Cancers

4 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections de cellules cancéreuses ou des implantations chirurgicales de fragments de tumeurs humaines, puis des traitements répétés par voie orale, veineuse ou intrapéritonéale, avant un prélèvement terminal de la tumeur et des organes. L'objet est d'étudier le microenvironnement des tumeurs et d'y tester de nouveaux traitements anticancéreux. Le porteur affirme qu'aucun système in vitro ou ex vivo ne reproduit la complexité de ce microenvironnement et évoque des modèles cellulaires en 3D destinés à réduire, à terme, le nombre d'animaux.

Objectifs

L’hypothèse de travail porte sur l’hétérogénéité tumorale qui corrèle avec l’agressivité́ des tumeurs, leur résistance aux traitements et leur capacité métastatique. Cette hétérogénéité est un paramètre biologique complexe qui inclue une hétérogénéité des cellules tumorales et de leur environnement et peut être impactée par les traitements utilisés. Le microenvironnement tumoral va créer un sanctuaire pour la mise des cellules cancéreuses dans un état de dormance qui deviennent résistantes aux drogues et sont alors responsables de la récurrence de la maladie plusieurs mois ou années après la rémission. Ce sanctuaire est une zone de tolérance immunitaire renforçant la survie et la croissance des cellules tumorales. Le projet portera sur le développement de nouvelles approches thérapeutiques et l’analyse de l’impact des traitements sur l’hétérogénéité tumorale et ses conséquences cliniques. Les approches thérapeutiques testées reposeront sur un ciblage des cellules tumorales (ex. chimiothérapie, inhibiteurs de kinases), un ciblage du microenvironnement tumoral (ex. ciblage des macrophages, inhibiteurs de points de contrôle du cycle cellulaire) en monothérapie ou en bithérapie. Ces approches seront testées in vivo dans des modèles murins xénogéniques (souris immunodéficients) ou syngéniques (souris immunocompétentes). Les pathologies tumorales étudiées seront des sarcomes (osseux ou tissus mous) ou de carcinomes (ex. prostate, colon, poumon). Ce projet a pour objectifs : - de caractériser sur un plan cellulaire et moléculaire le microenvironnement tumorale au cours de l’évolution naturelle de la maladie (impact sur la tumeur primaire et sur le développement métastatique), - de caractériser de manière cinétique l’évolution du microenvironnement tumoral et son impact sur la clonalité des cellules cancéreuses au cours des traitements, - d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, - de développer de nouvelles approches thérapeutiques reposant sur un ciblage du microenvironnement tumora

Bénéfices attendus

Le dialogue établi entre les cellules cancéreuses et leur environnement est considéré comme un point majeur dans la progression tumorale et dans le processus de résistance aux traitements. Cependant, quels que soient les traitements utilisés en oncologie, ceux-ci impactent la biologie des cellules tumorales et également les cellules « saines » du microenvironnement tumoral. Le projet présenté permettra de mieux comprendre les modifications du microenvironnement au décours des traitements, leur impact sur la progression tumorale et le développement de résistances aux drogues. Les bénéfices de ce projet sont multiples à court et long termes. A court terme une meilleure compréhension de l’évolution du microenvironnement permettra : - de cartographier l’impact des traitements sur les tissus, - de comprendre la contribution des éléments du microenvironnement dans le développement tumoral et la réponse aux traitements, - d’identifier et de valider de nouveaux biomarqueurs pronostiques, - d’identifier et de valider de nouvelles cibles thérapeutiques. A long terme, ce projet permettra d’analyser de manière cinétique l’évolution du microenvironnement tumoral, d’identifier de nouveaux biomarqueurs pronostiques et de nouvelles cibles thérapeutiques en cancérologie. Les résultats obtenus permettront également la mise en place d’essais cliniques chez les êtres humains et les animaux (chiens, chats, etc) atteints de cancer.

Procédures

Le projet prévoit l’induction de tumeurs chez la souris par l’injection de cellules cancéreuses (3440 animaux) ou de fragments tumoraux humains frais (1360 animaux). Fréquence : une seule injection/implantation par animal. L’induction des tumeurs par injection de cellules sera réalisée par injections de cellules en site sous cutanée et en site intramusculaire para-osseux sur animal vigile, ou en site intracardiaque sous anesthésie générale. Des implantations intra-osseux sont prévues sous anesthésie générale. L’induction des tumeurs par implantation de cellules cancéreuses en site intra-osseux, ou de fragments tumoraux en site sous cutanée ou intra-musculaire sera réalisée par une procédure chirurgicale sous anesthésie générale. Durée d’intervention : 10 minutes par souris (site sous cutanées ou intramusculaire), 20 minutes (site intra-osseux) Les traitements par injection en site intra-péritonéal, sous cutanée seront réalisés sur animal vigile. Les traitements par injection en site intra-veineux seront réalisés sur animal sous anesthésie gazeuse (durée de la manipulation: 10 minutes). Les traitements oraux seront réalisés sur animal vigile (durée de manipulation : courts moins de deux minutes/animal). La rythimicité des traitements est dépendante des agents thérapeutiques utilisés et de leur mode d’injection (Fréquences maximales des traitements par animal: intra-veineux (un par semaine), sous-cutanée (1 par jour), intra-péritoneal (1 par jour), gavage (1 par jour) ; Fréquences moyennes des traitements par animal selon l’expérience de l’équipe : intra-veineux (un par semaine), sous-cutanée (1 par jour deux fois par semaine), intra-péritoneal (1 par jour deux fois par semaine), gavage (1 par jour). Les volumes tumoraux seront suivis manuellement à l’aide d’un pied à coulisse deux fois par semaine sur animal vigile (durée de la manipulation : 2 minutes/animal). Les prélèvements de tissus (organes, os, tumeurs) seront réalisés en point final après euthanasie des animaux, et un prélèvement sanguin en site intracardiaque sera réalisé sur animal sous anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

Les procédures présentées dans ce projet peuvent générer des douleurs chez les animaux comme l’injection de cellules ou l’implantation de fragments tumoraux. Une prise en charge de la douleur spécifique à chaque geste technique sera proposée et reposera sur une administration médicamenteuse adaptée et proportionnée à l’évaluation de la douleur. Cette prescription médicamenteuse sera maintenue pendant 24 heures (procédure dite légère) ou avec une fréquence toutes les 12 heures pouvant être accrue toutes les 8 heures (procédure jusqu’à récupération complète et disparition de la douleur liée à la procédure). La suite du protocole ne doit pas générer de douleur, néanmoins, s’il est constaté́ une douleur (mobilité réduite, comportement anormal type prostration, pelage hérissé, etc), la procédure légère de prise en charge de la douleur sera réitérée.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés selon la procédure précisée en vue de prélever la tumeur, les sites métastatiques, le sang et les organes afin d’analyser les caractéristiques du microenvironnement tumoral et d’analyser l’impact des molécules thérapeutiques sur celui-ci et leur effet sur les organes des animaux.

Remplacement

Le microenvironnement tumoral est un environnement très complexe composé de divers types cellulaires et de matrice extracellulaire produit par différentes cellules, et qui se développent de manière cinétique en trois dimensions. Toutes ces composantes interagissent entre elles pour établir pour assurer la mise en place d’un environnement propice à la croissance de la tumeur, au processus métastatique et au contrôle de la réponse aux médicaments par les cellules tumorales. Par ailleurs, cette niche tumorale peut être modifiée en fonction du temps par les thérapies utilisées. Ces caractéristiques font qu'il n'existe actuellement aucun système in vitro ou ex vivo permettant de récapituler tous les évènements et les modifications du microenvironnement associées que ce soit pour les sarcomes et les carcinomes. Cependant, parallèlement aux modèles animaux proposés, des essais in vitro "basés sur les tumeurs" (lignées cellulaires, cultures primaires de cellules humaines, modèles de culture 3D) ont débuté au sein de l’équipe pour développer une plateforme de criblage de composés prometteurs et ainsi réduire le nombre d'animaux requis. Ces futurs modèles associeront des systèmes microfluidiques, de la reconstruction en 3D de coupes histologiques humaines, des approches utilisant des données archéologiques (tissu osseux) et de la modélisation informatique.

Réduction

La conception de nos protocoles expérimentaux repose sur notre expérience, les données quantitatives publiées antérieurement suite à différents traitements médicamenteux et les recommandations de notre cellule statistique. En prenant en compte tous ces éléments, le nombre d’animaux par groupe est fixé à 10. Si des différences importantes sont observées lors des premières expérimentations à venir (essai d’une nouvelle génération de molécules), une réduction du nombre d'animaux dans les expériences suivantes sera appliquée après une nouvelle estimation statistique. Toutes les expériences seront « randomisées » : les animaux sont inclus au hasard dans chaque groupe après induction des tumeurs, et groupés de manière à réduire le nombre d'animaux en utilisant, dans la mesure du possible (par exemple : un même groupe de contrôle peut être utilisé pour plusieurs molécules à tester). Des études pilotes reposant sur un nombre d’animaux réduits seront envisagés lorsque cela sera nécessaire (ex : nouvel échantillon de patient) pour définir un temps de croissance tumorale par exemple et ainsi réduire le nombre d’animaux par groupe ultérieurement. Un plan expérimental sera établi avant chaque expérimentation afin de réduire au maximum le nombre d’animaux inclus.

Raffinement

Les modèles murins qui seront utilisés dans ce projet sont déjà établis et nous disposons déjà de données dans l'utilisation de ces modèles (ex. croissance tumorale, formation de métastases, réponse à certaines chimiothérapies). Nous avons déjà identifié la chronologie de la croissance de la tumeur primaire pour les modèles reposant sur l’injection de cellules tumorales issues de lignées cellulaires commerciales, de l'initiation des métastases pulmonaires (cas des ostéosarcomes) et de la détection des cellules tumorales circulantes. Ces informations nous permettent d'initier les procédures expérimentales à un moment approprié avec une reproductibilité accrue. Une attention particulière sera donnée sur le suivi des signes de souffrance des animaux. Une surveillance étroite des animaux par des techniciens animaliers et des chercheurs expérimentés sera mise en place et, le cas échéant, une analgésie sera utilisée pour soulager la douleur. Nous continuerons à affiner les études en termes de surveillance/imagerie des tissus et de collecte de données. Dans le cadre des bonnes pratiques de laboratoire, nous rédigerons un protocole [plan d'étude individuel (PIE)] pour chaque expérience, comprenant l'énoncé du ou des objectifs, une description de l'expérience, couvrant des questions telles que les traitements expérimentaux, les détails du matériel expérimental.

Choix des espèces

Nos procédures expérimentales prévoient l’utilisation de souris immunocompétentes et immunodéprimées selon l’origine des cellules ou des tissus tumoraux implantés. Des souris immunodéficientes seront utilisées pour l'injection de lignées cellulaires humaines et pour l'injection de cellules issues de cultures primaires ou d'échantillons de patients. L’utilisation de souris immunocompétentes permettra d’étudier les populations immunitaires associées au développement tumoral suite à l’implantation de cellules d’origine murine. Différentes souches de souris seront utilisées selon l'origine des cellules. La souris est préférentiellement choisie en raison de l’origine des lignées cellulaires disponibles et par le fait que ces animaux de petites tailles nécessitent des quantités de molécules thérapeutiques réduites. Pour les modèles de d’ostéosarcomes et de sarcomes d’Ewing, des souris jeunes seront utilisées afin de mimer au mieux les tumeurs chez les patients (enfant, l’adolescent et le jeune adulte). Réception de souris âgées de 4 semaines, utilisation après une semaine d’acclimatation (âgées de 5 semaines). L’âge des souris est déterminé selon l’âge de diagnostic de la pathologie chez l’être humain. Pour les modèles de sarcomes des tissus mous, chondrosarcomes et de carcinomes, des souris âgées de 8 semaines seront utilisées. Réception de souris âgées de 7 semaines, utilisation après une semaine d’acclimatation (âgées de 8 semaines). L’âge des souris est déterminé selon l’âge de diagnostic de la pathologie chez l’être humain.

34 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une injection de pristane puis d'hybridomes qui déclenchent une tumeur et une accumulation de liquide d'ascite dans l'abdomen, décrite comme source de détresse, avant un prélèvement terminal. Le projet produit in vivo un anticorps monoclonal destiné à des kits de diagnostic industriels, le porteur affirmant que la production in vitro n'a pas été validée et concluant à une "nécessité incontournable". Le recours à 34 000 souris pour produire un anticorps par la méthode d'ascite ressort comme l'élément marquant de ce projet.

Objectifs

L’objectif du projet est de produire in vivo chez la souris un anticorps monoclonal (Mab) ultra-spécifique d’un produit terminal de la dégradation de la fibrine. Ce Mab entre dans la composition d’outils de diagnostic biomédical utilisé par la majorité des hôpitaux et des laboratoires français, européens et américains pour le diagnostic de la CIVD (Coagulation Intra Vasculaire Disséminée), des thromboses veineuses des membres inférieurs (phlébites) et de l’exclusion de diagnostic de l’embolie pulmonaire. Ces dispositifs IVD exploitant ce Mab sont pleinement validés, au sens du marquage CE des dispositifs IVD, de la U.S. FDA et des divers organismes règlementaires internationaux. Les besoins de santé publique et la nécessité absolue de ces dispositifs IVD exploitant ce Mab et en l’absence de solution alternative, imposent le maintien de la production de ce réactif.

Bénéfices attendus

L’obtention in vivo de cet anticorps monoclonal permettra le maintien de la production de kits de diagnostic essentiels à la définition d’un statut clinique. Cet anticorps entre dans la composition d’outils de diagnostic biomédical utilisé par la majorité des hôpitaux et des laboratoires français, européens et américains pour le diagnostic de la CIVD (Coagulation Intra Vasculaire Disséminée), des thromboses veineuses des membres inférieurs (phlébites) et de l’exclusion de diagnostic de l’embolie pulmonaire. Ces dispositifs de diagnostic in vitro (IVD) exploitant ce Mab sont pleinement validés, au sens du marquage CE des dispositifs IVD, de la U.S. FDA et des divers organismes règlementaires internationaux. Les besoins de santé publique avec la nécessité absolue de ces dispositifs IVD exploitant ce Mab et en l’absence de solution alternative, imposent le maintien de la production de ce réactif. Il est à noter que ces kits, ont joué un rôle clé dans la crise sanitaire liée à la maladie à coronavirus (COVID-19). Les instances scientifiques ont permis de définir un lien entre le taux du produit de dégradation de la fibrine dosé par les kits dépendant de cet anticorps et la gravité de la maladie COVID-19 (mauvais pronostic pour le patient).

Procédures

Mise en quarantaine des souris dans une zone d’hébergement dédiée conforme à la règlementation Après respect d'une semaine de quarantaine, à J1 les souris reçoivent une injection d’un agent d’amorçage. Afin de minimiser la souffrance des animaux, l’injection de cet agent est précédée 30 minutes avant par l’injection en sous-cutanée d’un antalgique. A J22, après expansion clonale, les hybridomes sont injectés en IP unique à raison de 4.106 cellules/souris. En accord avec les discussions réalisées lors des réunions du bien-être animal, du comité d’éthique et des éléments évoqués avec la DDPP, un analgésique sera également distribué aux souris après inoculation des cellules dès l’apparition des premiers signes de douleur par injection. Suivi quotidien des animaux. Les animaux présentant des signes d’inconfort sont euthanasiés et ponctionnés de manière éthique. Récupération unique et terminale d’ascite par paracentèse dès apparition. Injection IP ou SC, durée de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Chez l'animal, une douleur et une détresse peuvent résulter de l'injection intrapéritonéale (IP) de l'amorce (pristane), de l'inoculation IP des cellules tumorales, et de la croissance des cellules tumorales dans la cavité abdominale (effets primaires) sous forme de plaques péritonéales qui s'infiltrent dans la paroi abdominale ou les organes abdominaux. Plus précisément, il semble que l'injection par voie IP produit un niveau de détresse modéré; on décrit que la production d'ascite et la croissance de tumeurs causent de la souffrance chez les patients humains. De plus, les changements pathophysiologiques et pathologiques complexes peuvent provoquer une détresse chez l'animal.

Devenir

Tous les animaux sont concernés, les souris sont toutes euthanasiées en fin de protocole. L’ensemble des animaux inclus dans un cycle de production sont euthanasiés avant paracentèse.

Remplacement

L’alternative la plus logique pour la production de cet anticorps serait une production in vitro. Malheureusement, à ce jour, l’anticorps n’a pu être caractérisé techniquement et validé cliniquement que sur des lots issus de production en condition in vivo. L’ensemble des résultats concernant la capacité de certains clones à produire in vitro les mêmes anticorps selon le même cahier des charges requis pour les dispositifs IVD concernés, démontre la nécessité incontournable de poursuivre la production de ce Mab en condition in vivo (incapacité des hybridomes à tolérer un transfert en extension d’échelles notamment de rendement de production et ou de qualité fonctionnelles des anticorps obtenus). Les besoins de santé publique de ces dispositifs IVD exploitant cet anticorps, et en l’absence de solution alternative, imposent le maintien de la production de ce réactif. La société nous demandant de réaliser des productions d'anticorps in vivo, est consciente de l’aspect éthique de l’expérimentation animale et s'engage à ne recourir à la production in vivo que dans des cas de stricte nécessité. En parallèle, de ce protocole, les essais de passage en in vitro se poursuivront notamment via la mise en œuvre d’essai de tris des clones présentant les taux de sécrétion d’immunoglobulines les plus élevés. Il est également à noter que pour les nouvelles versions de cette gamme de produit, les anticorps utilisés seront fabriqués avec des anticorps produits uniquement avec un process « in-vitro » (développement en cours)

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit au maximum, il s'agit de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire. Nous pourrons nous baser sur l’expérience acquise sur les anciens protocoles réalisés sur ces clones. L’utilisation de souris anciennes reproductrices permet également de ne pas utiliser d’animaux jeunes spécifiques au projet, mais d'utiliser des souris qui étaient vouées à être euthanasiées. Les expériences de sélection des clones possédant les meilleures capacités de sécrétion, devraient permettre à minima de réduire le nombre d’animaux engagés par protocole. La dernière demande d’autorisation concernait 21000 souris par an, la nouvelle demande impliquerait 17000 individus annuellement, soit une diminution d’environ 19%. A ce jour 1 souris permet la réalisation de 1400 tests.

Raffinement

Les recommandations (issue de CNREEA et parue le 28 juin 2017) sur la production d’anticorps par liquide d’ascite chez la souris seront appliquées. L’unique paracentèse sera réalisée après euthanasie de l’animal, afin de limiter les manipulations de l’animal toujours sources de stress. Afin de minimiser la souffrance des animaux, l’injection de l’agent d’amorçage est précédée 30 minutes avant par l’injection d’un antalgique. En accord avec les discussions réalisées lors des réunions du bien-être animal, du comité d’éthique et des éléments évoqués avec la DDPP, un analgésique sera également distribué aux souris après inoculation des cellules dès l’apparition des premiers signes de douleur par injection. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 2 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion…) et signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 3 niveaux : normal, souffrance légère mise en œuvre d’antalgies à envisager, souffrance sévère arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les animaux bénéficient d'un hébergement, d’un environnement, d'une certaine liberté de mouvement, de nourriture, d'eau et de soins appropriés à leur santé et à leur bien-être. Afin de faciliter la sociabilité des souris, elles ne sont pas isolées dans une cage et des objets d'enrichissement sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont euthanasiés et prélevés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore.

Choix des espèces

Les hybridomes concernés ont été obtenus par fusion de splénocytes de souris et de myélome de souris, selon la méthode de Milstein et al (1975). Les clones obtenus n’ont jamais pu être produits autrement que chez la souris. Le Mab obtenu et validé dans les dispositifs IVD concernés, est un Mab obtenu et produit chez la souris. Les souris doivent être de même souche (syngéniques) à la fois pour l'immunisation en vue de la création du clone d'hybridome et pour la production subséquente de Mab, de sorte que les tissus utilisés soient histocompatibles. Les souris Balb/c représentent le meilleur choix puisque les cellules myélomateuses parentales employées dans le processus de fusion proviennent de cette souche. Les souris utilisées préalablement pour la reproduction présentent l’avantage pour la production de l'ascite parce que leur musculature abdominale a déjà été étirée (Falkenburg, 1998). Les animaux utilisés sont de préférence des femelles adultes Balb/C (anciennes reproductrices), car elles présentent une prédisposition physiologique favorisant une dilatation de leur paroi abdominale en diminuant le risque de compression d‘organe (respect des 3R).

350 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des cellules tumorales sont implantées dans la joue, suivies d'un protocole d'irradiation qui peut provoquer dépilations, croûtes et ulcérations locales pendant sept à dix jours. Le porteur décrit un "projet pionnier" à "fort impact sociétal" et affirme qu'il est "indispensable" de développer des modèles animaux, les mécanismes inflammatoires ne pouvant selon lui être étudiés que dans un organisme entier. Le passage en essais cliniques au bénéfice des patients reste annoncé pour la fin du projet, au conditionnel.

Objectifs

Le carcinome épidermoïde de la cavité buccale (CCSO) est un sous-ensemble important de cancers de la tête et du cou, qui sont le 6e cancer les plus répandus dans le monde. De plus, la radiothérapie est l’une des méthodes les plus efficaces et les plus utilisées pour traiter les cancers. Pour certains types de tumeurs radiorésistantes comme certaines tumeurs de tête et cou, la radiothérapie ne peut être que palliative. Pour parvenir à une dose de radiation curative, le risque de dommages graves aux tissus sains est trop élevé pour pouvoir être considéré. Dans le cadre de ce projet, nous nous focaliserons sur des techniques innovantes qui ont montré un intérêt significatif dans la préservation des tissus sains (même à des doses très élevées) ainsi qu’un effet très efficace sur le contrôle de la croissance tumorale chez des rongeurs. Nous investiguerons aussi la participation de certains mécanismes radiobiologiques. L’efficacité de la technique d’irradiation portera sur la préservation des tissus sains environnants la tumeur et sur le contrôle de la croissance des tumeurs, de la tête et du cou, irradiées. Dans ce contexte, notre objectif principal s’inscrit dans l’amélioration des traitements de radiothérapie.

Bénéfices attendus

Ce projet pionnier a un fort impact sociétal. Il explore des techniques novatrices en radiothérapie (RT), moins agressives pour les tissus sains. Le gain en matière d'épargne/récupération tissulaire contribuera à l'élimination du principal obstacle dans les traitements de cancer par RT : les doses de tolérance des tissus normaux. A la fin du projet, nous disposerons d'études radiobiologiques complètes qui nous permettront de procéder à des essais cliniques pouvant bénéficier a des patients qui actuellement reçoivent un traitement seulement palliatif ou pour lesquels les conséquences sur les tissus sains sont très impactants pour leur qualité de vie et pouvant également ouvrir une voie vers un traitement efficace des tumeurs très radiorésistantes, comme les tumeurs de tête et cou. En outre, les connaissances biologiques acquises permettront d'améliorer d'autres techniques de RT et peut-être de changer certains des paradigmes de la RT conventionnelle. La preuve de concept de ces techniques innovantes existe déjà, le projet est sur la voie qui va de la conception de l'idée aux éventuels premiers essais cliniques.

Procédures

La première procédure est une étape de go/no go visant à caractériser l’impact de la croissance tumorale de 2 lignées cellulaires au niveau de la joue de souris. Pour cela, des cellules tumorales seront implantées dans l’épithélium oral de la joue d’animaux anesthésiés (durée anesthésie : 20 minutes) et un suivi par imagerie scanner, durant laquelle les animaux seront sous anesthésie gazeuse (durée anesthésie : 20 minutes), sera effectué chaque semaine pendant 3 mois pour suivre l’évolution de la croissance tumorale. Dans la seconde procédure visant à réaliser une première évaluation in vivo de l’augmentation possible de l’index thérapeutique de notre technique d’irradiation pour le traitement de tumeur tête et cou, des cellules tumorales seront implantées dans l’épithélium oral de la joue aux animaux anesthésiés (durée anesthésie : 20 minutes). Vingt et un à vingt-huit jours après l’implantation des cellules, les animaux seront irradiés sous anesthésie générale (durée anesthésie : 30 minutes). Trois prélèvements sanguins seront réalisés. Selon les résultats de la procédure 1, les animaux seront également imagés par scanner régulièrement pour suivre la croissance tumorale. Enfin, la troisième procédure permettra l’étude et la caractérisation de l’infiltration immunitaire induite par notre technique d’irradiation. Pour cela, des cellules tumorales seront implantées dans l’épithélium oral de la joue aux animaux anesthésiés (durée anesthésie : 20 minutes). Vingt et un à vingt-huit jours après l’implantation des cellules, les animaux seront irradiés sous anesthésie générale (durée anesthésie : 30 minutes). Deux prélèvements sanguins seront réalisés et les animaux seront mis à mort 7 jours après irradiation pour réaliser les analyses post-mortem de l’infiltrat immunitaire.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales conduira au développement d’une tumeur au niveau de la joue des animaux qui sera contrôlée régulièrement. Suite à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids transitoire pouvant durer quelques jours . Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croutes et même des ulcérationsau niveau de la joue, à l’endroit de l’irradiation pendant 7 à 10 jours.

Devenir

tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Nos critères d’évaluation pour l’efficacité de la technique vont porter sur la préservation des tissus sains environnants la tumeur et sur le contrôle de la croissance des tumeurs irradiées. De même, les mécanismes inflammatoires et vasculaires induits par l’irradiation ne pourront être étudiés que dans la globalité d’un organisme vivant intégré. Aussi, le recours à des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans ce projet et il nous est indispensable de développer des modèles animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet a été calculé à l'aide d'outils statistiques pour que les résultats puissent être significatifs.

Raffinement

Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Une étape de socialisation des souris sera mise en place avant toute expérimentation : les souris seront manipulées quotidiennement pour les habituer au manipulateur et à la préhension et permettre ainsi une réalisation plus aisée et moins stressante des procédures expérimentales par la suite. Dans un souci de raffinement, tout d’abord, nous veillerons quotidiennement au bien-être des animaux. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux pour permettre la détection de signes précoces de détresse ou de mal-être. L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie générale associée à des analgésiques adaptés aux interventions chirurgicales mises en place.

Choix des espèces

Les souris sont particulièrement utilisées en cancérologie et dans les études de radiothérapie car il s’agit d’espèces génétiquement caractérisées et pour lesquelles les références bibliographiques sont très nombreuses dans la littérature ayant trait au domaine de la radiothérapie. Les procédures seront réalisées sur des animaux adultes de 8-10 semaines, âge compatible avec un développement suffisant et la possibilité de garder les animaux assez longtemps pour permettre une étude des effets à long terme de l’irradiation.

198 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, la gravité la plus élevée du lot. Une tumeur cérébrale de type gliome leur est implantée, puis leur cerveau est irradié à des doses de 15 à 40 Gy avant l'injection d'un anticorps d'immunothérapie. Le porteur décrit une détresse, une perte de poids et des ulcérations du cuir chevelu au site d'irradiation, et prévoit la mise à mort dès l'atteinte d'un point limite. Il qualifie le projet de "pionnier" à "fort impact sociétal" et affirme que la combinaison radiothérapie-immunothérapie est "indispensable" à évaluer sur l'animal entier.

Objectifs

La radiothérapie est l’une des méthodes les plus efficaces et les plus utilisées pour traiter les cancers. Au moins 50% des patients atteints d’un cancer sont traités par radiothérapie durant leur maladie. Le principal défi de la radiothérapie est de parvenir à déposer une dose curative dans la tumeur tout en s’assurant que les tissus sains environnants soient préservés dans leur intégrité. Pour certains types de tumeurs radiorésistantes comme les gliomes (tumeur cérébrale), la radiothérapie ne peut être que palliative. Pour parvenir à une dose de radiation curative, le risque de dommages graves aux tissus sains est trop élevé pour pouvoir être considéré. Notre objectif principal s’inscrit dans l’amélioration des traitements de radiothérapie. Pour ce faire, nous explorons de nouvelles approches et proposons de développer des techniques innovantes utilisant de nouvelles modalités de traitement afin d’améliorer encore l’indice thérapeutique. Ces techniques de radiothérapie innovantes qui utilisent du fractionnement spatial de la dose seront alors combinées avec un des traitements les plus prometteurs que sont les inhibiteurs de point de contrôle immunitaire. Ainsi, l’immuno-oncologie a pour objectif d’exploiter et de renforcer les capacités de notre propre système immunitaire à reconnaître et détruire les cellules cancéreuses. Tout d'abord, il faut savoir que les lymphocytes T aident l'organisme à lutter contre les infections et d'autres maladies, y compris le cancer. Toutefois, les cellules tumorales peuvent échapper à cette attaque en exprimant à leur surface une protéine appelée PD-L1 qui inactive les lymphocytes T avant qu’ils n’attaquent. La PD-L1 agit en se liant à des récepteurs appelés PD-1 situés sur les lymphocytes T. La liaison de PD-L1 avec PD-1 conduit à l’inactivation des lymphocytes T, un mécanisme dénommé « épuisement des lymphocytes T » qui est un moyen de résistance tumorale. Cette liaison PD-L1 avec PD-1 constitue donc une cible thérapeutique intéressante pour l’immuno-oncologie. En effet, le blocage de la protéine PD-L1 peut empêcher les cellules cancéreuses d'inactiver les lymphocytes T et inverser leur épuisement. Ils retrouvent donc leur rôle dans la détection et la destruction des cellules cancéreuses. L'immuno-oncologie est certainement l'un des domaines de la recherche médicale les plus enthousiasmants, car cette approche a le potentiel de changer profondément la façon dont sont traités de nombreux types de cancer.

Bénéfices attendus

Ce projet pionnier a un fort impact sociétal. Il explore des techniques novatrices en radiothérapie (RT), moins agressives pour les tissus sains. Le gain en matière d'épargne/récupération tissulaire contribuera à l'élimination du principal obstacle dans les traitements de cancer par RT : les doses de tolérance des tissus sains. Dans ce nouveau projet nous cherchons à améliorer encore l’indice thérapeutique en combinant des techniques d’irradiation innovantes avec de l’immunothérapie avec des inhibiteurs de point de contrôle immunitaire. A la fin du projet, nous disposerons d'études radiobiologiques pouvant ouvrir une voie vers un traitement efficace des tumeurs très radiorésistantes, comme les gliomes. , le projet est sur la voie qui va de la conception de l'idée aux éventuels premiers essais cliniques.

Procédures

Dans la procédure visant à déterminer à quel moment précis PD-L1 est bloquée par l’administration de l’anticorps anti-PD-L1, les rats Fischer sous anesthésies (générale gazeuse et locale environ 45 minutes) seront tout d’abord implantés avec la tumeur au niveau du cerveau puis recevront l’anticorps anti-PD-L1 en injection intrapéritonéale à j13, j16 et j19 post implantation de la tumeur. Puis dans une seconde procédure, la combinaison de l’immunothérapie par blocage de la voie PD-1/PD-L1 au temps idéal précédemment déterminé et de la radiothérapie par mini faisceaux à j14 post implantation tumorale sera réalisée. Les rats Fischer sous anesthésies (générale gazeuse et locale environ 45 minutes) seront tout d’abord implantés avec des cellules de gliome de rat au niveau du cerveau ; puis irradiés au niveau du cerveau, sous isoflurane (environ 20 minutes d’anesthésie) avec une dose entre 15 et 40 Gy à j14 post-implantation de la tumeur et, pour finir, les animaux recevront une dose d’anticorps anti-PD-L1 en injection intrapéritonéale (durée du geste inf à 10 sec) au temps idéal déterminé lors de la première procédure.

Impact sur les animaux

Suite à l’implantation tumorale et à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité pendant 3 à 5 jours. Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croûtes et même des ulcérations au site d’irradiation pendant 5 à 6 jours. Le blocage de la voie PD-1/PD-L1 n'a montré aucun signe de toxicité chez les souris traitées dans la littérature.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Nos critères d’évaluation pour l’efficacité de la technique vont porter sur la préservation des tissus sains environnants la tumeur et sur le contrôle de la croissance des tumeurs irradiées. Les mécanismes inflammatoires, d’infiltration immunitaire et vasculaires induits par l’irradiation ne pourront être étudiés que dans la globalité d’un organisme vivant intégré. Ces mécanismes sont les clés pour une combinaison efficace avec l’immunothérapie. Dans une première étude in vivo (Bertho et al 2022), nous avons démontré que la MBRT induit un recrutement efficace des lymphocytes T et cela justifie l’évaluation de la combinaison avec des immunothérapies. De plus, l’évaluation des combinassions radio-immunothérapies requièrent l’expérimentation in vivo où l’interaction entre la réaction à la radiation et le système immunitaire peuvent être activées. Il est donc impossible de faire nos d’études avec des approches in vitro ou en utilisant des organoïdes. Aussi, le recours à des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans ce projet et il nous est indispensable de développer des modèles animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé à l'aide d'outils statistiques.

Raffinement

Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Une étape de socialisation des rats sera mise en place avant toute expérimentation : les rats seront manipulés quotidiennement pour les habituer au manipulateur et à la préhension et permettre ainsi une réalisation plus aisée et moins stressante des procédures expérimentales par la suite. Dans un souci de raffinement, tout d’abord, nous veillerons régulièrement au bien-être des animaux (une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux) pour permettre la détection de signes précoces de détresse ou de mal-être, puis nous utiliserons un enrichissement adapté avec des objets placés dans les cages d'accueil (des tunnels en carton). L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie générale adaptée aux interventions mises en place. Suite à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité pendant quelques jours (3 à 5 jours) pour y remédier, des aliments appétants sont ajoutés dans la cage. Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croûtes et même des ulcérations sur le dessus de la tête, à l’endroit de l’irradiation pendant quelques jours (5 à 6 jours), une crème, apaisante cicatrisante sera administrée sur la peau pour permettre la cicatrisation (au minimum 1 semaine, application quotidienne). Une grille de score permettra d’évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d’atteinte d’un point limite, conformément à la grille de score, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs sont particulièrement utilisés en cancérologie et dans les études de radiothérapie car il s’agit d’espèces génétiquement caractérisées et pour lesquelles les références bibliographiques sont très nombreuses dans la littérature ayant trait au domaine de la radiothérapie. Notre projet va nécessiter de travailler sur des rats chez lesquels la taille plus importante du cerveau va être plus adaptée aux types d’irradiation proposés dans le cadre des procédures expérimentales. Le système immunitaire des rats est adapté pour nos études (même types cellulaires que l’humain, même mode d’action) et déjà dévelopé au moment de l’étude. Les animaux utilisés seront des adultes de 6-7 semaines, âge compatible avec un développement suffisant y compris du système immunitaire et la possibilité de garder les animaux assez longtemps pour permettre une étude des effets à long terme de l’irradiation.

904 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent par chirurgie une greffe de tumeur mammaire humaine, parfois suivie d'une résection, pour entretenir une banque de xénogreffes issues de patientes atteintes de cancer du sein. Le porteur suit la croissance tumorale au pied à coulisse et prévoit des points limites, avant une mise à mort permettant de prélever la tumeur ou de cartographier les métastases sur de nombreux organes. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité tissulaire d'une tumeur, seule la greffe in vivo la restituant selon lui.

Objectifs

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent et le plus meurtrier chez la femme, à l’origine d’un peu plus de 11 800 décès par an en France. C’est une maladie complexe. Il existe de nombreux sous types de tumeurs mammaires qui ont des profils histologiques, génétiques et génomiques variés expliquant une évolution clinique différente. Cette hétérogénéité constitue à l’heure actuelle un des freins majeurs à une prise en charge thérapeutique optimale des patientes. Le développement de modèles précliniques mimant la complexité de la maladie est donc indispensable pour définir au mieux le traitement de demain. Pour cela, nous avons établi, dans un précédent projet (#01152.03), une banque d’une cinquantaine de xénogreffes (également appelée xénobanque) issues de tumeurs de patientes atteintes de cancer du sein (PDXs : Patient Derivated Xenograft) qui ont été archivées sous forme d’ampoules. Ce modèle a été démontré comme mimant parfaitement la biologie de la tumeur chez la patiente avec des profils histologiques, génomiques et transcriptionnels identiques (Marangoni et al., CCR 2007; Reyal F et al., BCR 2012; Derose et al., Nat med 2011). Il a également été démontré que ces modèles de xénogreffe reproduisent fidèlement la réponse aux thérapies conventionnelles observée chez les patientes (Zhang et al., Cancer Res 2013). Par ailleurs, cette xénobanque a permis d’initier la caractérisation du rôle des cellules souches cancéreuses (CSCs) présentes au sein de la tumeur et qui est à l’origine de 20 % des cancers du sein (Müller et al., 2020 ; Arfaoui et al., 2019, Guégan et al., 2019). Cette xénobanque sera donc au centre de notre projet qui aura 3 objectifs principaux: 1/ La préservation de la xénobanque; 2/ La caractérisation du développement métastatique des échantillons de la xénobanque; 3/ Le déploiement de la xénobanque dans des tests précliniques.

Bénéfices attendus

La préservation de la xénobanque réalisée grâce à ce projet permettra notamment de poursuivre la carctérisation de du développement métastatique des échantillons de cette banque et de mieux comprendre le rôle des CSCs dans ce processus permettrait de développer de nouvelles approches thérapeutiques afin d’améliorer la prise en charge des patientes atteintes de cancer du sein. Le matériel issu de cette xénobanque sera également utilisé pour l’étude des thérapies ciblant les CSCs en combinaison avec des traitements de chimiothérapie conventionnels (#16487-2018082108541206 v3), le développement de traitements ciblant la maladie métastatique (#21988-2019080815368654 v4) et l’étude de l’impact de la radiothérapie seule sur les CSCs ou combinée avec une thérapie capable de radiosensibiliser les CSCs (#26523-2020070810304662 v2). In fine, le renouvellement de cette xénobanque nous permettra d'approfondir nos connaissances sur le cancer du sein, son développement métastatique, sa résistance thérapeutique et plus particulièrement les CSCs pour pouvoir, espérons un jour, proposer une thérapie ciblée pour chaque patiente.

Procédures

L'ensemble des animaux subira une procédure chrirugicale (sous anesthésie) lors de l'implantation des cellules tumorales dans la glande mammaire qui durera approximativement 15 minutes. Dans le cas de la procédures 2, les souris seront soumis à une procédure chirurgicale supplémentaire de résection de la tumeur qui durera 10-15 minutes.

Impact sur les animaux

L'ensemble des animaux subira une procédure chrirugicale lors de l'implantation des cellules tumorales dans la glande mammaire. La nuisance de ces actes chirurgicaux sera prise en compte par l'application d'une anesthésie générale, d'une analgésie post-operatoire et l'utilisation d'un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. Les éventuelles nuisances liées à la croissance tumorale seront détectées au plus tot à l'aide d'une grille de score de la douleur intégrant des points limites les plus précoces possibles.

Devenir

A l'issue de la Procédure 1, les souris seront sacrifiées et les tumeurs seront prélevées, dissociées et soit réinjectées dans des glandes mammaires pour nos autres projets soit pour réaliser des ampoules pour notre xénobanque. Suite à la Procédure 2, les souris seront sacrifiées et différents organes seront prélevées afin de réaliser la cartographie métastatique de chaque souris (coeur, poumons, cerveau, rate, reins, foie, ovaires, cage thoracique, squelette).

Remplacement

Sur le plan physiopathologique, une greffe orthotopique de cellules tumorales obtenue chez un animal présente des caractéristiques, non pas identiques, mais similaires à celles d'une tumeur humaine, avec une complexité tissulaire impossible à reproduire in vitro. De même, la coopération spatiale des cellules, l’importance du stroma, l’angiogenèse péritumorale, le contexte cytokinien, sont des mécanismes cruciaux lors de la croissance tumorale et qui ne peuvent pas être reproduits de façon satisfaisante in vitro.

Réduction

Nous nous limiterons au nombre minimum d'animaux permettant la réalisation d’ampoules et de nos différentes études. De plus, lorsque cela sera possible, les mêmes animaux serviront aux étapes de rafraichissement et d’amplification. Ce projet de maintien d'une banque de xénogreffes nécessitera donc 904 souris immunodéficientes de type NSG.

Raffinement

Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture et eau ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Le suivi du développement tumoral se fera par des mesures cinétiques utilisant des procédés non invasifs : la mesure du volume tumoral à l’aide d’un pied à coulisse. Les procédures de transplantation seront réalisées sous anesthésie associée à une analgésie afin d’éviter toute douleur. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l’apport d’un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvèlement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). Afin de respecter leur instinct grégaire, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de copeaux de bois compactés, de lanières de papier et éventuellement d’un dôme. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal.

Choix des espèces

Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. L’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de notre approche, permettant la transplantation de cellules d’un individu d’une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d’une espèce différente (souris). Des souris adultes pubères de 6 à 10 semaines seront incluses dans les procédures expérimentales, après le développement du tissu épithélial mammaire. En effet, le développement de la glande mammaire est un processus postnatal. A la naissance, chez la souris, le rudiment mammaire comprend un canal primaire bien formé et quelques ramifications secondaires. La glande mammaire reste quiescente jusqu’au début de la puberté (4 semaines), puis les canaux mammaires s’allongent et se ramifient intensivement, envahissant progressivement tout le stroma adipeux qui entoure la glande.