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Etude des processus inflammatoires auto-immuns et des pathologies malignes dans un modèle de souris portant une mutation constitutionnelle de c-MET associée à une mutation de LPR ou GLD.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de mutations du gène c-MET associées à des mutations LPR ou GLD, elles reçoivent des injections censées induire une inflammation articulaire, subissent des ponctions de moelle osseuse sous anesthésie, puis sont tuées et disséquées pour analyse de leurs organes. Le porteur relie ce modèle au cas d'une patiente cumulant cancer du sein, syndrome myéloprolifératif et polyarthrite. Il affirme les modèles in vitro "limités" et juge ses lignées murines les seules à répondre à sa problématique.
Objectifs
A partir de l’observation, chez une jeune femme de 36 ans, d’une association inhabituelle de maladies graves (un cancer du sein, un syndrome myéloprolifératif de type Vaquez, et une polyarthrite rhumatoïde), nous avons fait la preuve du concept d’une approche individuelle en génétique constitutionnelle. Pour notre patiente, nous avions deux échantillons pathologiques: un fragment de son cancer du sein et un prélèvement de moelle osseuse. A l’aide d’une nouvelle technologie d’analyse génomique, nous avons identifié une mutation de l’oncogène cMET. C’est une mutation constitutionnelle, retrouvée dans l’ADN de la patiente et dont la valeur pathologique n’était jusqu’alors pas connue. Nous avons établi un modèle de transgénèse non dommageable pour cette mutation de c-MET chez des souris de fond génétique C57bl/6. La caractérisation phénotypique a mis en évidence des syndromes auto-immuns et myéloprolifératifs semblables à ceux observés chez la patiente. Cependant, les phénotypes restent peu sévères et n’altèrent en rien la survie des animaux. Un premier projet sur ces animaux a permis de montrer l'aspect multifactoriel de l'apparition des syndromes autoimmuns en associant cette mutation c-MET avec l'administration de molécules pro-inflammatoires. Toutefois, ce travail n'a pas permis de mettre en évidence de développement tumoral chez ces animaux. Notre objectif est de poursuivre l'étude de cette mutation c-MET et de démontrer son rôle dans l'apparition des cancers.
Bénéfices attendus
L'apparition des cancers trouvent souvent des origines multifactorielles. Cette mutation dans le gène c-MET peut être qualifiée de moyenne à faible pénétrence, ce qui signifie qu'elle ne peut, à elle seule, induire la survenue tumorale. Toutefois, nous penssons que l'on associe cette fragilité génétique à d'autres facteurs, cela peut aboutir à la formation de cancers. Au delà de l'étude des implications que peuvent avoir cette mutation c-MET dans le dévelopement de pathologies, cela constitue également un outil d'étude des fragilités génétiques aboutissant à l'apparition de tumeurs.
Procédures
2 nouvelles lignées ont été créés portant à la fois la mutation c-MET et une mutation du gène LPR ou GLD. Des modèles de souris mutés LPR ou GLD sont commercialisés et ces mutations sont associés à des syndromes auto-immuns tels que l'arthrite, et des lymphadénopathie aboutissant dans 10% des cas à des tumeurs chez les sujets âgés. Les souris double mutés c-MET et LPR ou GLD ont un phénotype non dommageable comparable à celui des souris seulement mutées pour le gène c-MET. La survenue des pathologies trouvant souvent leur origine dans des processus multifactoriels, nous souhaitons traiter ces souris afin de déterminer l’impact de facteurs additionnels sur l’aggravation du phénotype des animaux. Cette objectif sera atteint par l'injection de 2 composés, l'un permettant d'induire une inflammation, et l'autre se liant spécifiquement à cMET. La sévérité se traduira par l'observation d'un gonflement au niveau des articulations. Ce travail propose d’étudier des pathologies très diverses dont l’élément clé serait la mutation du gène MET pour lequel nous avons des modèles animaux pertinents, qui reproduisent la pathologie humaine et sur lesquels nous pouvons étudier les facteurs d’aggravation des phénotypes.
Impact sur les animaux
Les études précédentes sur les souris c-MET traitées avec du LPS et HGF ont montré l'apparition de syndrome auto-immuns sans pour autant induire de répercutions physiologiques visibles chez l'animal. Ici, l'association avec une mutation dans le gène LPR ou GLD devrait permettre d'amplifier ces phénotypes.
Devenir
A l'issu de ce projet, tous les animaux seront euthanasiés et disséqués afin d'effectuer des analyses histologiques fines des organes, et ainsi qualifier les atteintes (apparition de tumeurs, syndromes auto-immuns, syndromes myéloprolifératifs).
Remplacement
Les modèles d’étude in-vitro sont limités et peu pertinent dans ce cas de figure exceptionnel. L’objectif de notre projet est d'étudier un modèle porteur d'une mutation du gène Met et de faire le lien génétique entre des maladies graves et très différentes telles que la polyarthrite rhumatoïde, des syndromes myéloprolifératifs de type Vaquez mais aussi des cancers. De ce fait, il est actuellement très difficile d’étudier ces pathologies très diverses in-vitro, et les modèles cellulaires dont nous disposons ont des résultats limités. Par ailleurs il s’agit aussi de proposer un projet qui s’inscrive dans une démarche préclinique a visée thérapeutique pour les patients porteurs de cette mutation et pour les patients atteints de ces pathologies. Aussi, les lignées murines uniques développées sont des modèles de choix puisqu’elles reproduisent fidèlement les atteintes humaines. Les modèles dont nous disposons sont les seuls qui permettent de répondre à notre problématique pour laquelle l’expérimentation animale ne peut pas être substituée.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé au minimum sur la base d’une étude statistique pour nous permettre d’atteindre les objectifs fixés. Ce nombre est porté à 144 souris. Tous les animaux sont disséqués selon un protocole rigoureux pour valoriser les animaux utilisés dans ce projet.
Raffinement
Les actes de ponctions de moelles seront réalisés sous anesthésie générale. Un suivi quotidien des animaux est assuré par les membres de l’animalerie et le personnel formé de l’unité. Pour assurer le bien-être des animaux, les souris sont placées en groupes sociaux et dans des cages avec enrichissement. Des points limites précoces ont été fixés pour limiter la gêne et la souffrance éventuelle des souris.
Choix des espèces
Ce projet utilisera 144 souris C57bl/6 portant la mutation cMET et la mutation LPR ou GLD mâles et femelles. En raison de ses bonnes performances de reproduction, cette souche a été utilisée pour la mise en place de la lignée transgénique. Le modèle murin est un modèle robuste et parfaitement caractérisé sur lequel il est relativement facile de réaliser des expériences de transgénèse. Souris adultes de 8 semaines. Les souris sont obtenues par croisements. Certaines seront utilisées pour les générations suivantes, les autres pour les injections d’HGF ou de LPS. Les animaux seront utilisés pour nos expériences dès l’âge de 8 semaines. En effet, la patiente chez laquelle la mutation Met a été découverte était agée de 36 ans lors du diagnostic. Nous nous plaçons ici dans les mêmes conditions pour nos souris jeunes adultes.
Essais d’efficacité anti-tumorale chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 1337
1 679 rongeurs, 1 337 rats et 342 souris, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère, 835 relevant de la gravité la plus élevée. Une tumeur leur est greffée puis un médicament candidat leur est administré, avant des prélèvements de sang et d'organes et la mise à mort. Le porteur présente ces essais comme un moyen d'accélérer le développement de traitements anticancéreux plus efficaces chez l'humain. Il affirme que la toxicité et l'efficacité antitumorale ne peuvent être évaluées que sur un mammifère, malgré des tests cellulaires préalables.
Objectifs
Evaluer la dose tolérée maximale, la pharmacocinétique et l’efficacité tumorale de traitements anticancéreux dans différents modèles animaux.
Bénéfices attendus
Notre projet s’inscrit dans la continué de différents projets de recherche dans notre laboratoire et permettra d’accélérer le développement des médicaments candidats contre le cancer plus efficace chez l’homme.
Procédures
Procédures : Les animaux vont être d’abord subi une période d’acclimatation. L’induction de cancers est réalisée par l’inoculation des cellules tumorales. Lorsque la taille des tumeurs est visible par l’œil nu (environ 70-100 mm3), les souris vont être traités par le médicaments candidats. L’efficacité est évalué en comparant la taille des tumeurs chez la souris traitée versus la souris contrôle. Également, nous allons prélever les échantillons sanguins afin d’étudier les biomarqueur et les organes pour les analyses histologiques. En moyenne, une expérience comprend quatre groupes expérimentaux (1 contrôle et 3 doses), avec 8-12 animaux par groupe. La durée d’une expérience est généralement de 5-6 semaines.
Impact sur les animaux
Suite aux protocoles expérimentaux et aux anesthésies, une perte de poids peut être observée.
Devenir
A l'issu de chaque procédure les animaux seront euthanasiés afin de procéder à des prélèvements de sang et d'organe.
Remplacement
Les produits anti-tumoraux ont fait l’objet d’évaluations d’efficacité sur des lignées cellulaires tumorales avant les essais sur animaux décrits dans ce projet. Toutefois, l’évaluation du rapport entre la dose toxique et la dose efficace sur des tumeurs nécessite le recours à des organismes modèles de l’Homme. En effet l’efficacité antitumorale est liée à la disponibilité de la molécule dans la tumeur solide, d’une part et, d’autre part, la toxicité systématiquement élevée des produits anticancéreux peut affecter des types cellulaires variés et ne peut valablement être étudiée que sur un mammifère.
Réduction
Tout au long de nos expériences in vivo, nous allons strictement respecter les règles de 3R (Réduire, Raffiner et remplacer). Dans certain cas, l’utilisation des modèles cellulaires in vitro (par exemple, le test de prolifération) va permettre de réduire le nombre d’animaux en amont. D’autre part, nous allons utiliser les logiciels de calcule de puissance (power.t.test) pour déterminer exactement le nombre d’animaux nécessaire dans chaque groupe expérimental afin de respecter à la fois les règles de 3R et de respecter l’exigence statistique
Raffinement
Afin de raffiner nos procédures et limiter le stress et la souffrance chez les animaux, nous utiliserons des protocoles précis d'anesthésie et de prise en charge de la douleur par l'injection d'analgésie. Nous respecterons les points limites établis par la surveillance quotidienne des animaux et le suivi de leur état via une fiche de scoring. Leur environnement et leur condition d'hébergement sont aussi quotidiennement contrôlés, l'enrichissement est présent et adéquat au vue de l'espéce (batonnet de coton, sizzle ball, demi dôme de cellulose). DU diet gel pourra aussi être quotidiennement mis dans les cages si une perte de poids était observée.
Choix des espèces
Le choix des espèces animales est déterminé (i) par la disponibilité de lignées cellulaires tumorales d’intérêt dans l’espèce considérée, (ii) par l’existence de lignées d’animaux immunodéficients pouvant être maintenues dans les conditions du laboratoire et tolérantes vis à vis de la greffe de lignées cellulaires tumorales humaines susceptibles d’induire la formation de tumeurs et (iii) par la possibilité de pratiquer dans cette espèce les interventions chirurgicales nécessaires à la greffe tumorale et les prélèvements sanguins en volume suffisant pour le dosage des principes actifs administrés. Nous allons utiliser les animaux de 5 - 6 semaines dont la maturité sexuelle a été atteinte. Ces animaux « adultes » permettent d’éviter les perturbations physiologiques lors de la montée hormonale pendant la puberté.
Fourniture de souris porteuses de tumeurs cérébrales en sous cutanée.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
250 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, le projet consistant à leur greffer une tumeur puis à les livrer à un chercheur extérieur. Une lignée de cellules de glioblastome humain leur est implantée sous la peau du flanc sous anesthésie, puis elles sont expédiées au demandeur dans les quinze jours, avant l'apparition annoncée de nuisances. Ce laboratoire se limite donc à greffer une tumeur et à fournir les animaux à un tiers, qui les utilisera pour tester des sondes d'imagerie. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer "l'animal entier" pour étudier la biodistribution d'un composé.
Objectifs
Ce projet a pour but de fournir, à la demande d'un chercheur extérieur à notre laboratoire, des souris modèles de cancer cérébral. Ces souris modèles seront ensuite utilisées chez le chercheur afin d'évaluer la spécificité de nouvelles sondes d'imagerie TEP (Tomographie d'émission de positons) ciblant en particulier le métabolisme du tryptophane. La lignée cellulaire tumorale d'origine humaine U87 MG Luc correspond aux besoins du chercheur. L’objectif du financement ANR du chercheur est le transfert en clinique de radiopharmaceutiques innovants pour l’imagerie TEP en oncologie et neurologie et la radiothérapie moléculaire. Il est donc nécessaire des réaliser ce projet sur une lignée cellulaire humaine. Les souris porteuses de tumeurs cérébrales en sous cutanée seront envoyées au chercheur 15 jours maximum après leur induction.
Bénéfices attendus
Le métabolisme du tryptophane via la voie de la kynurénine médiée par l'indoleamine 2,3-dioxygénase (IDO) joue un rôle dans l'immunomodulation et est devenu une cible plausible pour l'immunothérapie contre le cancer. Ce projet permettra au chercheur d'évaluer la spécificité de nouvelles sondes d'imagerie TEP (Tomographie d'émission de positons) ciblant le métabolisme du tryptophane. L'imagerie TEP est un outil diagnostique de choix en cancérologie chez l'homme.
Procédures
Souris porteuses de tumeurs cérébrales en sous cutanée : 1 seule injection par animal, cellules injectées sous anesthésie gazeuse en sous cutanée au niveau du flanc des souris. Cette procédure dure moins de 5 minutes. Pesée des animaux vigiles , dure 30 secondes, 1 fois par semaine minimum. Mesure de la tumeur au pied à coulisse, se fait sous anesthésie gazeuse, dure moins de 1 minute, 1 fois / semaine maximum. Si l'envoie des souris se fait 15 jours après l'induction: pour chaque souris 3 pesées minimum et 2 mesures de tumeur au pied à coulisse).
Impact sur les animaux
Les dommages attendus sont liés au développement d'une tumeur sous cutanée. Dans ce modèle, il n'y aura pas de métastases. Les souris seront envoyées au chercheur avant l'apparition de nuisances ou d'effets indésirables soit 2 semaines maximum après l'induction des tumeurs. La douleur infligée par l’injection des cellules correspond à celle d’une piqûre d’aiguille et se fait sur souris anesthésiée (Isoflurane 2% dans l'air) tout comme la mesure de la tumeur au pied à coulisse qui est indolore. Les souris immonodéficientes utilisées présentent un phénotype dommageable dû à leur immunodéficiences qui n'apparait pas puisqu'elles sont hébergées en portoir ventilé.
Devenir
Tous les animaux du projet (50 souris x 5 envois= 250 souris) seront uniquement induits puis hébergés dans nos locaux pendant 2 semaines maximum. Ils pourront ensuite être fournis au chercheur demandeur de ce modèle pour des projets expérimentaux autorisés réalisés dans son UE. Nous lui fournirons la grille de scoring et le suivi pondéral des animaux dans nos locaux.
Remplacement
Aucun modèle in vitro n'est à même de remplacer l'animal entier étant donné la complexité des processus mis en jeu, notamment les interactions avec le microenvironnement tumoral. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle in vitro nous permettant d’étudier la biodistribution d'un composé dans tous les organes d'un individu. Le recours à l'animal entier, vivant, est indispensable pour l'étude de la biodistribution/ciblage de nouvelles sondes d'imagerie.
Réduction
Ce modèle de cancer chez la souris a pour finalité d'être utilisé par un chercheur pour l'étude de nouvelles sondes d'imagerie. D'une part, nous avons déterminé avec lui le nombre minimal de souris nécessaire pour mener à bien son projet et d'autre part le chercheur mettra en œuvre une technique d'imagerie (Tomographie d'émission de positon) qui permettra de réaliser un suivi longitudinal des animaux et ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles, évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Pour chaque série expérimentale, il analysera les images ce qui permettra de comparer l’accumulation du traceur dans différentes zones (« zones d’intérêt ») entre les temps d’imagerie pour chaque groupe, et entre les groupes. Les différences d’accumulation du traceur dans chaque zone d’intérêt seront analysées statistiquement.
Raffinement
Les cages sont enrichies avec des petits cylindres de coton pour la fabrication d’un nid. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation. Les animaux seront observés quotidiennement et afin d’éviter toute souffrance avant leur départ chez le chercheur, nous mettrons en place une grille de score et utiliserons des points limites adaptés et un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance.
Choix des espèces
Ce modèle animal nous donne la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la biodistribution/le ciblage de nouvelles sondes d'imagerie. Modèle de cancer réalisable chez le jeune animal (6 à 10 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale.
Evaluation par bioluminescence de l’efficacité combinée de la radiothérapie et du temozolomide sur un modèle de glioblastome opéré ( EU 2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
85 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance déclarés modérés à sévères. Toutes reçoivent une greffe de cellules tumorales dans le cerveau, 72 subissent une chirurgie d'exérèse partielle de la tumeur et 54 des séances de radiothérapie, pour reproduire le protocole appliqué aux patients atteints de glioblastome. Le porteur indique que la tumeur ne peut être contrôlée et atteint des points limites qui conduisent à la mise à mort de toutes les souris, et reconnaît une chirurgie classée sévère et le stress de l'hébergement individuel. Il affirme que la chirurgie ne peut pas être menée sur des modèles in vitro, justifiant le recours à la souris.
Objectifs
Nos projets de recherche portent sur le développement et la validation de stratégies innovantes pour le traitement des glioblastomes, tumeurs cérébrales très agressives et de très mauvais pronostic. Dans ce contexte, nous cherchons à affiner nos modèles , tant in vitro qu'in vivo afin qu'ils deviennent plus pertinents et plus représentatifs de la réalité clinique de cette pathologie. Nos modèles jusqu'à présent étaient limités car l'intervention chirurgicale pratiquée en première intention chez les patients n'était pas appliquée dans nos expérimentations. Nous sommes parvenus à mettre au point le modèle de glioblastome opéré chez la souris immunodéprimée porteuse d'une tumeur intracérébrale. Nous souhaitons donc maintenant appliquer à nos animaux, le traitement classiquement délivré aux patients (appelé "protocole de Stupp") qui combine chirurgie + radiothérapie + chimiothérapie : l'objectif est de caractériser les effets des traitements et de mieux comprendre les mécanismes conduisant à la récidive tumorale.
Bénéfices attendus
L'utilisation d'un modèle de glioblastome opéré dans nos expérimentation permettra de replacer nos recherches dans un contexte thérapeutique plus représentatif de la pratique clinique. En particulier, cette étude devrait nous aider à comprendre les mécanismes induits par la radiothérapie et la chimiotherapie, lorsque celles-ci sont administrées juste après une chirurgie, et déterminer comment les cellules tumorales et les cellules du microenvironnement favorisent la rechute. Au final, ces données seront essentielles pour proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les phénomènes de récidives.
Procédures
Tous les animaux (85) recevront une injection de cellules tumorales dans le cerveau : l'injection est réalisée une fois au début de l'étude (durée 45min) et le suivi du développement de la tumeur intracérébrale se fait par imagerie de bioluminescence 2 à 3 fois par semaine (durée de chaque examen environ 15 min). Parmi les 85 animaux prévus, 72 animaux subiront une intervention chirurgicale permettant de retirer partiellement la tumeur qui s'est développée dans le cerveau : cette chirurgie d'exérèse est réalisée une fois au milieu de l'étude (durée 45min) et les animaux sont placés après l'opération en cage individuelle pendant 4 jous pour convalescence. Pour 54 animaux : traitement par radiothérapie (chaque irradiation dure environ 5 min ; 18 animaux recevront 1 irradiation ; 18 animaux recevront 2 irradiations espacées de 72h, 18 animaux recevront 5 irradiations à raison d'1/jour pendant 5 jours consécutifs)
Impact sur les animaux
La première nuisance attendue sur les animaux est liée à l’implantation même du glioblastome (apparition d’une tumeur cérébrale avec des effets délétères attendus non réversibles). Schéma de traitement par radiothérapie (itérations répétées) et imagerie par bioluminescence (2 ou 3 fois par semaine en phase péri-opératoire de l'exerèse) nécessitent un transport et une anesthésie répétés des animaux, qui se produiront de surcroit lors de la phase péri-opératoire. Une accoutumance liée à la répétition des anesthésies chimiques (kétamine) peut être observée, nécessitant une augmentation des volumes administrés : ce phénomène est maitrisé par le laboratoire et l'augmentation du volume injecté est de l'ordre d'une dizaine de µL entre le début et la fin des expérimentations. La bioluminescence et la radiothérapie sont des protocoles rapides et nécessitent une anesthésie de 15 minutes maximum. Une attention toute particulière sera portée aux animaux notamment en optimisant au maximum les conditions de raffinement. Chirurgie opératoire classée sévère mais utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux. Hébergement en cage individuelle après la chirurgie d'exérèse pouvant conduire à un stress des souris (limitation des interactions sociales directes) mais atténuation de cet effet indésirable en accolant les cages les unes aux autres qui sont de surcroit transparentes. Une attention toute particulière sera portée aux animaux notamment en optimisant au maximum les conditions de transport des animaux.
Devenir
Tous les animaux du projet développent une tumeur qui ne peut pas être contrôlée par les traitements appliqués : la tumeur finit par provoquer l'apparition de points limites qui expliquent la mise à mort à l'issue de chaque procédure (soit 85 souris au total)
Remplacement
Dans notre contexte, le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n'est clairement pas possible puisque nous tentons de modéliser chez l'animal l'impact de l'ablation chirurgicale des tumeurs dans le cas de tumeur cérébrale très agresssives et de très mauvais pronostic : la chirurgie ne peut pas être réalisée sur des modèles in vitro.
Réduction
Pour deux groupes d'études, nous avons réduit le nombre d'animaux car nous avons, lors une étude préliminaire, acquis des données qui pourront être compilées avec celles acquises dans ce nouveau projet. Afin de suivre la croissance tumorale, nous utiliserons une méthode d'imagerie permettant ainsi un suivi dans le temps de chaque animal. De plus, concernant les animaux qui recevront les différentes modalités de radiothérapie, les procédures se feront de façon séquentielle, palier par palier, de la procédure d'irradiation la moins contraignante à la procédure d'irradiation la plus contraignante pour les animaux. Seules les procédures bien tolérées seront conduites.
Raffinement
Un soin tout particulier sera apporté aux animaux notamment par un suivi post-opératoire rigoureux (désinfection de la plaie, analgésie, réhydratation par injection de glucose à 37°C...). Les souffrances de l'animal seront évaluées en appliquant une grille de score adaptée aboutissant à une prise de décision adéquate, en fonction de points limite et de crières d'arrêt préalablement définis et validés pour nos protocoles. Les conditions d'hébergement et d'enrichissement garantiront les conditions de bien-être animal. Le transport des animaux se fera de façon à éviter au maximum le stress des animaux.
Choix des espèces
Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles souris et rats. Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de son accessibiltié et de sa facilité de manipulation. Les souris immunodéprimées sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines. Nous privilégions des souris femelles, plus dociles et moins agressives, pour faciliter l'hébergement collectif. Des souris âgées de 6 semaines sont utilisées, à un stade où leur crâne a une conformation très bien définie qui permet l'injection de cellules tumorales sans danger et sans difficulté.
Développement d’un nouveau biomatériau naturel poreux pour une médecine régénérative en vue de traiter les communications bucco-sinusiennes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une perte de substance du palais leur est infligée sous anesthésie pour créer une communication entre la bouche et les sinus, comblée par un biomatériau à base de collagène et de lysat plaquettaire, avec un suivi de trois semaines par scanner avant mise à mort au 21e jour. Le porteur reconnaît des douleurs postopératoires, des difficultés à s'alimenter, des risques d'infection, de nécrose et une mortalité pouvant atteindre 5 %. Il affirme qu'il n'est pas possible de se passer d'animaux et présente ce modèle comme un préalable à des essais chez l'humain.
Objectifs
Les communications buco-naso-sinusiennes (CBS) sont fréquentes en cancérologie, d'origine iatrogène de la tête et du cou et peuvent être causées par la chirurgie et/ou la chimiothérapie. Elles se manifestent sous forme de fistules entre la cavité orale et les sinus maxillaires ainsi que les fosses nasales.Ces communications peuvent entraîner des symptômes tels que des infections récurrentes des sinus, une obstruction nasale, des douleurs faciales et des écoulements nasaux persistants. Les traitements actuels sont souvent invasifs et présentent un risque élevé d'échec. Pour résoudre ce problème, nous proposons un nouveau biomatériau sec, poreux et bioactif fabriqué à partir de collagène de types I et de lysat plaquettaire. Ce biomatériau a pour objectif de fermer complètement les CBS tout en libérant des molécules bioactives qui favorise la réparation tissulaire (facteurs de croissance, des cytokines...) Le but se ces travaux d'évaluer l'efficacité de ce biomatériau sur des animaux dans le cadre du traitement des CBS. Il vise à offrir une solution thérapeutique supplémentaire aux CBS de petite ou moyenne taille, en particulier celles qui sont récidivantes et réfractaires au traitement par lambeaux. L'utilisation de ce biomatériau plutôt que d'un lambeau permettrait d'éviter la morbidité associée (séquelles du site donneur) et de raccourcir la durée de l'opération. Cela améliorerait la qualité de vie des patients, en particulier ceux qui doivent porter des plaques palatines obturatrices à vie en raison de CBS persistantes. Les approches utilisant des biomatériaux bioactifs d'origine naturelle, comme celle que nous proposons, représentent une alternative de choix pour combler ce vide thérapeutique.
Bénéfices attendus
- Prouver l’efficacité des biomatériaux pour la régénération tissulaire in-vivo - Perfectionner le modèle animal de CBS chez le rangeur (rats)
Procédures
L'induction de la communication bucco-sinusienne et la mise en place des biomatériaux seront réalisées sur l'ensemble des rats (60) sous anesthésie générale, avec une durée estimée de 60 minutes. Chaque rat sera placé allongé sur le dos sur un tapis chauffant, avec la bouche maintenue ouverte à l'aide d'un élastique placé sur les incisives maxillaires. La procédure consistera en la création d'une perte de substance palatine, conformément à la méthode décrite dans la littérature. Cette perte de substance sera ensuite comblée avec nos biomatériaux sélectionnés, soit l'aérogel de collagène et de lysat plaquettaire, soit l'aérogel de collagène seul, à l'exception du groupe contrôle. Lors de l'application des aérogels, une pression douce sera exercée avec une compresse jusqu'à obtention de l'hémostase. Un suivi de 3 semaines sera effectué, avec une observation hebdomadaire par scanner (micro-TDM) sous anesthésie générale, pour une durée estimée inférieure à 15 minutes. Ceci permettra d'évaluer la régénération tissulaire induite par nos biomatériaux dans les groupes traités et de la comparer à la régénération spontanée du groupe contrôle. Enfin, après une anesthésie générale, tous les rats seront euthanasiés au 21e jour ce qui prendra quelques secondes. Les cadavres des rats seront ensuite transférés au service de zootechnie expérimentale pour la dissection, et des analyses histologiques seront réalisées sur les échantillons.
Impact sur les animaux
Douleurs : Il est possible que des signes de douleur postopératoire apparaissent en raison des incisions chirurgicales, de la manipulation tissulaire et des lésions tissulaires pendant la chirurgie. Ces douleurs peuvent avoir des effets négatifs sur le bien-être général des animaux, tels que des problèmes de comportement tels que l'anxiété, la dépression ou l'agressivité. /Difficultés alimentaires : Des difficultés à s'alimenter peuvent survenir en raison de douleurs ou d'inconfort buccal, des modifications anatomiques de la cavité buccale et des sinus qui affectent la fonction de mastication et rendent l'ingestion des aliments moins efficace./Infection : Il est possible que des infections se développent au site de la communication bucco-sinusienne ou de la réparation subséquente avec l'aérogel./ Mauvaise cicatrisation : Il est possible que la réparation avec l'aérogel ne soit pas efficace et que la communication bucco-sinusienne persiste ou se reforme. /Effets secondaires systémiques : L'utilisation de l'aérogel pour la réparation de communications bucco-sinusiennes chez les rats peut entraîner des effets secondaires systémiques, tels que des modifications du poids corporel, du métabolisme ou d'autres paramètres physiologiques. Réaction immunitaire : Il est possible que certains animaux développent une réaction allergique à l'aérogel, ce qui pourrait entraîner des symptômes tels que de l'inflammation, des rougeurs, des démangeaisons ou une nécrose tissulaire. /Mortalité : Il est possible que des animaux décèdent en raison de complications liées à la procédure de réparation avec l'aérogel, telles que des infections, des complications chirurgicales ou des réactions inattendues (risque estimé inférieur à 5%).
Devenir
Mise à mort nécessaire pour examen histologique (évaluation biointégration, biodégradation, formation osseuse, présence d'ostéoradionécrose).
Remplacement
Il n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet. En effet, avant de pouvoir mettre en place les premiers essais cliniques chez l'Homme, il est nécessaire de vérifier l'efficacité du nouveau biomatériau dans une étude préalable sur modèle animal. Une seule formulation de mousse composé de collagène et de lysat plaquettaire parmi 3 formulations de départ sera évaluée, car l’évaluation in-vitro (culture cellulaire 3D) a montré son fort potentiel
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit par une analyse statistique optimale établie en fonction des résultats attendus, ainsi que le choix de modèles animaux et de protocoles déjà validés dans la littérature.Le critère de jugement principal est le taux de rats présentant un succès. Un succès est défini comme une régénération de plus de 50% de la surface. En utilisant un plan de A’Hern sous les hypothèses alpha=5%, puissance=85%, p0=25% et p1=55%, il est nécessaire de randomiser 20 rats dans chaque bras expérimental. Un ratio 1:1:1 sera utilisé pour la randomisation, le bras contrôle étant uniquement présent pour valider les hypothèses. Au total 60 rats (bras contrôle : n=20 / bras expérimental 1: n=20 / bras expérimental 2 : n=20) seront randomisés dans cette étude. Le critère principal est le taux de rats présentant un succès (cf. section critère de jugement principal).Il sera présenté par bras sous la forme de nombre, pourcentage et intervalle de confiance à 95% selon une distribution binomiale exacte.
Raffinement
La totalité des procédures effectuées seront réaliser par un personnel qualifié composé de concepteur de projet et d’applicateur de procédure expérimentale ainsi de chirurgiens ORL Un entrainement sur des cadavres de rats sera effectué afin de permettre aux opérateurs de se familiariser et raffiner la procédure chirurgicale. Le bien-être animal sera raffiné par une optimisation de la gestion de la douleur (buprenorphine). Les animaux seront surveillés avec attention (comportement, prise alimentaire) et seront pesés de manière hebdomadaire durant toute l'expérience. Les difficultés à l'alimentation seront surveillées et la prise alimentaire sera facilitée par les antalgiques et un accès à l'eau et à de l'alimentation molle (croquettes ramollies). Elle sera supplémentée par des compléments hypernutritifs en cas de perte de poids. Les cages seront de taille adaptée. Le change sera effectué 2 fois par semaine. Un enrichissement environnemental dans les compartiments sera réalisé avec mise en place de cachettes, de papier, coton pour réaliser des nids. Des points limites seront respectés pour éviter toute souffrance excessive. L'ensemble du personnel est qualifié et compétent en matière d'expérimentation animale, et l'animalerie possède l'agrément et le plateau technique nécessaires. A noter que les animaux ne pourront pas être réutilisés car l’évaluation de la régénération tissulaire nécessitera une autopsie.
Choix des espèces
Bien que les modèles animaux ne puissent reproduire précisément la physiologie ou l'anatomie humaine, le rat se distingue en tant que modèle animal particulièrement avantageux pour notre étude. Il présente une combinaison d'atouts significatifs, tels que son coût abordable, sa robustesse et sa facilité d'entretien. Notre sélection s'est orientée vers la race Wistar Han, avec des mâles âgés d'environ 7 à 9 semaines, pesant entre 251 et 275 grammes. Toutes les expérimentations animales seront rigoureusement conduites au sein d'une installation de Zootechnie agréée. Cette décision repose sur des études préalables similaires à notre approche de recherche, qui ont été précédemment publiées.
Prélèvements et injections sur des modèles AGA dans un contexte de génotypage, caractérisation moléculaire et phénotypage in-vivo dans un élevage.
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Rats : 696
80 905 animaux non-humains, 80 209 souris et 696 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant surtout un niveau de souffrance léger, avec 10 102 cas modérés et 12 sévères. Ils subissent des biopsies de la queue, des injections et des prélèvements de sang pour génotyper et caractériser des lignées génétiquement modifiées, une partie étant tuée pour prélever des tissus ou faute de porter la modification recherchée. Le porteur indique que les animaux d'intérêt sont maintenus en vie et expédiés aux chercheurs, et que d'autres sont utilisés pour former le personnel. Il présente le recours à un organisme entier comme difficilement substituable et signale que la suppression de certains gènes provoque des phénotypes sévères, jusqu'à une mort précoce.
Objectifs
Réalisation de prélèvements et injections sur les animaux génétiquement modifiés dans le but de les caractériser, les valider et de réaliser leur production afin de livrer de slots expérimentaux aux aires thérapeutiques (Immuno-Oncologie, Immuno-Inflammation, Maladies Neurologiques Rares, Unité de médecine génétique). La validation du modèle consiste à vérifier la présence de la modification génétique et la caractérisation permet d'une part de vérifier qu’elle soit fonctionnelle puis d’autre part d’en mesurer l’impact sur la santé de l’animal. Ces techniques sont réalisées par du personnel formé et qualifié et dans le plus grand respect du bien-être animal.
Bénéfices attendus
Avantages à court terme : valider, caractériser et vérifier la présence/absence de la modification génétique avant et pendant la production et l’utilisation des animaux présentant un intérêt pour les indications cliniques des aires thérapeutiques. Les unités de recherche ont au préalable déterminé en relation avec le département de biostatistiques le nombre d’animaux à utiliser pour atteindre leurs objectifs scientifiques. Avantages à long terme : les animaux génétiquement modifiés utilisés dans ce projet permettront l’avancée dans la compréhension de la physiopathologie de certaines maladies, améliorer le diagnostic et tester des molécules pour traiter les patients. Les connaissances scientifiques obtenues feront l’objet de publications dans un délai de 2 à 5 ans et le bénéfice sur les patients est attendu par le biais des études cliniques dans un délai de 5 à 10 ans.
Procédures
- Biopsie de queue : de 2mm maximum réalisée entre 10 et 21 jours d’âge - Injection unique ou répétée (maximum sur 5 jours) intra-péritonéale ou intraveineuse - Administration de Doxycycline dans l’eau de boisson et/ou la nourriture pendant 5 semaines maximum (contrainte liée à l’inappétence du produit) - prélévement de sang sur 14 jours (suivi glycémique) via la veine submandibulaire (contrainte de courte durée). Pour avoir des naissances ou des embryons à une date/stade précis, des injections d’hormones sont réalisées (contention, injection).
Impact sur les animaux
Stress ou douleur légère de courte durée liée à la biopsie de queue .Stress ou douleur légère de courte durée liée aux injections unique ou répétées (maximum sur 5 jours) intra-péritonéale ou intraveineuse . Inconfort lié à l'inappétence du produit dans l'eau de boisson et/ou la nourriture pendant 5 semaines maximum -Stress ou douleur légère de courte durée liée au prélèvement sanguin. La suppression de la protéine A peut entrainer un phénotype dommageable dont la gravité pourra potentiellement aboutir à un phénotype sévère, tel qu’une encephalomyopathie incluant retard de croissance, léthargie, perte des fonctions motrices, ataxie à évolution progressive entrainant la mort à ~7 semaines d’âge. La suppression de la protéine B entraine un phénotype dommageable de gravité modérée se traduisant par un stress accru, une diminution de la fertilité, une mortalité avant sevrage de 10% .
Devenir
Les animaux d’intérêt sont maintenus en vie et expédiés aux chercheurs pour être intégrés dans des projets de recherche en utilisation continue. Par ailleurs, certains animaux seront euthanasiés soit pour permettre le prélèvement de tissus nécessaire à la caractérisation du modèle, soit parce qu’ils ne présentent pas la modification génétique d’intérêt, ou ayant atteint un point limite. Enfin, certains animaux seront réutilisés pour la formation du personnel manipulant des animaux.
Remplacement
La validation, la caractérisation et la production de rongeurs répondent aux besoins de certains projets scientifiques de disposer d'animaux homogènes en poids et en âge selon des critères génétiques définis et en nombre suffisant. Les modèles génétiquement modifiés permettent de reproduire le contexte physiologique d’un organisme entier, cette étape est difficilement substituable puisque seul un organisme intégré permet d’étudier et de comprendre les interactions entre les cellules dans les tissus et organes. Le recours à l’animal est justifié pour chacune des lignées utilisées (développement des projets des équipes de recherche). Chaque fois que des méthodes in silico ou méthodes in vitro (cultures de cellules, organoïdes…) suffisent à couvrir les besoins des chercheurs celles-ci sont privilégiées sans recours ultérieur à l'animal.
Réduction
La caractérisation moléculaire et l’immunophénotypage visent à déterminer la viabilité du modèle selon la cible analysée. Ce phénotypage est réalisé en amont de l’élevage afin de réduire la production inutile d’animaux en cas d’obsolescence du modèle. Le nombre d’animaux produit est optimisé par les pratiques d’élevage et le relevé d’indicateurs de production propres à chaque souche. Les objectifs de production sont réévalués régulièrement (maximum tous les 6 mois) avec les utilisateurs, et ajustés chaque fois que nécessaire. Les demandes sont calculées sur la base des évaluations statistiques propres à chaque projet utilisateur, afin de limiter le nombre d’animaux produits aux stricts besoins des procédures en place dans chaque projet de recherche, selon les justifications statistiques de chaque test.
Raffinement
Les conditions d’utilisation des animaux sont conformes à toutes les législations en vigueur, encadrées par des procédures et mises en place sur la base des meilleurs standards internationaux. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux, un enrichissement est placé dans les cages (cellulose de nidification, dômes en carton) et un enrichissement sonore est présent dans chaque pièce d’hébergement afin de couvrir les sons liés au travail zootechnique. L’observation des animaux est faite quotidiennement par du personnel formé et compétent. Le responsable de l’étude est informé de toute anomalie, de même que le vétérinaire désigné si des signes cliniques sont relevés. Chaque observation est consignée, permettant ainsi de suivre le bien-être de l’animal et d’ajuster au besoin les conditions environnementales. Dans le cas où la modification génétique altère le bien-être de l'animal nous mettons en place les mesures nécessaires pour y remédier (environnement, nourriture à disposition dans les cages, critères d’arrêt spécifiques) et une surveillance quotidienne des animaux par du personnel formé et compétent. Les biopsies sont réalisées à la queue et font au maximum 2mm sur des animauxde 10 à 21 jours( absence d'innervation et de ossification à cet âge) afin de limiter l'impact de ce geste. Cette intervention ne concerne que les animaux dont le schéma d’accouplement ne permet pas 100% d'animaux porteurs de la modification génétique d'interêt. Dans le cas contraire, seuls les géniteurs sont biopsiés afin de garantir le génotype de la descendance sans avoir recours à la biopsie. Une seconde biopsie est réalisée si et seulement si les résultats de génotypage ne sont pas concluants.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont des modèles pharmacologiques de choix pour les études scientifiques. En effet, leur génome facilement modifiable et à 90% similaire à celui de l’homme permet d’utiliser ce modèle pour mimer les pathologies humaines afin d’en comprendre l’origine et de tester des molécules dans les phases préliminaires de recherche. De plus, sa rapidité de production et d’hébergement permettent de réaliser des modèles en un temps et un espace restreint. Les animaux commandés sont le plus souvent des adultes (jeunes ou matures), permettant de garantir la pleine expression physiologique des cibles thérapeutiques visées. Le génotypage est effectué sur des animaux âgés de 10 à 21 jours afin de sélectionner les animaux d’intérêts aux études et aux renouvellements de géniteurs. Le phénotypage est effectué généralement sur des animaux âgés de 3 à 10 semaines. Des animaux plus âgés peuvent être également phénotypés dans le cadre d’études de vieillissement. Les animaux sont expédiés généralement entre 5 et 8 semaines d’âge selon les besoins des chercheurs.
Etablissement d’un modèle syngénique de tumeur hépatique et développement de modèles pré-clinique chez la souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
2 189 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 1 709 d'entre elles. Elles subissent des greffes de tumeurs par laparotomie sous anesthésie, des injections répétées, des prélèvements de sang et des échographies, y compris des souriceaux de quelques jours et des femelles gestantes. Le projet développe un modèle d'hépatoblastome, cancer du foie de l'enfant, les retombées cliniques restant renvoyées au long terme. Le porteur affirme que les modèles in vitro ne miment que partiellement la maladie et juge le recours à l'animal indispensable.
Objectifs
L’hépatoblastome est le cancer du foie le plus fréquent chez l’enfant. La survie globale à 5 ans actuellement est de 80 pour cent. Le traitement associe de la chimiothérapie à base de cisplatine à une résection chirurgicale de la tumeur. Mais 20 pour cent des enfants traités vont développer une résistance au cisplatine au cours de la chimiothérapie ou au cours de la récidive de la maladie. Il existe actuellement peu d’alternatives thérapeutiques, avec des données insuffisantes sur les alternatives proposées. Il est donc crucial de pouvoir tester de nouvelles associations de traitement ou de nouveaux traitements. Les modèles pré-cliniques d’hépatoblastome qui existent aujourd’hui sont réalisés sur des souris nude (souris immunodéprimées), chez qui un fragment de tumeur humaine ou des suspensions cellulaires issues de culture cellulaires sont implantés en sous cutané ou directement dans le foie. Cependant le système immunitaire a un rôle primordial dans la réponse anti-tumorale. Il est donc très important de développer des modèles syngéniques d’hépatoblastomes chez la souris immunocompétente afin de pouvoir, une fois le modèle établi, étudier l’effet de nouveaux traitements et également étudier la réponse immunitaire impliquée dans la réponse anti-tumorale.
Bénéfices attendus
Notre équipe s’intéresse à deux grands types de tumeurs malignes du foie : les carcinomes hépatocellulaires principalement développés chez l’adulte et les hépatoblastomes qui se développent chez l’enfant de moins de 5 ans. Dans le cas des cancers de l’adulte les options thérapeutiques sont encore très limitées et peu efficaces dans les formes avancées. Quant aux cancers pédiatriques, bien que la majorité des patients répondent aux traitements conventionnels, certains sont réfractaires. Les modèles précliniques que nous allons développer sont les plus pertinents actuellement pour étudier la réponse thérapeutique car ils sont représentatifs du comportement de la tumeur. Leur utilisation dans cette étude nous permettra donc de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu, et de tester de nouvelles approches thérapeutiques pouvant être bénéfiques aux patients pour lesquels les options sont actuellement limitées.
Procédures
Les animaux pourront être soumis, selon la procédure considérée, aux gestes suivants : injections sous-cutanées d’analgésiques (animal vigile, 6 fois maximum, 30 sec), injections sous-cutanées d’une suspension cellulaire (animal vigile, 2 fois, 30 sec), injections intrapéritonéales (animal vigile, 10 fois maximum, 15sec), laparotomie (une seule fois, animal anesthésié, 30min maximum), greffe de tissus (une seule fois, animal anesthésié, 15 à 30 min selon la méthode considérée), prélèvements de sang (animal anesthésié, 10 fois maximum avec une intervalle de une semaine minimum entre chaque, 1min) ; échographie abdominale (animal anesthésié, 20 fois maximum, 10 min). Selon les molécules antitumorales que nous choisirons de tester, le nombre d’injections intrapéritonéales pourra être augmenté pour certains animaux, et deux gestes supplémentaires pourront être réalisés si nécessaire : administration par voie orale sur animal vigile (15 sec), injections intraveineuses sur animal anesthésié (30sec). Le nombre d’administration n’a pas encore été déterminé car il dépendra des composés choisis. Tous les actes chirurgicaux sont couverts par une analgésie appropriée.
Impact sur les animaux
Les nuisances prévues sont principalement celles engendrées par les procédures chirurgicales réalisées, qui peuvent engendrer une douleur au niveau de l’incision au réveil de l’animal et avoir une incidence sur l‘état général de santé de l‘animal (perte d‘appétit, déshydratation, baisse de l‘activité, infection de la cicatrice, détresse de l’animal dans les cas les plus grave), ainsi qu’entrainer une légère gêne dans la locomotion. Un risque anesthésique est également à prendre compte (détresse respiratoire, réveil intempestif). L’utilisation d’animaux à des âges précoces peut engendrer un abandon de la part de la mère. Un stress de l’animal peut aussi être constaté lors des contentions, ainsi qu’un inconfort lors des injections. Le développement des tumeurs est généralement asymptomatique et n’entraîne donc pas de nuisances en soit, car les animaux seront euthanasiés avant que les tumeurs entrainent une dégradation de l’état général des animaux.
Devenir
Le prélèvement des tissus d’intérêt étant nécessaire pour la réalisation de nos analyses, l’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin des procédures grâce à une méthode réglementaire, et dans le respect des bonnes pratiques.
Remplacement
Les modèles in vitro ne miment que partiellement la pathologie humaine car ils ne permettent pas de modéliser certains paramètres biologiques pouvant influencer le développement tumoral ou la réponse thérapeutique, tels que les interactions des cellules tumorales avec leur environnement ou encore l'hétérogénéité intra-tumorale. Il est donc essentiel de disposer de modèles in vivo reproduisant le plus fidèlement possible les caractéristiques de la pathologie humaine. Le recours à des modèles animaux est donc indispensable pour mieux comprendre l'histoire naturelle de la maladie et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Réduction
Les effectifs des différentes procédures ont été réduits au maximum, afin d’utiliser le moins d’animaux possibles tout en permettant d’obtenir des résultats suffisamment robustes (nombre minimal d’animaux par groupe déterminé grâce à un calcul de puissance). Les expériences pourront être réitérées jusqu’à 3 fois si nécessaire. Afin de limiter au maximum les éventuelles variations entre les expériences, les paramètres d’hébergement et de soin des animaux seront contrôlés. Des expériences préliminaires de mise au point seront réalisées afin de diminuer le nombre d’animaux utilisé par la suite (détermination des lignées cellulaires les plus appropriées, doses optimales à utiliser, etc.). Le suivi tumoral sera réalisé grâce à une méthode non invasive, ce qui diminue également le nombre d’animaux utilisés. L’effectif total du projet sera de 2189 animaux, et des tests statistiques appropriés seront choisis pour l’interprétation des résultats.
Raffinement
Les animaux seront hébergés sous une atmosphère contrôlée et selon les paramètres réglementaires (cages sur portoirs ventilés, 5 animaux par cage maximum, hygrométrie 55% +/- 10%, température 22°C +/- 2°C, éclairage alterné jour/nuit 12h/12h de 6h du matin à 6h du soir, nourriture et boisson à volonté). Les cages seront enrichies avec du coton de nidification, des maisonettes en plastique ainsi que des batonnets à ronger. Les femelles gestantes seront regroupées à 2 par cages afin d’éviter leur isolement, et ne seront séparées qu’en cas de mise bas afin d’éviter la surpopulation au sein d’une même cage. Les animaux issus d’établissement fournisseur observeront une durée d’acclimatation de 7 jours minimum avant toute utilisation. Un change sera réalisé par le personnel de l’animalerie une fois par semaine (sauf indication contraire) et une surveillance quotidienne rigoureuse des animaux sera réalisée tout au long de leur vie. Des pesées seront également réalisées à intervalles réguliers et une grille de suivi pourra être mise en place si l'état des animaux le nécéssite. Les procédures seront raffinées afin de limiter au maximum la douleur et l’inconfort des animaux (personnel formé et compétent, anesthésie et analgésie adéquate suite aux procédures chirurgicales puis surveillance rapprochée des animaux avec étiquetage spécifique des cages concernées), et des points limites précis seront établis. Si un animal présente des signes de douleur ou de détresse, il sera immédiatement euthanasié par une méthode réglementaire afin d’éviter toute souffrance animale. La Structure chargée du Bien-Etre Animal et/ou le vétérinaire pourront être sollicités pour conseil si besoin.
Choix des espèces
La souris est un modèle expérimental de choix pour l'étude des pathologies humaines car c'est un petit mammifère qui se reproduit rapidement, est facile à manipuler, et dont nous avons une bonne connaissance du comportement et de la génétique. De plus, son génome présente une grande homologie à celui du génome humain, ce qui suggère une bonne transposition des mécanismes observés. On peut également facilement apprécier les modifications physiques et/ou comportementales traduisant une souffrance et/ou douleur, ce qui conduirait à l’euthanasie de l’animal. De nombreux outils moléculaires sont également disponibles chez ce modèle animal. Des femelles gestantes âgées de 2 à 3 mois seront utilisées, ce qui correspond à l’âge adulte et également à l’âge optimal permettant le bon déroulement de la gestation d’une part, et une bonne récupération de l’acte chirurgical d’autre part. Les embryons seront transfectés avec le vecteur viral à 15 jours post- insémination. De jeunes animaux âgés de 2, 5 et 15 jours seront également utilisés pour mimer le développement de tumeurs hépatiques chez l’enfant (les souriceaux présentent alors un foie immature et en prolifération, ce qui maximise les chances de développer un hépatoblastome), ainsi que des animaux adultes âgés de 6 à 8 semaines (ce qui correspond à l’âge classiquement utilisé pour les procédures de greffes).
Etude de l’environnement inflammatoire cérébral post-radiothérapie : suivi par microdialyse sur rat porteur de glioblastome (EU porteur; EU 2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
64 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une tumeur cérébrale humaine leur est implantée, puis une sonde de microdialyse par une chirurgie classée sévère, avant des prélèvements de liquide cérébral sur animal éveillé maintenu en cage de contention individuelle, avec radiothérapie et imagerie. Le porteur teste un médicament associé à la radiothérapie sur le glioblastome et présente la microdialyse comme un moyen de réduire le nombre d'animaux en répétant les mesures sur un même individu. Il annonce une mise à mort au point limite ou au plus tard 90 jours après le début, et juge les méthodes alternatives 'clairement pas possibles'.
Objectifs
Les tumeurs cérébrales appelée glioblastomes sont les tumeurs du cerveau les plus fréquentes et sont généralement agressives. En clinique, actuellement le protocole de traitement de ces tumeurs cérébrales commence par une ablation chirurgicale, suivie de séances de radiothérapie et de chimiothérapie. En effet, dans la plupart des cas, l’ablation chirurgicale ne permet que de retirer partiellement la masse tumorale. Les cellules cancéreuses restantes après chirurgie sont ensuite traitées par radiothérapie et chimiothérapie. Ce projet se place dans le contexte clinique de traitement des tumeurs cérébrales, et plus particulièrement sur l’amélioration de l’efficacité du traitement par radiothérapie grâce à l’utilisation de nouvelles molécules. Dans ce projet nous chercherons à évaluer le potentiel thérapeutique d'un médicament innovant (en cours de développement clinique), en association avec la radiothérapie, sur un modèle de tumeur cérébrale humaine implantée chez l'animal. L’objectif du projet étant d'étudier la réponse immunitaire après traitement par ce médicament innovant en association avec la radiothérapie. Pour cela nous utiliserons une technique qui permet un dosage répété des molécules présentent dans l'environnement de la tumeur sans réaliser de biopsie du cerveau. Au cours d'une chirurgie nous plaçons une sonde dans la tumeur cérébrale de l'animal; celle-ci nous permettra de mesurer la réponse immunitaire durant plusieurs jours. Cette technique permet de réduire considérablement le nombre d'animaux comparé aux techniques traditionnellement utilisées qui necessiteraient la mise à mort de l'animal pour chaque point de mesure. Pour le suivi de l'évolution de la masse tumorale des différents traitements, nous utiliserons des techniques d’imagerie non invasive permettant notamment de réduire les souffrances de l’animal et de réitérer nos observations dans le temps sur un même animal.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de mieux appréhender les mécanismes d’action du médicament innovant pour le traitement du glioblastome. La technique de mesure utilisée permettra, par l'intermédiaire d'une sonde implantée dans le tissu cérébral, d'obtenir des échantillons de façon dynamique tout en gardant l’animal en vie. Ces échantillons nous permettront un suivi au cours du temps de la réponse immunitaire après traitement du médicament innovant et de la radiothérapie.
Procédures
Implantation dans le cerveau des animaux de tumeurs cérébrales humaines, cette chirurgie dure environ 1h. Implantation d'une sonde de microdialyse : durée de la chirurgie environ 1h30 ; présence de la sonde qui ressort au niveau du crâne et qui reste présente à partir du moment de son implantation jusqu'à la mise à mort de l'animal. Prélèvement de liquide cérébral sur animal vigile hébergé en cage individuelle spécifique au mode de prélèvement. Cette méthode de prélévement sera réalisée du jour 11 au jour 17 sur l'animal conscient; l'hébergement en cage individuelle spécifique au mode de prélèvement induit une restriction des déplacements de l'animal. Protocole de radiothérapie et imagerie pour le suivi de l'évolution de la tumeur sur animal anesthésié
Impact sur les animaux
Implantation au niveau du cerveau de cellules tumorales d'origine humaine : chirurgie classée modérée car seule l’incision de la peau du crane peut provoquer une souffrance à l’animal. Nous utiliserons un analgésique local pour limiter la souffrance des animaux. Implantation de la sonde : chirurgie opératoire classée sévère mais utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux. Hébergement en cage individuelle après l’implantation de la sonde (pour éviter que les animaux ne se rongent la partie visible de celle-ci) pouvant conduire à un stress des animaux (limitation des interactions sociales directes) mais atténuation de cet effet indésirable en accolant les cages les unes aux autres qui sont de surcroit transparentes. Cages d’hébergements adaptées au mode de prélèvement avec système de contention. Radiothérapie et imagerie sur l’animal : transport de l'animal jusqu’à la plateforme d'imagerie et de radiothérapie ; afin d’éviter toute nuisance à l’animal, le transport est réalisé en cages filtrées dans un sac de transport isotherme (pour le maintien d’une température optimale, des bouillottes chauffantes sont placées sous les cages si nécessaire). Les procédures de radiothérapie ou d’imagerie sont réalisées sur l’animal anesthésié. L'imagerie est un examen non invasif , il ne produit aucune forme de douleur.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet pour analyse des tissus cérébraux. La mise à mort est réalisée dès l’apparition d’un point limite (altération des déplacements et/ou perte de poids) ou en cas d'efficacité du traiement au maximum 90 jours après le début des expérimentations.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement de tumeurs cérébrales et les effets du traitement par radiothérapie avec ou sans médicament innovant, dépendent de phénomènes biologiques complexes. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé que sur un modèle animal.
Réduction
La technique utilisée est une méthode permettant le recueil du liquide cérébral et de ses composants sans avoir à mettre à mort les animaux. Elle offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux dans la mesure où les prélèvements peuvent être réitérés au cours du temps. Nous n’avons pas de réelle idée des variations attendues entre les différents groupes d'animaux, il est donc compliqué de définir un nombre d’animaux précis nécessaire pour une obtenir une solide étude statistique mais 8 animaux par groupe semble tout à fait pertinent.
Raffinement
Les deux procèdures chirurgicales seront effectuées sous anesthésie gazeuse afin de limiter le stress de l'animal et de permettre un réveil rapide. Une attention toute particulière sera portée aux animaux d'une part après l'implantation de la tumeur (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) mais d'autre part lors de la chirurgie d'implantation de la sonde (analgésie avec réitération, mise en cage individuelle, pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie). Une vigilance accrue sera accordée au moment des prélèvements intracérébraux, en effet les animaux seront régulièrement observés pour vérifier que le comportement des animaux n’est pas altéré par le mode de prélèvement et les contraintes de contention. L'atteinte d'un point limite décrit précédemment dans le descriptif des procédures conduira à la mise à mort de l'animal. Une attention toute particulière sera également portée lors du transport des animaux sur le site d’imagerie, notamment par le maintien d'une température optimale (par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages). Ce transport se fera toujours sous conditions éveillées : l’anesthésie gazeuse étant rapidement réversible. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de sopalins et de bâtonnets en bois à ronger.
Choix des espèces
Dans les études menées en cancérologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les rats constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. En outre, le choix de cette espèce se justifie par la taille du cerveau plus importante permettant une implantation de la tumeur et de la sonde de prélèvement plus précise mais également par la nécessité d’obtenir de volumes de prélèvement suffisamment importants. De plus la taille du cerveau de rat offre une meilleur résolution pour l’imagerie. Des rats âgés de 6-8 semaines sont utilisés, à un stade où la taille et la forme du crâne correspond à celle d'un atlas permettant de cartographier le cerveau de rat.
Évaluation pharmacologique de différentes approches thérapeutiques dans un modèle expérimental de cancer du côlon obtenus par inoculation de cellules tumorales par voie intra-cæcale chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
620 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des cellules tumorales sont inoculées dans le côlon par voie intra-cæcale, puis les souris reçoivent chimiothérapie, immunothérapie ou radiothérapie, avec un suivi par imagerie pouvant durer plusieurs mois. Le porteur décrit une douleur liée au développement des tumeurs et de possibles métastases, la mise à mort survenant au point limite ou après des prélèvements incompatibles avec la survie. Il présente la souris comme un 'passage obligatoire' avant l'humain et renvoie la découverte de nouveaux médicaments au 'long terme'.
Objectifs
Le projet consiste à évaluer les effets anti-cancéreux de différentes approches thérapeutiques comme la chimiothérapie, l’immunothérapie et la radiothérapie (en association ou non) dans un modèle expérimental de cancer du côlon chez la souris. Les animaux peuvent être déplacés vers une autre animalerie pour certains traitements et examens. Après implantation des cellules tumorales au niveau du colon, les souris seront suivies cliniquement pendant une période variable, allant de quelques semaines à plusieurs mois, en fonction de la croissance tumorale. Selon les cas, un suivi par imagerie (IRM ou bioluminescence) de la croissance tumorale pourra être réalisé. En cours de suivi, des prélèvements de sang pourront être réalisés. En fin d’expérience, les tumeurs pourront être prélevées pour analyses. D’autres prélèvements de tissus ou de sang pourront être effectués en phase terminale.
Bénéfices attendus
A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter le cancer du côlon, une pathologie humaine touchant plus de 43 000 personnes par an en France (dont environ 23 000 hommes et 20 000 femmes). Il est responsable de plus de 17 000 décès par an. Du fait de la cible thérapeutique, ce composé pourrait avoir aussi une application en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques.
Procédures
Les souris de ce projet pourront subir une l'anesthésie gazeuse, l'administration du produit et/ou des prélèvements sanguins, le transport de l’animalerie vers la plateforme d’imagerie (moins de 10 min), une contention lors de la radiothérapie ou de l’imagerie [Mesure de la bioluminescence (moins de 10 min) ou IRM (15 à 60 min)] et lors des suivis cliniques (2 à 3 fois/semaine, environ 1 min), une douleur liée au développement des tumeurs variable selon la localisation (Colon pour le site initial ou autres organes dans le cas de métastases).
Impact sur les animaux
Les souris de ce projet pourront subir un stress lié à l'anesthésie gazeuse, un stress post-opératoire, une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration du produit ou de prélèvements sanguins, un stress lié au transport de l’animalerie vers la plateforme d’imagerie (moins de 10 min), un stress lié à la contention lors de la radiothérapie ou de l’imagerie (Mesure de la bioluminescence, moins de 10 min ou IRM, de 15 à 60 min) et lors des suivis cliniques (2 à 3 fois/semaine, environ 1 min), une douleur liée au développement des tumeurs variable selon la localisation (Colon pour le site initial ou autres organes dans le cas de métastases).
Devenir
Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal Et/ou Euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués par le développement de la tumeur ou par le(s) produit(s)/ modèle chez les animaux.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le cancer colorectal. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 6-12 / par groupe.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.
Choix des espèces
La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit sur le cancer colorectal par injection de cellules tumorales dans le caecum, notamment de par leurs facilités d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs ressemblances avec l’espèce humaine. Selon l’origine des cellules implantées, le recours à des animaux immunodéficients pourra être fait. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Développement d’un modèle de tumeur du sein sur souris immunodéprimées pour l’étude de l’efficacité de nouveaux agents anticancéreux
- Recherche appliquée
- Cancers
144 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de cancer du sein leur sont greffées sous la peau du flanc, puis des anticorps anticancéreux sont injectés, avec suivi de la croissance de la tumeur jusqu'à un volume limite de 1600 mm³ déclenchant la mise à mort. Le porteur signale un stress à la contention, une douleur aux injections et une possible perte de poids liée à la tumeur. Il présente le passage in vivo comme nécessaire pour évaluer les anticorps sur un 'organisme entier', les bénéfices visant des cancers en 'impasse thérapeutique'.
Objectifs
Dans un contexte où de nombreux patients atteints de cancer résistant sont en manque de traitements efficaces, nous proposons dans un premier temps d’établir un modèle de greffe de cellules cancéreuses d'une lignée de cancer du sein présentant des caractéristiques récapitulant les cancers résistants retrouvé chez l'Homme. La mise en place de ce modèle va ensuite nous premettre dans un deuxième temps d'évaluer des anticorps ciblant une protéine impliquée dans le mécanisme de résistance ainsi que leurs versions couplés à des molécules cytotoxiques. Ces anticorps ont une activité anti-tumorale in vitro prometteuse que nous nous proposons de tester in vivo afin d'évaluer leur efficacité dans ce modèle de cancer en impasse thérapeutique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus concernent la santé humaine. En effet, il n’y a pas aujourd’hui de stratégies thérapeutiques pour les patients atteintes de cancer du sein avec tumeurs difficiles à traiter. L’étude de nouvelles stratégies va permettre de développer en phase préclinique de nouvelles molécules qui permettront au mieux de guérir les patients atteints de ces cancers, ou au moins de ralentir la progression tumorale.
Procédures
Injection (unique) des cellules cancéreuses sur souris vigiles en sous-cutanée dans le flanc droit : contention et geste de quelques minutes - Pousse tumorale : gêne si le volume tumoral atteint le point limite - Injection intrapéritonéale (unique), durée du geste : quelques secondes de composés thérapeutiques non toxiques - Pesée et mesure de tumeur : contention et geste de quelques minutes
Impact sur les animaux
Les animaux vont subir des injections sous cutanée qui vont générer du stress à la contention et une douleur courte à l’injection. Lors du traitement, les animaux vont subir un stress à la contention et une douleur courte lors de l’injection intrapéritonéale. La pousse tumorale peut engendrer de la perte de poids et des douleurs au niveau de la tumeur. Les pesées et mesures de tumeurs génèrent un stress lors de la contention et éventuellement de la douleur au niveau de la tumeur pendant la mesure avec le pied à coulisse.
Devenir
Tous les animaux seront sacrifiés à l'issue de chaque procédure, pour cause de volume tumoral hors-éthique (supérieur à 1600mm3).
Remplacement
Avant le passage chez l’animal, de nombreuses manipulations de caractérisation des différents anticorps ont été réalisées qui ont permis de sélectionner les deux candidats les plus efficaces. Le passage vivo est maintenant nécessaire pour l’évaluation du candidat médicament sur un organisme entier. Par ailleurs plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans la tumeur nécessite de travailler sur un organisme entier. Pour cette raison nous devons effectuer les études d’efficacité sur la souris.
Réduction
Les études pour l'établissement du modèle seront faites séquentiellement, ce qui donnera lieu à un GO/NO GO pour la mise en place de la deuxième phase impliquant l'étude des anticorps. Cette décision sera prise par le comité scientifique, les résultats seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été déterminé à l'aide d'un outil statistique et les procédures seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de façon statistiquement fiable. En conséquence, les études statistiques nous ont permis de déterminer qu'il nous faudra 144 animaux au total pour cette étude.
Raffinement
Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures, les animaux seront habitués à la manipulation en les pesant et en les contentionnant une fois par jour pendant 5 jours. Pour chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort au plus tard 56 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a pas été atteint avant ce délai. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour jeux). Si l'état des animaux le nécessite, des analgésiques seront utilisés.
Choix des espèces
Nous souhaitons évaluer nos traitements anticancéreux in vivo. l'utilisation d'une souche murine fortement immunodéprimée est donc nécessaire pour éviter les phénomènes de rejet des cellules ou des tissus implantés et favoriser la prise des greffes. Après l’utilisation d'une souche moins immunodéprimée sans prise tumorale de ce modèle, nous allons utiliser une souche de souris plus immunodéprimée. La souris est l’espèce la plus adaptée pour cet objectif est un modèle qui permet une prise tumorale avec de nombreuses lignées humaines. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.
Etude des gènes impliqués dans l’infiltration des cellules immunitaires dans les cancers du sein de type triple-négatif
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
300 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de cancer du sein triple-négatif humain leur sont injectées dans les tissus mammaires sous anesthésie, pour étudier le rôle du gène HLF dans l'infiltration des tumeurs par les cellules immunitaires. Le porteur annonce une douleur légère au réveil et une gêne liée à la croissance tumorale qu'il dit limitée, puis une mise à mort pour analyses post-mortem. Il affirme que seul 'un animal vivant, entier' permet d'étudier ces interactions et juge le recours à la souris 'indispensable', les applications thérapeutiques restant hypothétiques.
Objectifs
Le cancer du sein est devenu en 2020 le type de cancer le plus fréquent à l’échelle mondiale, avec plus de 2 millions de nouveaux cas diagnostiqués chez les femmes. Le cancer triple négatif (TNBC pour Triple-negative breast cancer) est l’une des formes les plus agressives et est associé à des rechutes plus précoces, plus fréquentes et à un mauvais pronostic vital. Il a été montré qu’un niveau élevé d’infiltrats lymphocytaires intra tumoraux après chimiothérapie chez les patients TNBC est corrélé à un excellent pronostic, suggérant que la surveillance immunitaire anti-tumorale joue un rôle crucial dans l’évolution des cancers TNBC. Grâce à des analyses bioinformatiques, nous avons identifié un gène dont l’expression pourrait inhiber l’attraction des cellules immunitaires dans les tumeurs et donc, potentiellement être utilisé comme cible thérapeutique dans le traitement de ce type de cancer. Nous avons supprimé ou diminué son expression et donc ses fonctions dans des lignées tumorales humaines TNBC. Des travaux réalisés in vitro nous ont confortés dans le rôle joué par notre gène d’intérêt dans l’infiltration des tumeurs par les cellules immunitaires et souhaitons maintenant déterminer son influence dans l'organisme. Pour se rapprocher du modèle humain, nous injecterons des cellules tumorales humaines TNBC parentales ou inactivées pour le gène étudié dans les lignées de souris immunodéficientes.
Bénéfices attendus
Ce projet transversal est issu d’observations cliniques indiquant que lorsque le gène HLF est surexprimé dans les cellules tumorales de patientes souffrant de cancer de type TNBC, une inhibition de la réponse immunitaire, en particulier de l’activation d'un sous-type de globules blancs est observée et corrélée à un mauvais pronostic. Des études in vitro en cours nous suggèrent que ce gène est bien impliqué dans la régulation de mécanismes moléculaires et cellulaires associés à l’attraction et la fonction de ces cellules blanches. L’étude dans l'organisme de l’infiltration des tumeurs TNBC exprimant ou non HLF est indispensable afin de confirmer le rôle joué par ce gène dans la réponse immunitaire anti-tumorale au sein du microenvironnement et en particulier dans la régulation des fonctions des cellules impliquées dans la lutte anti-tumorale. Ces connaissances fondamentales sont également essentielles pour passer à la phase suivante de recherche plus translationnelle et de déterminer si le gène HLF pourrait constituer une cible pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour ce type de cancer très agressif de mauvais pronostic. Des inhibiteurs de ce gène identifiés par criblage à haut débit sont actuellement en cours de caractérisation in vitro au laboratoire.
Procédures
Injection de cellules tumorales au niveau des tissus mammaires après anesthésie générale: une fois par animal, durée 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances seront liées aux injections: légère douleur au réveil après injection des cellules tumorales et à la gêne physique induite par la croissance des tumeurs: limitées car la taille des tumeurs sera très limitées. Ces tumeurs n'entraînent pas d'autres nuisances.
Devenir
Les souris seront euthanasiées pour analyses post-mortem sur tissus et organes.
Remplacement
Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le développement des tumeurs et leurs extensions éventuelles. Nous avons de solides résultats préliminaires in vitro qui suggèrent que notre gène d’intérêt joue un rôle important dans le recrutement et l’activation de certaines cellules blanches dans la lutte anti-tumorale dans les cancers du sein de type triple négatif. Il est indispensable pour notre projet de tester nos hypothèses in vivo dans un modèle de souris immunodéficientes greffées par des tumeurs humaines ayant conservé sa population de cellules blanches, ou dans un modèle murin humanisé pouvant être reconstitué avec des cellules humaines, et recevant des greffes de tumeurs humaines.
Réduction
Le nombre de souris par lot expérimental a été déterminé par calcul de puissance. Pour certaines expériences, une étape de sélection de lignées triple-négatif sauavges et déplétées pour le gène d'intérêt à étudier seront réalisées in vitro afin de réduire au maximum le nombre de souris. Les résultats obtenus seront exploités par des études statistiques.
Raffinement
Les animaux seront suivis quotidiennement pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un triatement. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. L'eau et la nourriture leurs sont proposés à volonté et lorsque les animaux présentent une faiblesse, un complément alimentaire adapté leur est proposé avec facilité d'accès.
Choix des espèces
Nous avons développé des lignées de cancer triple-négatif humaines inactivées ou non pour le gène d'intérêt qui seront injectées chez des souris immunodéficientes. Nous avons choisi l'espèce souris car ces souris immunodéficientes permettent d'étudier les tumeurs humaines sans rejet. Ces souris présentent également l’avantage d’avoir conservé la production des globules blancs sur lesquels nous avons centré notre projet. Le cancer étudié apparaissant chez les adultes, les animaux auront entre 7-15 semaines au début des procédures.
Evaluation de nouveaux outils thérapeutiques pour le traitement du cancer sur des modèles de xénogreffes dérivés de patients – EU 1/2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
2 352 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce volet se déroule dans le premier des deux établissements du projet, où une tumeur humaine leur est greffée avant l'administration d'un anticorps couplé à un métal radioactif et une imagerie nucléaire. Le porteur reconnaît des douleurs post-chirurgicales, une déplétion des cellules sanguines et un "sentiment d'isolement et absence de liberté d'expression" liés à l'hébergement individuel après l'injection radioactive. Il conclut que l'expérimentation animale est "requise", les données précliniques étant imposées par les autorités.
Objectifs
Malgré les efforts de la recherche et les nombreux traitements développés dans le cadre de la lutte contre le cancer, les cellules cancéreuses parviennent parfois à échapper aux thérapies de différentes façons. Afin de contourner ce problème, la mise au point de nouveaux outils ciblant des vulnérabilités tumorales clés couplés à la radioactivité est actuellement en plein essor. Cette technologie est appelée radiothérapie interne vectorisée (RIV). Elle consiste à lier un métal radioactif à un anticorps spécifique d'une cible biologique fortement exprimée dans la tumeur afin que l'anticorps puisse diriger et concentrer le métal dans les cellules cancéreuses. En fonction du métal choisi, il sera alors possible d'effectuer la détection de la tumeur ou bien de traiter les cellules tumorales via des rayonnements fortement énergétiques. Il a été démontré que la protéine N est fortement exprimée dans de nombreux cancers. Un anticorps spécifique de cette protéine a donc été développé afin de bloquer sa liaison avec ses récepteurs dans la cellule et ainsi conduire à leur mort. Cet anticorps est actuellement en cours d'investigation dans le cadre d'un essai clinique chez l'Homme. Dans le but de mieux sélectionner les patients exprimant fortement la protéine N, cet anticorps a été modifié par couplage à un métal radioactif émetteur de particules lumineuses afin de détecter sa présence par imagerie nucléaire. Ce nouvel outil devrait permettre d'inclure les patients sur la haute expression de la cible afin de les traiter avec l'anticorps seul (non radioactif) et ainsi déclencher la mort des cellules tumorales. Par ailleurs, les mécanismes d'échappement de la cellule tumorale concernant la protéine N étant déjà décrits, l'efficacité de l'anticorps non radioactif est donc limitée. C'est pourquoi l'ajout de la radioactivité est alors nécessaire afin de détruire les cellules cibles. Ce projet se déroulera au sein de deux établissements utilisateurs agréés (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Les patients pris en charge en clinique ne sont généralement pas testés pour l'expression de la cible, limitant ainsi les chances de réponse aux traitements. Dans ce présent projet, il est proposé de valider l'utilisation d'un test compagnon basé sur l'imagerie chez différents modèles tumoraux hautement représentatifs de la pathologie humaine afin de n'inclure que des patients exprimant un fort taux de la cible et d'augmenter l'effet anti tumoral des thérapies ciblées. Le but final est de réaliser une phase I clinique chez l'Homme à la fin de l'étude.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : -Interventions chirurgicales : greffe de tissu tumoral humain (1 ou 2 par animal en fonction de la greffe unilatérale ou bilatérale, durée : 5 minutes maximum). -Injection de produit en intraveineuse dans la veine caudale : 2 injections chez les souris incluses lors des expérimentations d'imagerie et de traitement. -Injection de produit en sous-cutanée : 2 injections prévues au moment de la greffe (peropératoire et post-opératoire). Des injections supplémentaires de produit analgésiant pourront être réalisées en cas de nécessité seulement et selon les conditions définies dans chacune des manipulations expérimentales. -Anesthésie gazeuse à l'isoflurane réalisée lors de la greffe, lors de chaque injection ou au moment de la mise à mort. -Imagerie Nucléaire : imagerie SPECT/CT dans les procédures d'imagerie. -Mesures du poids ainsi que du volume tumoral dans toutes les procédures (deux fois par semaine). La greffe de tissu tumoral humain sera réalisée dans l'EU1 tandis que tous les autres actes (injections de produit non radioactif, radioactif, imagerie nucléaire) seront effectués dans l'EU2. Les anesthésies gazeuses ainsi que les merures de poids et de volume tumoral pourront être effectuées dans les deux établissements utilisateurs.
Impact sur les animaux
Au sein de ce projet, plusieurs nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont attendus et cités ci-dessous : -douleurs générées post-intervention chirurgicale (incision réalisée sur la peau pour la mise en place du greffon), lors de la prise du greffon, lors de l'injection ou de l'application de produit d'analgésie ou d'antiseptsie, lors de l'injection des anticorps. -fatigue provoquée par la déplétion légère à modérée de cellules sanguines dans les jours suivants l'injection de l'anticorps radioactif, notamment lors de la détermination de la dose radioactive maximale tolérée par l'animal préalable à l'évaluation de l'efficacité thérapeutique de notre composé. -stress généré par les contentions lors des pesées, lors des mesures de la taille de la tumeur à l'aide du pied à coulisse ou encore lors de l'anesthésie générale effectuée pour la greffe, les injections ou avant la mise à mort de l'animal. -sentiment d'isolement et absence de liberté d'expression causés par l'hébergement individuel des animaux à partir de l'injection radioactive lors des expérimentations d'imagerie.
Devenir
Les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie générale à l'issue de l'ensemble des manipulations expérimentales qui constituent le présent projet. Cette méthode se justifie par la présence d'une greffe de tissu tumoral humain sur chacun des animaux ainsi que la réalisation d'une injection radioactive sur chaque souris inclue dans les expérimentations d'imagerie ou de thérapie. Les organes ainsi que le cadavre devront également être récupérés à la fin des procédures d'imagerie pour permettre un comptage de la radioactivité organe par organe. Un suivi de la courbe d'atteinte de points limites sera également nécessaire lors des études de l'efficicacité thérapeutique.
Remplacement
Les expérimentations in vitro sur cellules permettent de réaliser beaucoup d'études de mise au point de nouveaux traitements. Cependant, elles n'offrent pas la possibilité de prédire l'influence de l'environnement tumoral, l'éventuelle toxicité de la molécule sur l'organisme ou encore le devenir du candidat médicament après administration. Un remplacement par une approche entièrement réalisée sans animaux vivants n'est donc pas envisageable car il serait alors impossible d'évaluer l'ensemble de ces paramètres. De plus, l'acquisition de données précliniques sur animaux est imposée par les autorités pour les nouveaux médicaments. L'expérimentation animale est donc requise pour le présent projet.
Réduction
Afin de respecter la règle des 3R, le nombre d'animaux utilisés sera réduit au minimum. Le nombre de souris nécessaire à la réalisation de la greffe est réduit au minimum tout en prenant en compte le taux de reprise des modèles de tumeurs humaines lors de la décongélation. Lors de l'étape d'amplification du modèle tumoral humain, une greffe bilatérale sera effectuée sur les animaux afin de réduire leur effectif. Pour la détermination de l'efficacité thérapeutique de la molécule, les effectifs des animaux ont été calculés à partir d'un logiciel afin de tenir compte des analyses statistiques appliquées aux résultats expérimentaux. Les effectifs des animaux des autres procédures ne reposent sur aucune considération statistique mais seulement sur la prise en compte de la variabilité biologique possible entre les souris. Les expériences de ce présent projet ne seront pas répétées et chaque étape devra montrer de bons résultats avant le passage à l’étape suivante afin de limiter le nombre d'animaux strictement nécessaire.
Raffinement
Méthode utilisée pour réduire la douleur : -Anesthésie générale gazeuse. 1 anesthésie/animal lors de la greffe (5min). 1 anesthésie/ animal lors de chaque injection sous la peau ou dans la veine de la queue (5 min). 1 anesthésie/ animal lors de chaque acquisition d'imagerie nucléaire (45min) et 1 anesthésie lors de la mise à mort de l'animal. -Analgésie mise en place en cas de douleur chez l'animal, possibilité de renouvellement toutes les 24h. -Antisepsie : application cutanée en cas de blessure observée en zone d'hébergement ou en amont de l'incision de la peau lors de la greffe. Raffinement des conditions d'hébergement : afin d'atténuer l'effet de l'isolement causé par l'hébergement individuel suite à l'injection de la molécule d'imagerie, les cages seront obligatoirement transparentes et mises côte à côte dans le but de permettre un contact visuel des animaux et en enrichissement de la cage (jouet) sera ajouté.
Choix des espèces
Le taux de réussite du développement des modèles tumoraux établis à partir du tissu cancéreux de patients (PDX) est fortement lié au type de souris utilisé pour implanter le tissu tumoral. Les souris immunodéprimées sont couramment utilisées pour développer des modèles de PDX car celles-ci se caractérisent par l'absence de thymus, ce qui se traduit par un nombre considérablement réduit de cellules immunitaires fonctionnelles afin d'éviter que leur système immunitaire empêche le développement des cellules cancéreuses. Ces animaux présentent le meilleur taux de réussite pour la prise tumorale de tissu humain et seront donc utilisés dans ce projet. Les animaux ont entre 6 et 8 semaines lorsqu'ils sont inclus dans chacune des procédures car la prise tumorale est meilleure à cet âge.