Cancers
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Evaluation de la biodistribution, du métabolisme et des voies d’excrétion de composés chimiques ou biologiques radiomarqués ou non chez le rat avec placement des animaux en cage métabolique et administration intracorticale
- Recherche appliquée
- Cancers
150 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur injecte des composés directement dans le cerveau sous anesthésie, puis on en place une partie jusqu'à cinq jours en cage à métabolisme, sur sol grillagé et isolés, pour mesurer le devenir de candidats médicaments dans l'organisme. Le porteur qualifie lui-même de sévères la douleur chirurgicale et le stress de la cage à métabolisme, et prévoit une mise à mort au-delà de 15 % de perte de poids. Il présente ces études comme "requises par les instances réglementaires" avant tout passage chez l'humain, en visant des cancers du cerveau comme le glioblastome pédiatrique.
Objectifs
En phase préclinique, le développement d’un médicament évalue différents paramètres dans le but de démontrer son efficacité ainsi que sa bonne tolérance et élimination par l’organisme. Parmi les données à apporter lors de la constitution d’un dossier en vue d’une demande de mise sur le marché, une évaluation de la pharmacocinétique comprenant les étapes d’absorption, de métabolisme, de distribution et d’excrétion, du composé actif est nécessaire. L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo l’absorption, la distribution, la métabolisation et l’excrétion de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, par voie intracorticale (dans le cerveau). Cette approche est en particulier justifiée dans le cas de l’évaluation d’approches thérapeutiques ciblant spécifiquement le cerveau, pour des pathologies – notamment en oncologie (par exemple glioblastomes pédiatriques) – pour lesquelles le besoin médical est critique. Certains paramètres d’absorption, de distribution, de métabolisme et d’élimination des composés seront si possible déterminés préalablement in vitro, avant l’évaluation plus exhaustive in vivo chez le rat. Dans certains cas, il sera possible d’avoir recours à une forme radiomarquée des composés afin de faciliter leur dosage et l’identification de leur distribution. La procédure de ce projet permettra d’étudier la pharmacocinétique des composés testés in vivo, par administration par voie intracorticale de la molécule froide ou radioactive, des animaux contrôles seront traités par administration intraveineuse avec le même composé. Selon les objectifs d’étude, pour l’évaluation des excrétions (fèces et urine), une partie des animaux seront placés en cage à métabolisme en hébergement individuel pour d’une durée maximale de 120h (5 jours). Des prélèvements divers (notamment sanguins), pourront être effectués in vivo dans le respect des recommandations vétérinaires afin de doser le composé dans ces fluides, et des prélèvements d’organes pourront avoir lieu, exclusivement post mortem. Les urines et fèces seront récupérés grâce aux dispositifs de la cage à métabolisme, sans intervention sur l’animal.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer chez le rat la pharmacocinétique in vivo de composés biologiques ou chimiques après une administration chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 28 jours. Lors du développement d’un médicament, cette évaluation est requise par les instances règlementaires avant passage en phase clinique. Ainsi, le comportement de la molécule dans l’organisme, son métabolisme, sa distribution dans les tissus et son excrétion pourront être anticipés avant de réaliser les études chez l’homme. La voie d’administration des composées (intracorticale = dans le cerveau) adresse le cas de pathologies difficiles à traiter et pour lesquelles le besoin médical actuel est critique, notamment en oncologie (par exemple glioblastomes pédiatriques). Le bénéfice attendu du développement de nouvelles molécules thérapeutiques est donc particulièrement important.
Procédures
Des composés chimiques ou biologiques froids ou radiomarqués seront administrés aux animaux par voie intracorticale, sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie.Les administrations intraveineuse (IV) dans la veine caudal (veine de la queue) seront réalisée si nécessaire sous anesthésie générale à l’Isoflurane (cas de produit radiomarqué). Les traitements pre et post opératoire les administrations sous cutanée (SC) et intrapéritonéale (IP) seront réalisées sur animaux vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile. Le nombre et la fréquence des administrations sera déterminé en fonction de l’objectif de chaque étude. Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. La phase in vivo pourra durer jusqu’à un maximum de 5 jours en cage à métabolisme ou 28j en cage standard. Des prélèvements de sang, d’organes, d’urine et de fèces pourront être réalisés afin de suivre la biodistribution et l’élimination des produits administrés. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages à métabolisme, au maximum 120h (5 jours). En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération des organes et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie.
Impact sur les animaux
La chirurgie et la voie d’administration des composés génèreront une douleur opératoire et post opératoire de niveau sévère, justifiant la mise en place d’une analgésie, une perte de poids transitoire sera attendue sur un maximum de 7 jours. De plus, la chirurgie pourra induire d’autres effets indésirables de type neurologique, considérant le site de dépôt du produit. Deux à 3 jours avant le démarrage de l’étude, les animaux seront répartis en groupes homogènes (poids des animaux) et donc potentiellement mis en présence de nouveaux congénères. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress léger pendant 1 à 2 jours. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et prélèvements entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation. Lorsque cela sera nécessaire, le placement en cage à métabolisme génèrera un stress sévère après administration intracorticale. Dans ces conditions d’hébergement dérogatoire (et justifiées scientifiquement pour le suivi individuel des excrétions), les animaux seront placés sur un sol grillagé, ce qui pourrait gêner leur locomotion. Ils seront hébergés individuellement, mais resteront en contact visuel avec leurs congénères. Aucune toxicité du produit n’est attendue dans les conditions prévues de dose de produit utilisées.
Devenir
Après la procédure , les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés.
Remplacement
Les molécules chimiques ou biologiques dont la pharmacocinétique sera évaluée dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées à l’aide de tests in vitro (tests sur hépatocytes, microsomes, etc.) afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité, de leur propriété pharmacocinétique favorables et de leur absence de toxicité. Ces données sont insuffisantes pour avoir une bonne prédiction de la pharmacocinétique in vivo des molécules et d’autant plus pour permettre l’extrapolation de l’animal à l’homme. La pharmacocinétique réelle des meilleures molécules candidat devra donc être étudiée en premier lieu chez le rat.
Réduction
Ces études pré-règlementaires constituent une des dernières étapes des phases de développement préclinique, stade auquel les molécules évaluées auront déjà été sélectionnées en tant que candidat médicament parmi de nombreuses autres molécules. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individus. Une étude peut être composée de 2 à 15 groupes. Le nombre d’animaux par groupe variera généralement entre 3 (biodistribution) à 15 par dose de produit. Le nombre minimal d’animaux surnuméraires, sera utilisé afin de constituer plus facilement des groupes homogènes au moment de l’initiation de l’étude. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans cette procédure, il sera toujours proposé d’utiliser des prélèvements séquentiels d’un même animal.
Raffinement
Les animaux seront randomisés minimum 2 jours avant la chirurgie. Pour le groupe d’animaux devant être mis en cage de métabolisme une phase progressive d’habituation sera mise en place (sur 3 jours). Un enrichissement de l’environnement est utilisé dans toutes les cages et dans les cages à métabolisme l’enrichissement sera adapté. La procédure chirurgicale permettant le traitement intracortical (dans le cerveau) sera réalisée par des techniciens maitrisant les gestes chirurgicaux spécifiques. L’absence de conséquence neurologique a été démontrée dans des études préalables. La réalisation de la procédure sera suivie par la SBEA et toutes propositions seront étudiées. La procédure sera réalisée sous anesthésie générale combinant une anesthésie fixe et une anesthésie gazeuse avec une analgésie opiacée et un anti-inflammatoire non stéroïdiens. Une anesthésie locale sera également administrée en sous-cutané avant la chirurgie. L’analgésie sera renouvelée 4h et 6-8h après la chirurgie puis 2 fois le lendemain et le surlendemain de la chirurgie (couverture 72h). L’anti-inflammatoires non stéroïdiens ou un corticoïde sera renouvelé pendant 2 jours. Un soutien thermique (tapis chauffant ou armoire chauffante) sera mis en place durant toute l’anesthésie et la phase réveil. Les administrations IV et prélèvements seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress. Les expérimentateurs sont formés pour évaluer l’état de souffrance et les points limites. Une grille de scoring est mise en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les principaux points limites sont listés dans la procédure. Les scores cliniques les plus élevés et l’accumulation de scores intermédiaires constitueront un point limite. Après chaque manipulation lorsque cela est possible l’animal recevra une récompense (contact positif). • Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine et pesés quotidiennement pendant les 7 jours suivant la chirurgie.Si perte du poids >10% : pesées quotidiennement et ajout de capsules d’eau gélifiées Poids entre 10 et 15% : réhydratation avec du Ringer Lactate (1mL) 1 fois par jour. Si perte de poids > 15% ou >10% pendant plus de 3 jours constituera un point limite. Le maintien des animaux en cage à métabolisme sera évalué quotidiennement par le vétérinaire ou la SBEA
Choix des espèces
La réglementation demande de réaliser les études précliniques sur plusieurs espèces différentes, or pour la réalisation de cette procédure chirurgicale, le rat en raison de sa taille, est l’espèce la plus adaptée. Les animaux seront utilisés après sevrage à l’âge de jeunes adultes (7 semaines minimum). Des animaux adultes seront utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour mieux supporter les effets de la chirurgie et les effets secondaires des composés à tester
Etude de l’origine et de la fonction des fibroblastes associés aux tumeurs du poumon et de la vessie dans deux modèles murins de carcinogénèse chimio-induite
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
632 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 256 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit des cancers du poumon ou de la vessie par un carcinogène chimique présenté comme identique à celui du tabac, administré par injections ou dans l'eau de boisson pendant plusieurs semaines, pour étudier des fibroblastes qui entourent les tumeurs. Le porteur indique que les tumeurs de vessie peuvent provoquer une occlusion, une rétention d'urine et des douleurs, contenues par une palpation régulière et des points limites. Il reconnaît que des cultures d'organoïdes sont à l'essai mais les juge insuffisantes, et renvoie à une perspective les retombées pour l'immunothérapie.
Objectifs
Les recherches actuelles sur les cancers solides ne se focalisent plus uniquement sur les cellules cancéreuses mais ciblent aussi le microenvironnement tumoral. En effet, ce dernier composé de différents types cellulaires joue un rôle déterminant dans l’initiation et la progression tumorale. Le ciblage des cellules immunitaires (immunothérapie réactivant les lymphocytes T notamment) a conduit à des résultats spectaculaires de rémissions durables dans des tumeurs solides notamment dans le mélanome, le cancer du poumon et plus récemment le cancer de la vessie. Toutefois, cette stratégie thérapeutique fonctionne chez un nombre limité de patients (20 à 30%), incitant à étudier et comprendre les éléments contrôlant cette résistance. Des études récentes dans le cancer du poumon ont montré que certaines cellules (fibroblastes) associées aux tumeurs (CAF) forment une barrière autour des ilots tumoraux et empêchent les lymphocytes T de rentrer en contact directe avec les cellules tumorales empêchant leur destruction. Cette exclusion peut expliquer certains de ces échecs thérapeutiques. Deux types de tumeurs solides répondant partiellement à l’immunothérapie seront étudiées dans ce projet : - Le cancer du poumon :principale cause de décès par cancer dans le monde. Les traitements des stades précoces par chirurgie et radiothérapie conduisent à des rémissions durables mais les stades métastatiques ont une faible survie et restent un enjeu majeur de santé publique. - Le cancer de la vessie qui reste un enjeu majeur de santé publique en cas d’envahissement du muscle ou des ganglions lymphatiques voisins. Ces tumeurs peuvent potentiellement être guéries par l'ablation chirurgicale de la vessie et des ganglions lymphatiques. Cependant, chez plus de la moitié des patients qui subissent ce type d'intervention chirurgicale, des cellules cancéreuses ont déjà métastasé et le pronostic vital reste sombre. L’objectif de ce projet est d’identifier l’origine des fibroblastes capables de générer une barrière autour des ilots tumoraux et d’étudier leur fonctionnalité sur l’initiation et la progression tumorale. Cette recherche fondamentale sur l’origine et la fonction des CAF pourrait déboucher sur des thérapies innovantes ciblant les fibroblastes afin d’augmenter l’efficacité des immunothérapies
Bénéfices attendus
Les retombées à venir et les bénéfices attendus de ce projet sont importants car une meilleure caractérisation des cellules composant le microenvironnement tumoral a un impact majeur sur l’efficacité des nouvelles approches thérapeutiques antitumorales. Ainsi, l’identification de cibles pour manipuler les CAF et permettre aux lymphocytes T d’atteindre les cellules tumorales permettrait de guérir un nombre plus important de patients par immunothérapie, notamment dans un contexte de cancer du poumon ou de la vessie.
Procédures
Tous les animaux de ce projet seront soumis à une biopsie auriculaire, en vue de déterminer leur génotype, avant d’intégrer les différentes procédures. Dans une première expérience, les animaux recevront une injection d’un produit non douloureux directement dans l’abdomen (intrapéritonéale) à raison d’une fois par jour pendant 5 jours. Deux jours après la dernière injection, les animaux recevront un traitement chimique en vue de favoriser le développement de tumeurs pulmonaires. Ce traitement (non douloureux) sera administré directement dans l’abdomen des animaux, à raison d’une fois par semaine pendant 10 semaines. Dans une seconde expérience, les animaux recevront un traitement chimique en eau de boisson pour induire le développement de tumeurs vésicale. Les animaux seront exposés à ce traitement pendant 4 à14 semaines.
Impact sur les animaux
Une légère douleur de courte durée est attendue lors des biopsies auriculaires nécessaire au génotypage des animaux. Les produits administrés aux animaux ne sont pas irritants. Ils sont administrés dans l’eau de boisson ou par injection intrapéritonéale (douleur légère et de courte durée). Les dommages causés par le développement des tumeurs pulmonaires sont à long terme une perte de poids importante et dans les cas extrêmes non étudiés ici une difficulté respiratoire. Dans cette étude, une définition de points limites prédictifs et suffisamment précoces et un suivi régulier des animaux permet de ne pas atteindre ces stades avancés et de limiter la survenue de douleur. Suite au développement des tumeurs de vessie, les animaux pourront présenter une occlusion vésicale potentielle engendrée par une tumeur trop volumineuse (>7mm de diamètre). Cette occlusion peut provoquer une rétention d’urine et des douleurs associées. Une palpation régulière des animaux permet d’éviter ce stade terminal et de limiter la survenue de douleur. Aucune métastase n’a été observée dans ce modèle.
Devenir
Mise à mort des animaux d’élevages de génotypes non pertinents Mise à mort des souris pour analyse des tumeurs post mortem
Remplacement
Le rationnel de ce projet a été établi sur des prélèvements de tumeurs humaines étudiés par immunohistochimie. Des essais de culture sous forme d’organoïdes en 3 dimensions sont en cours mais ne nous permettent pas pour l’instant de reproduire les observations réalisées ex vivo chez l’homme. Seuls des modèles de souris transgéniques possédant un marquage des populations de fibroblastes d’intérêt et porteurs de tumeurs pulmonaires et de vessie peuvent nous permettre d’initier cette recherche fondamentale. L’identification des fibroblastes impliqués dans l’initiation et la progression tumorale pourrait déboucher sur des thérapies innovantes ciblant les CAF afin d’augmenter l’efficacité des immunothérapies.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est basé sur les données de la littérature décrivant les 2 modèles chimioinduits et nécessite au minimum 10 souris/temps d’analyse afin d’obtenir suffisamment de matériel tumoral. Les souris mâles et femelles transgéniques seront inclus afin d’optimiser l’utilisation des animaux produits en élevage. Aucune différence liée au sexe n’est attendue ici . Les souris non pertinentes d’une même portée seront utilisées en contrôles. Aucun test statistique ne sera envisagé dans cette étude car il s’agit d’une étude qualitative de suivi des fibroblastes par un marqueur sur des coupes d’histologie de tumeurs pulmonaires et de tri de la population tracée. En revanche le faible nombre de tumeurs par souris nous impose d’utiliser un nombre suffisant d‘animaux afin d’avoir le matériel pour conclure.
Raffinement
Les animaux transgéniques utilisés dans cette étude possèdent des fibroblastes marqués par une molécule fluorescente et présentent un état physiologique normal L’exposition au carcinogène chimique n’induit pas de douleur par lui-même, ni de perte de de l’appétit ou de poids. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux et l’absence de douleur due au développement des tumeurs. Un suivi régulier des animaux et une définition de points limites précoces permettent de limiter au maximum la souffrance engendrée par le développement des tumeurs. Les animaux seront mis à mort dès l’atteinte d’un point-limite
Choix des espèces
Le choix d’un modèle tumoral préclinique chez la souris est justifié du fait de l’existence de modèles de souris génétiquement modifiées permettant de visualiser une population de fibroblastes d’intérêt similaires à ceux trouvés chez l’Homme. L’induction de tumeurs (poumon ou vessie) par un carcinogène chimique dans de telles souris transgéniques permet de tracer in vivo le devenir de ces fibroblastes lors de la tumorigenèse et leur implication potentielle dans l’initiation et la progression tumorale. Les carcinogènes utilisés sont identiques à ceux présents dans le tabac et reproduisent des cancers de même type que ceux induits chez l’homme par l’exposition au tabac. De plus, les modèles murins permettent d’utiliser de nombreux outils disponibles (anticorps, cytokines) qui permettent d’étudier précisément la réponse immunitaire antitumorale dans cette espèce. Les souris seront génotypées à 3 ou 4 semaines (prélèvement auriculaire) Des souris adultes agées de 8 à 32 semaines seront utilisées en procédures. Cet âge adulte permet d’avoir un système immunitaire fonctionnel.
Utilisation de miARN dans la prévention du cancer colorectal associé aux Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin
- Recherche appliquée
- Cancers
32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit une inflammation chronique de l'intestin évoluant vers le cancer, avec une injection dans le péritoine et sept prélèvements sanguins rétro-orbitaux sous anesthésie sur trente-neuf jours, provoquant diarrhées et pertes de sang. Le porteur indique que la vérification in vivo est "exigible réglementairement" avant tout développement clinique, et qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la "complexité" de la cancérisation. Le bénéfice annoncé, prévenir le cancer colorectal par des microARN, reste hypothétique.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) qui regroupent la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH) se caractérisent par une inflammation de la paroi d’une partie du tube digestif. Les MICI peuvent survenir à tout âge mais sont le plus souvent diagnostiquées chez des sujets jeunes et 15 % des cas concernent des enfants. Chez environ 20 % des patients, les crises sont sévères nécessitant l'hospitalisation, l'arrêt de l'alimentation et un traitement parentéral pendant quelques jours. En outre, l’évolution de la maladie peut entraîner des complications aiguës chirurgicales et chroniques comme le cancer du côlon. Même si la pathogenèse des MICI n’est pas encore bien élucidée, des facteurs génétiques et environnementaux ainsi que des facteurs associés aux altérations du microbiote intestinal sont suspectés. La physiopathologie des lésions épithéliales intestinales notamment durant les phases aigues des poussées implique un processus inflammatoire résultant de la réponse immunitaire dite innée. Parmi les mécanismes de régulation de l’activité de cette réponse immunitaire, les microARN (ou miARN), qui sont des séquences d’ARN de petite taille, jouent un rôle en inhibant différentes voies de signalisation pro-inflammatoires. Le rôle de ces miARN dans la régulation du processus inflammatoire permet de les considérer comme de nouveaux outils thérapeutiques. L’objectif de ce projet est de tester, dans un modèle murin connu de MICI chronique/cancer, certains miARN précédemment identifiés comme jouant un rôle anti-inflammatoire afin d’évaluer leur potentiel effet inhibiteur du développement du cancer colorectal.
Bénéfices attendus
La stratégie de lutte contre l'inflammation induite lors des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin avec un miARN permettrait de prévenir le développement du cancer colorectal.
Procédures
Les animaux seront sousmis à une injection péritonéale pour une durée d'1 minute et sept injections sanguines sous anesthésie étalées sur 39 jours et pour une durée de 5 minutes par injection.
Impact sur les animaux
Le modèle d'inflammation chronique de l'intestin nécessite deux actes expérimentaux, à savoir des injections rétro-orbitales et des injections par voie péritonéales pouvant créer un léger stress pour l'animal. De plus le modèle induit des diarrhées et des pertes de sang légères et parfois une perte de poids.
Devenir
Le prélevement d'organes à la fin des procédures expérimentales nécessite l'euthanasie des animaux.
Remplacement
Plusieurs tests in vitro sur un modèle de cellules de l’intestin permettent de sélectionner les miARN présentant une activité anti inflammatoire intéressante. L'étape de vérification de leurs activités in vivo est exigible réglementairement avant toute nouvelle phase de développement clinique. Le recours à l'animal est indispensable pour valider l'effet thérapeutique de notre candidat anti-inflammatoire lors d'un processus de cancérisation et à ce jour aucun modèle in vitro ou in silico n'est capable de reproduire la complexité de ce processus dans son intégralité.
Réduction
Une planification statistique minutieuse a permis de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés au nombre de 32, tout en préservant la validité statistique de l'étude. Les groupes contrôles des animaux ont été mutualisés aussi souvent que possible.
Raffinement
Les animaux seront hebergés avec suffisamment d'espace, par groupe de 5 avec comme enrichissement un tunnel de carton et du papier pour construction de nids. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux subissent le minimum de stress possible. En particulier, les litières seront changées quotidiennement et les animaux auront un accès direct et illimité à l'eau de boisson et à la nourriture. La procédure d'expérimentation sera pratiquée enutilisant des anesthésiques permettant de limiter la souffrance des animaux qui bénéficieront d'une procédure d'euthanasie anticipée et une sortie d'étude prématurée en cas d'atteinte des points limites éthiquement non acceptables. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Souris (Mus musculus) [A1
Choix des espèces
La souris est l'animal utilisé dans le modèle du cancer colorectal induit par une inflammation chronique du colon. Les souris seront manipulées à l'âge de 6 ou 7 semaines (maturité sexuelle atteinte). Ce choix est motivé par la nécessité d'utiliser des animaux ayant atteints l'âge adulte et qui répondent au modèle du cancer colorectal.
Etude de la biologie des tumeurs pédiatriques et développement de nouvelles approches thérapeutiques.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une greffe de fragments de tumeurs d'enfants ou une injection de cellules tumorales, puis des injections répétées et des prélèvements sanguins, pour étudier le sarcome d'Ewing et tester des traitements. Le porteur décrit des greffes et injections jugées peu gênantes et des prélèvements sanguins brièvement douloureux. Sur le remplacement, il affirme que ces modèles reproduisant l'écosystème tumoral sont les seuls proches des tumeurs de patients et restent nécessaires avant les essais chez l'humain.
Objectifs
Les tumeurs pédiatriques sont rares, puisqu’en France, un enfant sur 440 va développer un cancer avant l’âge de 15 ans, mais elles représentent 28 % de la mortalité enfantine ce qui en fait la 2e cause de décès chez les 1-14 ans après les accidents. Le sarcome d’Ewing est la seconde tumeur osseuse maligne pédiatrique la plus fréquente après l’ostéosarcome et touche environ 80 à 100 nouveaux patients par an en France. Malheureusement, 20 % des patients présentent des métastases au diagnostic ce qui diminue drastiquement leur chance de survie. Génétiquement, le sarcome d’Ewing a bien été caractérisé et est lié à une fusion entre deux gènes, aboutissant à l’expression d’une protéine anormale. Cependant, les mécanismes d’action de cette protéine dans la transformation tumorale doivent encore être élucidés. Afin de comprendre cette transformation tumorale et identifier les meilleures pistes thérapeutiques pour ces patients, l’utilisation des modèles animaux est primordiale pour nos projets. Nous utilisons des modèles de PDX (patient derived xenograft) qui sont générés après une greffe chez la souris d’un fragment de tumeur issu de patients. A l’heure actuelle, ces modèles animaux n’ont pas d’équivalence qui leur permettrait d’être remplacés par des approches alternatives de type in vivo puisqu’ils sont les seuls qui se rapprochent le plus de la tumeur de patients. . L’objectif du projet est d’identifier les mécanismes qui sont impliqués dans la transformation tumorale et de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont : - la génération de nouveaux modèles d’étude de cancers pédiatriques (PDXs ainsi que de nouvelles lignées cellulaires dérivées de PDX) qui sont limitants aujourd’hui. En effet, les modèles de PDX nous permettent d’obtenir du matériel tumoral suffisant pour réaliser nos études puisque nous ne pouvons pas les effectuer sur les tumeurs de patient, vu la quantité de matériel obtenue et la rareté des échantillons. De plus, les modèles PDX sont les seuls modèles qui se rapprochent le plus aux tumeurs de patient. - Etudier la structure 3D de la chromatine sur ces échantillons de PDX pourra générer un maximum de données qui seront primordiales à la compréhension de la biologie des tumeurs d’Ewing et des Ewing-Like. Ces résultats et analyses vont nous permettre de répondre à nos questions biologiques et par la suite, ces données pourront être utilisées par toute la communauté scientifique afin de répondre à leur propre hypothèse. - La validation des nouvelles molécules identifiées sur des modèles de PDX. En effet, les découvertes qui seront réalisées grâce à ces nouvelles technologies et grâce au criblage in vitro, vont nous permettre l'identification de nouvelles molécules. Il sera donc important de valider ces dernières in vitro sur des cellules dérivées de PDX et in vivo sur des modèles de xénogreffe/PDX avant de passer aux tests cliniques chez l’homme.
Procédures
Une partie des souris de ce projet sera opérée sous anesthésie (1 fois) pour recevoir un fragment tumoral en sous-cutanée au niveau du dos (durée de l’anesthésie : 15 min). Certains de ces animaux seront ensuite traités à raison de 3 injections par jour (injections des traitements en sous-cutanée sur animaux vigiles) ou de 2 fois par jour pour les traitements administrés par voie orale (durée de chaque geste inférieure à 10 sec). La durée du traitement variera en fonction de la molécule administrée et sera en accord avec la littérature. Des prélèvements de sang seront réalisés sur les animaux vigiles à raison d’une fois par semaine. (durée du geste inférieure à 30 sec) Une autre partie des souris sera injectée avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée aux animaux anesthésiés (1 fois – durée de l’anesthésie inférieure à 1 min). Certains de ces animaux seront ensuite traités à raison de 3 injections par jour (injections des traitements en sous-cutanée sur animaux vigiles) ou de 2 fois par jour pour les traitements administrés par voie orale (durée de chaque geste inférieure à 10 sec). La durée du traitement variera en fonction de la molécule administrée et sera en accord avec la littérature. Des prélèvements de sang seront réalisés sur les animaux vigiles à raison d’une fois par semaine (durée du geste inférieure à 30 sec)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues au cours de la greffe de fragments tumoraux seront celles liées à l’incision de la peau sur des animaux anesthésiés (gène d’intensité faible et de courte durée). Suite à ces greffes, les souris développeront des tumeurs en sous cutanée au niveau du dos qui ne devraient pas induire de gêne particulière. Les nuisances attendues lors des injections de cellules tumorales seront celles à l’injection de produits non toxiques et non douloureux (gène d’intensité faible, de courte durée). Suite à ces injections, les souris développeront des tumeurs en sous cutanée au niveau du flanc qui ne devraient pas induire de gêne particulière. Les prélèvements de sang au niveau de la joue entraineront une douleur de courte durée liée à la piqûre elle-même. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection de produits non douloureux et non toxiques dans l’abdomen des souris.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
L'utilisation de modèles pré-cliniques pertinents de la maladie est nécessaire, pour étudier les mécanismes qui sont impliqués dans la transformation tumorale et de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques. En particulier, l'utilisation de la souris qui est un organisme vivant, mammifère intégré et autonome, présente de nombreuses similitudes avec l’homme. L’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques ne peut se limiter à des expériences in vitro. En effet, nous réalisons d’ores et déjà pour nos différentes études des expériences in vitro pour tester par exemple des molécules sur des lignées cellulaires. Aussi, nous réalisons en collaboration, des expériences ex-vivo en microfluidique en utilisant des cellules dérivées de PDX. La microfluidique permet de miniaturiser l’expérience afin de tester un grand nombre de molécules avec peu de cellules ce qui permet de réduire le nombre de souris à utiliser pour ces tests. Nous effectuons également des expériences sur des tumeurs de patients pour caractériser l’expression des gènes. Cependant, la rareté des échantillons humains et la faible quantité obtenue ne nous permettent pas de réaliser des expériences complémentaires sur ces échantillons. D’où l’importance d’utiliser ces - modèles murins, reproduisant au mieux la complexité de l’écosystème tumoral, incluant cellules tumorales et cellules du microenvironnement, avant d’envisager des tests chez l’Homme dans le cadre d’essais cliniques.
Réduction
Toutes les précautions seront prises pour réduire le nombre d’animaux utilisés, tout en assurant une valeur significative des résultats obtenus. Les tests préliminaires in vitro permettent de limiter le nombre de molécules à tester sur les souris. Le nombre minimum d’animaux qu’il faut utiliser pour répondre aux questions posées a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats.
Raffinement
Les souris recevront anesthésique et analgésique au moment de la greffe. En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de la cancérologie, lors des greffes ainsi que des traitements, les animaux auront une surveillance accrue afin d'assurer leur bien-être. Une observation et une notation de leur état général seront évaluées de façon objective en utilisant une grille de score. Les expérimentations sont arrêtées dès l'atteinte d'un point-limite.
Choix des espèces
La souris est un modèle pertinent pour les expériences menées en oncologie. En effet, les souches murines sont parfaitement définies (modèles génétiquement modifiés, souches immunodéprimées permettant le développement de tumeur d'origine humaine) et présentent une parenté biologique avec l’Homme (génome murin/humain, physiologie). Ceci est vrai pour la tumeur que nous étudions, à savoir le sarcome d’Ewing. Nous utilisons des modèles PDXs reproduisant la diversité des tumeurs de patients. Dans le contexte préclinique du cancer, les PDXs reconstituent l’écosystème tumoral avec ses différentes composantes, incluant cellules tumorales et autres cellules présentes de la tumeur tel qu’il existe chez les patients. Nous travaillons sur des cancers qui atteignent des individus entre l'enfance, l'adolescence et les jeunes adultes. De ce fait, nous serons amenés à utiliser des animaux âgés de 5 semaines (réception de souris âgées de 4 semaines, utilisation après une semaine d’acclimatation) à 8 semaines afin de pouvoir mimer le stade de développement de ces tumeurs pédiatriques.
Injection de vésicules liposomales dans le traitement des lymphomes et des leucémies sur des modèles murins
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
322 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de lymphome ou de leucémie puis des injections de vésicules liposomales, pour tester un candidat traitement contre ces cancers du sang. Le porteur indique que les animaux peuvent présenter fatigue, pâleur, difficultés à s'alimenter et signes d'aplasie de la moelle. Sur le remplacement, il affirme avoir déjà validé les composés in vitro et conclut qu'à ce stade préclinique le recours aux méthodes sans animaux "n'est plus possible".
Objectifs
Les Lymphomes et les leucémies sont des cancers des cellules du tissu hématopoïétique caractérisé par un blocage de maturation et une prolifération excessive des cellules cancéreuses. Près de la moitié des cancers du sang sont des lymphomes. Ce sont des cancers du système lymphatique, avec environ 80 % de lymphomes non hodgkinien (LNH) et 20% de lymphomes hodgkiniens (LH). Les lymphomes se caractérisent par la prolifération excessive des lymphocytes (B, le plus souvent, ou T) au niveau des ganglions, du foie, de la rate et plus rarement d'autres organes. Ils provoquent une augmentation de leur taille. La Leucémie Aiguë Lymphoblastique (LAL) concerne les cellules de la lignée issue du progéniteur lymphoïde. Elle représente environ 1,5 nouveau cas pour 100.000 habitants par an, soit environ 1000 nouveaux cas par an en France. Elle se déclare en majorité chez l’enfant de 2 à 5 ans, 75% des malades ont moins de 18 ans, et représente 30% des cancers de l’enfant. La LAL est une maladie hétérogène qui touche les précurseurs des lymphocytes T ou B dans respectivement 25% et 75% des cas. Malgré les améliorations des traitements actuels chez l’homme, les taux de rechute restent élevés. Ainsi, pour réduire l’intensité de la chimiothérapie et traiter avec succès les patients en rechute, il est encore nécessaire de développer de nouvelles thérapies. Nous avons identifié de nouveaux candidats thérapeutiques (immunoliposomes et liposomes biologiques) susceptibles d’être utilisés dans le traitement de ces pathologies. Nous les avons validés dans un premier temps par des méthodes alternatives, à l’aide d’outils in vitro. Nous souhaitons maintenant étudier leurs efficacités dans cette étude préclinique in vivo. Pour cela, nous allons utiliser des modèles murins incluant des xénogreffes de cellules humaines (lignées cellulaires humaines déjà établies) dans des souris immunodéficientes, ou des greffes de cellules leucémiques humaines et lymphomateuses murines (lignées cellulaires murines déjà établies) dans des souris. Lors de cette étude préclinique, les souris seront traitées avec les immunoliposomes afin d’étudier leurs effets sur l’activation de l’immunité antitumorale et le ralentissement de la croissance tumorale.
Bénéfices attendus
En effectuant des expérimentations in vitro sur nos modèles de leucémie et de lymphomes, nous avons identifié de nouveaux composés (Immunoliposomes artificiels) qui bloquent la prolifération des cellules cancéreuses. Après avoir validé in vitro leurs actions, nous souhaitons maintenant tester leurs efficacités sur nos modèles murins in vivo lors d’études précliniques. Le bénéfice attendu du projet concerne la découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques moins intenses et susceptibles d’être utilisées dans le traitement des leucémies et des lymphomes et leurs rechutes.
Procédures
Pour les lymphomes, les animaux seront soumis à des implantations de cellules lymphomateuses par des injections sous cutanées (s.c.) sur leur flanc sous anesthésie générale. Une seule injection est prévue par souris, (durée de 30 secondes). Après la greffe, des injections par voie intra-veineuses (i.v.) d’immunoliposomes (2 injections par souris sont prévues, à J6 et J9, durée par injection de 5 secondes sur souris vigile). Un prélèvement de sang à partir de la veine de la queue (un seul prélèvement par souris, 1 à 2 gouttes soit au maximum durée de 1 minute) sera réalisé Pour les leucémies, les animaux seront soumis à des transplantations de cellules leucémiques par des injections intraveineuses (i.v.) (une seule injection d’une suspension tumorale est prévue par souris, durée totale de 5 secondes sur souris vigile). Après la transplantation, des injections par voie intraveineuses (i.v.) d’immunoliposomes (3 injections par souris sont prévues, à J15, J20, J25 , durée par injection de 5 secondes sur souris vigile). Un prélèvement de sang à partir de la veine de la queue (un seul prélèvement par souris, 1 à 2 gouttes, durée de 1 minute) sera réalisé à J35 jours après la transplantation.
Impact sur les animaux
. Dans moins de 1% des cas, une nécrose de la tumeur peut être observée. les souris peuvent présenter un état de fatigue et une couleur pâle de la peau au niveau des oreilles et aux extrémités des pattes avants et arrières. , elles pourront avoir des difficultés pour s’alimenter , montrer des signes d’aplasie médullaire, Les injections peuvent provoquer un stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort après la procédure.
Remplacement
Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler sur des cellules ou des tissus (in vitro). Le recours aux modèles in vitro doit être l’objectif du chercheur si son expérimentation le permet. Les immunoliposomes et les liposomes biologiques que nous allons tester dans ce projet préclinique ont d’ores et déjà été testés in vitro par des méthodes alternatives, sur des lignées cellulaires. Ceci nous permet d’être sûr que les composés qui vont être étudiés in vivo sont fonctionnels sur les cellules cancéreuses. Il nous faut maintenant valider sur des études précliniques in vivo l’efficacité de ces molécules et le remplacement par des méthodes alternatives n’est plus possible à ce stade du projet de recherche.
Réduction
Dans ce projet, nous allons diminuer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche. S’il est essentiel d’utiliser le plus petit nombre d’animaux possible, il faut néanmoins éviter que cet effort de réduction nuise à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a alors été intégrée à la construction de ce projet. Pour les tests, nous utiliserons des groupes de de 7 souris afin d’effectuer des tests du Logrank, pour les tests sur la viabilité cellulaire, nous utiliserons des groupes de 5 souris afin de réaliser des tests de Student (t test ou ANOVA).
Raffinement
Afin de réduire, supprimer ou soulager la douleur ou la détresse des animaux, et ainsi améliorer leur bien-être, en amont des expériences, nous allons planifier les protocoles nous allons aussi planifier et établir les points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure. Afin de limiter le stress des animaux, ils sont placés par groupe de 5 à 10 dans des cages agrémentées d’éléments en carton ou en plastique leur permettant de se regrouper dans un nid. La litière des cages est changée une fois par semaine et les animaliers veillent quotidiennement à ce que les animaux ne manquent ni d’eau, ni de nourriture. Afin qu’une prise en charge des animaux puisse se faire le plus rapidement possible, nous communiquerons les points limites au personnel de l’animalerie. Après le prélèvement de sang et les injections, nous donnons des soins adéquats, la queue de la souris en légèrement pincée pendant 30 secondes pour éviter tout saignement. Les souris pour lesquelles nous avons prélevé le sang ou injecté sont placées dans une nouvelle cage et dans une litière propre. Une surveillance des animaux sera également réalisée par les expérimentateurs tout le long de la procédure (au minimum 2 fois par semaine puis tous les jours à l’approche du J35 ). Nous avons établi les points limites de nos procédures expérimentales. Les procédures d’euthanasie appropriées seront appliquées des lors où un des points limites est observé.
Choix des espèces
Pour qu’un nouveau traitement puisse être commercialisé, il est nécessaire de mener des études précliniques et cliniques, afin de prouver son efficacité, d'optimiser les dosages mais aussi d'identifier ses effets indésirables possibles. Les études précliniques nécessitent d’avoir recours à des animaux. Nous disposons d’échantillons de cellules lymphomateuses qui sont des lignées cellulaires murines établies et commercialisées et de cellules leucémiques provenant de patients que l’on peut transplanter à des souris immunodéficientes sans crainte de rejet de greffe. L’hématopoïèse et la leucémogénèse des souris (A1, mus musculus) est l’une de celle qui se rapproche le plus de l’homme. L’infiltration des cellules leucémiques dans la moelle osseuse ainsi que dans la rate reproduit la physiopathologie de la maladie. Nous utilisons des souris, car nous possédons des modèles de xénogreffes reproduisant de façon assez fidèle le développement des leucémies humaines. C’est pourquoi l’étude de l’immunité anti tumorale des souris est en effet celle qui se rapproche le plus de l’homme. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules lymphomateuses sur le flanc des animaux et des cellules hématopoïétiques saines et leucémiques.
Caractérisation des mécanismes participant à la transformation des cellules hématopoïétiques et liés à l’anomalie moléculaire IDH2 R140Q
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
229 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire une anomalie liée aux leucémies aiguës myéloïdes, elles développent avec l'âge des maladies du sang et subissent des injections et jusqu'à dix prélèvements sanguins, avant d'être euthanasiées pour analyse des tissus. Le porteur indique que ces souris peuvent former, rarement, des tumeurs solides de gravité modérée. Sur le remplacement, il affirme que le recours aux animaux est "incontournable" pour saisir les conséquences de ces anomalies au sein d'un "organisme vivant".
Objectifs
Ce projet a pour but d’étudier l’un des mécanismes à l’origine de l’apparition d’hémopathies malignes chez l’homme. Les hémopathies malignes sont des affections de la moelle osseuse, tissu qui est responsable de la fabrication de l’ensemble des cellules du sang (globules rouges, globules blancs et plaquettes). Les hémopathies malignes regroupent un ensemble hétérogène de cancers des cellules sanguines ; on distingue les leucémies, les syndromes myélodysplasiques, les syndromes myéloprolifératifs et les lymphomes. Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) représentent la majorité des leucémies aiguës de l’adulte. Comme toutes les hémopathies, les LAM sont la conséquence de nombreuses anomalies génétiques acquises au cours du temps.
Bénéfices attendus
L'étude de modèles animaux reproduisant les anomalies moléculaires d’intérêt et développant à terme des pathologies proches de la maladie humaine pourrait permettre potentiellement de comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la prédisposition au cancer chez les individus présentant des hématopoïèses clonales à potentiel indéterminé (dont les anomalies IDH2). Ceci pourrait permettre également de tester des nouveaux traitements pertinents.
Procédures
Les animaux pourront avoir des injections uniques sous anesthésie locale (durée 1 minute). Des prélèvements de sang sous anesthésie locale seront faits (durée 3 minutes) chez certains animaux, au maximum une fois par semaine quand les animaux développent une hémopathie. Le nombre de ces prélèvements pourra être de 10 au maximum par animal.
Impact sur les animaux
Les injections et les prélèvements de sang pourront impliquer des contraintes et un stress légers et temporaires. Les animaux pourront développer avec l'âge des syndromes hémopathiques avec (rarement) formation de tumeurs solides de gravité modérée.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour analyses sur tissus et organes post-mortem.
Remplacement
Les conséquences fonctionnelles de ces évènements « fondateurs » du cancer ne peuvent être pleinement appréhendées qu’au sein d’un organisme vivant ; en effet ces anomalies génétiques fondatrices influent sur l’expression de nombreux gènes qui eux-mêmes conditionnent le devenir des cellules en réponse aux multiples signaux extra-cellulaires présents chez un individu et au sein d’un tissu (homones, facteurs de croissance etc…). L’utilisation d’animaux est incontournable pour évaluer l’importance des processus biologiques affectés par ces anomalies fondatrices. Pour ces raisons, nous établissons des lignées de souris génétiquement modifiées reproduisant les anomalies moléculaires d’intérêt et développant à terme des pathologies proches de la maladie humaine.
Réduction
Dans toutes les procédures, nous chercherons à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.Les nombres d'animaux nécessaires ont été déterminés par calcul de puissance. Pour les analyses subséquentes, nous utiliserons un test statistique non paramétrique Mann-Whitney-Wilcoxon. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, les différentes procédures seront mises en oeuvre séquentiellement, en fonction des résultats obtenus. Les nombres indiqués dans ce projet sont des nombres maximaux.
Raffinement
Tout signe de souffrance ou de douleur chez l’animal entrainera la mise en place d’un soin particulier, antalgiques et morphiniques,. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les souris seront maintenues à raison de 5 souris par cage dans un environnement enrichi (nid, maison, tunnel). - Toutes les injections seront réalisées sous anesthésie locale ou générale. - Les prélèvements sanguins seront tous réalisés sous anesthésie générale . Dans la mesure du possible, les souris seront déplacées de leur cage vers l’appareil à anesthésie en utilisant des tunnels pour éviter de les prendre par la queue. - Les souris auront un suivi clinique quotidien.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’animal vertébré le plus utilisé dans la recherche translationnelle sur les cancers et les tests de toxicité, aussi bien qu'en recherche fondamentale. Cela se traduit par un accès à une quantité importante de publications scientifiques et techniques détaillées essentielles à nos études. C'est donc le modèle animal le plus pertinent pour ces études d'hémato-oncologie. Animaux adultes, ces pathologies se développant progressivement avec l'âge chez l'adulte.
GastroNano-2 : Traitement des métastases péritonéales d’origine gastrique (VX2) par chimiothérapie pédiculée et pressurisée par aérosol sur modèle de lapins
- Recherche appliquée
- Cancers
58 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. On leur greffe des tumeurs dans le péritoine par chirurgie, puis ils reçoivent trois séries de chimiothérapie pressurisée par aérosol sous anesthésie, avant d'être tués pour l'examen des organes. Le porteur décrit une douleur modérée possible, une anorexie, une perte de poids et d'éventuels troubles respiratoires si des métastases pulmonaires apparaissent. Il présente ce test comme "indispensable" avant tout essai chez l'humain et affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas la réponse d'un "organisme entier".
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’implication de la réponse aux traitements par nanomédicaments de platine/doxorubicine administrés via PIPAC (Chimiothérapie intrapéritonéale pressurisée par aérosol) dans un modèle animal immunocompétent. Cette approche validera l’utilisation de l’approche chimiothérapeutique pour traiter les métastases péritonéales d'origine gastrique. L’évolution de la tumeur primaire et des métastases péritonéales (PM) sera étudiée dans un modèle animal lapin. Des lapins présentant des tumeurs (carcinome à cellules squameuses de lapin transplantables) implantées à différents sites abdominaux (péritoine pariétal +/- viscéral +- viscères) vont être traités par chimiothérapie pressurisée par voie coelioscopique (groupe test) versus contrôle (injection de sérum physiologique).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de démontrer l’efficacité d’un traitement anticancéreux mini-invasif dans un essai comparatif des différents drogues/formulations chimio-thérapeutiques. Il est indispensable avant de réaliser les tests d'efficacité de traitements chimiothérapeutiques sur des individus qui ne sont pas pris en charge par la thérapie curative de nos jours. Au-delà de la valorisation scientifique, les applications en santé humaine seront facilement transposables en raison de l'absence d'études dans ce domaine.
Procédures
Procédure 1 : les animaux sont soumis à une unique intervention (injection percutanée du muscle) de 5 min environ. Procédure 2 : les animaux sont soumis une unique intervention chirurgicale pour l’injection péritonéale des cellules tumorales de 30 min environ, ainsi qu’un contrôle de la tumeur par imagerie sur animal vigile (échographie et ou scanner), puis les animaux ont 3 séries de traitement par laparoscopie sous anesthésie générale (procédure d’une heure).
Impact sur les animaux
Il est possible que la maladie engendrée (MP) cause une douleur modérée par la suite aux animaux. L’expérience ne se prolongera pas au-delà de 5 semaines après la greffe des tumeurs ce qui limite l'étendue de la maladie et l'effondrement des constantes de l'animal non traité (fonction digestive par exemple). Une attention particulière est portée sur le comportement alimentaire : anorexie, perte de poids supérieure à 20%, sur l'altération de l’apparence physique et celle du comportement (repli dans un coin, prostration, …). Une prise de poids est néanmoins possible en raison de la croissance des MP et de la possible accumulation du liquide d'ascite dans la cavité péritonéale, en particulier les dernières semaines post greffe. Le fonctionnement du transit intestinal peut aussi être perturbé et l'aspect des selles sera surveillé. Des troubles respiratoires peuvent apparaitre si des métastases pulmonaires se développent au cours de l’expérimentation.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélever les organes traités (tumeur, foie, muscle) et pour évaluer par examen nécropsique les éventuelles lésions sur les organes à distance. Les paramètres histologiques évalués sur les prélèvements nécropsiques concernent les réactions tissulaires associées au traitement (nécrose tumorale ou du tissu saine, œdème, fibrose, inflammation…).
Remplacement
Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser la complexité de la réponse histologique d’un organisme entier face à l’administration de thérapeutiques, et encore moins en prenant en compte l'environnement tumoral (une métastase 3D ne répondra pas aux traitements chimiothérapeutiques de la même façon qu'une culture 2D) et la coopération avec le système immunitaire. Ils sont aussi insuffisants pour envisager des essais cliniques chez l’Homme. Le modèle lapin de carcinose péritonéale présenté permet de mimer le phénomène pathologique et la procédure de traitement observé chez l’Homme.
Réduction
Une implantation de 2 tumeurs par animal donneur sera effectuée pour réduire le nombre total de donneurs. Des études de faisabilité ont été effectuées afin de diminuer le risque d’échec et limiter le nombre total d’animaux à utiliser. Ainsi nous estimons que 5 lapins par groupe permettront d’avoir des résultats qui permettent d’apporter des conclusions. Néanmoins, si les résultats ne sont pas concluants du fait du nombre faible de lapins par groupe, une nouvelle expérimentation pourra être réalisée (permettant de doubler le nombre d’animaux par groupe).
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions d’hébergement (température et hygrométrie de l’environnement, présence systématique d’enrichissement, vidange et nettoyage régulier du bac de déjection, nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. Un protocole de suivi des animaux et de prise en charge de la douleur par un système de scoring et des traitements analgésiques systématiques et symptomatiques est mis en place. Des points-limites avec évaluation des paramètres de suivi sont utilisés afin de réduire au maximum la douleur animale. Une attention particulière sera apportée au bac recueillant les crottes et l’urine pour surveiller indirectement l’état l'hydratation et les troubles urinaires et les éventuels troubles du transit. De plus, l’ensemble des procédures sera réalisé de manière à limiter le stress et la souffrance des animaux (anesthésie, analgésique per opératoire). Lors de précédentes études, les points limites n’ont pas été atteints et aucun signe clinique d’une occlusion intestinale ou pylorique n’a été observé. Les animaux ont gardé un appétit et un transit intestinal normaux, aucun signe de douleur n’a été signalé. Les lésions péritonéales étaient des tumeurs en évolution localisées à l’endroit de l’implantation, sans envahissement métastatique incontrôlé du péritoine ou des organes de la cavité abdominales. D’une façon générale et moins sévère, l’appétit des animaux peut être diminué pendant les 2-3 premiers jours suivant les procédures chirurgicales.
Choix des espèces
L’utilisation de cellules tumorales chez le lapin comme modèle de tumeur a été développée dans les années 50. Le modèle présente l’avantage d’être reproductible, facilement implantable, à croissance rapide et transplantable dans de nombreux organes. De plus, contrairement aux rongeurs, la taille du lapin permet l’utilisation des mêmes appareillages que chez l’homme. Il n’existe pas de modèle de tumeur reproductible chez le gros animal (cochon, mouton, chèvre). La taille et l’anatomie du lapin permettent d’utiliser le même matériel que dans la plupart des procédures cliniques de type PIPAC. Le modèle de tumeur chez le lapin est aujourd’hui largement utilisé pour l’évaluation des thérapies chirurgicales mini-invasives et de radiologie interventionnelle.
Etude Préclinique de la Réponse Immunitaire radio-induite par radiothérapie externe combinée à une thérapie ciblée utilisant un nouveau vecteur de 177Lu ciblant
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 470 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur colorectale, une irradiation puis l'injection d'un produit radioactif au lutétium-177, avant le prélèvement de leurs organes. Le porteur n'attend qu'une "perte de poids légère" et décrit peu d'effets, tout en fixant la gravité à modérée. Il justifie le choix de la souris par sa "petite taille", sa "grande fécondité" et son "coût de production peu élevé", et affirme que l'in vitro ne simule pas la complexité de l'organisme.
Objectifs
Nous proposons dans cette étude de développer, dans une première étape, un nouveau vecteur de TRT (radiomarqué avec le lutétium-177 - 177Lu) ciblant des protéines cibles radioinduites par une radiothérapie (RT) externe de 8 Gy. La RT va ainsi réchauffer la tumeur et induire l’augmentation des antigènes cibles mais aussi l’infiltration de la tumeur par des cellules immunitaires. Dans la seconde étape, nous évaluerons cette réponse immunitaire intra-tumorale et systémique induite par la combinaison de RT et TRT pour deux modèles syngéniques de cancer colorectal de souris
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de développer un nouveau radiopharmaceutique (candidat-médicament) de TRT marqué au 177Lu qui pourra être administré en combinaison avec une fraction de RT externe +/- une immunothérapie
Procédures
- Injection sous cutanée de la tumeur (une seule fois). Le développement de la tumeur prends 10 jours à partir de la date d'injection. - Ensuite le radiopharmaceutique est injecté par voie intra-veineuse (une seule injection sera faite sur les souris, durée d'injection =1h à 2h dépendament du nombre de souris à injecter) - Prélèvement d’organes en fin de manip ou à des temps d’étude bien définis (durée = environs 3 h).
Impact sur les animaux
Une perte de poids légère pourra être observée chez les souris traitées avec la radioactivité durant les trois premiers jours qui suivent l’injection. Aucun autre effet secondaire ou nuisance n’est attendu.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure, selon le schéma décisionnel suivant : - Les animaux dont la greffe n’aura pas prise - Euthanasiés à des temps différents selon le planning de l’étude - Euthanasiés si points limites atteints
Remplacement
Etant donné que nous allons évaluer l’effet des modalités d’administration de la RT sur la réponse immunitaire, il nous est nécessaire de réaliser notre étude sur des modèles animaux. Le REMPLACEMENT des animaux est donc impossible pour cette étude. Toutefois l’étude préalable des molécules d’intérêts sur culture cellulaire permet de s’affranchir de l’utilisation d’animaux non justifiée (REMPLACEMENT)
Réduction
En comparaison avec une étude de biodistribution « classique » qui nécessite l’euthanasie des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie par SPECT (Single photon emission computed tomography), nous permet de suivre la biodistribution/pharmacocinétique de la molécule sur une longue période (7 jours) chez le même animal et donc de REDUIRE le nombre d’animaux d’autant. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant sur un nombre d’animaux relativement réduit de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Ainsi il faut prévoir seulement 20% d’animaux supplémentaires au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules cancéreuses syngéniques de souris permet d’étudier la réponse des cellules immunitaires à la présence de cellules cancéreuses d’un même fond génétique. Afin de garantir la répétabilité des résultats il est nécessaire de réaliser les expérimentations en triplicat.
Raffinement
Les souris seront maintenues dans des cages de 10 individus en présence d’enrichissement. Les irradiations seront réalisées sous anesthésie gazeuse et aucune toxicité n’est attendue aux doses utilisées. Les injections de chimiothérapies (CT) et d’immunothérapie seront réalisées en vigile en IP ou en per os. Les traitements par CT et immunothérapie ont déjà été réalisés dans ces conditions sans entrainer de toxicités particulières. Cependant si des signes de douleur sont observés (animal prostré, perte d’orientation, perte de poids), les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse. Toutes les manipulations susceptibles de générer de l’inconfort ou de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin d’éviter toute souffrance des animaux.
Choix des espèces
La petite taille des souris, leur grande fécondité, leur coût de production et d’entretien relativement peu élevé en font un animal de choix pour les laboratoires.[1] De plus, le modèle murin est parfaitement approprié car les expérimentations in vitro ne permettent pas de simuler la complexité d’un organisme, notamment dans les études impliquant l’activation du système immunitaire. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant sur un nombre d’animaux relativement réduit de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Ainsi il faut prévoir seulement 20% d’animaux supplémentaires au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules cancéreuses syngéniques de souris permet d’étudier la réponse des cellules immunitaires à la présence de cellules cancéreuses d’un même fond génétique. Les souris utilisées seront de 8 semaines minimum, âge adulte de manière à avoir un système immunitaire mature et un poids corporel plutôt stable > 20 g, ainsi qu’une bonne tolérance aux anesthésies, d’après les données de la littérature. [1]- Schuc et al., “Trials, tribulations, and trends in tumor modeling in mice" Toxicol Pathol (2004)
Développement d’un vaccin thérapeutique dans le mélanome à l’aide de longs peptides synthétiques artificiels (aSLP).
- Recherche appliquée
- Cancers
186 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent jusqu'à six injections sous-cutanées et une greffe de cellules tumorales qui forme une tumeur sur le flanc, puis sont suivies trois fois par semaine pendant près de trois mois avant d'être tuées par dislocation cervicale. Le projet teste un vaccin fait d'un peptide couplant un antigène tétanique et un antigène de mélanome, avec l'espoir de freiner la croissance de la tumeur. Le porteur indique que l'évaluation du bénéfice vaccinal passe "nécessairement" par l'animal et vise à terme un brevet et un développement clinique.
Objectifs
L'objectif du projet est d'évaluer in vivo l'efficacité d'un nouveau type de vaccin contre le cancer. Ce vaccin est constitué d'un long peptide synthétique qui comprend un antigène de la toxine tétanique contre lequel la plupart les individus ont déjà été vaccinés et un antigène spécifique de la cellule tumorale. L'avantage attendu de ce type de vaccination est de profiter de la réponse préexistante contre la toxine tétanique pour augmenter l'efficacité de l'immunisation contre l'antigène tumoral et ainsi générer une réponse des lymphocytes T qui puissent détruire la tumeur. Nos résultats préalables ont démontré l'efficacité de ces vaccins synthétiques pour stimuler les cellules immunitaires in vitro et nous devons désormais valider notre approche in vivo pour pouvoir espérer la mettre en œuvre ensuite chez l'homme. Notre modèle d'étude est un modèle de souris vaccinées contre le tétanos auxquelles nous transplanterons une tumeur exprimant un antigène de mélanome bien caractérisé et qui seront ensuite vaccinées avec notre vaccin synthétique (toxine tétanique +antigène de mélanome). Nous espérons démontrer ainsi l'efficacité de ce vaccin pour limiter la croissance tumorale chez ces souris.
Bénéfices attendus
L'objectif principal de ce projet est d’obtenir, à l’aide de modèles pré-clinique in vivo, des preuves de concept justifiant la mise en place d’immunothérapies par vaccination à l'aide de longs peptides synthétiques optimisés dans le traitement des mélanomes. En fonction des données de faisabilité et d’efficacité obtenues, ces travaux pourront permettre d'aller vers un dépôt de brevet et un développement clinique du produit.
Procédures
Les animaux sont soumis à des injections par voie sous-cutanée de peptides formulés en émulsion (composition proche d'un vaccin). Les animaux reçoivent au maximum 5 injections de peptides, une toutes les 2 semaines. L'injection en elle-même dure 3-5 secondes. Certains animaux reçoivent aussi par voie sous-cutanée une petite quantité de cellules tumorales qui vont générer une tumeur sur le flanc de l'animal. Cette injection se fait sous anesthésie générale. Le suivi de la croissance tumorale et le poids des animaux est effectué 3 fois par semaine, les souris sont donc manipulées régulièrement. La durée de l'expérience n'excède pas 87j.
Impact sur les animaux
Les nuisances suivantes sont identifiées: - douleur intrinsèque à la piqûre (toutes les injections, de peptide et de cellules tumorales sont réalisées en sous-cutané). Selon les lots, les souris subiront au maximum 6 injections (2 pre-immunisations, 1 injection de cellule tumorale, 3 vaccinations). - développement d'une tumeur de type sarcome sur le flanc.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures, les animaux sont sacrifiés par dislocation cervicale. Des études ex-vivo seront effectuées à partir de prélèvements post-mortem (sur les tumeurs et la rate).
Remplacement
Les résultats attendus dans cette étude ne peuvent pas à ce jour être remplacés par des procédures in vitro. L'évaluation du bénéfice thérapeutique de la vaccination thérapeutique passe nécessairement par l'utilisation de modèles animaux. Ce projet s'appuie sur des données préliminaires in vitro attestant l'immunogénicité du produit. Notre étude permettra d'évaluer l'efficacité du traitement proposé en conditions physiologiques (notamment en termes de migration de lymphocytes T induits par la vaccination sur le site tumoral). Ces résultats auront une importance capitale lors de la valorisation du produit et de son transfert espéré en clinique.
Réduction
Le nombre de lot d'animaux est réduit le plus possible: 2 lots pour évaluer l'immunogénicité (peptide vaccin comparé à peptide contrôle) et 2 lots pour évaluer le bénéfice thérapeutique (1 lot vacciné et 1 lot non vacciné). Le nombre total d'animaux prévoit l'évaluation de 4 peptides vaccinaux qui seront testés en séquentiel selon l'avancée du projet. Les expériences préliminaires ne seront pas répétées pour chaque vaccin testé.
Raffinement
Le recours à des expériences préliminaires réalisées sur un petit nombre de souris nous permet de valider les paramètres expérimentaux et de prendre en main le modèle expérimental. Cette précaution doit nous permettre de réduire la variabilité sur les procédures complètes (procédures 2 et 4) et doit également limiter le risque de résultats non concluants. Les souris qui vont recevoir les cellules tumorales sont rasées la veille de l'injection et l'injection se fait sous anesthésie gazeuse ce qui permet une implantation tumorale plus précise, avec une croissance plus homogène et donc une évaluation de la taille tumorale plus précise. Nous raffinons également nos procédures expérimentales par la définition de points limites adaptés à un modèle de croissance tumorale, ce qui permet un arrêt de la procédure si des souffrances sont suspectées.
Choix des espèces
Le modèle animal dont nous avons besoin ici est un modèle de souris dont le génome a été modifié pour produire des réponses immunitaires contre des antigènes humains. Nous travaillons sur des souris adultes mâles et femelles car les traitements de vaccination anti-tumorale dans le mélanome sont proposés à des hommes et des femmes adultes.
Utilisation de souris humanisées pour évaluer la survenue de tempête cytokinique consécutive à la thérapie par cellules CAR-T
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
188 souris humanisées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation, une greffe de tumeur, quatorze injections et plusieurs prélèvements sanguins, plus des séances d'imagerie sous anesthésie, pour comparer deux types de cellules CAR-T dans un cancer du sang et un cancer du pancréas. Le porteur renvoie les retombées pour les patients, une immunothérapie mieux tolérée, au conditionnel et au long terme, l'objectif immédiat restant de mesurer les effets secondaires chez la souris. Sur le remplacement, il affirme que ses résultats doivent être validés dans un "organisme vivant entier", seul système qui montrerait cette baisse des effets indésirables.
Objectifs
Les cellules CAR-T représentent une avancée majeure en immunothérapie du cancer. Cependant, si ce traitement donne des résultats remarquables dans le contexte des cancers du sang, 30% des patients traités rechutent. De plus, ce type de traitement induit très fréquemment des effets secondaires très préjudiciables à la santé du patient, notamment une tempête cytokinique et une toxicité neurologique. Ces effets secondaires découlent d’une hyperactivation de la réponse innée induite par les cellules CAR-T. L’analyse de ces processus nécessite donc l’utilisation de modèles de souris humanisées, dans lesquelles les cellules CAR-T pourront interagir avec notamment un compartiment myéloïde également humain autologue. Nous avons récemment établi un nouveau protocole permettant de générer des cellules CAR-T ayant un potentiel antitumoral fortement augmenté. Le projet proposé consiste à comparer la survenue de ces effets secondaires après l’injection de cellules CAR-T classiques ou des cellules CAR-T obtenues suivant notre protocole. Nous comparerons la survenue de ces effets secondaires dans deux modèles tumoraux : un modèle de cancer du sang et un modèle de cancer du pancréas.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre à terme d’établir les bases expérimentales permettant le repositionnement du médicament anti-diabétique en immunothérapie. En effet, initialement décrit dans la prise en charge du diabète, ce traitement pourrait être à la base d’un protocole permettant d’obtenir une nouvelle génération de cellules CAR-T . Ces cellules, en levant les verrous liés à la faible persistance et l’anergie induite par le microenvironnement tumoral mais également en minimisant la survenue d’effets secondaires très préjudiciables à la santé du patient, pourraient induire une nette amélioration de la prise en charge des patients traités par l’immunothérapie basée sur l’utilisation de cellules CAR-T.
Procédures
Suivant les conditions expérimentales, les animaux seront soumis à une irradiation légère (durée 3 minutes), 7 injections (
Impact sur les animaux
Les souris subiront un stress léger consécutif aux manipulations fréquentes (suivi de croissance tumorale, suivis par prises de sang). Les souris subiront des injections sous anesthésie locale engendrant un stress temporaire léger. Les souris subiront une irradiation légère sans effet retardé et des séances d'imagerie sous anesthésie générale ayant un impact léger (préhension, déplacement). Enfin, la croissance tumorale elle-même peut induire une gêne physique légère ou modérée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser les prélévements et les analyses sur organes nécessaires à l'étude.
Remplacement
L’objectif du projet est d’évaluer l’intérêt thérapeutique d’un nouveau protocole d’élaboration de cellules CAR-T que nous avons mis au point, notamment la minimisation de la survenue d’effets secondaires délétères pour la santé du patient. Nous avons, en amont des expériences exposées ici, réalisé un grand nombre d’expériences ex vivo montrant une diminution de l'activation de certaines cellules en présence de cellules CAR-T obtenues suivant le protocole que nous avons développé par comparaison avec des cellules CAR-T classiquement obtenues. Nous avons notamment pu établir que des monocytes cultivés en présence ces cellules CAR-T produisent moins de cytokines pro-inflammatoires et présentent un phénotype moins activé que ceux cultivés en présence de cellules CAR-T classiques. A présent, afin d'obtenir des résultats au plus proche d'un essai clinique, nos résultats doivent être validés dans un organisme vivant entier, seul système qui puisse montrer que cette moindre activation du compartiment myéloïde se traduit par une diminution des effets secondaires (perte de poids, fièvre, atteinte neuronale).
Réduction
Un suivi longitudinal de la croissance des tumeurs sera réalisé par imagerie par bioluminescence afin de réduire le nombre d'animaux utilisés (l'animal est son propre témoin pour certains paramètres, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux) . Les groupes d'études sont mis en oeuvre le plus souvent en même temps afin de réduire le nombre de groupes contrôles. Le nombre de souris utilisées dans chaque procédure a été établi sur la base de l'experiences acquise au cours de 20 années de travaux antérieurs. Au cours de ce projet, nous utiliserons le nombre de souris minimal requis pour obtenir des résultats statistiquement représentatifs.
Raffinement
Les animaux sont hébergés avec un enrichissement constitué de sizzlenests et de maisonnettes en carton. Les interventions seront faites sous anesthésie générale. Nous utiliserons l’imagerie par bioluminescence qui permet un suivi longitudinal et non invasif de la croissance tumorale, ce qui nous permettra de définir un critère d’efficacité des immunothérapies basé sur cette approche pour les études ultérieures. Ceci permettra aussi de détecter au plus tôt les tumeurs pour arrêter le plus tôt possible les procédures. Les souris seront surveillées quotidiennement (examens cliniques) pendant toute la durée de la procédure expérimentale afin de déceler et notifier rapidement tout signe de changement de comportement ou d'état de santé des animaux. Afin de minimiser les douleurs lors des injections sous cutanée et intraveineuse au niveau de la veine caudale ou faciale, les souris seront anesthesiées localement par apllication d'un spray lidocaïne. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
Le modèle de souris est humanisable ce qui permet de suivre les conséquences d'interactions complexes de nombreux partenaires cellulaires autologues au sein d'un organisme vivant. Il constitue donc le modèle le plus adéquat aux études précliniques. Pour générer les cellules d'intérêt pour l'humanisation, il est indispensable d'utiliser des souris âgées de moins de 2 jours. En effet, des travaux recents montrent que passé cet âge, la reconstitution de la lignée lcellulaire d'intérêt est fortement altérée. Pour les tests sur souris humanisées, les souris utilisées seront agées de 6 à 8 semaines en début d'expérience: âge optimal pour obtenir une reconstitutton du système immunitaire inné.
Validation préclinique de séquences d’IRM multiparamétriquesur un modèle murin de sarcome des tissus mous EU2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
22 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, vingt tuées et deux réutilisées. Elles reçoivent une greffe de cellules de sarcome humain sous la peau, puis deux IRM dont une avec injection d'un marqueur d'hypoxie, avant prélèvement des tumeurs. Le porteur décrit une gêne liée à la protubérance tumorale au flanc sans entrave à la mobilité, et justifie la mise à mort par le risque infectieux propre à ces animaux immunodéprimés. Il présente l'IRM comme non invasive, ce qui autorise la réutilisation de deux souris, et affirme que la mesure du flux sanguin est impossible sur cultures cellulaires.
Objectifs
Dans les sarcomes des tissus mous, pathologie rare, de mauvais pronostic, et touchant les humains et les animaux à tout âge, il n’existe aucun marqueur pronostic ni prédictif de réponse à la radiothérapie. Ce projet permettra de valider in vivo à la fois de nouvelles techniques IRM permettant une évaluation de la biologie tumorale et de son hétérogénéité, et de valider des méthodes de traitement d’image pour isoler des sous-populations tumorales et ainsi mesurer des marqueurs endogènes. Ces thématiques de recherche sont celles de l’équipe. Les résultats de ce projet préclinique seront directement utilisables chez l’Homme sans nécessité d’autre expérimentation animale, dans le cadre d’un protocole approuvé. De même, une translation ultérieure en soins vétérinaires chez le chat et le chien est envisagée dans le cadre d’un projet. Ce projet se déroule dans deux établissements utilisateurs, un établissement pour l’hébergement et l’autre pour l’imagerie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra par ailleurs de relier les données d’IRM avec l’observation au microscope. Il est le préalable de projets cliniques chez l’Homme et en médecine vétérinaire afin d’utiliser ces mêmes séquences IRM, dans le but de prédire la réponse aux traitements et pouvoir poser des diagnostics sans avoir besoin de biopsie.
Procédures
Les souris sont des animaux partiellement immunodéprimés pour permettre une greffe de cellules tumorales d'origine humaine sans rejet. Les conditions d'hébergement et de soins sont adaptées au statut immunodéprimé des animaux. Dans l’EU1, les souris seront xénogreffées. L'injection sous la peau du flanc de cellule tumorale de sarcome humain, geste d'une durée de 20 secondes, comportera 2 lignées tumorales disponibles, déjà utilisées et validées. Un IRM sera réalisé dans l’EU2 un examen IRM d'une durée de 1h30 n’engendre pas de douleur. La seconde IRM d'une durée de 1h30, dans l’EU2, est précédée d’une injection intrapéritonéale d'un marqueur d'hypoxie. Celle-ci sera réalisée sous anesthésie et après antalgie dans l’eau de boisson. Après la seconde IRM, les animaux seront mis à mort et les tumeurs seront prélevées dans l’EU2 pour analyse histologique.
Impact sur les animaux
Au plan du bien-être animal, les animaux ne présentent aucun déficit moteur ou social lié à cette injection sous la peau. Ils continuent donc d’être hébergés dans des conditions adaptées aux animaux immunodéprimés. La pousse tumorale peut se traduire par une protubérance au niveau du flanc. Celle-ci peut créer un inconfort et une gêne mais sans entraver la mobilité de l'animal.
Devenir
Du fait du phénotype athymique, ces souris seraient à risque infectieux local et systémique majeur après la chirurgie de retrait de greffe. Par ailleurs, une chirurgie carcinologiquement satisfaisante ne serait techniquement pas réalisable, et le risque de dissémination microscopique local et à distance rend ces souris à la fois à risque de récidive et inéligibles à des protocoles ultérieurs. La mise à mort s’avère donc nécessaire. Les animaux sont mis à mort pour pemrttre le prélèvmeent del a tumeur. compte tenu des risques liés à leur statut immunitaire et à la difficulté de l'intervention chirurgicale, l'extraction de la tumeur ne seriat pas bénéfique aux animaux.
Remplacement
Il s’agit dans un premier temps de mettre au point un protocole expérimental et de tester de nouvelles méthodes d’acquisition en IRM très haut champ magnétique, préalablement validés in vitro avant d’être appliqué à l’animal. L’autre objectif est une corrélation des données IRM avec des données biologiques. Il est nécessaire de passer par une expérimentation in vivo du fait de la mesure absolument nécessaire d’un flux sanguin (condition impossible sur cultures cellulaires) et d’une comparaison aux données microscopiques. L'examen IRM est basésur la détection de flux de liquides, dont le sang, ce qui est difficelement envisageable sur desm odèles non vivants et d'autre part, le projet s'intéresse non seulement à la tumeur mais aussi à son environnement et à sa vascularisation, lesquels sont encore à l'heure actuelle impossible à reproduire in vitro.
Réduction
L’IRM est une technique non-invasive et non-irradiante. Elle nous permet de réutiliser les animaux et donc de réduire leur nombre. Un total de seulement 22 souris sera utilisé pour obtenir suffisamment de données et pour valider la technique de mesure. Afin de pouvoir réduire au maximum le nombre d’animaux tout en permettant de tirer des conclusions statistiquement significatives, le nombre d’animaux (2 groupes de 11) nécessaire a été calculé sur les bases de tests non paramétriques et sur la base de données de prise de greffe lors de précédentes expérimentations. Par ailleurs chaque animal sera imagé 2 fois.
Raffinement
Afin que l'injection soit mieux supportée, elle sera effectuée en situation sous-cutanée, chez des souris déjà suffisamment développées, avec ajout d’antalgique dans l’hydratation, et avec un suivi rapproché. Le projet a été pensé pour obtenir des résultats à la fois fiables et dans un délai le moins étendu possible. Les deux examens IRM seront réalisés sous anesthésie générale et n’engendreront pas de stress pour l’animal. Les animaux seront récompensés sous forme alimentaire à leur réveil après l’anesthésie. Lors du transport entre les deux animaleries, 50m environ, les cages seront placées dans un chariot en prenant soin de les protéger de l'environnement extérieur qui pourrait les refroidir. Les cages seront recouvertes par une bâche. L'apparition de grosseur fera l'objet d'une surveillance régulière. Une évaluation de la souffrance de l’animal sera mise en place, avec adaptation de la prise en charge selon le score calculé, et en cas d’atteinte des points limites les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
La souris est à la fois proche de l’Homme, accessible, et peut être analysée sur l’IRM à très haut champ. La résolution spatiale de l’appareil sera suffisante pour permettre une validation précise. Puis les souris immunodéficientes avec xénogreffe de sarcome des tissus mous humain permettront une validation technique de la méthode d’imagerie, une première confrontation entre les données de tissu tumoral d’origine humaine (xénogreffe) et l’anatomopathologie, et un suivi longitudinal. Nous utiliserons des sarcomes des tissus mous dont la lignée tumorale a déjà été utilisée plusieurs fois sur modèles animaux. De plus, la souris est l’animal le plus utilisé pour le développement de modèles pathophysiologiques et les outils d’analyse immunologiques sont bien maîtrisés à la fois dans le monde et dans notre équipe. Par ailleurs les résultats obtenus pourront être confrontés aux données existantes dans la littérature.
Prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique (génotypage) des modèles animaux génétiquement modifiés.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système nerveux
18 000 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans une procédure impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit une biopsie du bout de la queue ou de l'oreille sous simple contention, geste que le porteur décrit comme une douleur légère avec un stress lié à l'immobilisation. Les souris sont gardées vivantes après le prélèvement, leur devenir dépendant ensuite du génotypage, sélection pour d'autres projets, maintien des colonies, ou mise à mort pour prélèvement de tissus ou faute d'usage. Il présente la biopsie comme la méthode la plus performante pour identifier les lignées modifiées et entretenir ces élevages.
Objectifs
Le laboratoire participe à plusieurs projets qui nécessitent le développement et l’utilisation de modèles murins génétiquement modifiés. Ce projet a pour objectif d’identifier et de caractériser génétiquement les animaux. Chaque animal, identifié par tatouage aux doigts ou par injection de nanopuces, sera caractérisé par génotypage sur une biopsie de bout de la queue ou d’oreille. Cette demande d’autorisation de projet de génotypage se justifie par la nécessité de : - sélectionner les animaux d’intérêt pour différents projets de recherche (inclus dans d’autres demandes d’autorisation de projet) menés au laboratoire ; - sélectionner les animaux d'entretien des colonies ; - sélectionner les animaux pour les prélèvements d’organes ou de tissus post mortem pour des études ex vivo (hors champ de demande d’autorisation de projet).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de la procédure de génotypage sont de permettre une sélection des animaux d’intérêt.
Procédures
Une biopsie de la queue ou un bout d’oreille (durée : quelques secondes) est réalisée sur animal vigile puis déposé dans un microtube. Dans la très grande majorité des cas, un seul prélèvement sera réalisé par animal. En cas de problème lié à l’analyse génétique de la biopsie, un deuxième prélèvement pourra être envisagé.
Impact sur les animaux
Les biopsies de queue ou d’oreille sont des gestes qui provoquent une douleur légère. L’animal est maintenu en contention pendant la biopsie ce qui représente une source de stress.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de cette unique procédure. Leur devenir diffère ensuite selon les résultats du génotypage : a/ ils sont sélectionnés pour un projet de recherche (inclus dans d'autres demandes d’autorisation de projet); b/ ils sont conservés pour l’entretien des colonies ; c/ ils sont euthanasiés pour des prélèvements de tissus post mortem ; d/ ils sont euthanasiés si leurs caractéristiques ne répondent pas aux besoins du projet et si aucune autre utilisation n’est possible.
Remplacement
Il n’existe à ce jour pas de méthodes aussi performantes que la biopsie de queue ou d’oreille pour réaliser le génotypage des souris, qui est nécessaire pour valider les études utilisant des lignées d’animaux génétiquement modifiés, et entretenir ces lignées.
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces permettant de caractériser et sélectionner les animaux génétiquement modifiés. Les personnels de l’animalerie établissent, en concertation avec le responsable de la lignée, les plans d’élevage en amont, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux générés et donc d’animaux génotypés.
Raffinement
Les biopsies sont réalisées par un personnel expérimenté. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Elles sont réalisées avec du matériel adapté permettant un geste rapide et précis. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveau-nés sont remis en présence de leur mère. Un suivi des animaux est réalisé suite à cette procédure et des points limites adaptés ont été mis en place.
Choix des espèces
Les modèles murins génétiquement modifiés sont très utilisés pour comprendre des pathologies humaines car les outils pour générer ces modèles sont bien connus et très efficaces. Le temps de génération d’une lignée est court (3 mois) et son élevage en laboratoire simple. Les biopsies sont réalisées sur des animaux âgés d’au moins 8 jours. L'essentiel des lignées sont génotypées à cet âge pour permettre d'avoir le résultat de génotypage au sevrage et de sélectionner uniquement les animaux d'intérêt à l’âge adulte.