Cancers

194 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une ou deux greffes de tumeurs mammaires puis des injections et des administrations orales répétées de médicaments, pour tester une combinaison de deux molécules contre le cancer du sein HER2+. Le porteur affirme que les modèles cellulaires ne rendent pas compte du microenvironnement tumoral, rendant selon lui le modèle in vivo "indispensable". Toutes les souris sont porteuses de tumeurs et euthanasiées pour analyse des tissus.

Objectifs

Les anticorps conjugués aux médicaments sont une classe émergente de produits thérapeutiques en oncologie. Ils sont capables de délivrer une concentration élevée de molécule thérapeutique spécifiquement aux cellules cancéreuses. Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes d'action et de régulation de ces anticoprs conjugués et du médicament qui lui est liée. Ceci a pour objectif de définir de nouvelles stratégies thérapeutiques qui allieront l'utilisation de ces nouveaux médicaments à d'autres traitements afin de potentialiser leurs effets. Dans ce contexte, nous étudions des combinaisons thérapeutiques de notre molécule dans le traitement du cancer du sein. Des résultats prometteurs obtenus sur des lignées cellulaires du cancer du sein, montrent que la combinaison de notre molécule avec un autre inhibiteur de croissance des cellules cancéreuses a un effet synergique. Ainsi, la combinaison de ces 2 molécules permettrait une amélioration de l'efficacité thérapeutique tout en limitant les doses d'anti-cancéreux administrés, donc les effets secondaires du traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera les caractérisations précliniques en vue de préparer l’étude sur des modèles de greffes de tumeurs de patientes puis l’étude clinique chez des patientes atteintes de cancer du sein triple négatif.

Procédures

Injections de cellules : 1 à 2 par souris. Administrations de médicaments : 3 injections (1 fois par semaine pendant 2 semaines), durée 1 minute. Administration par voie orale 10 par animal (5 fois/semaine pendant 2 semaines). L'administration orale d'un animal dure 30 secondes.

Impact sur les animaux

Nuisances liées à la présence de tumeurs sur les flancs des animaux et aux administrations orales répétées de médicaments non toxiques aux doses utiliséees.

Devenir

En fin de procédures, tous les animaux sont euthanasiés car ils seront tous porteurs de tumeurs et pour pratiquer des analyses post-mortem sur certains tissus.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo et donc indispensable. Ces modèles vont à la fois nous permettre d'étudier l’efficacité de la moléculetestée seule et en combinaison afin de proposer le meilleur traitement aux patientes lors d’éventuelles futures études cliniques.

Réduction

Si le schéma de croissance tumorale le permet et que la croissance tumorale est rapide et homogène, il pourra être envisagé de greffer les animaux sur chacun des 2 flancs afin de réduire le nombre d'animaux. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les doses seront calibrées en fonction des données de la littérature et des résultats obtenus in vitro. Concernant l'analyse des critères d'évaluation de l'efficicaité anti-tumorale, une étude statistique préliminaire a permis d'établir le nombre d'animaux greffés pour chaque étape du projet.

Raffinement

Les souris sont greffées sous anesthésie générale par inhalation ou par anesthésie locale par application cutanée d'un analgésique. Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter précocement le développement de la tumeur ou l'apparition de signes cliniques. Des points limite précis ont été définis et seront strictement appliqués. Si des signes de douleurs sont détectés un analgésique adapté sera administré. Les animaux seront stabulés en groupe, aliment et eau ad libitum. Un enrichissement adapté sera présent dans toutes les cages. En cas de suspicion de mal-être, un enrichissement supplémentaire sera ajouté.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé en oncologie, notamment du fait de l'existence de souches immunodéficientes permettant le développement de tumeur d'origine humaine. Le cancer du sein est un cancer de l'adulte. Les animaux seront donc utilisés à l'âge adulte.

370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau et des injections répétées, avec imagerie et prélèvement sanguin, pour étudier un gène impliqué dans l'infiltration lymphocytaire des tumeurs du sein triple-négatives. Le porteur décrit le modèle murin comme "incontournable" et affirme que l'étude de ces infiltrations immunitaires ne peut se faire que dans un "animal entier". Toutes les souris sont euthanasiées pour analyse du sang et des tissus.

Objectifs

Un traitement par des agents chimiothérapeutiques, notamment les anthracyclines, est souvent utilisé pour réduire la taille des tumeurs avant chirurgie ou radiothérapie chez les patients atteints de cancer du sein. Récemment, il a été montré dans notre laboratoire que la présence de lymphocytes infiltrants les tumeurs après chimiothérapie est associée à un meilleur pronostic chez les patientes atteintes de cancer du sein de type triple-négatif (TNBC) qui est particulièrement agressif. Des publications récentes montrent que le traitement des patientes par chimiothérapie, notamment par les anthracyclines, pourrait favoriser la réponse immunitaire en provoquant la mort des cellules cancéreuses et permettre ainsi la présentation d'antigènes tumoraux induisant l'activation d'une réaction immunitaire spécifique, qui se traduit notamment par l’infiltration de la tumeur par les cellules immunitaires. Une analyse génomique récente menée dans notre laboratoire sur des échantillons provenant de patients TNBC après chimiothérapie a conduit à l'identification d'une combinaison de quatre gènes liés au système immunitaire et dont le niveau d'expression est corrélé au niveau d’infiltrats lymphocytaires intratumoraux. Un des gènes appartenant à cette signature génomique, a été trouvé en relation négative avec la présence de TILs. En d’autres termes, une expression élevée de ce gène inhibe l’infiltration des cellules du système immunitaire dans la tumeur.

Bénéfices attendus

Amélioration de la prise en charge de certains cancers du sein (triple-négatifs) dans le cas ou l'attraction lymphocytaire est inhibée, si l'hypothèse est vérifiée.

Procédures

Injections: 5 par souris, durée 1 minute, sous anesthésie locale. Imagerie in vivo sous anesthésie générale: 1 fois, durée 15 minutes. Prélèvement de sang sous anesthésie 1 fois, durée 5 minutes.

Impact sur les animaux

Nuisances liées à la présence de tumeurs greffées sous la peau.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour analyses post-mortem sur le sang et les tissus.

Remplacement

Le but de ce projet est de déterminer l’implication du gène HLF (pour Hepatic leukemia factor) dans l’inhibition de l’infiltration des tumeurs du sein par les lymphocytes. Des études biostatistiques ont montré que lorsque ce gène est surexprimé dans les cellules tumorales de patientes souffrant de cancer de type TNBC, une inhibition de l’attraction lymphocytaire est constatée et corrélée à un mauvais pronostic. L’étude in vivo de l’infiltration lymphocytaires de tumeurs du sein induites chez la souris exprimant ou non HLF est indispensable afin de confirmer le rôle joué par ce gène dans ce processus et qui pourrait devenir une cible pour de nouvelles stratégies thérapeutiques. En effet, l'étude de ces infiltration en rapport avec l'immunité ne peut se faire que dans un animal entier.

Réduction

les lots d'animaux nécessaires seront réduits au nombre minimal nécessaire afin d'obtenir des résultats statistiquement valables. Un nombre minimum de 30 souris dans chaque lot a été déterminé comme nécessaire pour avoir des données fiables. Cependant, si les résultats obtenus avec une première série de 10 souris dans chaque série donnent des résultats significatifs et robustes, le nombre de souris utilisées sera diminué. Les résultats seront analysés statistiquement par analyse de variance.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales seront faites sous anesthésie générale (injections des tumeurs, imagerie in vivo) ou locale. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La lignée tumorale murine 67NR établie à partir d’une tumeur du sein spontanée chez la souris BALB/c est largement utilisée dans la littérature comme modèle d’étude des cancers de type TNBC. Cette lignée exprime le gène HLF et nous avons réussi à supprimer son expression par la technique CRISPR/Cas9. Le modèle murin est par conséquent incontournable dans notre projet pour l’étude in vivo du rôle joué par ce gène dans la réponse immunitaire antitumorale et en particulier dans l’infiltration des tumeurs par les lymphocytes. A partir de 6 semaines, pour que les souris aient un système immunitaire mature.

1 500 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une société prestataire greffe des tumeurs sous la capsule du rein pour améliorer la prise tumorale, puis administre des traitements par de multiples voies, avec imagerie, irradiation possible et prélèvements répétés, certaines tumeurs pouvant provoquer des métastases pulmonaires et des difficultés respiratoires. Les animaux sont tués parce qu'ils portent des tumeurs. Le porteur propose ces modèles comme prestation commerciale pour la sélection de molécules anticancer, et présente les méthodes de remplacement comme "marginales".

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement.

Bénéfices attendus

Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveaux composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Les modèles de ce projet sont des modèles orthotopiques rénaux ou des modèles dont la prise tumorale est faible dans des tissus communément utilisés (sous cutané par exemple) et dont la greffe en sub-capsulaire rénale améliore la prise tumorale, grâce à la forte vascularisation du rein. Pour certains modèles, les masses tumorales primaires greffées peuvent disséminer et créer des métastases. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme dans le cas des tumeurs de rein greffées par voie orthotopique, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tumorale tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

L’induction tumorale est réalisée sous anesthésie générale avec analgésie avec administration d’un anesthésique local et d’un anti inflammatoire (

Impact sur les animaux

Il pourra être nécessaire de mettre en place un implant sous cutané de diffusion hormonale pour les tumeurs hormonodépendantes, lors d’une chirurgie stérile sous anesthésie avec analgésie. Cela pourra entrainer une douleur modérée et un stress léger sur 1-2 jours. La greffe tumorale en sub-capsulaire rénal (réalisée sous anesthésie générale et analgésie) pourra engendrer une douleur modérée sur 1-2j et un stress modéré. L’évolution de la tumeur pourra entraîner un développement de métastases pulmonaires causant des difficultés respiratoires, une perte de poids. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress de 1-2j. Les animaux pourront recevoir des traitements par voie IM (avec analgésie), ID (avec analgésie) , SC, IV (bolus), orale, IN, IT, IP et / ou seront exposés à des rayons ionisants à visée thérapeutique. Ces traitements pourront entrainer un stress léger et une douleur légère. Dans le cas des rayons ionisants, les animaux seront transportés dans leur cage d’origine vers la plateforme d’irradiation. Cela pourra entrainer un stress léger. Dans le cas de l’imagerie, les animaux seront transportés dans leur cage d’origine vers la plateforme d’imagerie et imagés sous anesthésie générale. Cela pourra entrainer un stress léger. Les prélèvements de sang peu invasifs (veine faciale, jugulaire, caudale) seront effectués sous anesthésie générale à l’Isoflurane. Cela pourra entrainer un stress léger. Dans certains cas, comme par exemple pour le prélèvement à la veine caudale ou à la veine saphène, le geste pourra être effectué sans anesthésie, uniquement sous contention. Cela pourra entrainer un stress modéré pendant le prélèvement. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation.

Devenir

Etant porteurs de tumeurs les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (volume tumoral et/ou poids). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et aux paramètres étudiés : en général un groupe non traité et/ou traité par le véhicule utilisé pour la molécule à évaluer, puis un groupe par schéma de traitement (différentes doses, voies, molécules etc). Au minimum, une étude comportera un groupe avec tumeur, non traité et/ou traité avec le véhicule, et un groupe avec tumeur traité avec le composé à tester. Toutefois, dans la mesure du possible, le maximum de composés seront testés au cours de la même étude afin de ne pas démultiplier les animaux contrôles ainsi que les animaux surnuméraires non randomisés. Compte tenu de taux de prise tumorale variable et afin de pouvoir former des groupes homogènes en poids et/ou en volume tumoral, il sera en général nécessaire d’inclure au moins 10% d’animaux non randomisés. Le nombre d’animaux par groupe (en général 6 à 15 animaux) est choisi sur la base des précédentes études réalisées dans nos laboratoires pour les modèles connus afin de sélectionner le nombre d’animaux minimum pour observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et volume tumoral). Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal pour remplacer des analyses terminales en cours d’étude.

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine. Un gel nutritif et de l’eau gélifiée seront placés au fond de toutes les cages dès qu’une perte de poids >15% sera observée sur certains animaux en étude. La greffe sub-capsulaire rénale, la pose d’implants hormonaux ou la thoracotomie seront réalisés sous anesthésie profonde avec injection pré-opératoire d’un opiacé et un alpha2 agoniste. Suite à la greffe du matériel tumoral en sub-capsulaire rénal ou suite à la pose d’un implant, les animaux recevront 2 injections d’opiacépendant 48, et éventuellement sur 24 heures supplémentaires si besoin. Les autres administrations et prélèvements seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress (IV, prélèvement d’urine) ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Les administrations douloureuses (IM, ID) seront réalisées avec analgésie préalable, et sous anesthésie si besoin. Les points limites concernant le poids sont adaptés en cas de tumeurs cachectiques. Dans les modèles connus pour induire des métastases pulmonaires, ou les modèles inconnus pouvant causer des métastases pulmonaires, une attention particulière sera portée à la respiration des animaux (posture, fréquence respiratoire). Les difficultés respiratoires marquées constitueront un point limite. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans la procédure. Si l’un des signes cliniques liés aux points limites est observé, l’animal est mis en observation et un traitement est si possible mis en place. Par exemple, en cas de douleur constatée, le vétérinaire prescrira un traitement antalgique. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus suite à l’induction de pathologie cancéreuse et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux. En cas de toxicité sur l’animal, un arbre décisionnel validé par la SBEA sera utilisé. Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie pour sortir l’animal de la procédure.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou induites) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation).

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une greffe de cellules cancéreuses sous la peau leur fait développer une tumeur, dont la croissance est suivie au pied à coulisse, puis elles reçoivent jusqu'à six injections d'un vaccin à ARN messager sous anesthésie. Les animaux sont tués pour prélever les tumeurs et les organes. Le porteur renvoie le bénéfice, une nouvelle stratégie anticancer chez l'humain, au conditionnel et au long terme, et affirme que la réponse immunitaire complexe rend l'étude in vitro impossible.

Objectifs

Chaque année, les cancers provoquent le décès de plusieurs dizaines de milliers de personnes. Jusqu'alors, les traitements classiques (chirurgie, chimiothérapie, radiothérapie) ciblent directement la tumeur, offrant de bonnes chances de survie aux malades présentant des cancers localisés. Cependant, ces traitements ne sont pas assez efficaces, pour les cancers généralisés. C’est pourquoi, les chercheurs se penchent vers une nouvelle approche : l’immunothérapie. Cette approche permet de traiter le cancer en utilisant le propre système immunitaire du patient. Les vaccins de type ARN messager (ARNm) sont devenus des outils prometteurs pour l'immunothérapie du cancer. Ce projet de recherche a pour but d'évaluer les capacités thérapeutiques d'un vaccin ARNm nouvelle génération dans un modèle de tumeur de côlon. L’idée principale est donc d’induire une réponse immunitaire grâce à l’injection intramusculaire de ce vaccin ARNm nouvelle génération, afin de lutter contre le développement de la tumeur chez la souris.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est de contribuer à valider une nouvelle stratégie thérapeutique anti-cancer en santé humaine. Ce projet permettra d’évaluer le bénéfice d'une approche par un vaccin à ARNm, sur le développement de tumeurs cancéreuses. Cet outil pourrait être applicable à différents types de cancer.

Procédures

Des cellules cancéreuses sont injectées sous la peau des souris. Pour effectuer ce geste, la souris est maintenue environ 15 sec, une seule injection de 0.1ml. A la suite de cette injection, la souris développera une tumeur sous-cutanée. La croissance tumorale est suivie par des mesures au pied à coulisse 3 fois par semaine, l’animal est maintenu immobile environ 25 sec. Les composés sont administrés par voie intra-musculaire sur animal anesthésié au maximum 6 anesthésies sur une période de 2 semaines. Le volume d'injection est de 0.05 ml dans le muscle de la cuisse, temps 1 min (anesthésie comprise).

Impact sur les animaux

La greffe de cellules par injection sous-cutanée est réalisée sur animal vigile. La tumeur pourrait entrainer dans de très rare cas une gêne à la locomotion. L'immunisation est réalisée par une injection intra-musculaire dans le muscle de la cuisse. Au maximum, 6 immunisations sur une période de 2 semaines. Une inflammation au site d'injection ou une réaction à l'injection est très peu probable.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les tumeurs et des organes pour analyser les réponses immunitaires.

Remplacement

L'efficacité d'un vaccin contre le cancer dépend de sa capacité à induire une réponse immunitaire permettant de réduire le taux de croissance de la tumeur, avec un mécanisme d’action spécifique. C'est un phénomène biologique complexe faisant intervenir différents types de cellules immunitaires et une organisation particulière qui rend impossible son étude dans des tests in vitro.

Réduction

Une étude préliminaire pour vérifier la capacité des cellules à développer une tumeur est conduite sur un nombre restreint de souris. Si le résultat est concluant, l'étape 2 sera mise en oeuvre pour déterminer l'efficacité d'une vaccination préventive par un vaccin ARNm nouvelle génération sur le ralentissement de la croissance tumorale. Si et seulement si un ralentissement significatif de la croissance tumorale est constaté, alors l'étude d'un traitement curatif sera mise en oeuvre (les cellules cancéreuses sont injectées puis le traitement débute).

Raffinement

Les analyses de croissance des tumeurs seront non-invasives (mesure au pied à coulisse) et ne requièrent pas d'injection d'anesthésiant ou d'antalgique. De l'aliment humidifié en fond de cage sera disposé si un animal présente une gêne de la mobilité due à la croissance de la tumeur (très rare). Les immunisations (injection intra-musculaire ) se feront sur animal anesthésié. L'injection intra-musculaire est la voie la plus utilisée pour les vaccins à ARNm, permettant la stimulation de la réponse immunitaire. Certains animaux pourront recevoir jusqu'à 6 immunisations maximum. Ce nombre pourra être réduit à 5 en fonction de la croissance tumorale. Ces injections intramusculaires pourront être administrées alternativement sur la patte droite et la patte gauche. Des points limites adaptés sont définis de manière objective pour chaque procédure, incluant des critères d'arrêt de l'expérience en cas de souffrance.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour l’analyse de greffes de lignées cellulaires en oncologie. Les expérimentations sont réalisées sur des souris immunocompétentes car l'objectif de l'exprimentation est d'activer le système immunitaire en vue de réduire la croissance de la tumeur. Les souris seront âgées de 7 à 12 semaines. Le système immunitaire est décrit comme mature à partir de cet âge-là et non veillissant.

110 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent pendant trois semaines un régime contenant de la viande, puis passent jusqu'à 72 heures seuls en cage à métabolisme pour le recueil de leurs urines et fèces, une phase que le porteur reconnaît comme génératrice de stress. Les animaux sont tués pour prélever leur côlon et y mesurer l'oxydation et l'inflammation. Le porteur teste des antioxydants censés contrer l'effet cancérigène du fer héminique de la viande rouge, et affirme qu'aucune étude in vitro ne rend compte d'un "organisme entier".

Objectifs

Les études épidémiologiques réalisées chez l’Homme montrent une association entre la consommation importante de viande rouge et de charcuteries et le développement du cancer colorectal. Les études réalisées chez le rat ou la souris confirment cette association et montrent que le fer héminique (le rouge de la viande), contenu en grande quantité dans ces aliments pourrait être responsable de leur effet néfaste. Le fer héminique est un agent pro-oxydant qui provoque l’oxydation, dans la lumière intestinale, de composés du régime alimentaire, comme les lipides, aboutissant à la formation de composés toxiques. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet d'extraits végétaux antioxydants, ajoutés directement dans la viande (volet 2), ou bien indirectement dans la ration des bovins (volet 1), sur leur capacité à contrecarrer l’effet délétère du fer héminique de la viande. Les antioxydants ajoutés directement dans la viande (volet 2) seront choisis pour leur capacité antioxydante intrinsèque mais aussi pour leur capacité à moduler une voie importante impliquée dans le dialogue entre différents types cellulaires au niveau colique (études in vitro sur lignée cellulaire en amont de ce projet). Les antioxydants ajoutés dans la ration des bovins seront choisis pour répondre à un triple objectif : avoir non seulement un effet antioxydant, destiné à contrecarrer l’effet du fer héminique chez le consommateur de viande (volet 1), un effet de réduction d’émission de méthane lors de la digestion des bovins (étude sur digesteurs artificiels en amont de ce projet), mais aussi une absence de modification ou une amélioration de la qualité organoleptique (évaluation gustative par un jury de testeurs humains). La viande issue de ces bovins (8 bovins, 2/lots, 1 lot témoin/élevage, 3 lots/rations enrichie en antioxydant) sera testée en l’ajoutant à la ration des rats dans le volet 1. Dans ce projet, nous proposons deux volets où 110 rats Fisher F344 mâles seront nourris avec un régime contenant de la viande pendant 3 semaines. Leur urine et leur fèces seront récupérées lors d’un passage de 2 jours et demi en cage à métabolisme et leur côlon post mortem sera prélevé à la fin de l’expérimentation. Ces échantillons permettront des mesures des produits d’oxydation des lipides et de l’inflammation et permettront des analyses pour la compréhension mécanistique au niveau du tissu colique.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus dans chacun de ces 2 volets permettront l’identification de molécules prometteuses afin d’élaborer des stratégies de prévention nutritionnelles visant à limiter l’effet de la viande rouge sur le risque de cancer colorectal. La première stratégie (volet 1) constitue un levier de prévention nutritionnelle dès la production du bétail qui outre la limitation du risque de cancer colorectal devra provoquer une diminution des émissions de gaz à effet de serre par le bétail tout en maintenant une bonne qualité organoleptique des viandes. La seconde stratégie (volet 2) devra permettre de proposer un levier de prévention nutritionnelle du risque de cancer colorectal défini sur la base d’une étude mécanistique innovante.

Procédures

Tous les prélèvements in vivo, sur rat vigile, se feront sans contention de l'animal (animal posé sur le bras ou maintenu dans la main). Les fèces à l’anus seront prélevées 1 fois à J21 pour des analyses du microbiote. Une crotte sera prélevée par rat. Ce prélèvement dure environ 1 à 3 min par rat. Pour les prélèvements des fèces et urines de 24 h séparées, les rats seront hébergés en cage à métabolisme maximum 48h en continues. Les prélèvements sont en fait des recueils dans des réceptacles sous la cage à métabolisme. Nous recueillons toutes la production de 24h en féces et en urine séparément, 2 fois, au bout de 24 et 48h. Les rats n’ont pas besoin d’être manipulés. Les rats seront également manipulés sans contention pour les identifié par tatouage à l'oreille (pince Aramis spécifique aux rongeurs avec une aiguille type insuline, encre spécifique pour rongeurs, un point par rat).

Impact sur les animaux

Le projet comporte un passage en cage à métabolisme pendant au maximum 72h ce qui peut générer du stress pour les animaux qui sont hébergés seuls.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin que le côlon soit prélevé pour analyses.

Remplacement

Les études sur digesteurs artificiels mimant le rumen des bovins ont permis de choisir les extraits végétaux antioxydants qui réduiront le plus les émissions de méthane par les bovins (amont du volet 1). Des études in vitro sur des cellules permettront de choisir les antioxydants les plus à même d’avoir un effet intéressant sur le dialogue entre les différents types cellulaires du côlon (volet 2). Ces études en amont de ce projet permettent de limiter le nombre d’animaux en testant beaucoup de molécules in vitro puis de ne tester que les plus pertinentes chez l'animal. Cependant, aucune étude in vitro ne permet d'évaluer les répercussions de ces composés antioxydants, sur la physiologie et le métabolisme d'un organisme entier. L'utilisation d'animaux permet d’examiner des atteintes dans les voies intestinales et coliques (inflammation, atteinte tissulaire). Seule une approche in vivo permet de prendre en compte la complexité de l'épithélium colique sur la physiologie intestinale et le rôle des antioxydants dans l'inflammation et l'apparition de dommages à l'ADN dans l'épithélium ainsi que les modifications possibles du microbiote intestinal.

Réduction

Dans l'objectif de réduire au strict minimum l'utilisation d'animaux de laboratoire, le nombre d'animaux a été limité au maximum à 10 animaux par lot. Pour ces études nutritionnelles de 22 jours, notre expérience et nos publications montrent qu'un nombre minimal de 10 animaux par lot est nécessaire pour une modulation des marqueurs biologiques analysés. Par exemple, un nombre de 10 animaux par lot suffit à obtenir des résultats significatifs sur un marqueur urinaire tel que le DHN-MA (composé issue de la dégradation physiologique d'un acide gras lors de l'oxydation des lipides). Afin d'obtenir des résultats interprétables et statistiquement fiables, et d'être dans des conditions expérimentales équivalentes, nous prévoyons d'utiliser le même nombre d'animaux dans ce projet, soit 10 rats par lot

Raffinement

Les conditions d'expérimentation font l'objet d'une procédure de suivi du bien-être animal. Les animaux seront suivis et surveillés quotidiennement ou deux fois par jour lorsqu’ils passeront 48h dans une cage à métabolisme (animal isolé). La surveillance sera réalisée à l'aide d'une fiche de suivi sanitaire où sont listées et scorées différentes observations spécifiques au rat F344 utilisé dans cette étude. Cela concerne globalement le comportement alimentaire/social et l’état général. Si l'état sanitaire des animaux se révèle modérément modifié (exemple de score 2 : poils non toilettés, prise de poids modéré, …), la surveillance sera augmentée en conséquence (action préétablie à suivre). Si les observations montrent un état général ou un comportement classé sévère (exemple de score 3 : baisse de la prise de poids ou comportement non curieux) ou très sévère (exemple de score 4 = point limite : baisse du poids à 15% par rapport à la dernière mesure), alors le vétérinaire référent sera sollicité pour vérifier que l’action préétablie suffise (score 3) ou l’animal sera euthanasié et autopsié (score 4).

Choix des espèces

Des travaux précédents ont montré que le rat Fisher F344 était un bon modèle pour étudier la modulation de la cancérogenèse colorectale associée à la consommation d’un régime riche en viande rouge. Les mâles sont privilégiés pour analyser le développement des pathologies à l’âge adulte afin d’éviter les effets hormonaux liés aux cycles de la femelle (observés sur l’inflammation et la cancérogenèse). Les études se feront sur des rats adultes. Ils seront âgés de 5 à 6 semaines à leur arrivée et leurs organes seront matures en particuliers ceux de l'appareil digestif. L'ensemble des études précédentes ont été menées sur des rats adultes du même âge dont la fonction digestive est totalement fonctionnelle. Afin de rester en accord avec les résultats précédents, il est important de rester au même stade de développement.

4 258 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la bactérie de la listériose, par gavage ou injection intraveineuse, puis pesées quotidiennement, certaines recevant du tamoxifène ou des anticorps, et peuvent développer diarrhées et infections d'organes dont le cerveau. Le porteur situe le projet dans la recherche fondamentale sur les interactions entre la bactérie et son hôte, et indique que les souris seront tuées faute de pouvoir être réutilisées, replacées ou adoptées. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne rend compte de la complexité d'un "organisme vivant dans son intégralité".

Objectifs

Listeria monocytogenes (Lm) est la bactérie responsable de la listériose, maladie humaine d'origine alimentaire. Lm peut atteindre le cerveau et induire des méningites et encéphalites, en particulier chez les personnes âgées de plus de 65 ans, avec un taux de mortalité d'environ 30 %. La listériose peut aussi se traduire par une infection materno-fœtale chez les femmes enceintes, provoquant fausses-couches, accouchements prématurés ou infections néonatales. Les objectifs de ce projet sont de déterminer les rôles des facteurs bactériens et de l’hôte, y compris le microbiote intestinal, dans la listériose. L’étude de la listériose est importante pour comprendre cette pathologie, mais également pour mieux appréhender la réponse de l’hôte à un pathogène intracellulaire facultatif.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre de recherches fondamentales sur les maladies infectieuses et en particulier sur la listériose. Cette maladie tue chaque année plus de 300 personnes en France. Elle constitue donc un problème de santé publique ainsi que pour l’industrie agro-alimentaire. Elle est également un modèle précieux pour la compréhension des interactions entre une bactérie intracellulaire facultative et son hôte. Une meilleure compréhension du mécanisme de dissémination des bactéries dans l'organisme et de la réponse immunitaire mise en place est en soi importante pour l’évolution des connaissances et constitue un prérequis indispensable pour le développement de stratégies thérapeutiques multi-cibles innovantes et efficaces. Même si nos recherches se focalisent sur Lm, une grande partie de nos approches et résultats pourrait être étendu à l’étude d’autres pathogènes..

Procédures

1128 souris seront soumises à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute), avec un ou des composants du microbiote (ou PBS en contrôle) puis, 30 jours après, à un nouveau gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute) avec Listeria monocytogenes, pathogène pour l’homme et l’animal. Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement, et les fèces prélevés (durée d’environ 2 minutes dans une boîte individuelle). 600 souris seront soumises à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute) et 240 à une injection intraveineuse sur animal vigile (durée d’environ 2 minutes) avec Listeria monocytogenes. Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement (durée d’environ 10 secondes par souris). 324 souris seront soumises à une injection intraveineuse sur animal vigile (durée d’environ 2 minutes) avec Listeria monocytogenes. Ces animaux recevront 10 injections de tamoxifène ou de solvant contrôle (huile d’olive) par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes). 5 injections avant et 5 injections après inoculation de Listeria. L’injection de tamoxifène pourra être remplacée par l’ajout de tamoxifène dans la nourriture, si ce mode de délivrance est efficace pour notre modèle. Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement (durée d’environ 10 secondes par souris). 480 souris seront soumises à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute) avec Listeria monocytogenes. Parmi ces souris, 240 recevront 3 injections d’anticorps anti-Il-10 (ou anticorps contrôle) par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes, 2 injections avant et une injection le jour de l’inoculation par Listeria). Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement (durée d’environ 10 secondes par souris). 60 souris seront soumises à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute) et 60 à une injection intraveineuse sur animal vigile (durée d’environ 2 minutes) avec Listeria monocytogenes. Ces 120 souris recevront 3 injections d’inhibiteur d’EVH1 (ou contrôle) par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes, 1 injection avant et 2 après le jour de l’inoculation par Listeria). Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement (durée d’environ 10 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Les différentes expériences réalisées conduisent à un degré de sévérité modéré. Les animaux sont susceptibles de développer des diarrhées, des infections de différents organes y compris le cerveau.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.

Remplacement

Ce projet a pour but l’étude de la physiopathologie de la listériose. Il n’existe à l’heure actuelle, aucun modèle in vitro ou ex vivo rendant compte de la complexité d’un organisme vivant dans son intégralité, y compris les conditions très spécifiques pour maintenir un microbiote sous conditions physiologique. Seul les animaux, tels que les modèles murins, permettent de comprendre le processus d’infection dans sa globalité et c’est pourquoi il est nécessaire d’avoir recours à ces animaux pour atteindre les objectifs de notre projet. Nous utilisons en parallèle des approches in vitro ou ex vivo (organoïdes) pour répondre à des questions plus spécifiques.

Réduction

Les moyennes de CFU entre les groupes seront comparées à l'aide de tests de comparaison de moyenne (ANOVA ou test non paramétrique). Les effectifs par groupe (n=5) sont associés à des tailles d'effet de 2, pour un test de comparaison de 2 moyennes, un risque de 5% et une puissance de 80%. Ceci correspond à des effets forts, compatibles avec la question biologique. Lorsque cela est possible, les animaux sont infectés avec un mélange de souches (index de compétition), afin de comparer leur virulence au sein du même animal, ce qui permet de diminuer le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe avec une litière appropriée et des matériaux de nidification. Des points limites incluant la prostration/faciès de souffrance ou Body score 1, la perte de poids>20% du poids initial, ainsi que les signes d'infection du système nerveux central (paralysie partielle) sont appliqués pour ce projet. Les animaux seront mis à mort dès qu'un de ces points limites est atteint. Une réhydratation par voie sous-cutanée (Ringer Lactate) sera effectuée et de l’eau gélifiée sera mise à disposition pour les animaux présentant des signes de déshydratation (perte de poids >10%, pli cutané).

Choix des espèces

La souris n’est pas permissive à une infection orale par Lm du fait d’une spécificité d’espèce de l’interaction entre InlA et la E-cadhérine. La lignée murine permissive à Lm, qui exprime une E-cadhérine reconnue par InlA, sera dont principalement utilisée. L’interaction InlA-E-cadhérine n’étant pas impliquée après le passage de la barrière intestinale, des souris non permissives pour cette interaction, dont des C57BL/6J, pourront être également utilisées pour des infections intraveineuses afin de tester le rôle de facteurs bactériens ou de l’hôte indépendamment de la traversée de la barrière intestinale. Différentes lignées mutantes pourront ainsi être utilisées. Le recours à ces lignées permettra d’identifier et de caractériser les processus d’interactions hôtes / bactéries de la façon la plus pertinente possible, en prenant en compte les spécificités du modèle murin par rapport à l'homme. Selon les procédures, les animaux suivants seront utilisés : Souris adultes (âge > 7 semaines), pour lesquelles le système immunitaire est mis en place. Souris gestantes pour étudier la listériose materno-fœtale et l’infection des fœtus. Souris âgées (plus de 18 mois) pour caractériser l’augmentation de la susceptibilité à la neuro-listériose liée à l’âge et au changement de microbiote.

270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du sein dans la glande mammaire, puis des injections répétées d'un candidat médicament sous contention, avant d'être tuées par rupture des vertèbres cervicales. Le porteur signale une possible cachexie et une gêne à la marche liée au volume de la tumeur. Il affirme n'avoir "pas d'autre choix" que la souris pour reproduire un "organisme entier", l'étude constituant une étape vers un dossier réglementaire commercial.

Objectifs

Depuis plus de 10 ans, le cancer est la première cause de mortalité en France. Or il a été démontré qu'une molécule est exprimée, voire fortement surexprimée, au sein du microenvironnement tumoral (humain et murin). Ainsi, cette protéine est considérée comme un marqueur de mauvais pronostic et de récurrence dans de nombreux cancers tels que le cancer du sein, principal cancer retrouvé chez les femmes en France. Il y a donc une nécessité de développer de nouveaux traitements à l’heure actuelle afin d’améliorer la survie des patientes. Ce projet a pour but d’évaluer le potentiel anti-tumoral d’un candidat médicament qui en plus d’inhiber la vascularisation tumorale, a d’ores et déjà démontré des effets anti-tumoraux dans différents modèles murins de cancer tels que le cancer de la peau, cancer cérébral et le cancer ovarien. Il a également été montré dans ce dernier modèle la capacité du candidat médicament à activer l’immunité anti-tumorale. L’objectif de notre projet sera donc d’évaluer le potentiel thérapeutique et la pharmacologie du candidat médicament. Pour cela, un effet dose sera évalué en analysant la croissance tumorale au sein d'un modèle de cancer mammaire ainsi que la vascularisation grâce à la technique dite de "matrigel plug". Ces deux premières procédures permettront la détermination des paramètres pharmacologiques et pharmacocinétiques. Une fois la dose efficace déterminée à l'aide de ces deux premières études, nous analyserons l’effet de la dose efficace sur la réponse immunitaire dans les tumeurs. Pour cela, le modèle de tumeur mammaire est un modèle intéressant pour étudier les relations entre la tumeur et le système immunitaire en respectant la physiologie de développement tumoral. Enfin, le 3e volet de l’étude consistera à comparer quatre formulations du candidat médicament afin de déterminer celle qui pourrait améliorer l'efficacité du traitement.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus par le candidat médicament sont une diminution de la croissance tumorale liée à une augmentation de la réponse immunitaire ainsi qu’une diminution de la vascularisation tumorale selon un effet dose. La réalisation de ce projet d’expérimentation animale permettrait de valider les résultats obtenus in vitro et ex vivo et confirmerait la pertinence de la stratégie thérapeutique associée au candidat médicament dans un modèle complexe de progression tumorale in vivo (tumeurs vascularisées et système immuno-compétent). Cette étape, associée à la détermination d’une dose efficace de traitement et d’une formulation adaptée, constitue un prérequis à la constitution de dossier réglementaire lors du developpement pharmaceutique.

Procédures

Pour toutes les procédures (toutes les souris) : identification des souris par tatoo au niveau des oreilles (durée: moins d'1min) sous anesthésie générale par inhalation de gaz anesthésique (1 fois). Procédures 1, 3 et 4 (pour toutes les souris) : - Injection de cellules tumorales au niveau de la glande mammaire sous anesthésie générale par inhalation de gaz anesthésique (1 fois, durée: moins de 5min) - Injection de traitement par voie intraveineuse dans la veine de la queue sur animaux vigiles placés dans un tube de contention (durée: 5min) 3 fois par semaine pendant 3 semaines Procédure 2 (pour toutes les souris) : - Injection d’une solution de protéines matricielles, contenant un facteur favorisant la vascularisation, dans le flanc des animaux, sous anesthésie générale par inhalation de gaz anesthésique (1 fois, durée: moins de 5min) - Injection de traitement par voie intraveineuse, dans la veine de la queue, sur animaux vigiles placés dans un tube de contention (durée: 5min), 3 fois par semaine pendant 2 semaines. Procédure 1 (souris du groupe satellite) : - Prélèvements sanguins sous anesthésie générale par inhalation de gaz anesthésique (5 fois : submandibulaire gauche, submandibulaire droite (durée: 1min), rétoorbital gauche, rétroorbital droit (durée: moins d'1min), ponction intracardiaque après euthanasie) répartis au cours du temps jusqu'au sacrifice des animaux.

Impact sur les animaux

Une cachexie : d'après la bibliographie, la cachexie apparaît principalement au stade métastatique du développement tumoral environ 5 à 6 semaines suivant l’inoculation des cellules tumorales. Il est donc peu probable que la cachexie apparaisse après les 3 semaines de traitements néanmoins le risque que quelques animaux en présente n’est pas totalement exclu. Une gêne à la locomotion due au volume tumoral en raison de la localisation de la tumeur. Un stress des animaux lors des injections sur animaux vigiles ainsi que préalablement à l'imagerie. Une douleur transitoire lors de l'injection intraveineuse. Une inflammation et/ou une dépilation dans de rare cas à l'emplacement de la tumeur croissante ou de la solution matricielle.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés par rupture des vertèbres cervicales sous anesthésie générale (isoflurane 4%).

Remplacement

Une étude in vitro seule ne peut suffire pour représenter les mécanismes physiologiques d’un organisme entier et les approches informatiques ne permettent pas à ce jour de mimer la fonction d’un organisme et sa réaction face aux traitements. En effet, il est notamment très difficile de recréer exactement, in vitro, l’environnement tumoral. Ainsi, nous n’avons pas d’autres choix que d’utiliser le modèle animal pour apporter la preuve de concept de l’efficacité thérapeutique du candidat médicament et de définir sa dose efficace et la formulation adaptée avant l’éventuelle réalisation d’essais cliniques.

Réduction

Afin d’être adapté au modèle de cancer mammaire, uniquement des souris femelles seront considérées dans les procédures comportant ce modèle. Pour le modèle in vivo de vascularisation, il s’agira de souris mâles et femelles afin de pouvoir identifier, si nécessaire, une réponse différentielle liée à la synthèse hormonale. Le nombre d’animaux nécessaires a été calculé de manière à réduire au maximum la quantité d’animaux tout en permettant une interprétation fiable des résultats basée sur des analyses statistiques adaptées.

Raffinement

Une observation quotidienne des souris sera réalisée afin de garantir leur bien-être et détecter d’éventuels signes de douleur ou de stress. L’utilisation d’anesthésiques, d’analgésiques et d’antalgiques permettra de prévenir et/ou traiter toute douleur éventuelle. Une attention particulière sera portée à l’observation des points limites fixés tout au long du projet afin d’éviter toute souffrance non soulagée par les soins apportés, auquel cas l’animal sera mis à mort. Un soin sera apporté aux conditions d’hébergement permettant de limiter le stress (enrichissement du milieu de vie, respect de leur vie en groupe, surveillance quotidienne) Des outils d’imagerie non invasifs seront utilisés.

Choix des espèces

Souris Balb/c, syngéniques de la lignée de carcinome mammaire 4T1 Travaux antérieurs justifiant de la pertinence de ce modèle murin dans le cadre de l’évaluation de nouveaux agents thérapeutiques dans le traitement de différents cancers. Homologie de la protéine cible Animalerie agréée pour l’espèce souris Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique, les souris seront utilisées à l’âge de 8 semaines, ce qui correspond à un stade adulte (jusque environ 1 an chez la souris).

6500 rongeurs, 6200 souris et 300 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une induction tumorale, parfois une irradiation et un implant, puis des traitements répétés et des prélèvements de sang et de moelle osseuse, pour évaluer des composés contre des leucémies et des métastases. Le développement tumoral provoque une perte de poids et des difficultés à se déplacer. Le porteur reprend mot pour mot son argumentaire de remplacement pour justifier le nombre d'animaux, et affirme qu'aucune méthode alternative ne prédit l'efficacité in vivo.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux. En 2020, quelques 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer disséminés déjà mis en place ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la maladie humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour les traiter. Ces modèles permettront d’étudier des nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte physiologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une réelle évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers disséminés de type leucémie ou bien le développement des métastases chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques sur des leucémies ou des métastases. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera ainsi possible d’étudier dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme : -les mécanismes de dissémination des métastases, -les mécanismes d’évolution des leucémies, -les mécanismes de résistance à des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

Un système d’identification sera mis en place sur tous les animaux, sous anesthésie générale (moins de 1 minute, une seule fois). Induction tumorale de tous les animaux sous anesthésie (moins de 1 minute, généralement unique, mais pourra être répétée pour vérifier que la thérapie administrée peut empêcher des récidives). Si necessaire,en fonction de des cellules tumorales : transport vers le site où est réalisée l’irradiation (une seule fois, 2 heures). Pose d’un implant Sous Cutané (une seule fois, 1 minute) Test de composés chimiques, biologiques ou traitement par rayons ionisant administrés sous anesthésie générale (moins de 1 minute). Administration orale, intraveineuse, intrapéritonéale et sous cutanée sous contention sans anesthésie (moins de 1 minute). Ces administrations peuvent être uniques ou répétées, comme peut l’être la prise de médicament chez le patient. Pesée des animaux (moins de 1 minute) Prélèvements de sang potentiellement répétés en respectant les volumes maximum tolérés : -Prélèvements peu invasifs sous anesthésie générale (moins de 1 minute). -Prélèvement par piqûre à la veine caudale et marginale de la patte sous anesthésie, possible sous contention (moins de 3 minutes). -Prélèvements potentiellement répétés de moelle osseuse sous anesthésie (moins de 5 minutes). -Recueil d’urine individuel (potentiellement répété, avec isolement (moins d’une heure)). Technique d’imagerie, potentiellement répétée: sous anesthésie générale entre 10 et 45 minutes (en fonction des techniques).

Impact sur les animaux

Les gestes techniques suivants induiront un stress léger à l’animal: -Identification des animaux -Transport vers le site où est réalisée l’irradiation -Pose d’un implant Sous Cutané -Induction tumorale -Traitements par voies orale, Intraveineuse, intrapéritonéale, sous cutanée ou radiothérapie -Suivi des animaux par imagerie Les gestes suivants induiront une douleur plus marquée. -Les traitements par voie intramusculaire/intradermique Au début de l’étude, les animaux seront randomisés. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress léger. La prise de mesure des animaux (poids) induira un stress pouvant être considéré comme faible qui diminuera avec l’habituation Les prélèvements de sang ou de moelle osseuse en cours d’expérience induiront un stress plus important chez l’animal : Le développement tumoral induira une perte de poids et des difficultés locomotrices.

Devenir

Les animaux étant porteur de tumeur ils seront tous mis à mort.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais restent toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais restent toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Raffinement

Les procédures techniques sur les animaux seront réalisées selon les standards validés par le comité éthique. Toutes les procédures seront réalisées par des techniciens formés et dont les compétences ont été validées. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Chaque animal sera observé quotidiennement. Les animaux présentant des signes de douleur ou de souffrance seront suivis par la structure chargée du bien-être animal. Sous l’autorité du vétérinaire, des antalgiques pourront être prescrits. De l’enrichissement sera utilisé dans toutes les cages dès l’arrivée des animaux dans l’animalerie. L’induction tumorale se fera sous anesthésie. avec traitement antalgoique adaptée. L’induction tumrale fera l’objet d’une surveillance et de soins post induction seront pratiqués si nécessaires. Pour les traitements dont l’administration est douloureuse, les animaux en plus d’être anesthésiés recevront une antalgie adaptée. Les injections/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations du comité éthique en termes de volume, d’anesthésie, de fréquence et d’antalgie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. A partir de 10% de perte de poids, la fréquence de pesée sera augmentée pour tous les animaux Dans toutes les cages, un gel nutritif ou de l’eau gélifiée seront rajoutés, la quantité de nourriture en fond de cage sera augmentée. Chaque animal avec une perte de poids de 10% sera réhydratés.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines (modèles xénogéniques) dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (6 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’injection des cellules tumorales. Les animaux adultes pourront mieux supporter les effets secondaires des composés à tester. Les effets du développement tumoral sera plus facilement supporté par des animaux adultes.

785 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une implantation sous-cutanée de cellules de glioblastome issues de patients, puis jusqu'à cinq types d'interventions, imagerie de fluorescence, injections répétées sur cinq semaines, gavages sur cinq cycles et perfusion cardiaque. Le sang et les organes sont prélevés après la mise à mort. Le porteur affirme que le passage par un modèle animal est "indispensable" avant de tester ces molécules sur des patients.

Objectifs

Le glioblastome (GBM) est le cancer cérébral le plus fréquent et le plus agressif, avec 200 000 décès par an dans le monde. Le traitement standard actuel (extraction chirurgicale, radiothérapie et chimiothérapie) n’est malheureusement pas curatif et la survie médiane des patients est de 14 mois. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles thérapies contre ce cancer. Le projet compte évaluer des molécules capables de cibler et d’éliminer les cellules de GBM, seules ou en combinaison avec des nanotechnologies. Le développement pharmaceutique de ces formulations a permis de formuler ces médicaments pour une utilisation clinique (formulations validées sur des lignées cellulaires de GBM humain). Il est maintenant important d’évaluer l’intérêt thérapeutique de ces nouvelles molécules sur différents modèles animaux, avant d’envisager un essai clinique chez l’Homme. Le projet consiste à développer des modèles murins de GBM sous-cutanés à partir de cellules dérivées de patients, dans le but d’évaluer l’intérêt thérapeutique de plusieurs candidats médicaments après administrations répétées (intraveineuses ou sous-cutanées).

Bénéfices attendus

Le but de ces travaux consiste à développer des modèles murins de GBM sous-cutanés à partir de cellules dérivées de patients (PDX), dans le but d’évaluer l’intérêt thérapeutique de plusieurs candidats-médicament après administrations répétées (intraveineuses ou sous-cutanées). Si l’intérêt thérapeutique est attesté et les doses maximales tolérées et efficaces déterminées, ces travaux pourront servir pour réduire le nombre de souris utilisées lors d’une future étude sur des modèles PDX où les cellules tumorales seront injectées au niveau du cerveau (= modèle orthotopique), modèle plus proche de l’Homme. La combinaison des résultats sur ces modèles sous-cutanés et orthotopiques de PDX serviront de base pour la mise en place d’essais pré-cliniques règlementaires avant la mise en place d’essais cliniques.

Procédures

Dans la mise au point du modèle, les animaux subiront 2 types d'intervention : l’implantation tumorale sous-cutanée et le suivi de la croissante tumorale qui durent quelques minutes. Dans l’étude de biodistribution et pharmacocinétique tissulaire, les animaux subiront jusqu'à 5 types d’intervention : l’implantation sous-cutanée tumorale et le suivi de la croissante tumorale qui durent quelques minutes, un suivi de la biodistribution des molécules par imagerie de fluorescence (3 sessions au maximum sur une semaine qui durent plusieurs dizaines de minutes chacune), des injections intraveineuses ou sous-cutanées sur une période de 5 semaines (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours) et une perfusion cardiaque. Dans l’étude d'efficacité, les animaux subiront jusqu’à 4 types d’intervention : l’implantation sous-cutanée tumorale et le suivi de la croissante tumorale qui durent quelques minutes, des injections intraveineuses ou sous-cutanées (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours suivies de 2 jours de repos, sur 5 cycles) et des gavages répétés (1 gavage par jour pendant 5 jours suivi de 2 jours de repos, sur 5 cycles maximum).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables des candidats médicaments seront évalués lors de chaque phase du projet. Certains candidats médicaments pouvant être composés d’un anticancéreux, des effets indésirables communément retrouvés après injection de ce type de composé pourraient être observés (modification de la formulation sanguine, perte de poids, faiblesse, etc.). Les effets indésirables peuvent être également liés à l’injection des traitements (rougeur, inflammation, etc.).

Devenir

A l’issue de toutes les procédures, les animaux seront tous mis à mort pour prélèvements de sang et/ou d’organes.

Remplacement

L’utilisation des candidats médicaments étant à visée humaine, il est nécessaire de réaliser des études précliniques pharmacologiques non-réglementaires, comme ici des études de biodistribution et d’efficacité pour démontrer et valider sans aucune ambiguïté leur intérêt thérapeutique avant les études précliniques réglementaires et les essais cliniques chez l’Homme. Ces traitements visent les femmes et les hommes, c’est pourquoi il est important de démontrer leur efficacité chez les deux sexes. Des travaux in vitro sur cultures cellulaires vont être menés sur les cellules tumorales utilisées dans ce projet préalablement à son démarrage pour valider les formulations testées. Il est indispensable de passer sur un modèle animal mimant les conditions de développement du GBM avant de pouvoir tester les molécules sur des patients atteints de ce cancer. Le développement de ces types de modèle dans ce projet ne peut pas être remplacés par des méthodes alternatives car l'induction de tumeur s'accompagne de modifications physiopathologiques dans un microenvironnement particulier, notamment dans le cas du GBM, ne pouvant actuellement pas être reproduites in vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux.

Réduction

L'étude de toxicité que nous allons effectuer dans un autre projet (n° APAFIS 38113) va nous permettre de raffiner la dose administrée. Le nombre d’animaux d'un sexe sera également réduit au strict minimum en fonction des résultats obtenus chez l'autre sexe. Un seul modèle tumoral sera testé chez le deuxième sexe. Le nombre d’animaux choisi par groupe est suffisant pour garantir des données précises, représentatives de l’espèce, et statistiquement exploitables. Il est préférable de ne pas utiliser moins d’animaux, au risque d’être confronté à des variations entre des animaux d’un même groupe.

Raffinement

La douleur et l’angoisse de chaque animal seront évaluées par un suivi quotidien. Afin d’évaluer de façon raffinée la souffrance/douleur des animaux tout au long de l’expérimentation, un système de score sera mis en place pour chaque animal et pour chaque paramètre contrôlé. Dans le cas où un animal présenterait un ou des signes de souffrance, un médicament contre la douleur serait administré jusqu’à ce que ces signes disparaissent. L'atteinte d'un des points limites par un animal impliquera sa mise à mort. Plusieurs personnes seront impliquées dans ce suivi, mais la décision finale sera prise dans les 24h par le porteur de projet.

Choix des espèces

Des recherches bibliographiques montrent que la souris est l'espèce la plus utilisée et adaptée pour l’implantation de cellules de GBM, qu’elles soient issues de lignées immortalisées ou de patients. Il s'agit de l'espèce la mieux décrite dans la littérature. Les souris seront utilisées entre 6 et 8 semaines d’âge. Cet âge est majoritairement retrouvé dans les études bibliographiques in vivo sur modèle sous-cutané de GBM chez la souris.