Cancers

172 souris privées de système immunitaire vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur de gliome humain est greffée dans leur cerveau, suivie par imagerie de bioluminescence, puis un composé est injecté dans le cerveau et un anticancéreux administré par gavage, pour tenter de lever la résistance des glioblastomes au témozolomide. Le porteur invoque le secret d'un brevet pour ne pas décrire le composé et rapporte une sensibilisation de 45 % obtenue in vitro. Les souris sont tuées par perfusion de formol dans le cœur pour l'analyse histologique du cerveau.

Objectifs

Le glioblastome multiforme (GBM) est une tumeur cérébrale, à croissance rapide et dont le pronostic vital est mauvais puisque seulement 2% des patients survivent au-delà de 2 ans après le diagnostic. Les tumeurs sont constituées de multiples types cellulaires plus ou moins différenciés, parmi lesquels les rares cellules souches sont responsables de la résistance aux traitements anticancéreux et de la récurrence tumorale. La première phase du traitement consiste en une exérèse chirurgicale suivie de cycles répétés de radiothérapie et de chimiothérapie par prise orale de témozolomide (TMZ) permettant de ralentir la repousse tumorale. Le TMZ est l’anticancéreux le plus efficace à ce jour cependant les cellules cancéreuses deviennent résistantes au TMZ au fur et à mesure du traitement. Il n’existe pas d’alternative efficace au TMZ. Toute avancée permettant d’identifier des cibles moléculaires et cellulaires visant à réduire la capacité des cellules tumorales à résister au TMZ sera donc bénéfique pour les patients. Nous proposons d’utiliser un composé qui cible une molécule endogène des tumeurs cérébrales. Nous avons montré in vitro que ce composé et la stratégie utilisée permettaient de sensibiliser jusqu’à 45 % les cellules de gliomes à l’anticancéreux TMZ. Notre stratégie faisant l’objet d’un dépôt de brevet, nous ne pouvons pas donner plus de détail à l’heure actuelle car la plus stricte confidentialité est de rigueur. Nos données obtenues in vitro sur les lignées cellulaires de gliomes U251, U87 et T98G sont très encourageantes et nous proposons maintenant d’évaluer in vivo la capacité de notre traitement à sensibiliser les tumeurs au TMZ. Pour cela, le développement de tumeurs orthotopiques de gliomes, générées par injection de cellules tumorales humaines dans le cerveau de souris immunodéficientes est nécessaire (procédure expérimentale 1). Le développement tumoral sera suivi par imagerie de bioluminescence (procédure expérimentale 2) et le composé administré en intracérébroventriculaire (ICV) dès détection de la tumeur (procédure expérimentale 3). Les souris seront ensuite traitées par gavage avec le TMZ (procédure expérimentale 4) et suivies chaque semaine en bioluminescence pour mesurer le développement tumoral (procédure expérimentale 2). Lorsque les points limites seront atteints, les souris seront sacrifiées par perfusion intracardiaque de formol à 10 % (procédure expérimentale 5) et les cerveaux récoltés pour analyse histologique.

Bénéfices attendus

Le témozolomide (TMZ) est l’anticancéreux le plus efficace à ce jour pour traiter le glioblastome multiforme (GBM), cependant les cellules cancéreuses deviennent résistantes au TMZ au fur et à mesure du traitement. Il n’existe pas d’alternative efficace au TMZ. Toute avancée permettant d’identifier des cibles moléculaires et cellulaires visant à réduire la capacité des cellules tumorales à résister au TMZ sera donc bénéfique pour les patients. Nous proposons d’utiliser un composé qui cible une molécule endogène des tumeurs cérébrales. Nous avons montré in vitro que ce composé et la stratégie utilisée permettaient de sensibiliser jusqu’à 45 % les cellules de gliomes à l’anticancéreux TMZ.

Procédures

- implantation de tumeurs en intracérébrale (15 minutes par souris, 1 seule fois) ; - imagerie bioluminescente (10 minutes par souris,1 fois par semaine durant toute la pousse tumorale) ; - injection intracérébrale (10 minutes par souris, 1 seule fois lorsque la tumeur est bien établie) ; - gavage des souris (1 minute par souris, 1 fois par jour un semaine sur 2)

Impact sur les animaux

- Changement de l'état corporel (poids, pelage, écoulement oculaire/nasal) ; - Changement de comportement (posture, mobilité, automutilation) ; Comme décrit dans les points limites des procédures, ces effets indésirables sont cotés et l'animal est mis à mort s'il montre des signes de soufrances.

Devenir

Les animaux de chaques tâches sont gardés en vie à la fin des procédures 1, 2, 3 et 4 afin de pouvoir participer à la procédure suivante. Les animaux sont mis à mot à la fin de la procédure 5 car des analyses histologiques sont effectuées sur les cerveaux de chaque animal par la suite.

Remplacement

Nous avons montré in vitro sur des cellules de gliomes humains que le composé et notre stratégie sont efficaces. Nous continuons actuellement in vitro sur ces cellules toutes les études nécessaires à la caractérisation fine des mécanismes à l’origine de cette sensibilisation. Afin de déterminer si le traitement pourrait être utilisé chez l’Homme, il est nécessaire de le tester dans un organisme vivant. La souris NUDE est une souris mutante athymique qui présente une défaillance des lymphocytes T. La souris NUDE développe des tumeurs après greffe orthotopique de 200 000 cellules de U251. La souris NOD/SCID présente une défaillance des lymphocytes T et B et développe plus facilement des tumeurs à partir de petites quantités (1000) de cellules souches issues d’un gliome humain. Ces deux modèles murins sont immunodéficients ce qui limite le rejet des greffons de cellules de gliomes humains.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés afin d’obtenir des résultats significativement exploitables et valides.

Raffinement

Le composé et la stratégie ont été testés in vitro sur des cultures cellulaires. Ces expériences nous ont permis de déterminer des doses efficaces qui seront injectées in vivo. Toutes les procédures expérimentales seront réalisées dans un établissement autorisé et en stricte conformité avec le comité local de protection des animaux, les lignes directrices de l'UE (directive 2010/63/UE) et le Comité national français (2010/63) . Les souris utilisées seront des souris mutantes NMRI NUDE et NOD SCID. L’immunodéficience de ces souris permet le développement sans rejet des xénogreffes de cellules de gliomes humains. Les animaux seront hébergés et surveillés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément. La conception et l’application des procédures expérimentales, le soin et l’hébergement des animaux seront effectuées par du personnel compétent et formé. La plus grande vigilance sera apportée aux animaux afin de prévenir, minimiser et/ou abroger la souffrance et le stress. Dans ce but, des points limites spécifiques à chaque expérimentation seront clairement établis afin de prendre les mesures nécessaires au soulagement ou à l'arrêt de de la souffrance de l'animal. De plus toutes les procédures possiblement traumatisantes sont effecturées sous anesthésie gazeuse, avec une gestion de la douleur adaptée à chaque situation (utilisation d'analgésique).

Choix des espèces

Les souris utilisées seront des souris mutantes NUDE et NOD/SCID. La souris Nude est athymique et présente une défaillance des lymphocytes T. La souris NOD/SCID présente une défaillance des lymphocytes T et B. Ces propriétés rendent les souris immunodéficientes ce qui limite le rejet des greffons de cellules de gliomes humains. Les animaux seront utilisés "à l'âge adulte" c'est à dire à partir de l'âge de 2 mois, les glioblastomes étant des tumeurs survenant à l'âge adulte.

24 souris privées de système immunitaire vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de deux tumeurs sous la peau, une injection intraveineuse d'une sonde fluorescente et une injection intratumorale d'un candidat médicament anticancéreux ciblant le récepteur TLR3, suivies de séances d'imagerie sous anesthésie à 24, 48 et 72 heures. Le porteur affirme avoir déjà vérifié l'absence de toxicité et l'efficacité aux mêmes doses, et présente l'étude comme une preuve de concept destinée à préparer un essai clinique chez l'homme. Sur le remplacement, il conclut que "seul un modèle animal" permet d'observer l'apoptose dans un "organisme" complet.

Objectifs

=> RATIONNEL : Le TLR3 est un récepteur de l'immunité permettant au corps de se protéger des infections virales. Le concept du TLR3 comme cible anticancéreuse existe depuis près de 30 ans, même si son mécanisme exact n’est connu que depuis peu. L’activation de ce récepteur entraine une mort programmée, appelée apoptose, spécifique des cellules cancéreuses (pas des cellules normales), ainsi qu’une inflammation locale ayant un effet antitumoral. La conjugaison de ces deux mécanismes d’action induit une autovaccination à long terme contre la tumeur. Une nouvelle famille d’activateurs de ce récepteur a récemment été découverte (dont le candidat médicament de cette étude), homogène, actif, spécifique et très peu toxique. => BUT DU PROJET : L’objectif de cette étude est d’utiliser une sonde fluorescente afin de suivre le mécanisme d’apoptose cellulaire induit après administration du candidat médicament en injection locale, ainsi que sa spécificité pour les cellules tumorales exprimant le récepteur TLR3, in-vivo. Ce mécanisme sera regardé dans la souris par une analyse non invasive par imagerie de fluorescence sur tous les organes. Cette analyse quantitative au cours du temps sera effectuée grâce à un outil innovant de tomographie de fluorescence. Pour analyser la spécificité de l’apoptose des cellules tumorale exprimant le TLR3 (et non sur les organes ou tissus sains), induite par le candidat médicament, ce dernier sera injecté dans deux tumeurs (flanc-droit / flanc-gauche), avec les modèles exprimant le TLR3 sur un flanc et celui ne l’exprimant pas sur le flanc opposé. Chacune de ces tumeurs sera traitée par injection locale du candidat médicament à des doses connues comme efficaces dans ces modèles. Une injection a temps unique du candidat médicament sera effectuée, afin de suivre ses effets dans le temps. La sonde fluorescente marquant spécifiquement les cellules apoptotiques sera utilisée par injection intraveineuse 2h avant le premier point de cinétique, pour un signal durant jusqu’à 3 jours post-injection. Les analyses de fluorescence quantitatives sur l'ensemble du corps de l'animal (en 3D), seront effectuées sur animaux vivants sous anesthésie gazeuse respectivement à 24h, 48h et 72h après traitement. Afin de dissocier l’effet d'inflammation de l’effet d’apoptose induit par le candidat médicament, les souris utilisées ne posséderont pas de système immunitaire.

Bénéfices attendus

Cette étude, comprenant une seule procédure, permettra de déterminer le mécanisme d’action d’apoptose spécifique des tissus cancéreux du candidat médicament dans un modèle physiologique complet et d’en apprécier la spécificité par rapport aux organes et tissus sains. Il s’agit d’une étude de recherche translationnelle, de preuve de concept et prospective, permettant de poser les bases d’une étude clinique (dans des conditions d’injection locales), et de déterminer les meilleurs biomarqueurs d’engagement de la cible ainsi que d’en définir une première approche qualitative et cinétique.

Procédures

Trois injections sont prévues dans cette expérience : 1/ La greffe tumorale bilatérale sous-cutanée (sous anesthésie gazeuse) – env 5 minutes par souris 2/ L’injection de la sonde fluorescente en intraveineuse (sous anesthésie gazeuse) – env 5 minutes par souris. 3/ Le traitement en injection intratumorale et sous-cutané péri-tumorale (sous anesthésie gazeuse) – env 5 minutes par souris. A ceci, s’ajoute l’analyse de la fluorescence sur l'ensemble des organes et tissus des souris, qui est un acte non invasif et non douloureux, mais qui nécessite cependant l’immobilité complète de l’animal par une anesthésie sous isoflurane et une contention empêchant tout mouvement.

Impact sur les animaux

# Des effets indésirables pour les animaux pourraient venir des modèles ou des traitements en eux-mêmes => L'absence de toxicité et l’efficacité du candidat médicament ont déjà été analysée sur ces mêmes modèles aux doses utilisées dans cette expérience avec d’excellents résultats. # Les actes d’injection (sonde fluorescente et candidat médicament) induisent une douleur ainsi qu’un stress => une anesthésie gazeuse sera effectuée lors de ces actes. # L’analyse de fluorescence n’est pas un acte douloureux, cependant il nécessite l’immobilité complète de l’animalsous anesthésie gazeuse et une contention empêchant tout mouvement. # La croissance tumorale (pouvant durer env 2 à 3 semaines) peut induire de nombreux effets indésirables (nécrose, perte de poids, mobilité réduite, stress, comportement anormal…). => ici les tumeurs seront analysées à une très faible taille, ce qui devrait limiter la majorité de ces effets indésirables. Cependant, une grille de score basée sur nos expériences précédentes nous permettra d’anticiper toute souffrance des animaux. De plus, la moindre plaie interférant avec les mesures de fluorescence, aucune souris ayant des plaies ou signes de nécroses ne sera incluse dans ces expériences.

Devenir

Tous les animaux ne pouvant pas rentrer en analyse (absence de croissance tumorale, présence de plaies interférant avec l’analyse ou autre critère éthique), seront mis à mort. Tous les animaux analysés seront mis à mort après la dernière analyse. En effet, aucun de ces animaux ne pourra être réutilisé. Cette mise à mort s’effectuera par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse.

Remplacement

Seul un modèle animal permettra d’analyser des phénomènes d’apoptose indésirables au niveau des organes et tissus sains. Les preuves de concept in-vitro et ex-vivo de ce mécanisme d’action ont déjà été effectuées avec succès. A présent, un modèle préclinique complexe et physiologique est nécessaire pour permettre de poser les bases d’une étude clinique « first in human » (dans des conditions d’injection locale), et de déterminer les meilleurs biomarqueurs d’engagement de la cible ainsi que d’en définir une première approche qualitative et cinétique.

Réduction

Cette étude est menée dans un but prospectif. Ainsi l’utilisation de 5 souris par groupe et par modèle est considérée comme suffisant pour une validation de preuve de concept. Il est à noter que la greffe des deux tumeurs différentes (sur les deux flancs de la même souris), permet de réduire de moitié le nombre d’animaux nécessaires à cette étude sans compromettre les résultats scientifiques. Cette expérience s’effectue sur souris vivantes avec des analyses au cours du temps par des techniques douces d’imagerie, ce qui évite d’avoir à procéder à des actes chirurgicaux lourds ainsi qu’à des mises à mort de grands nombres d’animaux par des méthodes conventionnelles. Elle constitue en soit une réduction du nombre des animaux pour répondre à la question posée.

Raffinement

La mise en place d’une grille de score et d’une fréquence de surveillance des animaux adaptée à l’étude, permettra d'éviter toute souffrance animale. La surveillance des animaux sera effectuée deux fois par semaine avec une analyse scorée du comportement animal, du poids corporel et du volume tumoral. Les souris seront greffées sur chaque flanc en injection sous anesthésie gazeuse. Il est à noter que les deux modèles de tumeurs ont des comportements et temps de croissance très similaire. La très petite taille des tumeurs attendue dans cette étude devrait permettre à la fois une bonne analyse de la fluorescence ainsi qu’une souffrance et une gêne physique minimale pour l’animal. Cette expérience s’effectue par imagerie de fluorescence sur souris vivantes avec des analyses au cours du temps, ce qui évite d’avoir à procéder à de nombreux actes chirurgicaux et mises à mort d’animaux, avec des méthodes conventionnelles. Elle constitue en soi un Raffinement des méthodes pour répondre à la question posée. L’imagerie par fluorescence est une analyse « douce », non invasive et non douloureuse mais nécessitant l’immobilité de la souris pendant l’acquisition des données. Pour réaliser une analyse, l'animal est donc placé sous anesthésie gazeuse et est ensuite placé dans une cassette de contention pour éviter tout mouvement. Cette dernière est ensuite glissée dans la chambre noire de l’appareil. L’acquisition dure environ 5 minutes. De l’air chauffé circule dans l’appareil et permet de maintenir la température de l’animal. Ce temps court d’analyse, permet à l’animal une récupération rapide et autorise de répéter les acquisitions selon la cinétique décidée. Les animaux sont ensuite placés sur un plateau chauffant avec une lumière chauffante pour qu'ils se réveillent rapidement dans de bonnes conditions.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère bien caractérisé pour les études pharmacologiques permettant de démontrer dans un modèle vivant que les organes et/ou tissus normaux ne sont pas touchés par ces mécanismes d’action pouvant induire une toxicité du candidat médicament. En plus d’être un modèle pertinent, la souris est un modèle de petite taille, facile à manipuler et génétiquement bien caractérisé. Qui plus est, il existe aussi de nombreux outils (souris sans système immunitaire, appareillage de fluorescence adapté...), qui permettent d'étudier précisément les différents mécanismes d’action de thérapies chez cette espèce. Une souche de souris sans système immunitaire sera utilisée pour analyser uniquement l’effet d’apoptose indépendamment des mécanismes du candidat médicament sur le système immunitaire qui pourraient interférer. De plus, s'agissant d'une souche de souris sans poils, l'acquisition de fluorescence s'en trouvera facilitée. Des souris sans système immunitaire de 7 semaines seront utilisées. A cet âge, les souris sont physiologiquement adultes (ce qui est nécessaire dans notre étude en terme d’assimilation, maturation des organes...) etc.

70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont injectées sous la peau, puis une partie reçoit des traitements par gavage cinq jours par semaine et par injection intrapéritonéale deux fois par semaine, la tumeur pouvant atteindre 1 000 mm³. Le porteur décrit une gêne légère par geste dont l'accumulation devient modérée, et cherche à confirmer in vivo que bloquer le facteur CTGF limite l'agressivité tumorale dans le cancer du rein. Les retombées cliniques annoncées, de nouvelles combinaisons de médicaments, restent au conditionnel, et le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les interactions entre compartiments cellulaires.

Objectifs

Les tumeurs du rein sont très riches en vaisseaux sanguins. Une des stratégies thérapeutiques est de bloquer la formation de ces vaisseaux par des traitements anti-angiogéniques. Malheureusement, les patients développent des résistances au traitement et la maladie progresse inéluctablement. Notre équipe cherche à comprendre les mécanismes moléculaires qui expliquent l’apparition de résistance chez les patients atteints de cancer du rein à cellules claires. Nos résultats in vitro montrent que les cellules libèrent des molécules en réponse au traitement. Parmi ces molécules, nous avons identifié le facteur de croissance des tissus conjonctifs (CTGF), et nous avons montré que CTGF participe à l’agressivité tumorale. Par conséquent, nos résultats suggèrent que le ciblage de CTGF pourrait représenter une stratégie thérapeutique innovante. Nous souhaitons confirmer in vivo que bloquer CTGF permettrait de limiter l’agressivité tumorale voir induire la mort des cellules tumorales. Cette étude nous permettra de conclure sur la pertinence de l’utilisation d’un anticorps anti-CTGF dans le traitement du cancer du rein à cellules claire métastatique.

Bénéfices attendus

La validation de nos résultats in vitro sur un modèle in vivo nous permettrait dans l’avenir de développer des stratégies thérapeutiques ciblant CTGF dans le traitement des RCC. Cette démarche fondamentale et translationnelle permettra d’améliorer l’efficacité des drogues par l’identification de nouvelles stratégies thérapeutiques / biomarqueurs de résistances. Un transfert vers la clinique avec de nouvelles voies thérapeutiques incluant des combinaisons innovantes de médicaments serait l'accomplissement de ce projet.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à des injections sous-cutanées de cellules tumorales (une injection par souris). Ces souris seront divisées en 2 groupes. Un groupe ne subira aucun traitement, seul un suivi de la croissance tumorale sera réalisé. Pour le second groupe, lorsque la tumeur atteindra un volume suffisamment important, des traitements seront administrés aux souris en gavage et/ ou en injection intrapéritonéal. Le traitement par gavage sera réalisé 5 fois par semaine et le traitement en intrapéritonéal 2 fois par semaine. Ces injections, que ce soit de cellules tumorales ou du traitement administré, ne dureront que quelques secondes chaque fois. Le traitement par gavage, réalisé à l’aide d’une canule de gavage est également une procédure très rapide. Enfin, aucune autre intervention ne sera réalisée sur l’animal vigil ou endormi. Les souris seront monitorées quotidiennement afin d’assurer une bonne gestion de la douleur. Chacune des souris de ce projet sera suivie à l’aide d’une fiche de score adaptée à son traitement puis mise à mort à la fin de la procédure expérimentale ou si l’animal atteint un point limite. Si aucun point limite n’est rencontré, les traitements auront lieu durant 4 à 5 semaines jusqu’à atteindre un volume tumoral de 1000 mm3.

Impact sur les animaux

En ce qui concerne les injections sous-cutanées de cellules tumorales ainsi que les gavages sont associés à une gêne voir douleur de type légère. Ces actes expérimentaux ne nécessitent cependant aucune anesthésie. Ces cellules tumorales ne metastasent pas. Les animaux seront mis à mort suffisamment tôt afin d'éviter l'apparition de nécroses au niveau des tumeurs. Néanmoins, s'agissant d'un protocole impliquant i) l'injection de cellules tumorales, et ii) des traitements par gavage (5 jours /7) et en intrapéritonéal (2 fois par semaine), qui, individuellement, vont générer une douleur légère et du stress mais dont l’accumulation par animal entraine une nuisance globale modérée.

Devenir

Le prélèvement des tumeurs nécessitera la mise à mort des souris.

Remplacement

Aucune méthode alternative ou modèle in vitro n’existe pour mimer les interactions qui existent entre les différents compartiments cellulaires (endothelial, epithelial, stromal, etc).

Réduction

Avant de passer au modèle in vivo, toutes nos expériences ont été préalablement validées in vitro. Nous avons également effectué une large recherche bibliographique. Les effectifs ont été choisis afin d’obtenir des résultats significatifs avec le nombre de souris minimum. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous nous baserons sur les données de la littérature et sur nos résultats antérieurs pour les doses administrées de composés pharmacologiques. Le nombre minimum de souris est établi à 10 par groupe pour être statistiquement significatif (en nous basant sur le fait que les traitements expérimentaux induiront une diminution de la prise/croissance tumorale d’au moins 20%). Enfin, nous utiliserons un test statistique paramétrique (test Anova) afin de pouvoir réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de données statistiquement exploitables statistiquement.

Raffinement

Pour limiter la douleur modérée que notre procédure expérimentale pourrait induire, nous avons établi une grille d’observation visant à définir les points limites précoces à partir desquels l’expérience sera arrêtée et qui indique les mesures que nous prendrons à l’apparition des premiers signes de douleur ou de perte de poids. D'autre part, en plus du personnel de l’animalerie, un suivi sanitaire tri-hebdomadaire puis 5/7 jours (à partir du début des traitements) sera réalisé par les membres de l’équipe (expérimentateurs) à l’aide d’une feuille de score adaptée au modèle (Annexe 1). La fréquence de ces examens sera intensifiée en fonction des symptômes relevés sur un animal jusqu'à la disparition du problème ou la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

Les modèles murins sont les modèles les plus répandus pour étudier l’effet de drogue ou traitement par anticorps sur la croissance tumorale. Notons également que cette espèce est facilement manipulable. Dans ce projet, nous utilisons des souris immunodéficientes ce qui nous permettra d’utiliser des modèles humains de RCC. Les souris utilisées seront de jeunes femelles adultes agées de 7 à 8 semaines.

1 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans le cerveau, le sein, le pancréas ou l'ovaire, puis des examens IRM répétés avec injection d'agents de contraste au gadolinium, avant une mise à mort par dislocation cervicale et le prélèvement d'organes pour doser le métal. Le porteur présente l'IRM comme "non invasive et atraumatique" et affirme qu'elle réduit le nombre d'animaux en permettant un suivi répété. Il indique que l'étude "ne peut se faire que sur un organisme vivant entier".

Objectifs

L’IRM est une technique qui est maintenant reconnue et largement utilisée en routine clinique. C’est une méthode qui utilise des champs magnétique et qui n’utilise ni rayons X ni rayonnement ionisants. Elle est non invasive et atraumatique. Pour un examen IRM les animaux sont endormis (anesthésie gazeuse sous isoflurane1.5%) afin d’éviter tout mouvement dans l’imageur qui provoque du flou sur les images et les rend ininterprétables. Leur fréquence respiratoire est contrôlée tout au long de l’acquisition des images (à l’aide d’un capteur placé sous la cage thoracique) Plusieurs étapes seront nécessaires afin d’étudier la réponse de l’agent de contraste pour détecter le carcinome ovarien : 1) Induction des modèles tumoraux. 2) Etude de la perfusion tumorale (vascularisation de la tumeur et perméabilité des vaisseaux) au cours du développement de la tumeur. Il s’agit de suivre l’intensité du signal au cours du temps (1heure) après injection de DOTAREM (agent utilisé en routine clinique) ou d’autres agents de contraste (4 différents). Un traitement mathématique de la courbe permet d’extraire des paramètres quantitatifs de perfusion afin de déterminer le stade de développement de la tumeur où elle est le plus vascularisée. 6 stades de développement seront utilisés au maximum (J2, J7, J14, J21 et J28 et J35 en fonction du modèle tumoral). Ce sont les mêmes souris que l’étape 1. Les agents de contraste (à base de lanthanides) qui seront synthétisés partent tous de la structure des agents commerciaux utilisés en routine clinique. Ils ont donc été approuvés pour leur mise sur le marché. Notre projet ne nécessite dons pas d’étude in vitro au préalable. Les agents de contraste seront injectés par voie intraveineuse. L’IRM est une technique qui est maintenant reconnue et largement utilisée en routine clinique. Cette une méthode qui utilise des champs magnétiques et qui n’utilise ni rayons X ni rayonnements ionisants. Elle est non invasive et atraumatique.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est d’identifier le stade tumoral où la tumeur sera la plus vascularisée et les vaisseaux les plus perméables afin d’optimiser le passage de l’agent de contraste dans la tumeur pour un diagnostic le plus précoce possible. Ce projet devrait permettre d'améliorer la connaissance sur le développement d'une tumeur en terme d'hétérogénéité tissulaire et d'angiogénèse. Il devrait permettre de fournir une fenêtre temporelle là où la tumeur est le plus vascularisée et les vaisseaux suffisamment perméable pour laisser passer des agetns de contraste pour un diagnostic précoce ou des molécules thérapeutique.

Procédures

Imagerie par résonance magnétique. 1H par acquisition. Implantations de cellules tumorales en orthotopqiue (cerveau, sein, pancréas, ovaire)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont liés à la croissance tumorale et feront l'objet de points limites.

Devenir

tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure par dislocation cervicale. Certains organes (rein, foie, rate) seront prélevés pour dosage de gadolinium par spectroscopie

Remplacement

le modèle animal est fondamental dans notre cas, puisque l’étude préclinique de croissance tumorale ne peut se faire que sur un organisme vivant entier.

Réduction

le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. L’IRM pour le suivi des tumeurs permet aussi de réduire le nombre d’animaux puisque l’intérêt de l’IRM réside dans le fait qu’une même souris peut être observée plusieurs fois dans le temps. Les mêmes animaux seront suivis tout au long de la procédure d'imagerie au temps (J2, J7, J14, J21, J28, J35 post induction tumorale).

Raffinement

Les animaux seront hébergés 5 par cage et en portoir ventilé. Un enrichissement est mis en place avec des tubes, du côté et des petites maisonnettes en plastique. Ils sont observés quotidiennement scrupuleusement afin de respecter leur bien-être et d’éviter au maximum la douleur au moment de l’expérimentation. Les animaux sont anesthésiés pour les actes IRM. De plus, des points limites prédictifs ont été mis en place.

Choix des espèces

- La souris est un modèle adapté à notre imageur IRM (taille de l’ouverture). - Le modèle murin présente de nombreux avantages : nombreuses lignées génétiquement modifiées disponibles, existence de lignées immuno-compromises autorisant la greffe de cellules tumorales humaines (ici utilisation de souris Nude pour faciliter la prise de greffe tumorale dans le cas d’injection de cellules humaines). - L’administration de l’agent de contraste et son efficacité étant dépendantes de la physiologie, l’utilisation du modèle animal in vivo reste indispensable pour le présent projet Des souris femelles adultes de 8 semaines ; âge auquel tous les organes sont arrivés à maturation. Ce qui est important pour l’élimination des agents de contraste (en particulier les reins)

912 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour porter un système immunitaire humain, elles reçoivent une greffe de mélanome ou de cancer du pancréas, jusqu'à huit prélèvements de sang et des injections d'anticorps, pour tester des immunothérapies. Le porteur indique que les animaux peuvent développer une réaction du greffon contre l'hôte et être tués au plus tard 150 jours après reconstitution. Il affirme que "l'organisme animal entier reste le modèle le plus complet" pour évaluer ces thérapies.

Objectifs

Ce projet vise à étudier l’efiicacité antitumorale de d’anticorps thérapeutqiues chez la souris présentant un système immunitaire humain. La première procédure permettra de déterminer la prise tumorale de modèles de mélanome et de cancer du pancréas dans ces souris, avant de déterminer l’effet des anticorps thérapeutiques sur la tumeur et les cellules immunitaires.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à moyen terme. Ce projet permettra de développer et caractériser des modèles animaux porteurs de tumeurs afin de les utiliser pour tester l’efficacité antitumorale de composés anticancéreux en développement. Nous l’avons focalisé sur le mélanome et le cancer du pancréas, deux indications avec peu/pas de solutions thérapeutiques. Le projet va permettre de développer en phase préclinique des composés qui permettront au mieux de guérir les patients atteints de ces cancers, au pire de ralentir la progression tumorale. Les composés dont l’efficacité aura été démontrée sur les modèles de souris humanisées devront encore passer par une phase préclinique règlementaire avant une première administration chez l’homme. Les bénéfices sont attendus à moyen terme.

Procédures

-Implantation de tumeur en sous-cutané sur animal vigile (degré de gravité léger) -prélèvement de sang dans la veine caudale sur animal vigile sous contention (degré de gravité modéré), pour un maximum de 8 prélèvements espacés de 3 semaines -injection intrapéritonéale de composés thérapeutiques non toxiques (degré de gravité léger), pour un maximum de 4 injections espacées de 7 jours

Impact sur les animaux

- Perte de poids constatée : plus de 10% non améliorée par ajout de nourriture humide en maximum 24h ; plus de 20% mise à mort de l’animal - Injection sous cutanée de cellules tumorales : quelques minutes, degré de gravité léger - Prélèvement de sang dans la veine caudale sur animal vigile sous contention (degré de gravité modéré), pour un maximum de 8 prélèvements espacés de 3 semaines - Injection intrapéritonéale de composés thérapeutiques non toxiques (degré de gravité léger), pour un maximum de 4 injections espacées de 7 jours - douleur caudale si inflammation du point de prélèvement 2h maximum- Risque d'apparition de GVHD au delà de 6 mois post reconstitution complète: les animaux seront mis à mort maximum 150 jours post reconstitution

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure. La mise à mort est justifiée à la procédure 1 car les souris auront atteint un point limite. Pour la procédure 2, la mise à mort est justifiée soit par le besoin de réaliser des prélèvements, soit par l'atteinte d'un point limite.

Remplacement

Les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes lymphoïdes (la rate, les ganglions etc), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). Si certaines caractéristiques individuelles sont étudiées in vitro/ex vivo, l’impact et l’efficacité de thérapies destinées à la clinique ne peuvent être pleinement évaluées que dans un système complet. A ce jour, l’organisme animal entier reste le modèle le plus complet.

Réduction

Les procédures seront faites sur le nombre minimal de souris nécessaires permettant de conclure de façon fiable statistiquement ; Les expériences sur les différents modèles seront réalisées en séquentiel, les résultats seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences, afin de réduire autant que possible le nombre de souris utilisées

Raffinement

Avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Toutes les précautions seront prises pour détecter et minimiser la souffrance, la douleur et le stress des animaux (observation quotidienne, pesée des animaux, traitement antalgique si besoin).

Choix des espèces

Nous souhaitons travailler avec des animaux génétiquement modifiés, présentant un système immunitaire natif fortement immunodéprimé, permettant la reconstitution d’un système immunitaire humain fonctionnel. Les souris sont actuellement l’espèce permettant le mieux cette reconstitution. Nous avons choisi pour ce projet deux types de souris,nous souhaitons travailler sur ces deux types de souris car elles ne sont pas reconstituées de la même manière. Nous avons choisi des animaux âgés de 13 et 16 semaines. Ces âges sont les âges recommandés par les fournisseurs comme étant optimaux pour l’implantation tumorale.

240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection intraveineuse d'un conjugué anticorps-médicament puis huit prélèvements de sang sur vingt-et-un jours sous anesthésie, pour mesurer la durée de présence de la molécule anticancéreuse dans le sang. Le porteur indique que les organes seront prélevés après la mise à mort afin d'éviter une seconde expérience de biodistribution. Il justifie le choix du rat plutôt que de la souris par la "nécessité" de prélèvements répétés et par son statut de modèle "obligatoire" pour les études réglementaires.

Objectifs

Les modèles animaux permettent l’étude des effets positifs et négatifs de drogues anticancéreuses à l’échelle de l’organisme. Ces études précliniques sur l’animal permettent la validation de thérapies anticancéreuses plus efficaces et moins toxiques pour le traitement des patients. Les études proposées visent à determiner la durée de présence dans le sang de l'animal (pharmacocinétique) qui est étroitement corrélé avec son activité anti-cancéreuse. L'étude proposée vise à évaluer la pharmacocinétique de conjugués anticorps-médicaments innovant développés pour le traitement de cancers solides ne possédant à ce jour aucun traitement de thérapie ciblée. Connaître ce paramètre pour un composé permet de déterminer sa fenêtre d'efficacité et donc de déterminer la dose à utiliser. L'étude proposée porte sur différents variants d'un conjugué anticorps-médicament dont l'anticorps est validé par la FDA (Food and Drug Administration) et dont le médicament est un dérivé de molécule approuvé par la FDA. Ces conjugués anticorps-médicament sont en développement pre-clinique et l'étude vise à séléctionner le composé possédant le meilleur profile pharmacocinétique afin de le qualifier pour un développement pré-clinique plus poussé dans l'objectif de l'évaluer en clinique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à moyen terme. Ce projet permettra d’étudier l’influence de l’agent masquant sur le profil pharmacocinétique du conjugué anticorps-médicament formulé en fonction de sa taille et de la molécule cytotoxique attachée. Ces études sont essentielles pour la sélection du ou des ADC (antibody-drug conjugate, conjugué anticorps-médicament) ayant la meilleure fenêtre thérapeutique, et de sélectionner le candidat médicament pour les études précliniques réglementaires avant une première administration chez l’homme.

Procédures

- une seule injection de molécule thérapeutique dans la veine caudale. -prélèvement de sang dans la veine saphène. 8 prélèvements au total sur une durée de 21 jours. Les prélèvements sont effectués sur des animaux anesthésiés avec un anesthésie/analgésie adaptée.

Impact sur les animaux

- La dose administrée dans cette étude étant significativement plus faible que la dose maximum tolérée et les traitement étant stables en circulation, pas de nuisance concernant la perte de poids n'est attendue. - Injection unique d’un composé thérapeutique dans la veine caudale (degré de gravité modérée). - Prélèvement sanguins dans la veine saphène (degré de gravité modérée). Les prélèvements se font dans la veine saphène, superficielle, et n’entraîneront pas de difficultés locomotrices. - Douleur caudale si inflammation du point de prélèvement, 2h maximum.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure. L'ensemble des organes seront prélevés et conservés pour des études de biodistribution. En effet, l'étude ci-présente vise à déterminer le profile pharmacocinétique des composés, cependant un même schéma d'étude peut être effectué pour réaliser une étude de biodistribution. Le prélèvement des organes évitera donc de devoir réaliser une expérience similaire.

Remplacement

Cette étude vise à déterminer la durée de présence de nouvelles molécules dans le sang d’un organisme vivant, nécessitant ainsi l’utilisation d’un modèle animal. Des études in vitro ont été faites en amont afin de sélectionner uniquement les molécules ayant le plus grand intérêt thérapeutique pour les études in vivo.

Réduction

Le choix du rat versus la souris permet d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux pour pouvoir réaliser des prélèvements sanguins répétés. Nous avons choisi des effectifs permettant une analyse statistique pertinente et une reproductibilité des résultats tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux, à savoir 10 rats par groupes. Dans une démarche de réduction, l'ensemble des organes seront prélevés et congelés pour d'éventuelles analyses de biodistribution.

Raffinement

Avant le début des procédures, les rats seront habitués aux expérimentateurs des études, afin de pouvoir réduire, supprimer ou soulager leur stress et leur détresse. Des points limites adaptés comme une surveillance quotidienne, des pesées régulières, un traitement antalgique, ont été définis pour détecter et minimiser toute souffrance, toute douleur et tout stress des animaux.

Choix des espèces

Le choix du rat pour l'étude pharmacocinétique (PK) s’explique par plusieurs raisons, la nécessité de prélèvements sanguins répétés justifie le choix du Rat par la règle des 3R. Une étude chez la souris nécessiterait de multiplier le nombre d’animaux pour réaliser les prélèvements dans des conditions éthiques. De plus, les prélèvements répétés en 48h peuvent être faits avec une seule piqure initiale, les autres se faisant par prélèvement de la goutte de sang qui se forme lorsque l’on gratte le sang séché. Par ailleurs, le Rat est un des modèles obligatoires pour les études de PK règlementaires, il est donc justifié de réaliser ces études chez le Rat plutôt que la Souris. Pour cette procédure, nous avons besoin d’utiliser des rats de 6 semaines pour avoir un poids idéal de 200g des rats au moment du traitement.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses mammaires, puis des traitements par gavage et injections pendant trois semaines et des séances répétées d'imagerie sous anesthésie, pour évaluer un agent de contraste et des immunothérapies ciblant les macrophages tumoraux. Le porteur décrit les examens d'imagerie comme non douloureux mais reconnaît que les animaux porteurs de tumeurs peuvent subir des effets délétères en fin d'étude. Il affirme qu'un modèle in vivo est "nécessaire" car ces processus seraient "trop complexes pour être reproduits artificiellement in vitro".

Objectifs

Au sein des tumeurs, les cellules cancéreuses sont associées à un micro-environnement d'une très grande hétérogénéité inter- et intra-tumorale. Ce micro-environnement, composé de protéines formant une matrice extracellulaire, de cellules endothéliales formant un réseau vasculaire, de cellules fibroblastiques de soutien, et de cellules de l’inflammation. Le microenvironnement tumoral prend une part active dans le développement cancéreux. En particulier, les tumeurs sont infiltrées de macrophages, cellules de l’immunité innée, que la tumeur «reprogramme » afin qu’ils soutiennent sa croissance et l’aident à résister aux traitements. La présence de macrophages tumoraux dans certains cancers, comme le cancer du sein, est le signe de tumeurs agressives et est associée à une plus courte espérance de vie. La possibilité de quantifier la présence des macrophages tumoraux et de visualiser leur répartition par imagerie médicale représenterait donc une avancée majeure pour le diagnostic des tumeurs, et pour le pronostic des prises en charges thérapeutiques. Par ailleurs, certaines molécules chimiques peuvent « transformer » les macrophages pro-tumoraux en macrophages cytotoxiques luttant contre les cellules cancéreuses. Ils représentent ainsi une cible thérapeutique innovante. Au cours de ce projet, nous proposons (1) de mettre en place des modèles murins de cancer du sein, pour (2) évaluer le tilmanocept, un agent de contraste d’imagerie médicale permettant de visualiser les macrophages pro-tumoraux, et (3) évaluer par imagerie non invasive multimodale des thérapies ciblant l’immunité anticancéreuse.

Bénéfices attendus

Le cancer du sein figure toujours en tête des cancers les plus meurtriers chez les femmes, à l’échelle mondiale comme en France. En particulier, les cancers du sein triple négatifs, non hormono-dépendants, généralement diagnostiqués chez les femmes de moins de 40 ans, représentent toujours un défi thérapeutique. Pour y répondre tout en limitant les effets secondaires des traitements, de nouvelles approches thérapeutiques ciblant non seulement les cellules cancéreuses mais aussi leur micro-environnement sont désormais à l’étude. Ce projet permettra de mieux comprendre et d'évaluer une approche d'immunothérapie innovante dans le cadre des cancers du sein. Par ailleurs, le développement d'un agent de contraste d’imagerie nucléaire médicale spécifique des macrophages pro-tumoraux est important pour mieux caractériser les cancers et suivre plus finement les traitements d'immunothérapie. Au delà des cancers, cet agent de contraste d'imagerie pourrait également être utile dans les événements cardiovasculaires, les troubles métaboliques et autres pathologies, où les macrophages jouent également un rôle essentiel dans l'évolution de la maladie.

Procédures

Sauf pour les souris transgéniques PyMT, la mise en place des modèles cancéreux nécessite l'injection de cellules cancéreuses (une unique injection de 100 µL en sous cutané dans le flanc des souris nude et le coussinet adipeux mammaire des souris BalbC). Cette intervention de cinq minutes environ se fera sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane. Nous aurons quatre groupes de traitement (contrôle, inhibiteur du CSF1, anti-PD1 et combinaison). Ces molécules sont déjà autorisées en clinique pour d'autres types de tumeurs. L'inhibiteur du CSF1 sera administré par gavage 3 fois par semaine pendant 3 semaines (500 μL pour une souris de 25 g). Le groupe contrôle recevra la solution de dilution (10% de DMSO et 90% d'huile d'olive). L’anticorps anti–PD-1 sera injecté par voie intra-péritonéale 2 fois par semaine pendant 3 semaines (50 μL pour une souris de 25 g). Le groupe contrôle recevra du sérum physiologique. Ces administrations se feront chez l'animal vigile et durent de 1 à 2 minutes. Les procédures d'imagerie (2 fois par semaines pendant 4 semaines) sont réalisées sur animaux anesthésiés. Il s'agit de procédures non invasives et non douleureuses. Les animaux sont anesthésiés (1 à 2h ) uniquement pour ne pas qu'ils ne bougent. Avant l'examen de TEP-TDM-US, soit une fois par semaine pendant 4 semaines les glycémies de tous les animaux seront prises sur les animaux anesthésiés par ponction de la veine caudale. Cette mesure se fait à l'aide d'un glucomètre commercial (Accu-chek Performa) associé à des bandelletes et ne nécessite qu'une gouttelette de sang de quelque microlitres.

Impact sur les animaux

La procédure potentiellement douloureuse de ce projet est l'injection de cellules cancéreuses en sous cutané dans le flanc ou dans le coussinet adipeux mammaire. Elles seront réalisées sous anesthésie générale. Les examens d'imagerie réalisés ensuite sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique. L'inhibiteur du CSF1 (pexidartinib) et l'anticorps anti–PD-1 sont autorisés en clinique. Il n'a pas été décrit dans la littérature d'effets secondaires nuisibles chez la souris aux doses et à la durée de traitement retenues dans ce projet. Un contrôle attentif de l'état général des souris sera cependant mis en place. Les animaux inclus dans l'étude seront, par contre, porteurs de tumeurs, ce qui peut amener en fin d'étude à des effets délétaires dûs à la présence des lésions cancéreuses. Les animaux seront donc surveillés avec attention.

Devenir

A la fin de l’étude, au bout de trois semaines de traitement et le lendemain de la dernière acquisition d’imagerie, chaque animal de ce lot sera mis à mort par dislocation cervicale après sédation à l'isoflurane. L'euthanasie des animaux permettra d'éviter toute souffrance inutile à ces animaux porteurs de tumeurs, ainsi que le prélèvement des tumeurs pour valider les suivis par imagerie non invasive avec des analyses ex vivo.

Remplacement

Les systèmes et protocoles d'imagerie ont été optimisés et caractérisés sur des objets physiques de forme, géométrie, composition, etc... connus permettant ainsi de comparer images obtenues et réalité, avant de passer chez l'animal. Ce projet ayant pour but d'étudier le microenvironnement tumoral et les interactions au sein de la tumeur entre les cellules cancéreuses et différents types de cellules de l'inflammation, il est nécessaire d'utiliser un modèle in vivo, ces processus étant trop complexes pour être reproduits artificiellement in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été évalué à l'aide du logiciel disponible sur le site MF-Calc de calcul statistique pour l'expérimentation animale de l'Université de Lyon de façon à ce que les résultats obtenus soient suffisant statistiquement pour conclure sur l'efficacité anti-cancéreuse de nos approches thérapeutiques et diagnostisques. La méthode d'imagerie étant non invasive et non douloureuse, les animaux pourront être suivis au cours du temps et les paramètres étudiés seront mesurés plusieurs semaines d'affilée chez le même animal.

Raffinement

Toutes les procédures sur les animaux sont réalisées sous anesthésie générale. Les examens d'imagerie au centre du projet sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique. Les animaux seront surveillés tout au long du protocole afin d’observer leur comportement. En cas de signes de souffrance, des traitements analgésiques seront utilisés. En cas d'échec de réduction de la douleur, les procédures seront arrêtées et les animaux euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé pour les études en cancérologie, et nous permettra de comparer nos résultats à ceux présentés dans la littérature. Les appareils d'imagerie dont nous disposons sont adaptés spécialement à l'étude des rongeurs. Nous utiliserons 3 espèces de souris de façon à obtenir quatre modèles de cancer du sein présentant des caractéristiques génotypiques et phénotypiques différentes. Les souris nude, immunodéficientes pour les lymphocytes T mais possédant des cellules de l’immunité innée et des lymphocytes B fonctionnels nous permettrons l'étude de cellules humaines. Elles permettront d'obtenir un modèle simplifié pour étudier le rôle des macrophages dans la croissance tumorale et notre capacité à suivre l'effet de leur repolarisation par imagerie. Afin de pouvoir étudier également l'interaction des macrophages et des lymphocytes T, le développement d'un modèle immunocompétent, les souris BAlbC allogreffées avec des cellules cancéreuses murines, est nécessaire. Enfin les souris transgéniques PyMT représentent un modèle plus complexe de développement cancéreux. Adulte de 6 semaines car c’est l’âge ou les animaux sont de jeunes adultes ayant atteints la maturité, ce qui permet de s’affranchir des problèmes liés à l’âge. C'est cet âge qui est le plus souvent rapporté dans la littérature pour ce type d'étude, ce qui nous permettra de confronter nos résultats avec ceux d'autres équipes.

250 souris "humanisées" vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sur une centaine de jours, elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des cellules sanguines humaines et des anticorps monoclonaux, pour tester lesquels renforcent la réaction du greffon contre la tumeur. Le porteur prévoit une mise à mort dès qu'une tumeur atteint 2 000 mm³ ou qu'une souris perd 20 % de son poids, et décrit des tumeurs pouvant s'ulcérer et se nécroser. Il justifie le recours à ces souris immunodéficientes, seules à accepter des cellules humaines, comme une alternative aux primates en recherche préclinique.

Objectifs

En transplantation, l'effet greffon contre la tumeur a été observé après une greffe de cellules souches hématopoïétiques. Le greffon contient des cellules lymphocyte T du donneur qui peuvent être bénéfiques pour le receveur en éliminant les cellules malignes résiduelles. Dans le but d'évaluer le potentiel thérapeutique d'anticorps monoclonaux sur l'effet greffon contre la tumeur nous testons in vivo plusieurs candidats médicamenteux dans un modèle de greffe contre la tumeur chez la souris immunodifficiente. Ces anticorps monoclonaux ont été générés et validés in vitro mais les études in vivo sont indispensables pour pouvoir envisager des essais cliniques.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus à l’issue de cette étude, permettront de : - Comparer les résultats in vivo aux data in vitro - Déterminer le potentiel thérapeutique des anticorps testés sur les réponses immunes dans le contexte de cette maladie - Comprendre les différents mécanismes d’action mis en place - Valider et sélectionner pré-cliniquement la meilleure molécule avant d’envisager les tests cliniques

Procédures

- Rasage des souris la veille de l’injection des cellules tumorales, cette action s’effectuera sur animal vigile (2min/animal)- Injection des cellules tumorales en sous-cutanée (sur toute les souris) sous anesthésie gazeuse (10min/animal), 8 jours avant le début de protocole - une fois que les tumeurs sont détectables par palpation injection des cellules sanguine humaines en intraveineuse sur animal vigile (hormis le groupe de tumeur seul) 5min/animal - Injection des traitements en intra-péritonéal sur animal vigile (1min/animal) en fonction des groupes, deux fois par semaine - Prélèvement sanguin (100µl de sang,) tous les deux semaines sur toutes les souris (10min/souris)sous anesthésie gazeuse - Euthanasie sous anesthésie général et dislocation cervical de toutes les souris. A préciser que la durée totale de l'expérience est de 100 jours, chaque intervention sera réalisées à part dans un instant t. A noter que l’utilisatrice est une personne expérimentée en procédure animale, ce qui réduira les temps d’intervention et par conséquence moins de stress et d’angoisse animal

Impact sur les animaux

Ce modèle murin de GvT consistera à injecter des cellules tumorales en sous-cutanée, ce qui engendre quelques paramètres à surveiller régulièrement qui concerne la masse tumorale et l’animal lui-même. *La masse tumorale : les cellules seront injectées localement en sous-cutanée, la tumeur prendra de volume au fur à mesure, une surveillance quotidienne sera appliquée pour vérifier si la tumeur pousse ou pas en mesurant la longueur et la hauteur pour calculer le volume ? ; si elle envahie les tissus voisins en palpant la masse tout en cherchant les contours et des éventuelles adhérences avec le tissu cutané ? si elle s’ulcère, une ulcération de la tumeur sera visible l’œil nu, la tumeur sera rouge et présente un point de nécrose, à noter que le flanc de l’animal sera toujours rasé pour faciliter l’observation. *Le poids : une perte de poids est un signe d’un mal-être, souffrance ou douleur ; le poids sera suivi 2-3 fois par semaine, une perte supérieure ou égale à 20% est considéré comme point limite qui oblige l’euthanasie de l’animale. *Comportement : le comportement d’un animal souffrant d’un mal-être sera modifié, une baisse d’activité, une voussure de dos, pelage ébouriffé, froidure et pâleur des extrémités… tous ces critères indiquent une douleur. L’animale sera soulagé par une l’administration de l’anti-douleur adéquat et disponible dans notre laboratoire. A savoir que les animaux qui souffrent de manière chronique vont être suivis avec une attention particulière non seulement pour soulager leur souffrance, mais aussi parce qu’ils nécessitent une gestion et un mode de vie particuliers (manipulation délicate, accès facile à l’eau et à la nourriture, réduire le nombre de souris dans la cage, administration d’anti-douleur Ci-dessous une liste des points limites qui déterminera l’euthanasie de l’animal La masse tumorale : • L’évolution de la croissance tumorale est un des paramètres clés de cette étude, mais la masse tumorale ne doit pas interférer les fonctions normales de l’animale ni induire une souffrance pour son déplacement. Un volume tumoral supérieur ou égal à 2000mm3 est un point limite. • Une ulcération/infection à l’emplacement de la tumeur • Un envahissement des tissus voisin par la tumeur localisée La perte de poids • Une perte supérieure ou égale 20 % du poids du corps d’un animal normal (en tenant compte de la masse tumorale) Comportement anormale • Une détresse, un mal-être

Devenir

Mise à mort

Remplacement

Des études fonctionnelles ont été réalisées in vitro à partir de cellules humaines, les résultats sont prometteurs mais sont limités par l’absence du contexte physiologique et de la complexité du système immunitaire et ne peuvent remplacer les études in vivo. Il est donc nécessaire de tester l’efficacité immuno-régulatrice des molécules d’intérêt dans un modèle in vivo proche de l’Homme. Une alternative solide à l’utilisation de primates en recherche préclinique est le modèle de souris dites « humanisées ».

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est réduit à 25, nombre nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables. Les souris seront divisées en 10 groupes (25 souris/groupe). Le groupe témoin recevra un isotype contrôle ou PBS, les autres groupes seront traités avec les différents anticorps test. Le nombre de groupes a été réfléchi afin d’avoir les contrôles suffisants pour pouvoir conclure quant aux résultats obtenus. Le nombre total des animaux est de 250.

Raffinement

Afin de respecter le bien-être animal, au début de protocole les souris seront réparties par groupe de 3-5 souris par cage, avec des moyens d’enrichissement (frisottis, dôme et tunnel). Une surveillance quotidienne des animaux en protocole, pour déceler une douleurs, souffrance ou mal-être. Les animaux souffrants d’une douleur seront séparés des autres (étant donné qu’il existe toujours un animal dominant dans une cage, qui empêche l’animale faible d’accéder à la nourriture ou l’eau. En séparant les animaux faibles dans des cages offre une facilité d’accès à la nourriture et l’eau. Une administration d’analgésique buprénorphine 0.05mg/kg en sous cutané deux fois par jour pour tout animale souffrant, à noter que en cas de point limite (souffrance qui ne sera pas gérable par anti-douleur) l’animale sera euthanasié. Les différents points limites, une perte de poids de 20%, un volume tumoral de 2000mm3 ou montrant des signes physiques caractéristiques d’un mal-être seront euthanasiés (inhalation d'isoflurane suivie par une dislocation cervicale).

Choix des espèces

Les propriétés immuno-régulatrices de l’anticorps ne peuvent être testées que dans un modèle primate ou humanisé. Nous avons choisi les souris NOD/SCID/Il2R gamma-/- déficientes en cellules immunes car elles permettent l'acceptation de cellules immunes humaines. Un tel protocole chez des souris immunocompétentes ne serait pas possible, les cellules et tissus humains seraient rejetés par le système immunitaire. Ces souris sont issues de l'animalerie Charles River et sont reproduites au sein notre animalerie. A noter également que cette espèce animale présente une facilité de reproduction, d'hébergement et de manipulation.