Cancers

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie, une injection intraveineuse d'un immunostimulant dérivé d'une molécule bactérienne, puis des prélèvements sanguins, sur des lignées immunocompétentes et immunodéficientes. L'étude, exploratoire, vise à décrire la réponse immunitaire innée dite mémoire face à la tumeur. Le porteur affirme que tester ce composé exige un "organisme entier" que les cultures ne reproduisent pas, et renvoie les retombées contre les cancers et les maladies infectieuses au long terme.

Objectifs

Le système immunitaire joue un rôle essentiel dans le développement des cancers. Récemment, de nouvelles immunothérapies permettant la modulation du système immunitaire ont permis une avancée majeure dans la prise en charge des patients. Dans ce sens, une molécule contenue dans les bactéries a été mise en évidence pour son efficacité à stimuler le système immunitaire, mais sa toxicité ne permet pas son utilisation en clinique. La détoxification de ce composé et son encapsulation a permis d’améliorer sa pharmacocinétique et réduire sa toxicité pour permettre son injection intraveineuse. La réponse mémoire innée n’a été décrite que récemment, mais pourrait jouer un rôle dans le contrôle de la progression et de la rechute tumorale. Mais les mécanismes impliqués ainsi que les acteurs de ce contrôle sont en revanche encore peu connus à ce jour. Ce projet aura pour objectif : 1) de décrire le type de réponse immunitaire innée et adaptative induite par cette molécule détoxifiée sur des souris immunocompétentes, préalablement implantées avec des cellules tumorales. Cette évaluation nous permettra d’appréhender les variations des populations immunitaires totales au cours du temps. 2) nous évaluerons ces mêmes critères sur des souris immunodéficientes ne présentant pas tous les aspects de la réponse immunitaire, afin d’estimer l’implication de la seule réponse innée. Cela permettra par la suite d’évaluer si la réponse innée seule permet la mise en place d’une réponse efficace contre la prolifération des cellules cancéreuses, mais également de conclure sur l’efficacité de ce composé détoxifié en tant qu’immunothérapie anticancéreuse.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mettre en évidence les populations immunitaires impliquées dans la mémoire innée, et promues par ce composé détoxifié prometteur pour la santé humaine. Cette caractérisation aura plusieurs retombées : 1) Suivre la cinétique du système immunitaire complet chez des souris immunocompétentes, 2) Renforcer l’affirmation que le système immunitaire adaptatif n’est pas le seul menant à une réponse mémoire, 3) Mettre en évidence les populations cellulaires responsables de cette mémoire innée, permettant par la suite de comprendre comment favoriser leur induction. A plus long terme, cette réponse mémoire innée pourrait être mise à profit non seulement pour soigner différents types de cancers, mais également dans le cas de maladies infectieuses.

Procédures

Pour chaque souris : - 1 injection sous-cutanée de cellules tumorales sous vapeur d’isoflurane (3,5 %) - durée < 1 minute. - 1 contention + 1 injection intraveineuse (animal vigile) du composé testé - durée < 5 minutes. - 1 prélèvement sanguin sous vapeurs d’isoflurane (3,5%) - durée < 5 minutes.

Impact sur les animaux

- douleur lors d’injection de cellules tumorales en sous-cutané (durée de quelques minutes, une fois), - gêne à la locomotion, nuisances possibles si le volume tumoral atteint le point limite. Il n’y a pas de métastases attendues avec les modèles tumoraux utilisés. - stress lié à la contention et aux mesures des volumes tumoraux cutanés (durée de quelques minutes) - douleur lors d’injection dans la veine caudale (durée de quelques minutes, une fois)

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude, dû à la nécessité de prélever les échantillons biologiques

Remplacement

Avant le passage sur modèle animal, l’efficacité de ce composé et sa formulation ont été préalablement validées in vitro au laboratoire. Des tests plus poussés doivent être réalisés sur modèle animal pour évaluer l’effet de ce composé sur un organisme entier et plus complexe. En effet, la sensibilité des cellules tumorales aux molécules anticancéreuses dépend fortement du microenvironnement, et également du système immunitaire et de ses interactions complexes. Par ailleurs, plusieurs paramètres jouant sur la diffusion du composé dans le système sanguin et les différents organes, la mise en place de la réponse immunitaire et d’une réponse mémoire, sa migration, son recrutement et son effet sur la tumeur nécessite de travailler sur un organisme entier. Pour ces raisons, les études chez le modèle souris s’avèrent essentielles.

Réduction

Cette expérience est exploratoire, et a pour but de décrire les populations immunitaires recrutées après traitement ainsi que leur activation dans les différents compartiments testés. Nous avons choisi d’utiliser 12 animaux par groupes afin d’obtenir un nombre suffisant de cellules dans les organes prélevés pour mener à bien toutes les analyses et obtenir des résultats suffisamment représentatifs. Dans ce cas, nous ne pouvons pas déterminer de tests statistiques appropriés, mais nous nous sommes basés sur le nombre de cellules vivantes à enregistrer, en comparaison avec le nombre de cellules obtenu par prélèvement sanguin, retranché des biais de manipulation connus (mortalité cellulaire, perte des cellules lors des différentes étapes de lavages et de traitement de l’échantillon). Ce nombre permet également de palier au fait que l’implantation de tumeur ne prenne que dans 80% des cas. Nous avons donc dû prévoir une augmentation de l’effectif de souris prévu initialement de 20%. A des fins de réduction, nous avons choisi d’utiliser le groupe de souris contrôle comme point de référence T0.

Raffinement

Les souris seront observées quotidiennement en surveillant leur état général, leur comportement (activité, isolement…) critères physiques (poils hérissés, dos voussé (signe de douleur chez la souris) …), ou le moindre signe de douleur. L’altération de ces critères éventuels seront annotés sur une fiche de suivi, et comparées à une grille de score pour détecter le moindre signe de souffrance et prendre les mesures nécessaires afin que le bien-être de l’animal soit respecté. Si score 1, observation quotidienne des animaux par l’expérimentateur, pas d’action particulière. Si score 1 deux jours de suite : action similaire à score 2. Si score 2, animaux suivi matin et soir. Si score 3 ou 4, traitement palliatif mis en place le jour même sur une durée de 24h. Si score 5, animaux mis à morts = Point Limite. Des points limites adaptés seront appliqués pour éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Les souches murines sont particulièrement adaptées pour l’étude de tumeurs de par la disponibilité de modèles tumoraux, de réactifs et permettent de constituer des groupes d’effectifs compatibles avec des résultats statistiquement significatif. Des souris femelles âgées entre 12-20 semaines seront choisies car elles sont moins agressives entre elles que le sont les mâles, et ont un système immunitaire compétent et mature. Le modèle immunocompétent est particulièrement utilisé pour l’étude de l’immunité cellulaire. Pour évaluer la réponse immunitaire innée, un modèle animal fortement immunodéprimé ne comportant pas de système immunitaire adaptatif est nécessaire, celui-ci pouvant fausser nos résultats dû aux interactions entre ces deux versants de l’immunité. La souris immunodéficiente est connue pour présenter ces caractéristiques en ne développant pas certaines cellules immunitaires. Les autres modèles de mammifères immunodéprimés sont peu nombreux (rats) et il est préférable d’avoir recours aux modèles murins.

7 656 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses sous la peau, des injections intrapéritonéales d'anticorps répétées et des prélèvements sanguins dont un prélèvement terminal, pour étudier l'immunosurveillance anti-tumorale. Le porteur décrit une tumeur pouvant se nécroser en son centre et des points limites censés arrêter les atteintes avant un stade avancé. Les retombées annoncées pour les patients restent renvoyées à terme, tandis que le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" à la souris pour l'étude in vivo de ces mécanismes.

Objectifs

Dans le domaine complexe de la biologie humaine, la lutte contre le cancer est un combat permanent qui exige un arsenal d'approches innovantes. Parmi celles-ci, le concept d'immunosurveillance est apparu comme un gardien essentiel dans la lutte contre les tumeurs malignes. L'immunosurveillance fait référence à la capacité innée du système immunitaire à reconnaître et à éliminer les cellules anormales, y compris celles qui ont un potentiel cancéreux. Ce mécanisme de défense naturel constitue une ligne de défense cruciale, détectant et éradiquant les cellules indésirables avant qu'elles ne se transforment en tumeurs à part entière. On ne saurait trop insister sur l'importance de l'immunosurveillance dans la lutte contre le cancer. Contrairement aux traitements traditionnels du cancer qui ciblent souvent la tumeur elle-même, l'immunosurveillance s'attache à donner aux défenses de l'organisme les moyens d'identifier et d'éliminer les menaces cancéreuses. Toutefois, ce processus n'est pas sans faille, car les cellules cancéreuses peuvent échapper à la détection immunitaire grâce à diverses stratégies. Il est donc urgent d'améliorer et d'affiner les mécanismes d'immunosurveillance afin de garantir une défense plus efficace contre le cancer. L'amélioration de l'immunosurveillance implique une approche multidimensionnelle. En outre, il est essentiel de démêler l'interaction complexe entre le système immunitaire et les microenvironnements cancéreux. En comprenant comment les tumeurs manipulent leur environnement pour échapper à la détection, nous pourrons développer des stratégies pour contrer ces tactiques et renforcer l'immunosurveillance. Ainsi, l'objectif de ce projet est de déterminer comment les cellules tumorales échappent à leur éradication par le système immunitaire et de déterminer si le ciblage de ces voies représente une option thérapeutique prometteuse.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à terme de proposer de nouvelles options thérapeutiques pour les patients souffrants de cancers.

Procédures

Les souris seront rasées sur un des flanc (environ 30 secondes, réalisé sur souris vigile avec du matériel spécifique) et recevront une injection unique en sous-cutanée de cellules cancéreuses. Chaque injection prendra environ 5 minutes par souris et sera réalisée sur des souris vigiles. Une partie des souris recevra une injection intrapéritonéale d'anticorps tous les 2 jours pendant 2 semaines ou deux fois par semaine pendant 2 semaines. Chaque injection prendra environ 30 secondes et sera réalisée sur des souris vigiles. Pour ¼ des animaux, un prélèvement sanguin sera réalisé en cours de procédure et toutes subiront un prélèvement sanguin terminal. Ces prélèvements prendront environ 1 minute par souris. Un dernier groupe de souris recevra 4 injections intrapéritonéales sur 4 jours (une par jour). Chaque injection prendra environ 30 secondes par souris et sera réalisée sur des souris vigiles.

Impact sur les animaux

Lors d'injections intrapéritonéales répétées, il peut y avoir une inflammation au point d'injection. En ce qui concerne l'aspect et la taille de la tumeur, la tumeur peut présenter un trou en son centre. Avant l’arrivée aux points limites, les animaux pourraient subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous seront très attentifs. Ces effets indésirables pourront être causés soit par la croissance de la tumeur, soit par l’injection d’immunothérapies. Nous avons une grande expertise de ces modèles. Nous savons que la croissance tumorale n’entrainerait des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance (poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, absence de toilettage, une prostration et/ou une agitation), ainsi que des altérations visibles de la peau (nécrose…) qu’à un stade avancé de du développement de la tumeur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les organes et tumeurs et ainsi réaliser les études in vitro nécessaires à savoir analyser la composition cellulaire (cytométrie, immuno-histochimie) et biochimique de la tumeur.

Remplacement

Comme notre projet repose sur l’influence de l’expression de gène tumoraux sur le dialogue entre système immunitaire et les cellules cancéreuses, il n’existe pas à ce jour d’autre alternative que l’utilisation des souris pour l’étude in vivo des mécanismes moléculaires et des interactions complexes impliqués.

Réduction

Bien qu’il n’existe à ce jour pas de méthode de remplacement pour réaliser ces études, notre expérience des modèles utilisés nous permet de définir le nombre de souris minimum à utiliser afin d’être statistiquement significatif, grâce à l'utilisation de méthodes statistiques adaptées. De plus nous avons conçu le projet de façon à ce que les procédures soient réalisées les unes après les autres. En cas de résultats non concluant de la procédure initiale, les procédures suivantes ne sont pas réalisées, ce qui réduira le nombre d’animaux prévus dans ce projet. Enfin aucun effet hormonal n’a été décrit à notre connaissance dans ce modèle. Cela nous permettra de limiter notre étude exclusivement aux femelles, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisé pour ce projet.

Raffinement

Une grande importance sera accordée au bien-être des souris. En termes de raffinement, les souris sont hébergées en groupe avec de l'eau stérilisée par filtration, des aliments à volonté et un enrichissement systématique du milieu par diamond twist et igloo rouge. Leur suivi permet de détecter tout signe de souffrance, de détresse et ainsi la prise immédiate des mesures adéquates grâce à l’application de points limites adaptés à la pathologie du lymphome B. La notion d’enrichissement du milieu des rongeurs utilisés est familière aux demandeurs. Tous les participants à ce projet sont dûment qualifiés et ont validé les compétences requises pour les manipulations proposées. D’autre part, afin de minimiser l’inconfort des procédures concernées nous alternerons les sites d’injections en intra-péritonéal, utiliserons des aiguilles très fines adaptées aux injections répétées afin de minimiser/s’affranchir de problème lié à l’injection et nous utiliserons également une tondeuse spéciale rongeurs.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale relativement proche phylogénétiquement de l’homme, et est le modèle de choix utilisé par la communauté scientifique pour étudier les acteurs moléculaires et cellulaires impliqués dans le cancer. De plus, la souris présente plusieurs avantages comme un cycle de vie relativement court, une natalité importante et un modèle facile à élever. Les modèles utilisés sont les modèles les mieux adaptés pour étudier la réponse antitumorale. Nos souris seront âgées de 6 à 20 semaines car c’est durant cette période que le développement tumoral est optimal.

4 032 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur du foie leur est greffée ou induite, puis traitée par échauffement de nanoparticules sous anesthésie, avec injections et imageries répétées et un transport entre deux établissements, pour évaluer une thérapie localisée du cholangiocarcinome. Le porteur situe le bénéfice pour les patients au conditionnel, des doses plus faibles et moins d'effets toxiques. Il affirme qu'il n'est pas possible de recréer in vitro la complexité d'un organisme entier et que le passage par l'animal est un passage obligé avant tout transfert à l'homme.

Objectifs

Les cancers hépatobiliaires, en particulier le cholangiocarcinome (CCA) sont difficiles à traiter. Le développement de la nanomédecine permet d’envisager des traitements anticancéreux mieux ciblés, plus efficaces et avec de moindres effets secondaires par rapport aux traitements conventionnels. L’utilisation de nanoparticules activables à distance par un rayonnement lumineux dans le proche infrarouge permet de contrôler l’action thérapeutique à la fois dans le temps et dans l’espace. Le projet propose l’évaluation d’une thérapie anticancéreuse localisée par échauffement de nanoparticules sous rayonnement électromagnétique non ionisant, (lumière dans le proche infrarouge ou champ magnétique alternatif) en association ou non avec une immunothérapie ou une thérapie ciblée anti-EGFR. Cette évaluation sera réalisée sur un modèle murin après injection sous cutanée de cellules murines de cancer de CCA. L’échauffement de la tumeur sera modulé par la puissance du laser/champ magnétique et réduit aux zones d’accumulation des nanoparticules. On visera une hyperthermie modérée (43°C à 45°C pendant 30 min, répétée 2 ou 3 fois à 24h d’intervalle au moins) de manière à moduler thermiquement le microenvironnement tumoral et le rendre plus permissif aux chimiothérapies. L’évolution de la masse tumorale sera suivie par échographie, modalité qui est intégrée au module d’Imagerie Photoacoustique. L’imagerie permettra un suivi longitudinal de la biodistribution/dégradation/élimination de nanoparticules utilisées, en complément des caractérisations ex vivo. L’objectif final est d’identifier les nanomatériaux de meilleur potentiel thérapeutique associé une biodistribution favorable, biodégradable et sans effet indésirable à long terme. Le projet sera réalisé dans deux établissements utilisateurs. Le développement du modèle (implantation des tumeurs) est réalisé dans un autre centre (établissement 1), les traitements par hyperthermie et le suivi échographique sont réalisé dans notre établissement (établissement 2). Aucun animal n'est ajouté au décompte global du projet.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de développer des stratégies thérapeutiques loco-régionales pour traiter le cholangiocarcinomes qui présentent une toxicité moindre en comparaison aux traitements anticancéreux systémiques. Ce projet pourrait donc permettre d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients en combinant une thérapie loco-régionale et systémique en administrant des doses plus faibles de drogues, réduisant les effets systémiques toxiques secondaires.

Procédures

Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de cancers du foie et à leurs traitements. Les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie où point limites. Pour cela, une première partie des animaux seront soumis dans un premier temps à une greffe de cellules tumorales ectopiques, sous la peau (injection sous-cutanée sur animal vigile ou anesthésié). Une seconde partie des animaux subiront une injection hydrodynamique (injection intraveineuse animal vigile) de vecteurs plasmidiques afin d’induire une tumeur dans le foie (moins d’une minute). Les animaux seront ensuite impliqués dans différents traitements seul ou en combinaison : traitement par nanohyperthermie sous anesthésie, injection intraveineuse ou intrapéritonéale (1 à 40 minutes maximum selon les traitements). Les animaux seront suivis de manière longitudinale par imagerie non invasive effectuée sous anesthésie générale pour suivre la croissance tumorale (20 minutes maximum). Enfin, les animaux seront euthanasiés en vue des différents prélèvements nécessaires aux analyses. Les animaux seront transportés 1 fois de l'établissement 1 vers l'établissement 2 par un transporteur agréé.

Impact sur les animaux

La principale contrainte concerne le développement tumoral intrinsèquement lié à la question scientifique du présent projet qui vise à trouver des traitements innovants du cholangiocarcinomes. Les traitements mis en œuvre devraient quant à eux réduire les effets liés au développement tumoral avec de possibles effets secondaires mais qui restent très limités (inflammation locale et toxicité hépatique et/ou biliaire). Les animaux seront transportés 1 fois de l'établissement 1 vers l'établissement 2 par un transporteur agréé.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet (n=4032) seront euthanasiés dans notre établissement à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures.

Remplacement

Un système vivant est nécessaire pour tester des nouvelles stratégies antitumorales in vivo. C’est un passage obligé demandé par les industries pharmaceutiques ou les compagnies de valorisation (pour dépôt de brevet) avant un éventuel transfert à l’Homme. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans la croissance tumorale. L’effet antitumoral et la dégradabilité de nanoparticules utilisées in vivo seront au préalable testés et optimisés in vitro sur des modèles cellulaires 2D ou 3D ou encore dans des milieux mimant l’environnement biologique (remplacer).

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Au total ce projet impliquera 4032 souris immunocompétentes ou immunodéficiences en fonction des questions scientifiques. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. L’utilisation de cette technique d’imagerie non invasive combinée à la mutualisation de tissus pour les caractérisations ex vivo permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude (réduire).

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Ainsi, l’hébergement, les soins et l’ensemble des procédures expérimentales sur les animaux seront effectués dans le respect du bien-être animal avec la définition de points limites au-delà desquels l’expérience sera interrompue (raffiner). Le transport des animaux est réalisé par un transporteur agréé, dans un véhicule adapté et agréé, les animaux diposent d'alimentation et de gel d'eau pendant le transport, et celui-ci est effectué dans la journée.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : La souris est le modèle classique des expériences et études en cancérologie ; sa taille et son poids autorisent en outre d’utiliser de faibles quantités de composés cytotoxiques. La disponibilité de souches consanguines exprimant de façon stable des phénotypes immuno-supprimés permet de réaliser des xénogreffes de tumeurs humaines sans avoir recours à une suppression immunitaire iatrogénique. La disponibilité de souris non immunodéprimées permet également de réaliser des greffes syngéniques avec des cellules tumorales de la même espèce permettant ainsi d’étudier le système immunitaire et de tester des drogues anti-tumorales basées sur l’utilisation d’anticorps. Description du ou des modèle(s) : La souris Nude est le standard pour les études précliniques relatives à l'évaluation in vivo des effets anti-tumoraux sur des cellules humaines. Nous utiliserons la souche Athymic Nude-Foxnu. Nous utiliserons également les souris C57BL/6J pour les greffes syngéniques (pour greffer sous la peau des cellules cancéreuses murines) et pour induire une tumeur dans le foie par injection hydrodynamique de vecteurs plasmidiques dans la veine de la queue. Justification du stade : Les animaux sont utilisés au stade adulte (5-8 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection de cellules cancéreuses, une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l’expérimentation.

1 000 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer des tumeurs mammaires spontanées, elles reçoivent des traitements par voies multiples, subissent palpations, mesures de tumeurs et prélèvements répétés, le développement tumoral pouvant gêner la mobilité et la respiration, pour évaluer des composés anticancéreux commandés par des clients. Le porteur, prestataire de recherche préclinique, présente ce modèle comme le plus prédictif pour transposer les molécules à l'homme. Il affirme que les méthodes alternatives ne permettent pas de prévoir l'efficacité in vivo et que les reconstructions de tumeurs en 3D restent marginales.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer. Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est de d’utiliser un modèle spontané de cancers comme approche prédictive en oncologie. Ce modèle permet une approche pertinente pour investiguer les premiers stades de la maladie et notamment l’initiation spontanée de tumeurs. Le modèle de souris MMTV-PyMT est le modèle de souris génétiquement modifiées le plus couramment utilisé pour la recherche sur le cancer. Les lésions mammaires apparaissant chez les souris MMTV-PyMT suivent une évolution moléculaire et histologique similaire à celle des tumeurs mammaires humaines, ce qui en fait un outil de choix pour les chercheurs en cancérologie. Il est aussi intéressant de pouvoir évaluer des composés thérapeutiques dans un modèle animal particulièrement représentatif de la pathologie humaine et d’arriver, avant les essais cliniques, à établir une réelle évaluation de l’efficacité de nouveaux médicaments destinés à traiter les tissus cancéreux localisés chez l’homme. Une fois le modèle mis en place dans nos laboratoires, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie humaine, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

L’implantation de transpondeur pour identifier l’animal est réalisée sous anesthésie générale 0-3 (inférieur à15min). Avant les traitements, les animaux sont sélectionnés pour former des groupes homogènes en poids et/ou volume tumoral. Des méthodes d’imagerie non invasives peuvent être réalisée sous anesthésie générale (inférieur à 1h). Les animaux sont traités par voie : - intra-veineuse, intrapéritonéale, sous cutanée avec (inférieur à 15min) ou sans anesthésie générale (3min) - intra-musculaire ou intra-dermique sous anesthésie générale avec analgésie (

Impact sur les animaux

L’identification des animaux pourra induire une douleur légère (moins de 1 journée). Les animaux recevront des traitements par voie intramusculaire, intradermique, sous cutanée, intraveineuse, orale, intra-tumorale, intrapéritonéale. Ces traitements pourront entrainer un stress léger et une douleur légère (de quelques minutes). L’imagerie induira un stress léger. Le jour de la constitution des nouveaux groupes, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress léger de 1-2j. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral ainsi que les palpations entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation. Le développement spontané des tumeurs pourra avoir un impact sur la mobilité (point limite). Le développement de lésions localisées dans les poumons pourra induire une gêne respiratoire et une perte de poids (point limite).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure (la méthode utilisée étant l’une de celles autorisées par la Directive 2010/63). Au cours de leur vie les animaux vont développer des tumeur spontanées, ayant fait l’objet de gestes techniques et ayant reçu des traitements, aucune autre utilisation ne peut être envisagée.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (volume tumoral et/ou poids). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individus. Une étude peut être composée de 2 à 10 groupes (au minimum un groupe non traité et un groupe a traité; plusieurs groupes traités possibles pour évaluer différents traitements, doses etc). Le nombre d’animaux par groupe variera généralement entre 3 (biodistribution) à 15 (dans le cas de multiples paramètres d’efficacité à évaluer) par dose de produit. Jusqu’à 20% d’animaux excédentaires pourront être inclus initialement (avant sélection) afin de plus facilement constituer des groupes homogènes. Si possible, ce nombre sera réduit à l’issue de la procédure 1. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal.

Raffinement

Les administrations des produits/prélèvements seront effectués suivant les recommandations vétérinaires (anesthésie, de volume, fréquence et antalgie). Ces actes seront réalisés sous anesthésie (sauf per-os) avec l’analgésie appropriée pour les injections en intramusculaire/intradermique (opiacés). Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître les signes de souffrances et les points limites. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Pour raffiner, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et de l’imagerie faiblement invasives permettant d’atteindre l’objectif plus tôt et de sortir l’animal de la procédure. De l’enrichissement est utilisé. Des animaux adultes seront utilisés.. Lorsque la mobilité des animaux sera réduite, un gel nutritif et de l’eau gélifiée seront rajoutés, la quantité de nourriture en fond de cage sera augmentée.. L’exsanguination intracardiaque ou par l’aorte abdominale, se fera sous anesthésie profonde et avec administration préalable d’un opiacé.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules humaines de cancer de la prostate sous la peau, avec des mesures de la tumeur trois fois par semaine, avant d'être tuées à l'atteinte du volume limite ou au bout de cent jours pour prélever les tumeurs, afin de valider ce modèle dans le laboratoire. Le porteur reconnaît que la croissance tumorale peut provoquer une perte de poids, des douleurs, une ulcération et une nécrose. Il affirme que l'étude ne peut se faire que sur un "organisme entier" et présente le recours à la souris immunodéprimée comme "nécessaire".

Objectifs

Le projet présenté vise à valider dans notre laboratoire la prise et la croissance tumorale de cellules cancéreuses humaine de cancer de la prostate dans une souche de souris avec un système immunitaire déficient. Le cancer de la prostate souvent diagnostiqué chez les hommes de plus de 50 ans, est responsable chaque année d’un peu moins de 9000 décès en France et 350 000 au niveau mondial ce qui correspond à un pourcentage élevé de décès masculins liés à un cancer : 6.8%. Ce second cancer masculin fait donc parti des cancers à fort besoin thérapeutique, c’est pourquoi nous nous intéressons ici à la mise en place d’un modèle animal afin de pouvoir étudier ce type de cancer dans notre laboratoire.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. Ce projet permettra dans un premier temps de mettre en place un modèle de cancer de la prostate chez la souris, qui par la suite servira à étudier l’efficacité de potentiels nouveaux traitements anticancéreux plus efficaces ou avec moins d’effets indésirables que ceux déjà sur le marché.

Procédures

Injection de cellules cancéreuses en sous-cutané (réalisée une fois au début de l'expérimentation, quelques secondes). Mesures tumorales au pieds à coulisse 3x/semaine (quelques secondes).

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir des injections sous cutané qui génèreront du stress à la contention et une douleur courte à l’injection. La pousse tumorale peut engendrer de la perte de poids, des douleurs au niveau de la tumeur, et potentiellement de l’ulcération et de la nécrose. Les pesées et mesures de tumeurs génèrent un stress lors de la contention et éventuellement de la douleur au niveau de la tumeur pendant la mesure avec le pied à coulisse.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour atteinte du volume éthique ou 100 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai pour prélèvement des tumeurs.

Remplacement

Les interactions entre le système immunitaire, même incomplet (ici ne manquent que les lymphocytes-T), et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes lymphoïdes (la rate, les ganglions etc), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). L’étude de développement d’une tumeur et par la suite l’étude de l’efficacité de potentielles molécules anticancéreuses sur cette tumeur ne peut se faire que sur l’organisme entier.

Réduction

Les procédures seront faites sur le nombre minimal d’animaux nécessaires afin de conclure de façon statistiquement fiable à un taux de prise et de croissance tumorale permettant de réaliser par la suite une étude d’efficacité de composés. Dans cette étude le point final correspondra à l'atteinte d'un volume tumoral défini selon les points limites, il faut donc que nos cellules injectées puissent former une tumeur mais qui va aussi pousser et pouvoir atteindre ce volume. Un test statistique fiable a été utilisé pour déterminer le nombre de souris nécessaires au vu de la forte variabilité de taille et du caractère aléatoire de la prise tumorale dans ce modèle. Nous ferons les experiences en incrément et nous passerons à la concentration plus élevée uniquement si la concentration précédente n'était pas effective, ce qui réduira potentiellement de moitié le nombre de souris nécessaires.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x)manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en les contentionnant une fois par jour pendant 5 jours. Tous les animaux seront mis à mort au plus tard 100 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai pour prélèvement des tumeurs. Par ailleurs, le personnel animalier renseigne quotidiennement une grille de suivi basée sur des critères comportementaux et physiques relevant de points limites adaptés. Les animaux seront hébergés dans un environnement qui présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour jeux).

Choix des espèces

Nous souhaitons travailler avec des animaux présentant un système immunitaire déprimé pour éviter le phénomène de rejet. L'utilisation d'une souche murine immunodéprimée est donc nécessaire pour éviter ce phénomène. La souris est l’espèce la plus adaptée pour cet objectif, la souche Nude étant athymique, est un modèle qui permet une prise tumorale avec de nombreuses lignées humaines. En effet la souris immunodéprimée Nude est une souche reconnue pour l’implantation de xénogreffes. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

2 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules leucémiques, murines ou humaines, leur sont injectées, puis elles reçoivent des composés par de multiples voies avec suivi par bioluminescence sous anesthésie et prélèvements sanguins, dont l'amputation de l'extrémité de la queue, pour évaluer des candidats médicaments contre la leucémie. Le porteur décrit une dégradation possible, baisse d'activité, respiration difficile, perte de poids et impossibilité de s'alimenter à mesure que la leucémie progresse. Il juge le recours à l'animal "incontournable" au motif qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit la pharmacocinétique dans un organisme complet.

Objectifs

Ce projet consiste à évaluer de nouveaux traitements pour les leucémies, dont les besoins sont non satisfaits, chez la souris dans des modèles orthotopiques (i.e. injection de cellules cancéreuses au site correspondant à celui de la tumeur d’origine). Pour ces modèles, des cellules cancéreuses soit d’origine murine (syngénique) soit d’origine humaine (xénogreffe) seront inoculées à l’animal par voie systémique (i.e. intraveineuse ou intrapéritonéale). En fonction des cellules injectées, des souris immunocompétentes, immunodéficientes ou humanisées pour le système immunitaire seront utilisées. Les études consistent à administrer le ou les composé(s) à potentiel thérapeutique à des souris porteuses de tumeur, puis à mesurer l’évolution du cancer, les niveaux de biomarqueurs, les concentrations sanguines et/ou tissulaires du composé d’intérêt. Les mesures de concentrations du composé permettront d’établir un modèle entre la pharmacodynamie et pharmacocinétique du composé, indispensable pour la détermination des doses à utiliser dans les études d’efficacité, de toxicologie réglementaire et enfin de prédire les doses des phases de preuve de concept en développement clinique chez l’homme. Le suivi de l’évolution du cancer permettra d’évaluer l’efficacité du ou des composé(s). Celui-ci sera réalisé par imagerie non-invasive de bioluminescence sur animal anesthésié ou par cytométrie en flux sur des échantillons sanguins (prélèvement non terminal). Des prélèvements tissulaires post-mortem pourront être réalisés pour des analyses ex vivo complémentaires : histologiques, par cytométrie en flux…

Bénéfices attendus

Les leucémies sont des cancers du sang qui ne touchent pas seulement les enfants, mais également les adultes. Il existe plusieurs types de leucémie. La classification se fait selon la rapidité d’évolution de la maladie (aiguë ou chronique) et selon les cellules souches de la moelle osseuse à partir desquelles elle se développe (myéloïdes ou lymphoïdes). Toutes les leucémies prennent naissance dans la moelle osseuse et se caractérisent par une prolifération incontrôlée des cellules. Cette surproduction de globules blancs anormaux envahit la moelle osseuse, empêche les globules blancs normaux d’arriver à leur maturité pour assurer leur rôle. Les globules blancs anormaux finissent par se déverser dans le sang au détriment des globules blancs normaux. Environ 9 000 personnes sont touchées chaque année en France. Les leucémies représentent 29 % des cas de cancer diagnostiqués chez les moins de 15 ans et 14 % des cancers qui se développent à l’adolescence selon l’Institut National du Cancer. La proportion de personnes atteintes dans la population mondiale est de 1 à 2 cas pour 100 000 personnes. Si ces pathologies sont de mieux en mieux prises en charge, elles restent dévastatrices. En effet, selon leur type, les leucémies ne constituent pas un cancer de bon pronostic. La survie des leucémies aiguës est basse (survie de 19% pour les leucémies aiguës myéloïdes à 5 ans). Ce qui souligne l’inefficacité des traitements actuels et la nécessité de développer de nouvelles thérapies. Les procédures qui constituent ce projet s’inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. A court terme, elles permettront de prédire l’efficacité de nouveaux candidats médicaments. A plus long terme, ces procédures constitueront la base pour un traitement applicable à l’Homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients.

Procédures

Les gestes techniques concernant tous les animaux : • Tatouage (1 fois ; 2 min) sur animal vigile • Injection des cellules leucémiques (1 fois) sur l’animal vigile par injection intrapéritonéale (30 sec) ou intraveineuse via la veine caudale (30 sec) ou sur l’animal anesthésié par inhalation d’anesthésique gazeux par voie intraveineuse via le sinus rétro-orbital (30 sec) • Pesée (maximum 1 fois par jour sur la durée du protocole ; 30 sec) sur animal vigile. Les gestes techniques concernant tous les animaux ou en partie (dépendra des demandes clients) : • Administration intrapéritonéale (maximum 1 fois par jour sur la durée du protocole ; 30 sec) sur animal vigile • Suivi de la croissance tumorale par bioluminescence (maximum 3 fois par semaine sur la durée du protocole ; 15 min à 1h) sur animal anesthésié par inhalation d’d’anesthésique gazeux • Prélèvements de sang (30 sec) : la fréquence dépendra là encore des demandes clients mais elle sera adaptée en fonction du volume prélevé en accord la législation en vigueur Les sites seront la veine submandibulaire sur animal anesthésié par anesthésie gazeuse, ou veine caudale, ou amputation unique de la queue (coupe 1 à 2 mm sur l'extrémité non innervée de la queue) sur animal vigile. • Administrations des composés à potentiel thérapeutique : la fréquence dépendra là encore des demandes clients mais elle sera en accord avec la législation en vigueur. Les voies envisagées sur animal vigile seront les voies (30 sec) : per os, intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse via la veine caudale ou intramusculaire. Les voies possibles sur animal anesthésié par inhalation d’anesthésique gazeux seront intradermique (1 min) ou intraveineuse via le sinus rétro-orbital (30 sec).

Impact sur les animaux

Ces modèles peuvent engendrer une dégradation de l’état de santé de l’animal pouvant se traduire principalement par une diminution de l’activité motrice mais peuvent aussi également survenir une respiration difficile, une perte de poids, une pilo-érection et/une altération des fonctions normales (impossibilité de s’alimenter). Ces effets apparaissent potentiellement au fur et à mesure de l’évolution de la leucémie. Les animaux peuvent être également soumis à des anesthésies répétées ce qui peut constituer une nuisance.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des études afin notamment de prélever des organes d’intérêts qui feront l’objet d’analyses (ex : dosage de biomarqueurs, dosage des concentrations des composés à potentiel thérapeutiques …). Les modèles décrits ne permettent pas la réutilisation des animaux.

Remplacement

Principalement 2 approches sont utilisées pour mimer les événements biologiques associés aux processus de cancer : une approche in vitro, basée sur l’utilisation de lignées cellulaires ou de cellules cancéreuses isolées et des approches in vivo, basées sur l’utilisation d’animaux de laboratoire, chez lesquels des cellules cancéreuses sont inoculées. Les modèles in vitro ne recréent ni la diversité de l’environnement des tumeurs, ni la difficulté pour une molécule testée d’atteindre les cellules cibles. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouvelles molécules antitumorales. De plus, à notre connaissance, il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de modéliser la relation pharmacodynamique et pharmacocinétique dans un contexte tumoral. L’écosystème nécessaire pour la pharmacodynamie et la pharmacocinétique intègre de nombreux tissus et organes : système digestif, système circulatoire, système rénal, système immunitaire intégral, système nerveux périphérique et central. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes.

Réduction

L’évolution de la leucémie sera suivie au cours du temps par imagerie de bioluminescence ou prélèvement sanguin non-terminal. L’utilisation de ces techniques non-invasives permet d’observer au cours du temps un seul animal simplement anesthésié, là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade d’une seule étude permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. De plus, d’une manière générale, les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in sillico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex : un récepteur, une enzyme). En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d’observer une activité sur les modèles de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet se base principalement sur les données de la littérature et peuvent également se baser sur les données de mise en place des modèles, notamment des analyses de puissance statistique et des tests de détermination de la taille des groupes expérimentaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux standards règlementaires de la directive n°2010/63/UE. Les locaux d’hébergement font l’objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux, des systèmes d’hébergement et d’animaux sentinelles. Les animaux seront groupés sans des cages contenant de l’enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Le nombre de manipulations sur l’animal sera réduit au strict nécessaire. Les procédures générant inconfort ou stress se feront systématiquement sous anesthésie. En cas d’apparition de signe de douleur, un analgésique adapté est donné par voie SC ou en gel alimentaire pour couvrir une période de 24 h. Si les signes devaient perdurer ou si l’utilisation de l'analgésique n’est pas possible (interaction médicamenteuse pour les animaux sous traitement), l’animal serait euthanasié. Au fur et à mesure des données collectées, des points limites prédictifs et spécifiques pour chaque modèle seront définis basés sur l’intensité de bioluminescence et/ou le % des cellules leucémiques et/ou normales. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Une fiche de suivi des signes cliniques a été mise en place. Elle permet d’établir un score pour évaluer l’état général de l’animal et en fonction du total des scores des mesures sont appliquées. Ainsi, à partir d’un total de 2, les gavages seront suspendus (si applicable), à partir d’un score de 4, un suivi vétérinaire sera mis en place avec une surveillance renforcée des animaux et des mesures complémentaires seraient prises telles que aliment humide au sol, ajout d’enrichissement... et à partir d’un total de 6, l’animal sera euthanasié. De plus, si un animal atteint un des points limite établis, il sera immédiatement euthanasié.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rongeur. Des données sur les modèles de leucémie chez la souris existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets (doses de cellules, effets de molécules de références etc.). La souris est un modèle d’étude de choix car : 1/ sa petite taille facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo (ou plusieurs souris peuvent être placées en même temps dans l’appareil d’imagerie), et 2/ la biodisponibilité des souris immunodéficientes (nécessaires pour l’utilisation de cellules humaines). Adulte : les données de la littérature indiquent clairement que les rongeurs adultes représentent des modèles fiables pour l’évaluation de l’efficacité de composés dans le domaine du cancer.

702 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur est greffée sur leur flanc, puis elles reçoivent sous anesthésie quatre à neuf injections d'un vaccin, d'anticorps ou d'adjuvant, y compris directement dans la tumeur, pour étudier une immunothérapie anticancéreuse à base de complexes protéines-ARN. Le porteur décrit une inflammation transitoire et une gêne modérée liée à la tumeur, et affirme n'attendre aucune toxicité du vaccin. Il conclut qu'un "organisme entier" est nécessaire et qu'aucun milieu artificiel ne recrée la complexité de la réponse immunitaire.

Objectifs

Ce projet a pour but d'étudier une nouvelle classe d'immunothérapie anticancéreuse basée sur des complexes protein-ARNs. Le but est d’optimiser le potentiel thérapeutique d'une autoimmunité ciblée contre la tumeur et de mieux comprendre les conditions requises pour l’efficacité de cette thérapie. Les études mettront en lumière le mode d'action, et aideront à optimiser la formulation de cette nouvelle classe en vue de réaliser des essais ensuite chez l'homme.

Bénéfices attendus

Connaissances fondamentales. Ce projet contribuera à une meilleure compréhension du potentiel thérapeutique des complexes proteines-ARNs et des mécanismes impliqués dans la rupture de la tolérance. Ces résultats bénéficieront à la communauté scientifiques et potentiellement aux immunologistes travaillant sur le cancer et les maladies immunitaires déclenchées par les auto-antigènes. Connaissances appliquées : Le but ultime du projet est le traitement de patients humain.

Procédures

Nuisances modérées: Vaccinations/injections sous anesthésie générale et presence d'une tumeur sur le flan. Toutes les injections se font sur animaux anesthésiés. Injection du vaccin ( A injection durant 1 min par jour. 4 à 9 injections dans la peau au total). Injections d'anticorps dans la cavité abdominale (1 injection durant 1 min par jour. 4 à 9 injections au total ). Injections d'adjuvant et/ou d'anticorps pour mobiliser une réaction inflammatoire dans une tumeur (1 injection durant 1 minute par jour. 1 à 9 injections directement dans la tumeur). Mesure de la taille de la tumeur 2-3 fois par semaine (durée 2 minutes). Prelèvements après euthanasie.

Impact sur les animaux

Le vaccin n'est pas toxique. Une inflammation transitoire peut être observée. La tumeur sur le flan peut povoquer une gêne modérée. Les injections d'anticorps sous anethésie ne crééent pas de nuisance perceptibles sur le plaln clinique, mais seulement des effets mesurable sur le plan cellulaire et moléculaire (comme chez l'homme).

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure pour prélever les organes (rate, sang, tumeur si présente).

Remplacement

Un organisme vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement du vaccin. Il n’est pas possible de recréer, en milieu artificiel, la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans la réponse immunitaire.

Réduction

Le nombre minimum nécessaire et suffisant a été scrupuleusement déterminé par calcul statistique. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux seront observés et pesés quotidiennement.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Un mammifère est nécessaire car le système immunitaire des non-mammifères (invertébrés...) est trop différent de l'homme. La souris est l’animal classiquement utilisé pour étudier l’efficacité d’un vaccin thérapeutique antitumoral au niveau préclinique. La souris est aussi le seul modèle où nous disposons de tous les outils appropriés et validés (anticorps et tumeur). Livraison des animaux âgés de 5 semaines et début de l’expérimentation à 6-7 semaines. Ce stade est couramment utilisé dans la littérature ce qui nous permettra de comparer nos résultats avec les données publiées. Des séries d'immunisation sur des animaux âgés de 1 an sont également prévues afin de comparer la sureté et l'efficacité sur des animaux plus âgés et suivre les effets sur l'espérance de vie.

1 620 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Fortement immunodéprimées, elles sont greffées avec des cellules leucémiques humaines puis reçoivent des molécules candidates, avec des prises de sang hebdomadaires, pour mettre au point un modèle de leucémie liée au virus HTLV-1 et tester des traitements. Le porteur décrit les effets attendus de la greffe, amaigrissement, perte d'équilibre, difficultés motrices, gonflement du ventre et poils hérissés, suivis par une grille bi-hebdomadaire. Il juge de nouvelles approches thérapeutiques "indispensables" et affirme qu'il n'existe "pas de modèle cellulaire satisfaisant" pour cette maladie.

Objectifs

La leucémie/ lymphome T liée au virus HTLV-1 (ATLL) est une maladie du sang agressive qui est rapidement mortelle dans la majorité des cas malgré des protocoles de traitement intensifs. Ceci est principalement lié à une résistance des cellules leucémiques à la chimiothérapie chez environ 50% des patients. Il est donc indispensable de proposer aux patients de nouvelles approches thérapeutiques. Hormis les lignées dérivées historiques de cellules d’ATLL dont on sait que le comportement est éloigné de celui des cellules d’ATLL de patients, il n’existe pas de modèle cellulaire satisfaisant pour l’étude de la maladie induite. Par conséquent, il est nécessaire de tester l’efficacité de nouveaux traitements sur d’autres modèles, qui de plus représentent la diversité des mutations cancéreuses observées chez les cellules leucémiques des patients. Ce projet fait suite au précèdent projet dont l’objectif initial était l’établissement de lignées à partir de cellules primaires de patients atteints de lymphome/leucémie lié au virus HTLV-1 ou de cellules sur le même modèle de qui est réalisé dans d’autres maladies du sang. Depuis 2019, une vingtaine de cellules primaires d’ATLL ont été injectées à des souris fortement immunodéprimées. Il a été possible d’obtenir 4 lignées stables (après plusieurs réinjections). De manière intéressante, il a été possible de cultiver in vitro pendant quelques jours (2-3 semaines environ) 3 de ces lignées. Ce projet a un double objectif : 1. Mise au point d’un nouveau modèle de leucémie/lymphome T liée à HTLV pour permettre une meilleure compréhension de la maladie induite (poursuite de l’étude débutée en 2019). 2. Evaluer in vitro et in vivo l’efficacité de nouvelles thérapeutiques potentielles qui seront testées seules ou en association pour contrecarrer la résistance primaire des cellules d’ATLL à la chimiothérapie.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est l’identification d’une ou plusieurs molécules d’intérêt qui a (ont) un effet potentiel anti-tumoral sur les cellules d’ATLL. Cette (ces) molécule(s) fera (feront) l’objet d’études approfondies sur son (leur) mécanisme d’action. Enfin à terme, l’objectif est de proposer une étude clinique étant entendu que l’ATLL est une maladie orpheline qui concerne moins de 50 nouveaux patients par an en France mais environ 1000 cas par an au Japon et que l’ATLL est un modèle pour d’autres maladies du sang.

Procédures

Les souris seront greffées avec des cellules leucémiques d’origine humaine par voie intrapéritonéale, intraveineuse (queue) ou sous-cutanée (durée du geste : quelques secondes). Ce geste ne sera réalisé qu’une seule fois. Des prises de sang (50 microlitres maximum) seront réalisées de façon hebdomadaire pour évaluer la prise de greffe (durée du geste : quelques secondes). Des candidats molécules thérapeutiques seront administrées aux souris selon un schéma propre déjà décrit dans la littérature dans le cadre d’autres études sur d’autres cancers ; les doses injectées et les fréquences décrites n’engendrent pas d’effets secondaires néfastes. Différents modes d’injections seront utilisés (en respectant les volumes maximaux associés à chaque voie) : - Intrapéritonéal (quelques secondes) - Intraveineux : sous anesthésie gazeuse ou médicamenteuse (durée quelques minutes entre l’anesthésie et l’injection) - Gavage (quelques secondes)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables liés à la greffe de cellules tumorales humaines ont été observés et mesurés au cours du projet précédent et ont conduit au développement d’une grille de suivi spécifique bi-hebdomadaire : amaigrissement, ataxie (perte d’équilibre), des difficultés motrices, le gonflement du ventre, perte de poils ou poils hérissés. L’apparition d’un dos voussé ou d’un faciès douloureux est également noté. Les molécules candidates ont toutes déjà été utilisées dans des modèles murins et la quasi-totalité ont fait l’objet de publications scientifiques. Pour la majorité de ces molécules, il n’est pas rapporté d’événement indésirable notable en lien avec leur administration. Quelques-unes ont conduit à une dégradation de l’état des souris imputé à l’apparition d’un syndrome de lyse tumorale en cas d’administration à un stade de prise de greffe avancé ; pour ces molécules, nous privilégierons leur utilisation dans le cadre d’un traitement avant la prise de greffe afin de limiter ce risque et monitorerons de manière plus rapprochée les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car immunodéficients, infectés par le virus HTLV-1 et développant une tumeur.

Remplacement

Hormis les lignées dérivées historiques de cellules d’ATL (lignées TLOMI et MT1) dont on sait que le comportement est éloigné de celui des cellules d’ATL primaires, il n’existe pas de modèle cellulaire satisfaisant pour l’étude de la maladie liée au virus HTLV-1 (conclusion tirée après concertation entre laboratoires travaillant sur cette pathologie et analyse de la littérature). Les molécules que nous utiliserons auront toutes été préalablement testées et validées in vitro sur des cultures de cellules avant leur administration chez la souris. Cependant, cette étude in vitro, qui permettra de fortement limiter le nombre de molécules candidates à tester, ne peut remplacer une étude préclinique sur modèle animal pour tester leur efficacité in vivo.

Réduction

Nous utiliserons une double stratégie de réduction du nombre d’animaux utilisés dans le cadre de cette expérimentation. Dans un premier temps, toutes les molécules candidates seront testées in vitro sur des cultures de cellules, et seules les molécules ayant démontré une efficacité sur la viabilité des cellules tumorales in vitro seront utilisés dans le cadre de cette expérimentation. Dans un deuxième temps, nous évaluerons l’efficacité des molécules les plus efficaces dans le cadre d’un traitement avant greffe de tumeurs sur souris. Seules les molécules efficaces dans la procédure 2 seront ensuite éventuellement testées dans le cadre d’un traitement curatif (après la greffe), seules ou en association avec une chimiothérapie. Au niveau statistique, le nombre d’animaux prévu pour les procédures 2 et 3 est compatible avec la mise en évidence d’effets expérimentaux forts, ce qui est l’objectif recherché. Une hétérogénéité est attendue entre les différentes lignées (hétérogénéité génétique selon les patients), donc l’analyse des données devrait faire appel à des modèles statistiques spécifiques.

Raffinement

Une grille d’évaluation spécifique ainsi que des points limites spécifiques ont été développés au cours du projet précédent de génération des cellules, et seront utilisés afin de suivre de manière rapprochée et la plus précise possible la pris de greffe chez les animaux, et d’intervenir précocément en cas de signe de souffrance. Les points suivis sont : l’amaigrissement (grâce à l’aspect de la colonne vertébrale, le poids n’ayant aucune signification lors d’une prise de greffe), l’ataxie (perte d’équilibre), des difficultés motrices, le gonflement du ventre, l’aspect du pelage (perte de poils ou poils hérissés). L’apparition d’un dos voussé ou d’un faciès douloureux est également noté. En lien avec les animaliers chargés du suivi, nous avons développé une grille d’intensité (+, ++ ou +++) de ces symptômes conduisant aux points limites des expériences. Toute observation inhabituelle est également répertoriée et évaluée. En cas d’injection de la tumeur par voie sous-cutanée dans dugel, le volume tumoral sera évalué par mesure au pied à coulisse deux fois par semaine.

Choix des espèces

Le projet précédent a permis d’établir qu’un modèle ce cellule était réalisable dans le cadre de l’ATLL sur des souris femelles immunodéficientes, en conservant la plupart des caractéristiques de la tumeur initiale, ce qui en fait un modèle très pertinent pour étudier la maladie HTLV-1 induite et rechercher de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous ne disposons pas à ce jour de modèle d’étude plus proche de la maladie initiale et représentatif de l’hétérogénéité clinique et moléculaire de la maladie. Les souris seront âgées de 7 à 15 semaines au moment de l’injection de cellules de patients ATLL (même stade de développement que dans le projet précédent de développement des lignées, et que dans d’autres projets d’études de leucémies/lymphomes). En l’absence d’apparition de signes de souffrance ou d’atteinte d’une prolifération suffisante de cellules cancéreuses dans le sang des souris, les animaux seront mis à mort au plus tard un an après injection.

150 poules vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections intramusculaires d'un antigène couplé à un adjuvant sur soixante-trois jours, puis sont tuées, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur indique que les injections avec adjuvant complet de Freund peuvent provoquer ulcérations, fièvre et baisse de mobilité, et présente le prélèvement des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace et que l'immunité de l'animal vivant est "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.

Procédures

5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (perchoir, miroir, bloc à picorer ou type coquilles d'huîtres...).

Choix des espèces

La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.

130 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie générale, ils subissent une cœlioscopie de deux heures pour vaporiser une chimiothérapie dans l'abdomen puis la pose d'une sonde de dialyse péritonéale, avec prélèvements répétés de sang et de liquide péritonéal sur vingt-deux jours avant la mise à mort, pour tester la méthode PIPAC contre les métastases du cancer de l'estomac. Le porteur détaille les nuisances postopératoires et l'isolement en cage lié aux cathéters, et précise que cette étude est exigée par la réglementation avant un essai de phase 1 chez l'humain. Il justifie le recours au porc par une anatomie et un système immunitaire proches de l'humain, qu'aucun petit animal ni modèle in vitro ne remplacerait pour cette technique.

Objectifs

En 2018, plus d’un million de patients dans le monde ont développé un cancer de l’estomac. La même année, il a été estimé que les décès suite à un cancer de l’estomac représentent 8,2% de tous les décès par cancer. Parmi ces décès, 40-50% des patients ont développé des métastases péritonéales. Pour ces patients-là, en l’absence de thérapie, l’estimation moyenne de survie est de 3 mois. Même si la chimiothérapie palliative en intraveineux est un traitement standard pour les formes de cancer non résécables dans le monde entier, ce traitement n’améliore la survie médiane en cas de cancer de l’estomac qu’à 7 mois pour les patients atteints de métastases péritonéales. Les survivants à long terme sont exceptionnels. D’un point de vue médical, il est donc important d’améliorer les traitements des métastases péritonéales du cancer de l’estomac et de dévelloper des traitements qui améliorent la durée de la survie et la qualité de vie des patients. Une avancée récente dans le traitement du cancer de l’estomac non résécable a été l’approbation des Inhibiteurs de points de Contrôle Immunitaire (ICI) qui représente une voie attrayante comme thérapie. En effet, une tumeur peut utiliser des points de contrôle pour se protéger contre les attaques du système immunitaire. Inhiber ces points de contrôle permettrait donc de rétablir la fonction du système immunitaire. Toutefois, l’effet de l’immunothérapie intraveineuse est resté faible chez la majorité des patients avec un taux de réponse très limité (12% maximum). Ainsi, à ce jour, le traitement avec les seuls ICI est insuffisant. En 2021, des modèles murins ont démontrés que combiner un traitement avec un ICI et une molécule immunostimulation intrapéritonéale efficace permet de surmonter ces limitations. Mais aucune donnée n’est disponible sur un modèle de gros animal. Le but de ce travail est de se mettre dans les mêmes conditions que les patients humains sur un modèle animal porcin afin d’avaluer dans un permier temps la distribution intrapéritonéale des molécules anticancéreuses cibles, notamment immunologiques, suite à la réalisation de la méthode PIPAC. Cette méthode consiste à vaporiser de la chimiothérapie et permettra d’améliorer l’efficacité des molécules anti cancéreuses administrées directement au niveau des métastases et pas dans la circulation générale sans détériorer la qualité de vie des patients. Cette étude est nécessaire règlemenairement pour déposer une demande d'étude de phase 1 chez les êtres humains.

Bénéfices attendus

L’utilisation de la PIPAC présente des avantages pharmacologiques par rapport à d’autres méthodes de traitement des métastases péritonéales (MP) associés à certains cancer comme les cancers digestifs ou gynécologiques comme la chimiothérapie intrapéritonéale hyperthermique (HIPEC) et à la chimiothérapie IP conventionnelle basée sur un cathéter. Ces avantages sont: une meilleure homogénéité de la distribution du principe actif, une pénétration plus profonde et une concentration plus élevée du principe actif dans le tissu cible. L'indication actuelle de la PIPAC est le traitement palliatif des MP dans les tumeurs gastro-intestinales et gynécologiques. La PIPAC est réalisable chez la grande majorité des patients, est sûre, ne provoque pas de toxicité significative pour les organes et est bien tolérée. La PIPAC peut être une intervention ambulatoire. La PIPAC n'entraîne pas de détérioration de la qualité de vie. Les autres avantages de la PIPAC sont les longs intervalles sans traitement, la possibilité de répéter l'intervention, le potentiel de combinaison avec un traitement systémique et la possibilité d'évaluer la réponse au traitement par des biopsies en série.

Procédures

Les interventions seront soumis aux procédures suivantes. Mise en place de la chimiothérapie avec méthode PIPAC (sous cœlioscopie) et de la sonde de dialyse péritonéale sous anesthésie générale et antalgique: durée 2h00 une seule fois le premier jour. Prélèvement de sang et de liquide péritonéal sous anesthésie générale durée 30 minutes le 1er, 2eme, 3ème , 4ème, 8ème et 15ème jour. Le dernier prélèvement de fera au 22ème jour lors de la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

En principe, toute anesthésie générale représente une contrainte pour l'ensemble de l'organisme et comporte des risques qui sont dans ce cas minimes du fait du choix d'un protocole d'anesthésie approprié et d'une analgésie postopératoire. Voici la liste des nuisances qui pourraient affecter le bien être des animaux avec l’intensité associée de cette nuisance. 1) Prémédication / Injections intramusculaires (anesthésie, antibiothérapie, éventuellement analgésie): douleur faible liée à l’injection. 2) Intervention chirurgicale (PIPAC) - sous anesthésie profonde et analgésie : douleur absente pendant la durée de l’intervention. 3) Douleurs de la plaie postopératoires - avec régime analgésique: faible à moyen en fonction de l’analgésie. 4) Sédation/anesthésie courte: faible nuisance. 5) Prélèvements sanguins veineux: absence de douleur lors des ponctions car animal sédaté. 6) Prélèvements de liquide péritonéal: absence de douleur lors de la collecte car animal sédaté. Nb : ce prélèvement se fait chez l’humain conscient sans douleur. 7) Maintien en isolement post-opérative en assurant un contact social indirect voir directs (contacts olfactifs, auditifs, visuels) entre les lieux d’hébergement : faible nuisance. 8) Effets secondaires systémiques de la substance: effets non connus mais avec impact faible à moyen. 9) Port de cathéters et de bandages: faible nuisance. 10) Maintien des animaux en cage individuelle avec contact olfactif, visuel et auditif avec les congénères: nuisance modérée. La classification de la gravité de l'exposition selon l'annexe VIII de la directive 2010/63/UE doit être considérée comme globalement moyenne (annexe VIII, section III, point 2c).

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de l’étude. Cependant, les animaux utilisés pendant ce projet pourront être réutilisé pour des TP d’autopsie pour la formation de docteur vétérinaire. De même, des echantillons biologiques pourront être prélevés et servir à répondre à d’autres problématiques scientifiques sans avoir à utiliser d’autres animaux.

Remplacement

Les molécules étudiées dans cette étude sont essentiellement immunomodulatrices. Cela signifie qu'elles déclenchent une réponse immunitaire humorale et/ou cellulaire. Différents modèles permettent de répondre à différentes questions que ce soit des modèles in vitro et in vivo. Cependant, l'immunité innée et adaptative ne peut être étudiée que sur un être vivant. Par ailleurs, une recherche bibliographique approfondie a été menée avant de mettre en place cette procédure. Une recherche dans la base de données ZEBET sur les alternatives à l'expérimentation animale pour cette question (efficacité et toxicité locales versus systémiques) n'a donné aucun résultat. Des études in vivo existent mais uniquement sur des modèles murins. Ces études montrent une toxicité locale et systémique acceptable. Cependant, la procédure PIPAX ne peut pas être réalisée sur des modèles petits animaux et aucune donnée n'est disponible sur un modèle de gros animaux. Le porc a donc été choisi comme modèle pour les expériences prévues, car il est le mieux adapté en tant que mammifère similaire à l’homme du fait de son anatomie, de son système immunitaire et de sa physiologie. C’est d’ailleurs le modèle de référence aujourd’hui pour cette technique dans les études précliniques. En particulier, la surface péritonéale est comparable à celle d'un humain adulte dans la catégorie de poids choisie. Il en va de même pour les similitudes de l'immunité innée et réactive.

Réduction

Nous utilisons le nombre le plus réduit possible d’animaux notamment en réalisant une étude pilote sur seulement 3 animaux par groupe avant de débuter la phase de test réalisés sur le seul groupe retenu au préalable. Le groupe de l’étude test intégrera les résultats obtenus pendant l’étude pilote. L’interprétation des résultats sera réalisé à l’aide de statistiques descriptives en comparant les moyennes des paramètres biologiques.

Raffinement

Les animaux sont acclimatés à l’animalerie et maintenus en groupe tant que c’est possible. L’hébergement des animaux s’effectue dans un milieu enrichi avec des jeux afin de distraire les animaux et dans la mesure du possible sur copeaux afin de répondre à leur comportement d’animal fuisseur. Ils ne sont isolés que lorsqu’ils sont équipés de cathéters. A ce moment-là, on maintient entre eux un contact visuel, auditif et olfactif et notre équipe continue d’entretenir un contact social. Les catheters sont régulièrement entretenus pour éviter qu’ils ne se bouchent. Les animaux sont vus et soignés au moins deux fois par jour ce qui contribue à les apprivoiser. Toutes les phases douloureuses sont anticipées par des traitements analgésiques. Des points limites ont été mis en place et sont objectivés à l’aide d’une grille de scoring de la douleur (voir la procédure). Au terme de la procédure, des prélèvements biologiques peuvent être réalisés afin de créer une banque qui pourra être utilisée dans d’autres études. Le plan de prélèvements sanguins est conçu de sorte à ne jamais prélever un volume de sang supérieur à 7,5% du volume circulant de l’animal. De même, les administrations parentérales ne dépasseront pas les recommandations communément admises dans « A Good Practice Guide to the Administration of Substances and Removal of Blood, Including Routes and Volumes ».

Choix des espèces

Le porc a été choisi comme modèle pour les expériences prévues, car il est le mieux adapté en tant que mammifère similaire à l’homme dans de nombreuses propriétés anatomiques. C’est d’ailleurs le modèle de référence aujourd’hui pour cette technique dans les études précliniques. En particulier, la surface péritonéale est comparable à celle d'un humain adulte dans la catégorie de poids choisie. Il en va de même pour les similitudes de l'immunité innée et réactive. L'expérience prévue n'est pas possible sur des animaux plus petits, parce que la technologie et les paramètres physiques (conditions de pression) seraient surdimensionnés et inapplicables pour des animaux aussi petits. Les animaux devront avoir un poids corporel similaire à celui d’un homme (70kg) ou d’une femme (60kg) adulte, et donc être en phase de croissance : les porcs seront agés de 3-4 mois pour un poids de 70 kg environ et présenteront un volume de distribution plasmatique équivalent à celui d’un adulte.