Cancers

6300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis des séances d'imagerie hebdomadaires sous anesthésie et l'administration de composés une à deux fois par jour pendant jusqu'à 42 jours, pour tester des traitements anticancéreux. Les organes sont prélevés après la mise à mort pour mesurer l'efficacité des molécules. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité d'une tumeur et conclut à la nécessité du recours à la souris.

Objectifs

Les cancers font partie des maladies les plus complexes à traiter. Notre projet propose de trouver de nouvelles thérapies anticancéreuses et permettra de comprendre pourquoi on observe un échappement de la maladie lors de traitement à base d’anticorps ou de molécules pharmaceutique mais également de proposer des stratégies pour rendre ces thérapies plus efficaces.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels ne permettent pas de traiter 100% des patients atteint d’un cancer et l’on observe de plus en plus d’échappement aux thérapies déjà existantes. Ces études permettront à la fois d’expliquer le mécanisme d’échappement à ces traitements mais aussi d’expliquer le mécanisme d’action de certains traitements. Ces résultats seront comparés à ceux obtenus in vitro au préalable mais également avec ce que l’on attend des différents traitements observés lors des phases clinique chez l’homme. De plus, ces études permettront de tester de nouvelles thérapies plus innovantes et donc de proposer de nouveaux traitements plus efficaces aux patients atteint de cancer.

Procédures

1) Injection de cellules tumorales en moins de 3 minutes sous anesthésie une seule fois dans l'étude, 2) l'imagerie de la tumeur une fois par semaine pendant 6 semaines se fera sous anesthésie pendant 5 min apres une injection de sonde bioluminscente, 3) Prélèvements sanguins une fois par semaine pendant 6 semaines: prelevement en moins d'une minute avec anesthésie pas plus de 2 fois dans l'etudes ou intraveineux sans anesthesie ou en moins d'une minute, 4) Administration des composés à tester ou de leur solvant en moins d'une minute par animal, une à deux fois par jour pendant un maximum de 42 jours

Impact sur les animaux

L’injection en sous cutané de cellules tumorales chez la souris va induire le développement d’une tumeur qui va grossir au fur et à mesure. Les effets indésirables attendus chez la souris sont dans un premier temps une perte de poids, une diminution de l’activité. Les animaux seront également manipulés délicatement mais rapidement afin d'eviter au maximum le stress de la manipulation, des administrations et du gavage.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, des analyses sur les organes étant nécessaires pour mesurer l’efficacité des molécules testées.

Remplacement

A ce jour, aucun modèle cellulaire ne récapitule complètement la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la progression d’une tumeur où son échappement à une thérapie. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'études in vivo pour comprendre ce phénomène et évaluer de potentiels candidats médicaments. Afin de réduire au maximum le nombre d’étude et donc le nombre d’animaux utilisés, les différentes stratégies antitumorales seront préalablement testées in vitro. Et ne seront testés les traitements, les molécules ou anticorps, ayant montré le plus d’efficacité dans ces modèles.

Réduction

Pour respecter le principe des 3R, nous veillerons à ce que toutes les expériences qui pourront être réalisées in vitro le soient et que ne seront testés, in vivo, que les meilleures molécules ou anticorps obtenus in vitro. Le nombre de souris utilisées par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique. Une analyse statistique rétrospective permettra de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe afin d’obtenir pour chaque paramètre étudié une puissance de 80% et alpha=0.05. L’utilisation de l’imagerie bioluminescente et de cellules tumorales exprimant la luciférase permettront un suivi longitudinal des animaux et donc diminuera le nombre d’animaux utilisé dans les études. Nous utiliserons un modèle bien établi dans la littérature afin de limiter la phase de mise au point et ainsi de limiter le nombre d’animaux

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation de 4 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations. Les animaux et leurs conditions d’hébergement seront sous surveillance quotidienne. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la période d'étude. La bonne connaissance des études permettra de raffiner et d’anticiper le développement de la maladie chez l’animal et donc d’anticiper la mise à mort éthique. Pour cela, un programme d'analgésie ainsi qu'une grille de score, l'utilisation de points limites adaptés, d'un arbre décisionel et de critére d'arret de souffrance sont mis en place.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus utilisée pour ce type de modèle et donc le plus décrit. Son utilisation permettra de bénéficier de toute la littérature scientifique déjà parue sur ce modèle utilisant cette espèce. Nous nous appuierons sur de la bibliographie solide et sur un modèle déjà bien documenté afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour la mise au point Nous utiliserons des animaux à l’âge adulte afin de travailler sur des organes parfaitement développés.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection puis deux prélèvements sanguins sous anesthésie sur une période de 6 à 72 heures, avant d'être tué pour prélever ses organes. Le projet mesure la persistance et la toxicité de dix candidats médicaments d'immunothérapie anticancéreuse. Le porteur affirme qu'aucune technique in vitro ne mesure la persistance dans un "organisme entier" et présente l'animal comme la "seule approche" possible.

Objectifs

Au cours de la dernière décennie, les approches immunothérapeutiques ont révolutionné le traitement des cancers et constituent un domaine de recherche en plein essor. Les immunothérapies visent à rendre le système immunitaire plus à même de reconnaitre les cellules tumorales et de les détruire. Cependant, la proportion de patients qui répond à ce type de médicaments est pour l’instant trop faible. Nous avons récemment développé et breveté une technologie permettant de produire un panel de protéines immunomodulatrices, c’est-à-dire capables de moduler l’activité du système immunitaire. Sur la base de cribles d’activités réalisés in vitro nous avons sélectionné deux premières protéines qui s’avèrent capables de contrôler la croissance tumorale chez la souris ce qui indique le potentiel immunothérapeutique de notre technologie. A l’aide des mêmes cribles, nous travaillons actuellement à la sélection de nouvelles protéines présentant des activités immunomodulatrices encore plus optimisées qui représenteraient de ce fait de nouveaux candidats médicaments pour le traitement de cancers. Avant d’étudier l’efficacité thérapeutique des candidats sélectionnés, nous devrons caractériser leur devenir chez l’animal de laboratoire ainsi que leur toxicité potentielle. Ces travaux permettront en effet de définir les conditions de délivrance les plus appropriées pour tenter d’obtenir un effet thérapeutique optimal avec un risque de toxicité nul ou très limité. L’objectif de notre projet est donc de caractériser chez l’animal de laboratoire le devenir dans l’organisme au cours du temps ainsi que la toxicité potentielle de dix nouveaux candidats médicaments générés par notre technologie et préalablement sélectionnés in vitro. La persistance des protéines candidates dans l’organisme sera déterminée par immunodosage. Pour ces travaux, nous utiliserons des souris qui représentent des références pour la communauté scientifique impliquée dans le domaine de l’immunothérapie des cancers.

Bénéfices attendus

Les médicaments utilisés chez l’homme ou chez l’animal doivent être capables de générer des effets thérapeutiques significatifs en absence de toxicité ou avec une toxicité minimale par rapport au bénéfice attendu. Les candidats médicaments générés par notre approche technologique doivent répondre à ces deux critères. Pour évaluer l’efficacité thérapeutique dans des conditions optimales, il faut cependant définir dans un premier temps les conditions de délivrance les plus appropriées. Les études de persistance dans l’organisme réalisées dans ce projet seront d’un apport crucial dans ce contexte. En effet, le suivi de la demi-vie des candidats médicaments dans l’organisme permettra de connaître les paramètres d’absorption et d’élimination ainsi que l’atteinte des tissus cibles. Ces données permettront de définir i) la dose à injecter, ii) le temps entre deux injections, iii) la voie d’injection, pour obtenir une persistance significative des candidats médicaments durant les études d’efficacité réalisées ultérieurement. Les études de toxicité seront quant à elles essentielles pour évaluer l’innocuité des différents candidats médicaments. Les bénéfices du projet sont donc attendus aussi bien en terme de définition des conditions optimales de délivrance des candidats médicaments que du point de vue de la caractérisation de leur innocuité.

Procédures

Les animaux subiront une seule injection et deux prélèvements de sang sur une période de 72 heures. Dans ces deux cas, pour éviter tout stress, les animaux seront anesthésiés. Les études seront réalisées sur des temps courts, compris entre 6 heures et 72 heures. La présence des candidats médicaments dans le sang sera déterminée par immunodosage.

Impact sur les animaux

Au cours de nos études nous auront pour objectif de surveiller les animaux afin d’évaluer si des effets indésirables inattendus apparaissent. Les effets indésirables peuvent être une perte de poids, une perte de mobilité, un stress, des difficultés respiratoires, une inflammation au point d’injection. Il n’est pas possible d’évaluer, à priori, la durée d’effets inattendus. Cependant, si des effets apparaissent, leur durée sera comprise entre 6h à 72h au maximum car les animaux seront euthanasiés de 6 à 72 heures après le début de l’expérience.

Devenir

Les souris seront euthanasiées à la fin des expériences afin de prélever de prélever différents organes pour étudier la distribution des candidats médicaments dans les tissus.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer le devenir dans l’organisme ainsi que la toxicité potentielle de nouvelles immunothérapies. Ces travaux ne peuvent être réalisés sans se passer de l’animal car, aucune technique in vitro ne permet d’évaluer la persistance ou la localisation dans un organisme entier. L’utilisation d’animaux de laboratoire représente donc la seule approche permettant une évaluation du devenir et de la toxicité potentielle d’un candidat médicament.

Réduction

Notre technologie nous permet de produire des centaines de protéines dotées d’activité immunomodulatrice. Pour limiter le nombre d’immunothérapies à évaluer chez l’animal, les protéines produites seront dans un premier temps évaluées in vitro pour leur capacité à induire des cellules du système immunitaire. Seules celles qui présenteront la capacité immunomodulatrice la plus optimale seront sélectionnées pour être évaluées chez l’animal. Les expérimentations sont basées sur des modèles de souris chez lesquelles il existe une variabilité interindividuelle. Pour tenir compte de cette variabilité, trois animaux par temps de cinétique seront utilisés. Pour étudier le devenir des immunothérapies de façon fiable au cours du temps, il est recommandé d’effectuer des prélèvements sanguins à au moins 6 temps différents. Dix-huit animaux sont donc théoriquement requis pour l’étude d’une immunothérapie via une voie d’injection. Nous limiterons cependant le nombre d’animaux à douze en réalisant un deuxième point de cinétique au moment de l’euthanasie de neuf des animaux inclus dans l’expérience. Enfin, nous mènerons les études de biodistribution et de toxicité sur les rongeurs soumis aux études de pharmacocinétique ce qui permettra de réduire le nombre de rongeurs utilisés.

Raffinement

Les protocoles que nous utiliserons sont classiquement employés chez l’homme ou chez l’animal. Pour limiter le stress des animaux, permettre une manipulation aisée et douce, nous anesthésierons les animaux avant l’injection des immunothérapies et avant les prélèvements. Pour préserver le bien-être des animaux, ceux-ci seront hébergés au calme en respectant des cycles diurne/nocturne. De plus, ils seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué afin d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. L’application de critères d’arrêt et le suivi régulier des animaux hébergés en groupe permettront de garantir le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Pour évaluer le devenir dans l’organisme des immunothérapies ainsi que la toxicité potentielle, nous travaillerons chez la souris. Pour ce type d’étude, elle représente en effet une référence utilisée par la plupart des chercheurs académiques ou de l’industrie pharmaceutique. Les rongeurs auront entre 8 et 12 semaines car ils présentent un système immunitaire et une physiologie pleinement mature qui s’avère cruciale pour évaluer le devenir dans l’organisme au cours du temps et l’innocuité d’immunothérapies.

3 750 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cette prestation commerciale greffe des tumeurs humaines sous la peau ou dans la graisse mammaire, avec injections hydrodynamiques à fort volume, imagerie et parfois rayonnements ionisants, jusqu'à des pertes de poids et des nécroses tumorales. Le porteur teste des candidats médicaments pour des clients et greffe 10 % d'animaux surnuméraires pour compenser les échecs de prise. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne prédit l'efficacité in vivo et juge les modèles 3D "marginaux".

Objectifs

Dans le monde, il est constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, 19 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués avec 10 millions de décès des suites de cette maladie. Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. 1/8 hommes et 1/11 femmes en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation du processus contrôlant la prolifération, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Bien que possédant des caractéristiques communes, les differents cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente aux traitements. Une des cibles communes à tous les cancer est une approche thérapeutique qui agit sur le système immunitaire d’un patient pour lutter contre sa maladie. En effet, les cellules cancéreuses sont capables d’inactiver les défenses de l’organisme. Le microenvironnement tumoral devient alors immunosuppresseur et empêche l’arrivée sur place des défenses immunitaires. Cette approche se fonde sur l’utilisation de différents outils : vaccination, anticorps monoclonaux, immunomodulateurs, cytokines. Afin d’étudier les interactions physiologiques des cellules immunitaires avec les cellule cancéreuses il est nécessaire de disposer de modèle murins contenant des cellules immunitaires humaines. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles déjà mis en place dans notre société, et de les humaniser afin de les rendre plus prédictifs pour mieux évaluer de nouveaux médicaments. Cette évaluation permettra d’étudier ces molécules dans un contexte physiologique le plus proche possible de l’homme avant les essais cliniques. Les animaux sont utilisés pour déterminer l’efficacité antitumorale des composés testés, déterminer leur pharmacocinétique, leur toxicité, leur concentration active, et pour les comparer avec des composés cliniques de références. A ce jour, aucune méthode alternative ne peut se substituer à l’utilisation des animaux pour évaluer l’efficacité d’un composé. De plus, les animaux autorisent une grande variété de techniques d’administration, de prélèvements et de chirurgies permettant de créer des modèles dans lesquels l’évolution de la maladie et le traitement sont proches de la situation clinique.

Bénéfices attendus

Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer, spécifiquement les cancers d’origine osseuse ou à métastases osseuses. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

L’implantation de transpondeur pour identifier l’animal est réalisée sous anesthésie générale 0-3 jours avant la greffe (

Impact sur les animaux

Trois types de greffe pourront être faites : Sous cutanée, intradermique et graisse mammaire. Il y aura une évolution du volume tumoral ce qui entrainera une distension de la peau. Pour limiter cette tension qui peut engendrer une douleur ou une gêne dans la mobilité, le volume tumoral maximal sera limité. Il est possible que des nécroses apparaissent. La tumeur n’étant pas innervée, seules les plaies en surface peuvent engendrer une douleur. Par conséquent, la taille de la nécrose en surface sera limitée et des soins seront apportés. Il est aussi possible, que la progression tumorale entraîne une cachexie constatée par une perte de poids. Dans ce dernier cas, dès la greffe tumorale, de la nourriture enrichie sera apportée afin de limiter la perte de poids. Il est possible, que la progression tumorale entraîne une cachexie constatée par une perte de poids. Afin d’observer des effets de composé sur l’évolution de la tumeur, les animaux recevront des traitements de différents composés par voie IM, ID, SC, IP, IV et/ou seront exposés à des rayonnements ionisants. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress de 1 à 2 jours. En fonction du comportement des animaux ou bien des besoins de l’étude, il sera possible d’isoler des animaux.. Il est possible que l’injection hydrodynamique engendre une douleur et une perte de poids transitoire. L’injection hydrodynamique sera réalisée sous anesthésie gazeuse (isoflurane) et les souris seront placées sur un tapis thermochauffant pendant 15 min à 37°C et traitées par un antalgique avant et après l’injection (buprénorphine). Les souris seront observées pendant une heure suivant l’injection hydrodynamique. Le poids des animaux sera enregistré 4 fois par semaine incluant le jour de l’injection la semaine qui suit cette injection. Les mesures de poids et de volume tumoral entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation. Ces mesures seront faites dans les salles de stabulation. Les autres manipulations seront faites en laboratoire afin de ne pas stresser les autres animaux.

Devenir

Du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, ils seront tous mis à mort en fin de procédure.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais restent toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposable à l’homme.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (volume tumoral et niveau d’humanisation). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés : en général un groupe non traité puis un groupe par schéma de traitement (différentes doses, voies, molécules etc). Au minimum, une étude comportera un groupe avec tumeur, non traité, et un groupe avec tumeur, traité avec le composé à tester. Toutefois, dans la mesure du possible, le maximum de composés seront testés au cours de la même étude afin de ne pas démultiplier les animaux contrôles. Le nombre d’animaux par groupe est choisi sur la base des précédentes études réalisées dans nos laboratoires pour les modèles connus (en général 6 à 15 animaux) afin de sélectionner le nombre d’animaux minimum pour observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et volume tumoral). Moins de 5 études sont réalisées chaque année, mais le nombre peut varier en fonction des commandes des clients. Une étude peut être composée de 1 (dans le cas d’un développement d’un nouveau modèle) à 10 groupes. Le nombre d’animaux par groupe varie généralement entre 6 et 15 par dose de produit, ce nombre sera adapté en fonction de la connaissance interne du modèle ou en fonction des études réalisées dans la littérature. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal pour remplacer des analyses terminales en cours d’étude et donc éviter de multiplier les groupes nécessaires. Pour compenser le taux de prise variable de certaines tumeurs, et la variabilité intrinsèques de certains modèles, il sera nécessaire d’inclure des animaux surnuméraires. Ce nombre d’animaux surnuméraire est réduit à un maximum de 10% (pour 100 animaux, 110 seront greffés). Ces animaux exclus seront valorisés soit pour remplacer des animaux des groupes traités constitués, soit pour servir de contrôle ou de calbration lors des analyses (par exemple en cytométrie de flux pour les calibrations.

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine et 4 fois par semaine la semaine qui suit l’injection hydrodynamique: • 5% sera observée sur certains animaux. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, les traitements seront interrompus.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. Le statut immunodéprimé de l’animal choisi est également important pour évaluer l’immunothérapie du cancer, car l’espèce choisie doit simultanément tolérer la transplantation de tumeurs humaines et de cellules immunitaires humaines. Pour finir, les souris et les rats autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (6 semaines d’âge minimum pour leur réception et 8 semaines pour la manipulation).

64 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur dans le cerveau sous anesthésie, puis jusqu'à quatre injections intraveineuses et huit injections intrapéritonéales d'un anticorps sur trois à six mois, avant d'être tuées pour prélever sang et cerveau. Le porteur décrit des épendymomes pédiatriques sans traitement efficace et affirme qu'en l'absence de modèle cellulaire in vitro, le modèle animal est "indispensable". Il annonce espérer améliorer la survie des enfants atteints "à court terme".

Objectifs

Les tumeurs cérébrales constituent la première cause de mortalité et de morbidité par cancer chez l'enfant et l'adulte jeune. Les épendymomes sont des tumeurs intracrâniennes retrouvées très fréquemment chez l’enfant. Ces tumeurs sont chimiorésistantes et responsables de nombreuses rechutes malgré les exérèses chirurgicales. Au cours des dernières décennies, leur traitement n’a connu aucun progrès. A l’heure actuelle, il n’existe pas de modèles cellulaires in vitro de ces tumeurs. Il nous est donc impossible de prédire la réponse d’un médicament sans passer par un modèle animal. Nous avons développé plusieurs modèles de cette maladie à partir de tumeurs de patients que nous avons pu modifier en ajoutant un gène, qui permet un suivi de ces modèles par imagerie. Ces modèles sont très rares et sont un outil indispensable pour l'exploration de thérapies prometteuses. L'objectif de ce projet est d'étudier l'efficacité d'un anticorps monoclonal ainsi que ces propriétés de répartition dans les tissus atteints. Dans le cas où ses objectifs seraient atteints, les molécules pourront être directement transférées en clinique chez des patients pédiatriques en phase I.

Bénéfices attendus

Les épendymomes sont des tumeurs pédiatriques chimiorésistantes et responsables de nombreuses rechutes et aucun traitement à ce jour ne permet d’améliorer de façon importante la survie des patients. Le traitement par l'anticoprs monoclonal objet de ce projet est un nouvel espoir thérapeutique pour traiter ses tumeurs. Nous espérons pouvoir améliorer la survie des enfants atteints à court terme.

Procédures

Les animaux seront greffés avec des tumeurs dans le cerveau sous anesthésie générale (durée 30 minutes). Les animaux recevront au maximum 4 injections de produits en intraveineuse et 8 injections en intrapéritonéales, toutes injections seront réalisées sous anesthésie locale (lidocaïne) réparties entre 3 et 6 mois (durée pour chaque 1 minute).

Impact sur les animaux

En fin de procédure, les animaux pourront présenter des symptômes neurologiques (principalement apathie). Les doses d'anticorps monoclonal utilisée pour traiter les souris sont bien inférieures au doses maximales tolérées: aucune toxicité n'est donc à attendre du traitement.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de récupérer le sang et le cerveau et de pouvoir réaliser des analyses complémentaires ex vivo.

Remplacement

A l’heure actuelle, il n’existe pas de modèles cellulaires de ces tumeurs. Il nous est donc impossible de prédire la réponse d’un médicament sans passer par le modèle animal. Cependant, nous avons pu montrer que les épendymomes de patients présentent une très forte expression de certains récepteurs, constituant une cible thérapeutique très prometteuse. De plus, il est reconnu que la barrière hémato-enchéphalique est un réel frein quant aux passage de molécules dans les tumeurs cérébrales. Il est donc indispensable d’évaluer l'efficacité du traitement par l'anticorps monoclonal pressenti dans un modèle animal pertinent.

Réduction

Nos greffes sont suivies par imagerie. Ce suivi permet d'estimer le volume tumoral. Cela permet donc de diminuer le nombre des animaux par procédure et également d'assurer un suivi clinique précis et pertinent de l'évolution des tumeurs cérébrales. De plus, les animaux développent des tumeurs de façon homogène et reproductible. Le nombre de souris a été déterminé de façon optimale par calcul de puissance les croissances tumorales des animaux traités ou non. Des tests statistiques non paramétriques seront utilisés,en analyse de variance ou pour les comparaisons de groupes deux à deux.

Raffinement

Pour limiter la souffrance liée à la progression tumorale, les animaux seront suivis chaque jour pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un antalgique. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Les procédures dureront entre 3 et 6 mois suivant la croissance tumorale du modèle et la réponse au traitement. La dose du médicament évalué est inférieure à la dose maximale tolérée et des études d’efficacité chez la souris dans d’autres types tumoraux n’ont montré aucun effet toxique à la dose quenous utiliserons. Nous n’attendons donc pas à avoir de la toxicité du médicament. Des points limite précoces spécifiques ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

L'utilisation de modèles de souris immunodéprimées permet la greffe de tumeurs humaines. Les animaux utilisés auront entre 4 et 6 semaines (population cible pédiatrique).

568 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris immunodéficientes, elles sont irradiées, reçoivent des greffes de cellules souches et de cellules leucémiques humaines, puis des injections, des prélèvements sanguins et un prélèvement de moelle osseuse, l'envahissement leucémique pouvant provoquer un amaigrissement. Le projet, mené avec une entreprise de biotechnologies, teste une thérapie cellulaire dérivée des CAR-T contre les leucémies. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne produit des lymphocytes T humains matures et que seule la xénotransplantation le permet.

Objectifs

Les cellules CAR-T sont des lymphocytes T modifiés génétiquement dans le but de reconnaître puis éliminer les cellules cancéreuses. Elles sont la base d’une toute nouvelle approche de traitement contre le cancer, consistant à prélever des cellules immunitaires d’un patient ou d’un donneur sain (ici, les lymphocytes T), pour les modifier génétiquement et les réinjecter chez le patient. Cette nouvelle approche est un espoir dans le traitement des cancers. Des obstacles d'efficacité, de longévité et de spécificité des lymphocytes T génétiquement modifiés restent à résoudre dans cette thérapie et malgré un taux important de réponse complète aux traitements après thérapie, la rechute de la maladie reste un défi. La perte précoce des cellules liée à leur demi-vie courte et une inefficacité est une des raisons qui expliquent les échecs de cette thérapie. Notre stratégie est une approche cellulaire par l'utilisation de cellules progénitrices de lymphocytes T exprimant un récepteur CAR, génétiquement modifiées appelées ci-après (CAR-ProTcells) qui pourrait contourner certains des obstacles rencontrés. L'utilisation de la thérapie CAR-ProTcells permettrait d’accélérer la reconstitution du thymus, lieu de production des lymphocytes T, du patient, et améliorerait l'efficacité et la durabilité du traitement. Le projet sera mené en collaboration avec une entreprise de biotechnologies qui a mis en place un procédé de production de progéniteurs T et montré son efficacité à produire un compartiment de lymphocytes T matures, importantes. Des études préliminaires ont également mis en lumière une nouvelle génération de produits d’immuno-oncologie cellulaire pour lutter efficacement contre les cancers. Ces produits cellulaires pourraient limiter les effets néfastes secondaires récurrents, par exemple la production massive de cytokines inflammatoire, de la stratégie des lymphocyte T génétiquement modifiés. Notre projet propose de mener des études précliniques dans un modèle rongeur, afin de démontrer le potentiel et l’efficacité de la stratégie CAR-ProTcells comme thérapie pour l’éradication de leucémies.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de valider et justifier la mise en place d'une stratégie thérapeutique utilisant des progéniteurs de lymphocytes T génétiquement modifiés, et donc d'une plateforme de développement de ces cellules à visée d'utilisation clinique chez l'humain. L’acquisition de nos données est indispensable au développement de cette thérapie innovante, à fort potentiel translationnel. La stratégie de CAR-ProT cells pourrait offrir des réponses antitumorales durables et efficaces en contournant les obstacles majeurs d'efficacité, de longévité et de spécificité des CART reportés à ce jour dans le domaine des immunothérapies pour le cancer.

Procédures

Irradiation : Les animaux receveurs des greffes de CSH et cellules Pro-CAR T cells. La procédure d’irradiation durera moins de 5 minutes sur les animaux vigiles.) Injection intraveineuse rétro-orbitale des cellules 1 fois, sous anesthésie. L’injection durera 1 minute / animal après anesthésie. Injection sous cutanée, 1fois par semaine, animaux vigiles. durée 1 minute/ animal. Injection intraveineuse (queue) des cellules tumorales 1fois. L’injection durera 1 minute par animal vigile. Les souris subiront des prélèvements sanguins (au maximum 3 sur une période de 2 à 3 mois) en cours d'expérience sous anesthésie. Chaque prélèvement dure moins de 2 minutes par animal. Imagerie Bioluminescence sur animaux anesthésiés maximum 1 foi par semaine (dure 10 min/souris) Un prélèvement de moelle osseuse, sous anesthésie générale, avec un traitement anti-douleur avant et après l'intervention (dure environs 3 minutes)

Impact sur les animaux

L’introduction des cellules leucémiques humaines peut occasionner chez l'animal des troubles de type amaigrissement du fait de l'envahissement leucémique prononcé qui joue sur l'appétit des animaux. La durée de nos expériences ne dépassera pas 6 mois pour éviter ces effets indésirables. Nos expériences préparatoires vont anticiper ces possibles troubles en définissant la période précédant leur apparition, qui sera celle choisie pour injecter les CAR-T ou CAR-ProT cells qui devraient agir comme une thérapie. Un prélèvement de moelle osseuse sera réalisé (uniquement sur les groupes ayant reçu les cellules leucémiques du patient) qui pourrait provoquer également de la douleur.

Devenir

L'obtention des résultats requiert que tous les animaux soient euthanasiés en fin d'expériences afin de pouvoir analyser le contenu cellulaire normal et leucémique des organes des souris et donc de conclure sur l'efficacité du traitement.

Remplacement

Les expériences chez l’animal interviennent au terme d’un long processus expérimental de mises au point et s’inscrivent dans le cadre d’une validation in vivo de l’effet thérapeutique des CAR-ProT cells avant un développement clinique chez l'humain. Des études in vitro ont été réalisées avec des cellules humaines afin d’optimiser les conditions de préparation et améliorer le produit de thérapie cellulaire. Néanmoins ces tests sont trop limitants et il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro permettant d’obtenir des cellules T humaines matures et fonctionnelles. Pour l’instant, seule la xénotransplantation de cellules hématopoïétiques humaines à des souris immunodéficientes permet la maturation et la différenciation complète de progéniteurs de lymphocytes humains dans le thymus de ces souris. Nous sommes donc arrivés à un point où nous ne pouvons pas aller plus loin dans le remplacement de l'utilisation d'animaux par un modèle in vitro.

Réduction

Chaque expérience sera répétée 2 fois, afin d’accumuler les datas dans 10 à 12 animaux au total. Nous avons auparavant et au sein d’autres projets acquis des connaissances sur le modèle tumoral de cellules hématopoïétiques. Ce modèle est reproductible et la tumeur peut être éliminée par un traitement classique CAR-T. Selon nos expériences précédentes et les données de la littérature utilisant ce type de modèle, nous avons postulé que si nous accumulons des données sur 10 à 12 souris au total nous devons pouvoir observer une différence significative entre les groupes non-traités et traités par l’approche CAR-ProTcell (diminution de tumeur dans le groupe traité versus groupe non traité). Pour obtenir ces résultats sur le nombre d’animaux déposés, nous allons effectuer 2 expériences indépendantes contenant 5 à 6 souris par groupe.

Raffinement

Les animaux seront suivis très régulièrement pour mesurer l'impact des manipulations sur leur état de santé. L’état de santé sera évalué à l’aide d’une grille de score définie par la structure chargée du bien-être animal au sein de l’organisme. Cette grille permet de réagir rapidement, pour décider de la mise en place de traitements palliatifs ou d’une euthanasie Pour limiter les effets de stress et de douleur des animaux, les interventions telles que les prélèvements sanguins ou les injections de cellules seront réalisées sous anesthésie et analgésie

Choix des espèces

Dans ce projet, nous utiliserons des souris immunodéficientes. Ces souris ne présentent pas de phénotype dommageable. Le déficit immunitaire de ces souris permet la prise de greffe de cellules hématopoïétiques humaines, normales ou pathologiques, et offre la possibilité d'évaluer les immunothérapies avec des cellules humaines in vivo. Ce modèle est couramment utilisé pour tester l’efficacité des cellules CAR-T. Le thymus des souris immunodéficientes adultes, qui joue un rôle majeur dans la maturation des lymphocytes T, ressemble à celui des patients atteints de déficits immunitaires ou conditionnés pour recevoir une transplantation de moelle osseuse. De nombreuses données sur l’étude de la différenciation des lymphocytes T humains chez ces souris sont disponibles, ce qui nous permettra d’évaluer l’efficacité des progéniteurs lymphoïdes produits par nos équipes dans un environnement similaire à celui des patients.

2 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une administration unique d'un composé par voie orale ou intraveineuse, puis jusqu'à trois prélèvements sanguins, pour étudier le devenir de molécules dans l'organisme. Le projet relève de l'évaluation préclinique d'inhibiteurs de kinases, la sélection des meilleures molécules étant située à "plus long terme". Le porteur affirme que les tests in vitro "ne constituent pas des méthodes alternatives" et que le recours au modèle animal est "indispensable".

Objectifs

Le projet s'inscrit dans un contexte de développement de nouvelles molécules thérapeutiques ciblées de la classe des inhibiteurs de protéines kinases conçues par "fragment based drug design", dans le but de traiter des pathologies à fort besoin médical en santé humaine: maladies inflammatoires, pathologies affectant le système nerveux périphérique et central, et cancers. L’approche du « fragment-based drug design », ou conception de médicaments par la méthode des fragments, consiste à assembler des petites molécules, ou molécules fragments, dirigées contre une cible thérapeutique choisie, dans le cadre d’une pathologie particulière. Chacun des fragments va contribuer à la spécificité de la molécule complète pour sa cible biologique. Ce projet se situera dans la phase d’évaluation préclinique du médicament qui marque les premiers pas de son développement. Les études précliniques ont pour but de collecter des données d’ordre pharmacologique, pharmacocinétique et toxicologique, le tout sur des modèles de protéines recombinantes, de cellules mises en culture et au sein d’organismes animaux vivants. Les études sur les modèles de cellules en culture des composés à tester auront déjà été évaluées en amont de ce projet, qui quant à lui permettra d’obtenir des informations d’ordre pharmacocinétique. L’étude de la pharmacocinétique in vivo d’un nouveau composé permet d’affiner la compréhension et l’analyse du devenir du composé dans l’organisme afin de mieux caractériser son mode d’action et appréhender de potentiels effets indésirables. L'objectif du projet est d'étudier l'effet du système biologique d'un organisme entier sur le devenir d'un composé test au cours du temps suivant son administration.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer les propriétés pharmacocinétiques de nouvelles molécules thérapeutiques ciblées dans le but de déterminer leur capacité à atteindre leur cible in vivo. Cela permettra d’optimiser leur posologie (dose et fréquence d’administration) pour l’évaluation de leur toxicité d’une part et de leur activité biologique sur des modèles murins de pathologies humaines d’autre part. Ce projet s'inscrit dans un contexte de thérapie ciblée qui regroupe un ensemble de traitements qui s’intègrent dans une stratégie thérapeutique dite « de précision ». Ce terme est utilisé en oncologie pour caractériser les médicaments qui ciblent spécifiquement une protéine et/ou un mécanisme impliqués dans le développement tumoral, de manière à les bloquer. En théorie leur cible n’est censée être présente (ou surexprimée) que dans les cellules tumorales de certains patients, ces médicaments sont donc à priori sans effet sur les cellules saines, en opposition aux cytotoxiques qui agissent sur leur cible mais aussi sur de nombreuses autres cellules (d’où leurs effets indésirables). A plus long terme cette évaluation de nouveaux composés a donc pour but de sélectionner les meilleures molécules thérapeutiques, présentant peu ou pas d'effets indésirables dus au traitement, pour le traitement de maladies à forts besoins médicaux non satisfaits (maladies neurodégénératives, inflammatoires et cancer) et ainsi améliorer la prise en charge des patients.

Procédures

Les animaux se verront administrer un composé test une fois par voie orale (quelques secondes) ou intraveineuse (inférieur à 1 minute). Des prélèvements de sang seront réalisés à différents temps après le traitement n’excédant pas 3 prélèvements par animal (durée du prélèvement inférieure à 1 minute).

Impact sur les animaux

L'effet indésirable attendu suite à l'administration d'une nouvelle molécule et suite aux prélèvements sanguins répétés est une perte de poids. Les animaux se verront administrer le composé test une fois : par voie intraveineuse pour la moitié d’entre eux, et par voie orale pour l’autre moitié. Des prélèvements de faibles volumes de sang (microsampling) seront faits au niveau de la veine caudale ou de la veine mandibulaire, 3 fois maximum par animal, répartis sur une durée maximale de 48h.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés, ils ne peuvent pas être réutilisés car cela risquerait d’introduire un biais dû aux possibles interactions entre les composés testés.

Remplacement

Les molécules testées dans ce projet sont systématiquement préalablement évaluées in vitro pour leur paramètres physico-chimiques, leur activité biologique, leur selectivité pour la cible visée et leur toxicité. Ces tests permettent de sélectionner les meilleures molécules candidates d'une part, et d'autre part d'avoir une première approche de la pharmacocinétique des composés (absorption, métabolisme), mais ils ne peuvent fournir l'ensemble des éléments caractérisant le devenir du composé dans un organisme vivant. Ils ne constituent donc pas des méthodes alternatives ou substitutives à la complexité d’un organisme vivant. L'effet de l’administration du composé test in vivo résulte de l'interaction entre de nombreux mécanismes physiologiques qui ne peuvent être reproduits in vitro. Le recours à l’utilisation d’un modèle animal est donc indispensable.

Réduction

En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, il est nécessaire d'avoir au minimum 3 prélèvements par temps pour obtenir des paramètres pharmacocinétiques fiables en tenant compte de la variabilité biologique. Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés nous utiliserons la technique du microsampling : des micro-prélèvements de sang seront réalisés sur un même animal à différents temps de prélèvements réduisant ainsi la variabilité des résultats et le nombre d'animaux nécessaires. Il n'est pas prévu de faire une étude statistique sur ce projet. Les effectifs seront limités à 9 animaux par groupe pour tenir compte de la variabilité biologique (3 animaux par temps de prélèvement) et du nombre de prélèvements répétés possibles (chaque animal sera utilisé pour 3 prélèvements maximum).

Raffinement

Afin de limiter le stress des animaux lors du projet et donc d'augmenter la fiabilité des résultats, une période d'acclimatation de 7 jours sera respectée avant le début de la procédure expérimentale. Durant cette période les animaux seront manipulés et habitués à la boite de contention qui sera utilisée pour réaliser les injections intraveineuses. Au cours de la phase expérimentale les animaux seront observés quotidiennement. Dans le cas de l’atteinte de l’un des points limites définis dans le projet l’animal sera euthanasié. Pour les prélèvements de sang, la technique de microsampling (rapide et entrainant une douleur légère liée à la piqure) sera utilisée.

Choix des espèces

Ce projet s'inscrit dans un contexte de développement d'inhibiteurs de kinases pour le traitement de pathologies dans différentes aires thérapeutiques : oncologie, maladies inflammatoires et pathologie du système nerveux. La majorité des modèles animaux développés pour ces pathologies sont des modèles de souris génétiquement modifiées, souris transgéniques pour les pathologies inflammatoires et système nerveux, souris immunodéficientes pour les modèles en oncologie. Afin de tester l'activité biologique in vivo des molécules développées il est donc nécessaire d'avoir recours à ces modèles murins. Dans ce projet il n'y aura pas d'induction de pathologie, cependant les résultats obtenus serviront pour la suite de l’évaluation préclinique du médicament (dose maximale tolérée et efficacité). Il est donc prévu d’utiliser des souris de même fond génétique que les souches nécessaires et choisies pour la cible thérapeutique considérée. De plus, la souris est un modèle tout à fait pertinent pour les études de pharmacocinétiques en raison de ses similitudes avec les humains dans les processus d'absorption, de métabolisme et d'élimination. Les animaux seront adultes, soit 8 à 10 semaines lors du début de l’étude, afin d’avoir un système immunitaire, hormonal et métabolique mature dans le but d’obtenir la réponse recherchée sans biais.

3 340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau sous anesthésie, puis l'administration de composés pendant 56 jours maximum, une à deux fois par jour, avec des prélèvements sanguins répétés et une ponction intracardiaque terminale. Le projet vise à confirmer l'activité antitumorale d'inhibiteurs de kinases avant un éventuel passage en clinique, les bénéfices pour les patients étant renvoyés au conditionnel et au long terme. Le porteur affirme que le recours à la souris est "indispensable" pour obtenir des résultats transposables à l'humain.

Objectifs

Le projet s'inscrit dans un contexte de développement de nouvelles molécules thérapeutiques ciblées de la classe des inhibiteurs de protéines kinases conçues par "fragment based drug design", dans le but de traiter des pathologies à fort besoin médical en santé humaine, notamment les cancers. L’approche du « fragment-based drug design », ou conception de médicaments par la méthode des fragments, consiste à assembler des petites molécules, ou molécules fragments, dirigées contre une cible thérapeutique choisie dans le cadre d’une pathologie particulière. Chacun des fragments va contribuer à la spécificité de la molécule complète pour sa cible biologique. Ce projet se situe dans la phase d’évaluation préclinique du médicament qui marque les premiers pas de son développement. Les études précliniques ont pour but de collecter des données d’ordre pharmacologique, pharmacocinétique et toxicologique, le tout sur des modèles de protéines recombinantes, de cellules mises en culture et au sein d’organismes animaux vivants. Pour chaque composé test les études sur les modèles de cellules en culture, la pharmacocinétique et l’évaluation de la dose maximale tolérée in vivo auront déjà été évaluées en amont de ce projet, qui quant à lui permettra d’obtenir des informations d’ordre pharmacologique in vivo. Les composés testés dans ce projet auront été préalablement sélectionnés pour leurs propriétés anti-tumorales vis-à-vis de certains types de tumeurs dans des tests cellulaires adaptés et pertinents. L’objectif du projet est donc de confirmer l’efficacité anti-tumorale attendue in vivo sur des modèles murins porteurs de tumeurs pertinents.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de confirmer l’activité anti-tumorale de nouvelles molécules thérapeutiques ciblées sur des modèles vivo bien caractérisés et pertinents. Ces données, en association avec celles obtenues in vitro et in vivo au préalable permettront de poursuivre (ou stopper) le développement du médicament vers les phases d’essais cliniques. Ce projet s'inscrit dans un contexte de thérapie ciblée qui regroupe un ensemble de traitements qui s’intègrent dans une stratégie thérapeutique dite « de précision ». Ce terme est utilisé en oncologie pour caractériser les médicaments qui ciblent spécifiquement une protéine et/ou un mécanisme impliqués dans le développement tumoral, de manière à les bloquer. En théorie leur cible n’est censée être présente (ou surexprimée) que dans les cellules tumorales de certains patients, ces médicaments sont donc à priori sans effet sur les cellules saines, en opposition aux cytotoxiques qui agissent sur leur cible mais aussi sur de nombreuses autres cellules (d’où leurs effets indésirables). A plus long terme cette évaluation de nouveaux composés a donc pour but de sélectionner les meilleures molécules thérapeutiques, présentant peu ou pas d'effets indésirables dus au traitement, pour améliorer la prise en charge des patients dans le traitement de différents cancers.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés avec une injection par voie intrapéritonéale, puis une incision sur le dos sera réalisée suivie d’une injection de cellules dans le tissus sous cutané. L’évolution pondérale des animaux et le suivi de la croissance tumorale seront faits au minimum 1 fois par semaine en même temps, et jusqu’à 3 fois par semaine pour les tumeurs à croissance rapide. Les animaux se verront administrer des composés pendant 56 jours maximum, 1 à 2 fois par jour maximum. Les administrations seront faites par injection du produit par voie orale ou intraveineuse ou intrapéritonéale ou sous-cutanée. Des prélèvements de faibles volumes de sang (microsampling) seront réalisés au niveau de la veine caudale ou de la veine mandibulaire dans le respect des volumes maximaux réglementaires. A la fin de la procédure expérimentale, les animaux seront anesthésiés avec une injection par voie intrapéritonéale et une ponction intracardiaque sera réalisée.

Impact sur les animaux

L’implantation de cellules tumorales aux animaux peut générer une perte de poids transitoire. De même l'effet indésirable attendu suite à l'administration des molécules et suite aux prélèvements sanguins répétés est une perte de poids. L’implantation sous cutanée de cellules tumorales peut entrainer un inconfort transitoire au niveau du site d’incision cutané et du site d’injection. Enfin, l'injection d'un composé test ou d'un anesthésique ou la piqure d'une aiguille pour un prélèvement peuvent générer un inconfort transitoire au niveau du site d'injection/piqure.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés, ils ne peuvent pas être réutilisés car cela risquerait d’introduire un biais dû aux possibles interactions entre les composés testés.

Remplacement

Les molécules testées dans ce projet sont systématiquement préalablement évaluées in vitro pour leur paramètres physico-chimiques, leur activité biologique, leur selectivité pour la cible visée et leur toxicité. Ces tests permettent de ne retenir que les meilleures molécules candidates et d'avoir une première estimation de leur efficacité in vitro sur un panel de lignées cellulaires tumorales humaines, mais ils ne permettent pas de prédire leur efficacité face à la complexité des mécanismes mis en jeu dans un organisme vivant. Les modèles précliniques se doivent de mimer la réponse thérapeutique chez l’homme, et idéalement les mécanismes prédictifs de résistance. Il convient donc d’utiliser des modèles qui reproduiront la physiopathologie des cancers chez l’homme le plus fidèlement possible. Les souris constituent des organismes-modèles présentant de multiples avantages, notamment liés à leur physiologie proche de l’homme. Le recours à l’utilisation de ce type de modèle animal est donc indispensable afin d’obtenir des résultats transposables chez l’homme.

Réduction

Des études préliminaires in vitro et in vivo ont été réalisées afin de déterminer les propriétés toxicologiques et pharmacologiques des composés testés dans ce projet, ceci permettant de ne tester que les meilleures molécules candidates et d’affiner la dose et la fréquence d’injection aux animaux. Dans le cadre de la thérapie ciblée, les modèles de lignées cellulaires utilisés dans ce projet sont préalablement caractérisés au niveau moléculaire (présence de la cible) afin de s’assurer qu’ils soient pertinents et donc susceptibles de répondre aux thérapies envisagées. En effet la maitrise des modèles permet de cibler uniquement les plus pertinents, de gérer la variabilité attendue, notamment le taux de prise de greffe, et donc de réduire au strict nécessaire le nombre d’animaux greffés pour réaliser une étude d’efficacité pertinente. Le nombre d'animaux par groupe a été determiné de manière statistique afin d'obtenir des résultats analysables avec un test statistique. La réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet passe également par l'optimisation de l'utilisation des groupes contrôles : dans la mesure du possible des études pourront être définies pour tester plusieurs molécules en parallèles afin de limiter l’utilisation d’animaux dans les groupes contrôles.

Raffinement

Afin d’éviter un stress des animaux lors du projet et donc d'augmenter la fiabilité des résultats, les animaux seront manipulés et habitués aux conditions expérimentales au cours de la période d’acclimatation. Au cours de la phase expérimentale les animaux seront observés quotidiennement. Leur évolution pondérale et le suivi de la croissance tumorale seront faits au minimum 1 fois par semaine, et jusqu’à 3 fois par semaine pour les tumeurs à croissance rapide. Des limites ont été définies dans le projet pour renforcer le suivi des animaux lorsqu’ils se rapprochent d’un point limite nécessitant une euthanasie, notamment au niveau des pertes de poids. Si un animal devait atteindre l’un de ces points limites il sera euthanasié. Lors de la greffe de tumeurs les animaux recevront un anesthésique et un tranquillisant afin d'éviter un stress ou une douleur. Il en sera de même pour les prélèvements de sang terminaux en fin de phase expérimentale. Pour des prélèvements de sang de faible volume au cours de la phase expérimentale, la technique de microsampling (rapide et entrainant une douleur légère liée à la piqure) sera privilégiée car elle offre la possibilité de réaliser des prélèvements répétés sur le même animal en s’affranchissant des biais interindividuels et en réduisant le nombre total d’animaux nécessaires.

Choix des espèces

Ce projet s'inscrit dans un contexte de développement d'inhibiteurs de kinases pour le traitement de pathologies dans différentes aires thérapeutiques, notamment en oncologie qui constitue le sujet de ce projet. Les modèles implantables ou de greffe dans lesquels des cellules humaines (xénogreffes) ou murines (allogreffes), préalablement cultivées in vitro, sont greffés sur des souris immunodéficientes ou immunocompétentes, sont des modèles animaux indispensables et systématiquement utilisés pour la découverte, la caractérisation et le développement de candidats médicaments en oncologie. Il est donc nécessaire d'y avoir recours pour tester l'activité anti-tumorale in vivo des molécules testées dans ce projet. Nous cherchons à nous rapprocher de la physiopathologie cible du composé développé afin de pouvoir transposer nos résultats à l’homme, les animaux doivent donc être adultes au début de la phase de traitement. De plus, nous devons prendre en compte la période de latence nécessaire avant traitement pour avoir des tumeurs bien implantées, et le fait que le taux de prise de greffe diminue avec l’âge chez certaines souris immunodéficientes. Les animaux seront donc implantés au stade de jeunes adultes, soit un âge de 6 à 9 semaines environ.