes. Certains animaux pourront avoir 1 prélèvement sanguin par semaine durant 3 semaines: durée 3 minutes, sous anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Les animaux qui seront utilisés subiront des injections (dont des greffes de tumeurs sous la peau), ainsi que des prélèvements de sang. Parmi les nuisances possibles : stress léger et douleur légère et transitoire lors des administrations et des prélèvements, perte de poids modérée posible, gêne légère à la mobilité des souris à cause des tumeurs pouvant pousser sur le flanc.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de conduire des analyses post-mortem sur les tumeurs et les rates.

Remplacement

L’étude de l’effet thérapeutique d’un vaccin peptidique en combinaison avec les inhibiteurs de checkpoints immunitaires relève d’une grande complexité où les modéles in vitro seuls n’apporteraient que des réponses partielles et ne permettraient pas de vérifier nos hypothèses. Un des effets majeurs attendus est le recrutement et l’activation prolongée des cellules immunitaires au sein des tumeurs pulmonaires. L'utilisation d'un organisme vivant entier est donc incontournable.

Réduction

Afin de calculer le nombre d’animaux minimum pour répondre à nos hypothèses,, un logiciel de statistique a été utilisé. Les calculs de puissance ont pris en compte la réalisation d'expériences uniques, l'effet attendu, et le taux de prise de greffe. Les résultats seront étudiés par analyse de variance à une voie. Afin de limiter le nombre d'animaux utilisé, les doses de vaccins seront calibrées en fonction des données de la littérature et des résultats obtenus in vitro. Des procédures pourront être annulées en cas d'hypothèse non vérifiée.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux. Chaque cage contiendra en plus de l’eau et de la nourriture, des éléments d’enrichissements : Une maison par cage ou 2 tunnels en cartons, avec du sizzlenest pour leur nid. Le comportement social des souris sera suivi, en observant des comportements tels que le grooming, leurs mouvements dans la cage ou encore le temps de toilettage des souris. Des examens cliniques seront faits quotidiennement par l'équipe de recherche. En cas de perte de poids, un aliment plus riche, plus appétent et plus facile à consommer sera donné. Toutes les interventions lors des procédures seront faites avec anesthésie locale ou générale (ou en combinaison). Des antalgiques seront utilisés.Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle pour tester des vaccins sur animaux à système immunitaire normal (greffes de tumeurs murines) ou déficient (greffes de tumeurs humaines). Les souris seront greffées jeune adultes (6 semaines) et seront traitées à 8-9 semaines. Ce choix d’âge est justifié par une réponse immunitaire robuste et une prise de greffe plus efficace.

2 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur puis des injections locales de vecteurs lentiviraux et des prélèvements de sang par ponction rétro-mandibulaire, pour modifier le microenvironnement tumoral au profit d'une réponse anti-tumorale. Le porteur décrit comme effets attendus des lésions cutanées, une ulcération et des troubles du comportement liés à la croissance de la tumeur, et fixe un point limite à une taille de tumeur jugée trop gênante. Il affirme qu'il n'existe "pas de modèle non-animal" reproduisant la complexité du microenvironnement tumoral et présente la souris comme un "modèle de prédilection".

Objectifs

Le concept du projet est de modifier le micro-environnement tumoral afin de favoriser une réponse cellulaire anti-tumorale en se basant sur une injection locale de vecteurs lentiviraux exprimant une ou plusieurs protéines modulant le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Le laboratoire se concentre sur le développement de vaccins anti-tumoraux contre des antigènes viraux oncogéniques (issus du papillomavirus) ou des néo-antigènes (prostate, colon, pancréas). L’ensemble de ces cancers développent des tumeurs solides chez l’homme avec un micro-environnement défavorable à l’entrée et la fonctionnalité des cellules T effectrices générées par vaccination thérapeutique. La stratégie envisagée permettra un reconditionnement du foyer tumoral vers un environnement favorable à l’action de la réponse cellulaire induite. Si cette stratégie se révèle efficace chez l’animal, il sera possible d’envisager son utilisation pour induire un traitement des foyers primaires chez l’homme en parallèle à d’autres traitements immunothérapeutiques.

Procédures

Ce projet comprend les 4 expériences suivantes : 1ère expérience : Les animaux seront soumis à 1 injection en sous cutanée sous anesthésie gazeuse (5min), 1 injection en intra-tumoral sous anesthésie gazeuse (5min) ou 1 injection en intraveineux sur animal vigile (5min) et 3 prélèvements de sang par ponction rétro mandibulaire espacés de 7 jours sur animal vigile (inférieur à 1min). 2ème expérience : Les animaux seront soumis à 1 injection en sous cutanée sous anesthésie gazeuse (5min), 1 injection en intra-tumoral sous anesthésie gazeuse (5min). 3ème expérience : Les animaux seront soumis à 1 injection en sous cutanée sous anesthésie gazeuse (5min), 1 injection en intra-tumoral sous anesthésie gazeuse (5min), 1 injection en intramusculaire sur animal vigile (5min) et 3 prélèvements de sang par ponction rétro mandibulaire espacés de 7 jours sur animal vigile. 4ème expérience : Les animaux seront soumis à 1 injection en sous cutanée sous anesthésie gazeuse (5min), 1 injection en intra-tumoral sous anesthésie gazeuse (5min), 1 injection en intraveineux sous anesthésie gazeuse (5min) et 3 prélèvements de sang par ponction rétro mandibulaire espacés de 7 jours sur animal vigile (inférieur à 1min).

Impact sur les animaux

Notre stratégie se base sur l’utilisation de vecteurs lentiviraux pour exprimer modérément et de manière stable des protéines pro-inflammatoires en local. En principe, l’expression de ces protéines devrait se cantonner au site d’injection mais une possible diffusion en systémique est envisageable et sera monitorée par des prises de sang régulières et une observation visuelle des animaux tous les 3-4 jours. Au niveau de la croissance tumorale, les modèles sont largement décrits et les effets adverses de la croissance sont connus et seront monitorés : lésions cutanées, ulcération, capacité au déplacement des animaux, modification du comportement (isolation, tremblement, prostration, absence de toilettage).

Devenir

Pour toutes les expériences l’issue est identique : Le développement des tumeurs étant irréversible, les animaux seront mis à mort dans toutes les expérimentations selon les points limites établis. Si les animaux atteignent une régression totale de la tumeur, les animaux seront mis à mort au bout de 90 jours maximum après la fin du traitement car ils ne peuvent pas être réutilisé pour d’autres expérimentations. La stimulation du système immunitaire induite par l’implantation de la tumeur peut induire des biais importants pour toutes autres études. Les animaux d’élevage à fin d’expérimentation ne peuvent pas être adoptés.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas de modèles expérimentaux non-animal permettant de mimer efficacement la complexité du micro-environnement tumoral. La souris est un modèle de prédilection pour ce type d’étude par rapport aux autres animaux de par sa facilité d’élevage, de l’existence d’outils permettant une analyse en détail du système immunitaire et des corrélats pouvant être réalisées avec les tumeurs chez l’homme. Un maximum d’étapes de validation de l’efficacité des produits développés dans le laboratoire seront effectués in vitro sur des lignées cellulaires ou des cellules primaires avant injection chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour chaque expérience est déterminé en prenant en compte que le développement d’une tumeur et son interaction avec le système immunitaire comporte une large variabilité inter-individu, comme chez l’homme. En choisissant des animaux de même sexe et âge, il est possible de réduire au maximum cette variabilité. En s’appuyant sur des résultats antérieurs obtenu par notre groupe et une approche statistique, il a été possible d’anticiper le nombre minimal d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables et répétables sur les différents paramètres de l’étude. Le projet implique l’évaluation de plusieurs protéines immuno-régulatrices capable d’influencer le micro-environnement. La sélection rapide des meilleurs candidats dans un premier temps permettra de poursuivre leur caractérisation avec un minimum de groupes et donc d’animaux.

Raffinement

La croissance tumorale peut avoir un effet néfaste sur la santé de l’animal. Le site d’injection (flanc droit) a été choisi pour avoir un impact minimal sur les capacités motrices de l’animal et assurer un suivi visuel simple et régulier (3-4 jours) du développement de la tumeur (mesure de la taille de la tumeur au pied à coulisse) et une prise de décision rapide en cas d’apparition d’un trouble chez l’animal. Ces troubles peuvent être physiques (difficulté de se déplacer, lésion sur le corps) ou comportementaux (isolation, prostration). Grace à une documentation importante des modèles tumoraux utilisés chez la souris, il est possible d’identifier, de prévenir une partie de ces troubles (lésions cutanées légères nécessitant un traitement aseptisant) ou d’intervenir (surveillance accrue ou mise à mort) si une aggravation (ulcération au site d’injection, modification du comportement) est observée et non réversible. La majorité des procédures implique une mise à mort précoce de l’animal afin d’étudier la tumeur et son système immunitaire mais, dans certaines procédures, les animaux sont conservés pendant une plus grande période impliquant le développement de tumeurs de tailles importantes. Le point limite a été défini à un stade de taille de tumeuroù la gêne chez l’animal devient trop importante.

Choix des espèces

Le système immunitaire de la souris est proche du système immunitaire humain. Il existe de nombreux modèles de tumeurs qui peuvent être utilisés chez la souris pour tester nos stratégies anti-tumorales. De plus, des études précédentes montrent que les vecteurs lentiviraux sont immunogènes chez la souris et de nombreux outils sont disponibles pour étudier la réponse immunitaire. Les expériences seront effectuées sur des femelles car celles-ci présentent un phénomène de dominance moins marqué que les mâles. Chaque expérience n’impliquera que des individus d’un même sexe, ce qui permettra de s’affranchir de la variabilité inter-sexe.. Les modèles tumoraux choisis n’étant pas spécifiques d’un sexe en particulier (cancers du colon, du foie et de la prostate). Il a été jugé que la possible variabilité dans le développement de la réponse immunitaire antitumorale liée au sexe n’aura pas d’effet sur la portée de l’étude.

22 souris vont être utilisées, dont 20 tuées à l'issue et 2 réutilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Partiellement immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules de sarcome humain sous la peau puis deux examens d'IRM, avant que la tumeur ne soit prélevée après mise à mort. Le projet vise à valider des séquences d'IRM pour évaluer les tumeurs sans biopsie. Le porteur justifie la mise à mort par le risque infectieux lié au statut immunodéprimé et affirme que la mesure du flux sanguin est "impossible" sur cultures cellulaires.

Objectifs

Dans les sarcomes des tissus mous, pathologie rare, de mauvais pronostic, et touchant les humains et les animaux à tout âge, il n’existe aucun marqueur pronostic ni prédictif de réponse à la radiothérapie. Ce projet permettra de valider in vivo à la fois de nouvelles techniques IRM permettant une évaluation de la biologie tumorale et de son hétérogénéité, et de valider des méthodes de traitement d’image pour isoler des sous-populations tumorales et ainsi mesurer des marqueurs endogènes. Ces thématiques de recherche sont celles de l’équipe. Les résultats de ce projet préclinique seront directement utilisables chez l’Homme sans nécessité d’autre expérimentation animale, dans le cadre d’un protocole approuvé. De même, une translation ultérieure en soins vétérinaires chez le chat et le chien est envisagée dans le cadre d’un projet. Ce projet se déroule dans deux établissements utilisateurs, un établissement pour l’hébergement et l’autre pour l’imagerie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra par ailleurs de relier les données d’IRM avec l’observation au microscope. Il est le préalable de projets cliniques chez l’Homme et en médecine vétérinaire afin d’utiliser ces mêmes séquences IRM, dans le but de prédire la réponse aux traitements et pouvoir poser des diagnostics sans avoir besoin de biopsie.

Procédures

Les souris sont des animaux partiellement immunodéprimés pour permettre une greffe de cellules tumorales d'origine humaine sans rejet. Les conditions d'hébergement et de soins sont adaptées au statut immunodéprimé des animaux. Dans l’EU1, les souris seront xénogreffées. L'injection sous la peau du flanc de cellule tumorale de sarcome humain, geste d'une durée de 20 secondes, comportera 2 lignées tumorales disponibles, déjà utilisées et validées. Un IRM sera réalisé dans l’EU2 un examen IRM d'une durée de 1h30 n’engendre pas de douleur. La seconde IRM d'une durée de 1h30, dans l’EU2, est précédée d’une injection intrapéritonéale d'un marqueur d'hypoxie. Celle-ci sera réalisée sous anesthésie et après antalgie dans l’eau de boisson. Après la seconde IRM, les animaux seront mis à mort et les tumeurs seront prélevées dans l’EU2 pour analyse histologique.

Impact sur les animaux

Au plan du bien-être animal, les animaux ne présentent aucun déficit moteur ou social lié à cette injection sous la peau. Ils continuent donc d’être hébergés dans des conditions adaptées aux animaux immunodéprimés. La pousse tumorale peut se traduire par une protubérance au niveau du flanc. Celle-ci peut créer un inconfort et une gêne mais sans entraver la mobilité de l'animal.

Devenir

Du fait du phénotype athymique, ces souris seraient à risque infectieux local et systémique majeur après la chirurgie de retrait de greffe. Par ailleurs, une chirurgie carcinologiquement satisfaisante ne serait techniquement pas réalisable, et le risque de dissémination microscopique local et à distance rend ces souris à la fois à risque de récidive et inéligibles à des protocoles ultérieurs. La mise à mort s’avère donc nécessaire. Les animaux sont mis à mort pour pemrttre le prélèvmeent del a tumeur. compte tenu des risques liés à leur statut immunitaire et à la difficulté de l'intervention chirurgicale, l'extraction de la tumeur ne seriat pas bénéfique aux animaux.

Remplacement

Il s’agit dans un premier temps de mettre au point un protocole expérimental et de tester de nouvelles méthodes d’acquisition en IRM très haut champ magnétique, préalablement validés in vitro avant d’être appliqué à l’animal. L’autre objectif est une corrélation des données IRM avec des données biologiques. Il est nécessaire de passer par une expérimentation in vivo du fait de la mesure absolument nécessaire d’un flux sanguin (condition impossible sur cultures cellulaires) et d’une comparaison aux données microscopiques. L'examen IRM est basésur la détection de flux de liquides, dont le sang, ce qui est difficelement envisageable sur desm odèles non vivants et d'autre part, le projet s'intéresse non seulement à la tumeur mais aussi à son environnement et à sa vascularisation, lesquels sont encore à l'heure actuelle impossible à reproduire in vitro.

Réduction

L’IRM est une technique non-invasive et non-irradiante. Elle nous permet de réutiliser les animaux et donc de réduire leur nombre. Un total de seulement 22 souris sera utilisé pour obtenir suffisamment de données et pour valider la technique de mesure. Afin de pouvoir réduire au maximum le nombre d’animaux tout en permettant de tirer des conclusions statistiquement significatives, le nombre d’animaux (2 groupes de 11) nécessaire a été calculé sur les bases de tests non paramétriques et sur la base de données de prise de greffe lors de précédentes expérimentations. Par ailleurs chaque animal sera imagé 2 fois.

Raffinement

Afin que l'injection soit mieux supportée, elle sera effectuée en situation sous-cutanée, chez des souris déjà suffisamment développées, avec ajout d’antalgique dans l’hydratation, et avec un suivi rapproché. Le projet a été pensé pour obtenir des résultats à la fois fiables et dans un délai le moins étendu possible. Les deux examens IRM seront réalisés sous anesthésie générale et n’engendreront pas de stress pour l’animal. Les animaux seront récompensés sous forme alimentaire à leur réveil après l’anesthésie. Lors du transport entre les deux animaleries, 50m environ, les cages seront placées dans un chariot en prenant soin de les protéger de l'environnement extérieur qui pourrait les refroidir. Les cages seront recouvertes par une bâche. L'apparition de grosseur fera l'objet d'une surveillance régulière. Une évaluation de la souffrance de l’animal sera mise en place, avec adaptation de la prise en charge selon le score calculé, et en cas d’atteinte des points limites les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est à la fois proche de l’Homme, accessible, et peut être analysée sur l’IRM à très haut champ. La résolution spatiale de l’appareil sera suffisante pour permettre une validation précise. Puis les souris immunodéficientes avec xénogreffe de sarcome des tissus mous humain permettront une validation technique de la méthode d’imagerie, une première confrontation entre les données de tissu tumoral d’origine humaine (xénogreffe) et l’anatomopathologie, et un suivi longitudinal. Nous utiliserons des sarcomes des tissus mous dont la lignée tumorale a déjà été utilisée plusieurs fois sur modèles animaux. De plus, la souris est l’animal le plus utilisé pour le développement de modèles pathophysiologiques et les outils d’analyse immunologiques sont bien maîtrisés à la fois dans le monde et dans notre équipe. Par ailleurs les résultats obtenus pourront être confrontés aux données existantes dans la littérature.