Cancers

1 785 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur de prostate sous la peau puis des injections répétées pendant quatre à six semaines, pour tester des nanoformulations à base de carbone ciblant le métabolisme des cellules cancéreuses. Le porteur indique que la greffe peut provoquer une douleur au site d'incision, une infection et une inflammation, et que toutes les souris sont mises à mort pour collecter des tissus. Il affirme qu'aucune méthode de remplacement "pertinente" n'existe et qualifie la xénogreffe d'"indispensable", les retombées cliniques étant renvoyées au potentiel.

Objectifs

Le cancer de la prostate (CaP) représente 1 276 000 nouveaux cas et 360 000 décès dans le monde par an (57 000 cas, 9 000 décès en France). Il est dépisté par mesure du PSA (Antigène Spécifique de la Prostate) et toucher rectal. Aux stades localisés, des traitements curatifs existent : la chirurgie, la radiothérapie et la Curiethérapie, et des ultrasons. Au stade métastatique, l’hormonothérapie est le traitement de 1ère ligne, avec cependant une problématique de taille, l’échappement hormonal, qui fait que le cancer reprend son développement. Il s’agit d’un cancer complexe et hétérogène pour un même patient et entre les patients, et impliquant de multiples processus moléculaires permettant aux cellules tumorales d’échapper à la mort, rendant les traitements difficiles. Pour améliorer la survie des patients de nouvelles avancées sont nécessaires, tant pour le diagnostic que pour le traitement de la maladie. Dans ce projet ciblé sur le cancer de la prostate, nous allons développer des molécules chimiques innovantes qui permettent de combiner de la chimiothérapie et de la thérapie génique qui permet d’éteindre un gène d’intérêt important pour le développement tumoral.

Bénéfices attendus

Notre projet va optimiser au niveau préclinique l’utilisation de nanoformulations à base de carbone pour un double ciblage cellulaire du métabolisme. Les retombées de notre projet ont des implications potentielles très importantes pour la clinique. Nos résultats permettront ainsi d’ouvrir de nouvelles perspectives pour le traitement du cancer de la prostate. Du fait que les patients deviennent résistants aux thérapies anti-tumorales classiques dans ce cancer, il y a un besoin urgent de découvrir, de développer et valoriser de nouvelles alternatives thérapeutiques pour une meilleure prise en charge des patients aux stades avancés de la maladie. Récemment, de nouvelles opportunités ont émanées de laboratoires de recherche travaillant sur des composés ciblant le métabolisme cellulaire et l’apport en oxygène des cellules tumorales. Nos résultats antérieurs supportent largement notre hypothèse et valident le rationnel de ce projet. Ainsi, nous pourrons apporter de nouveaux outils pour cibler le métabolisme des cellules cancéreuses grâce à ces propriétés uniques des nanoformulations à base de carbone.

Procédures

Les animaux recevront un implant tumoral sous-cutané au cours d’une intervention chirurgicale sous anesthésie générale. La chirurgie durera 5 minutes. Le volume tumoral sera suivi par mesure hebdomadaire à l’aide d’un pied à coulisse électronique. Ils recevront des injections sous anesthésie générale répétées sur 4 à 6 semaines, à raison de 2 injections par semaine durant environ 15 secondes.

Impact sur les animaux

Comme il s’agit de greffer des petits morceaux de tissus tumoraux, il est possible qu’il y ait une douleur au site d’incision, et une infection au point de suture. Une inflammation au site d’injection est aussi possible.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin des expérimentations afin de collecter un maximum de tissus afin de procéder à des analyses complémentaires et soulager les douleurs éventuelles.

Remplacement

Le cancer de la prostate, comme beaucoup de cancer, se caractérise par une grande variabilité cytogénétique entre les individus et hétérogénéité au sein même de la tumeur. La réalisation d'études précliniques fiables nécessite l'utilisation de modèles reproduisant fidèlement ces caractéristiques des tumeurs humaines. Or, les modèles d'étude se basant sur les lignées cancéreuses clonales ne reflètent pas l'hétérogénéité de la tumeur in situ. De même, pour les systèmes de culture 3D en cours de développement qui ne permettent pas encore d’obtenir des résultats projetables à l’homme. Par conséquent, aucune méthode de remplacement pertinente n'existe à ce jour. Il est donc indispensable d’utiliser le modèle de xénogreffe de tumeur de patients, seul capable de reproduire les caractéristiques de la pathologie humaine.

Réduction

Nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux utilisés pour les différentes étapes du projet, notamment en réduisant le nombre de réimplantation lors de la stabilisation des modèles de xénogreffe et en réalisant des études pilotes pour valider les voies d’administration des traitements. Le nombre d’animaux a été calculé statistiquement (calcul de puissance) afin d’être réduit à son minimum tout en permettant d’atteindre les objectifs du projet. Dès que les objectifs seront atteints, ou en absence d’effet des traitements, aucun animal supplémentaire ne sera inclus permettant de réduire encore les effectifs.

Raffinement

Le raffinement sera assuré par un enrichissement des cages pour le confort des animaux (des bâtons à ronger pour limiter les querelles ; des carrés de coton pour une nidification ; des igloos, permettant le jeu et le repos). Les souris seront nourries et hébergées en groupe ; elles ne seront séparées qu'en cas de comportement agressif avec induction de plaies. Nous diminuerons la douleur et l'angoisse liées à la xénogreffe en opérant sous anesthésie générale, avec une anesthésie locale au site d’implantation, et en appliquant une analgésie péri- et post-opératoire. Les animaux seront maintenus au chaud sur un tapis chauffant pendant la phase de réveil, phase pendant laquelle les animaux seront surveillés en continu. De plus, nous avons établi des points limite qui mettront fin à l’expérimentation en cas de souffrance et d’inconfort des animaux.

Choix des espèces

Les pathologies cancéreuses en général se caractérisent par une grande variabilité cytogénétique (variation de l’ADN des cellules tumorales) entre les individus et sont généralement hétérogènes au sein même de la tumeur. Or, jusqu'à présent, les modèles d'étude en oncologie se basent sur les lignées cancéreuses clonales qui ne reflètent pas l'hétérogénéité de la tumeur in situ. Par ailleurs, les modèles expérimentaux in vitro ne prennent pas en compte le rôle du microenvironnement dans le développement tumoral. Ainsi, malgré le développement de cultures 3D dont la mise en place reste difficile, les modèles animaux s'avèrent donc indispensables pour la recherche translationnelle en oncologie. Le modèle expérimental décrit dans ce projet nécessite l'utilisation d'animaux immuno-déprimés pour permettre la greffe d'un tissu étranger. Les greffes seront réalisées sur des souris jeunes âgées de 5 à 6 semaines afin d’avoir un système immunitaire encore très peu mature, permettant d’assurer une prise de greffe optimale.

1 500 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de tumeur sous la capsule du rein, des traitements par voies multiples et des séances d'imagerie sous anesthésie, la tumeur pouvant produire des métastases pulmonaires et une perte de poids, avant d'être tué. Le porteur, société "prestataire de services en recherche préclinique", décrit son offre de modèles tumoraux destinés à sélectionner des molécules pour l'industrie. Il affirme que les méthodes alternatives ne prédisent pas l'efficacité in vivo et que la reconstruction de tumeurs en 3D reste "marginale".

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre International de Recherche contre le Cancer. Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement.

Bénéfices attendus

Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveaux composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Les modèles de ce projet sont des modèles orthotopiques rénaux ou des modèles dont la prise tumorale est faible dans des tissus communément utilisés (sous cutané par exemple) et dont la greffe en sub-capsulaire rénale améliore la prise tumorale, grâce à la forte vascularisation du rein. Pour certains modèles, les masses tumorales primaires greffées peuvent disséminer et créer des métastases. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme dans le cas des tumeurs de rein greffées par voie orthotopique, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tumorale tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

L’implantation de transpondeur pour identifier l’animal est réalisée sous anesthésie générale 0-3 jours avant la greffe (

Impact sur les animaux

Il pourra être nécessaire de mettre en place un implant sous cutané de diffusion hormonale pour les tumeurs hormonodépendantes, lors d’une chirurgie stérile sous anesthésie avec analgésie. Cela pourra entrainer une douleur modérée et un stress léger sur 1-2 jours. La greffe tumorale en subcapsulaire rénal (réalisée sous anesthésie générale et analgésie) pourra engendrer une douleur modérée sur 1-2 jours et un stress modéré. L’évolution de la tumeur pourra entraîner un développement de métastases pulmonaires causant des difficultés respiratoires, une perte de poids. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress de 1-2 jours. Les animaux pourront recevoir des traitements par voie intra-musculaire (avec analgésie), intradermique (avec analgésie) , sous-cutanée, intraveineuse (bolus), orale, intranasale, intra tumorale, intrapéritonéale et / ou seront exposés à des rayons ionisants à visée thérapeutique. Ces traitements pourront entrainer un stress léger et une douleur légère. Dans le cas des rayons ionisants, les animaux seront transportés dans leur cage d’origine vers la plateforme d’irradiation. Cela pourra entrainer un stress léger. Dans le cas de l’imagerie, les animaux seront transportés dans leur cage d’origine vers la plateforme d’imagerie et imagés sous anesthésie générale. Cela pourra entrainer un stress léger. Les prélèvements de sang peu invasifs (veine faciale, jugulaire, caudale) seront effectués sous anesthésie générale à l’Isoflurane. Cela pourra entrainer un stress léger. Dans certains cas, comme par exemple pour le prélèvement à la veine caudale ou à la veine saphène, le geste pourra être effectué sans anesthésie, uniquement sous contention. Cela pourra entrainer un stress modéré pendant le prélèvement. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation

Devenir

Etant porteurs de tumeurs les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (volume tumoral et/ou poids). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et aux paramètres étudiés : en général un groupe non traité et/ou traité par le véhicule utilisé pour la molécule à évaluer, puis un groupe par schéma de traitement (différentes doses, voies, molécules etc). Au minimum, une étude comportera un groupe avec tumeur, non traité et/ou traité avec le véhicule, et un groupe avec tumeur traité avec le composé à tester. Toutefois, dans la mesure du possible, le maximum de composés seront testés au cours de la même étude afin de ne pas démultiplier les animaux contrôles ainsi que les animaux surnuméraires non randomisés. Compte tenu de taux de prise tumorale variable et afin de pouvoir former des groupes homogènes en poids et/ou en volume tumoral, il sera en général nécessaire d’inclure au moins 10% d’animaux non randomisés. Le nombre d’animaux par groupe (en général 6 à 15 animaux) est choisi sur la base des précédentes études réalisées dans nos laboratoires pour les modèles connus afin de sélectionner le nombre d’animaux minimum pour observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et volume tumoral). Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal pour remplacer des analyses terminales en cours d’étude.

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine. Un gel nutritif et de l’eau gélifiée seront placés au fond de toutes les cages dès qu’une perte de poids >15% sera observée sur certains animaux en étude. La greffe subcapsulaire rénale, la pose d’implants hormonaux ou la thoracotomie seront réalisés sous anesthésie profonde avec injection pré-opératoire d’un opiacé et un alpha2 agoniste. Suite à la greffe du matériel tumoral en subcapsulaire rénal ou suite à la pose d’un implant, les animaux recevront 2 injections d’opiacé pendant 48, et éventuellement sur 24 heures supplémentaires si besoin. Les autres administrations et prélèvements seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress (intraveineuse, prélèvement d’urine) ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Les administrations douloureuses (intramusculaire, intradermique) seront réalisées avec analgésie préalable, et sous anesthésie si besoin. Les points limites concernant le poids sont adaptés en cas de tumeurs cachectiques. Dans les modèles connus pour induire des métastases pulmonaires, ou les modèles inconnus pouvant causer des métastases pulmonaires, une attention particulière sera portée à la respiration des animaux (posture, fréquence respiratoire). Les difficultés respiratoires marquées constitueront un point limite. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans la procédure. Si l’un des signes cliniques liés aux points limites est observé, l’animal est mis en observation et un traitement est si possible mis en place. Par exemple, en cas de douleur constatée, le vétérinaire prescrira un traitement antalgique. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus suite à l’induction de pathologie cancéreuse et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux. En cas de toxicité sur l’animal, un arbre décisionnel validé par la SBEA (structure chargée du bien-être animal) sera utilisé. Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie pour sortir l’animal de la procédure

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou induites) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation).

466 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ablation des testicules, puis des injections intrapéritonéales quotidiennes et des gavages pendant 28 jours, pour tester deux molécules contre la récidive du cancer de la prostate après castration. Le porteur indique que le gavage comporte un risque de perforation de l'oesophage et de détresse respiratoire, et que les injections répétées peuvent irriter la zone d'injection. Il affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit les stades du développement tumoral et que la validation chez la souris est "nécessaire".

Objectifs

Le cancer de la prostate est le cancer le plus diagnostiqué chez les hommes en France et le second en termes de mortalité par cancer. Pour les cancers de la prostate invasifs sa seule thérapeutique proposée est la castration chimique (déprivation en androgène) qui est, dans un premier temps efficace, mais dans 100% des cas la tumeur récidive en étant agressive (métastases). Dès lors, il n’existe aucun traitement efficace conduisant inéluctablement au décès du patient. Une équipe de recherche a identifié des cellules potentiellement initiatrices de cette récidive tumorale dans la prostate chez la souris, Dans un modèle de souris génétiquement modifié développant un cancer de la prostate résistant à la castration, le contingent de ces cellules est fortement amplifié. Ces cellules alors ont pu être isolées et caractérisées, ce qui a permis d’une part de montrer que cette population était constituée de plusieurs sous populations et de déterminer deux cibles thérapeutiques théoriques exprimées par ces cellules de la sous population la plus agressive. En utilisant deux drogues, chacune agissant sur une des deux cibles, nous montrons que ces drogues sont très efficaces pour tuer ces cellules et que leur effet est additif dans un modèle de culture de ces cellules en 3D, et ce en présence et en absence d’androgènes. Ces cellules ont aussi été identifiées chez l’Homme. Sur une lignée cellulaire humaine de ce type de cellules issue d’une tumeur prostatique de patient, nous avons montrés la même efficacité de ces drogues. L’objectif de ce projet est, chez le modèle de souris génétiquement modifié qui développe des tumeurs prostatiques résistantes à la castration : - d’une part de caractériser finement les sous populations cellulaires identifiées et ce, notamment post-castration, - d’autre part d’évaluer/confirmer l’impact thérapeutique de ces deux composés chimiques sur le développement et la récidive tumorale directement. Ces deux drogues seront administrer seule ou en combinaison chez la souris castrée ou non.

Bénéfices attendus

Pour améliorer la survie des patients développant des cancers de la prostate résistant à la castration, il est nécessaire de comprendre les mécanismes à l’origine de la récidive tumorale et notamment d’identifier les cellules à son origine, afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les études préliminaires in silico et in vitro ont permis d’identifier une nouvelle population cellulaire présentant toutes les propriétés théoriques recherchées. Des résultats et des tests fonctionnels in vitro de sur ces cellules ont permis de déterminer deux cibles potentielles majeures dont l’inhibition pourrait affecter la survie de ces cellules. Ce projet permettra de mieux caractériser ces cellules afin de comprendre l’évolution de leurs sous-populations au cours de divers traitements, dont la castration, et de confirmer l’efficacité de l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques, seul ou en combinaison pour empêcher ou ralentir la récidive tumorale. Les tests seront basés sur le traitement d’un modèle murin développant des formes de cancer de la prostate résistant à la castration.

Procédures

Les interventions subies par les animaux seront : - 1- Des chirurgies (ablations de testicules) de 15 min sous anesthésie gazeuse et sous analgésique (injection sous cutanée 30 min avant l’intervention puis à J+1 et à J+2 si nécessaire). - 2- Des traitements en injections (de moins d’une minute) intra péritonéal de drogues quotidiennement pendant 28 jours. - 3- Des traitements en gavage (de moins d’une minute) bi-hebdomadaires pendant 28 jours. Chaque animal subira une combinaison de ces interventions: dans un cas, l’ensemble des souris, sera soumis à l’intervention 1. Dans un deuxième cas les animaux seront soumis aux interventions selon leur groupe : - 108 souris subiront une chirurgie de castration (intervention 1) puis les animaux recevront des traitements comme suit : • 36 souris seront soumises à l’intervention 2 uniquement ; • 36 souris seront soumises à l’intervention 3 uniquement ; • 36 souris seront soumises aux interventions 2 et 3. - 108 autres souris recevront des traitements comme suit : • 36 souris seront soumises à l’intervention 2 uniquement ; • 36 souris seront soumises à l’intervention 3 uniquement ; • 36 souris seront soumises aux interventions 2 et 3.

Impact sur les animaux

L’ablation des testicules est un acte non douloureux car réalisé sous anesthésie et analgésie mais il peut occasionner une hypothermie, une déshydratation et l’asséchement des yeux. Suite à la chirurgie, les animaux peuvent souffrir et la plaie chirurgicale peut présenter des signes d’inflammation ou d’infection. Les anesthésies lors des chirurgies sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections intra péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection.

Devenir

Chaque animal intégré sera mis à mort : - soit parce qu’il atteint avant la fin un score supérieur ou égale à 3 de la grille d’évaluation indiquant une souffrance nécessitant sa mise à mort. - soit parce qu’il est un animal d’intérêt ou contrôle pour lequel il est nécessaire à la fin de prélever la prostate afin d’évaluer l’efficacité du traitement testé.

Remplacement

Nous avons dans un premier temps mené l’étude par différentes approches pour aborder ces questions, incluant, des études de prédiction par analyse bio-informatiques de données transcriptomiques, des cultures cellulaires 2D et 3D in vitro, selon le principe de Remplacement. Pour remplir nos objectifs, nous sommes contraints d’utiliser des modèles murins, car aucun système in vitro et aucun modèle d’organismes plus simples ne permet de reproduire les différents stades du développement tumoral prostatique et de sa récidive post-castration.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est une estimation permettant de couvrir les diverses études que nous réaliserons sur 5 ans. Il est important de noter qu’une souris permettra de réaliser plusieurs études in vitro par différentes méthodes de biologie cellulaire ou moléculaires. La multiplicité des tests réalisés grâce à une souris permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisé au cours de nos études. Une validation in vivo de l’efficacité des inhibiteurs testé in vitro est cependant nécessaire après validation sur divers modèles cellulaires. Selon le principe de Réduction, le nombre d'animaux utilisé in vivo pour valider ces données est calculé pour permettre d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. En revanche, des animaux pourraient être écartés de l’étude, il est donc nécessaire de prévoir un effectif légèrement supérieur à celui calculé dans cette section. C’est pour cette raison que nous avons fixé un nombre final de 18 animaux par condition, tenant compte de tous ces paramètres.

Raffinement

Pour s’assurer du bien-être des souris tout au long de leur vie, elles bénéficieront de coton, de maisonnettes, de tunnels et de bâtonnets de bois à ronger afin de les occuper et afin qu’elles puissent se construire un nid. Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie. A la suite des chirurgies, la personne en charge du protocole les observera tous les jours (pendant une semaine) et une fois par semaine par la suite. A leur entrée en traitement, elles seront pesées tous jours pendant les 28 jours. Afin de réduire la douleur associée à la castration, la chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale. Un analgésique sera administré en pré- et post-opératoire. A la suite de la chirurgie la souris sera réveillée au chaud et surveillée pendant les heures qui suivent et la bonne cicatrisation sera observée tous les jours durant la semaine qui suit l’opération par la personne en charge du protocole. Des points limites spécifiques ont été définis. Tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort. Si, pour des raisons de protocole (mise à mort de certains congénères ayant atteint un point limite), une souris devait se retrouver seule dans une cage, l’enrichissement sera augmenté.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, les modèles animaux créent le lien indispensable entre les tests in vitro et les études cliniques. Les animaux seront pour une première partie castrés entre 3 et 13 mois afin de regarder l’effet de l’orchidectomie sur des populations cellulaires, avant et après avoir laissé les structures tumorales se développer. Après la castration, les animaux seront mis à mort après un lapse de temps pouvant aller de 5 jours à 6 mois maximum (si la castration s’est faite entre 3 à 7 mois d’âge). Les animaux dans une deuxième partie subiront à partir de 6 mois une orchidectomie, afin d’attendre la mise en place du développement tumoral avant de les castrer. Ils seront ensuite traités à 8 mois. S’ils ne subissent pas d’orchidectomie, mais reçoivent uniquement le traitement, les animaux seront traités à partir de 8 mois afin de comparer l’efficacité du traitement entre le groupe de souris non castrées et le groupe de souris castrées.

4 011 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées de médicament et de cellules cancéreuses, une incision de la glande mammaire sous anesthésie, de nombreux prélèvements sanguins et jusqu'à sept séances d'imagerie, pour comparer des nanoparticules censées mieux cibler les tumeurs du sein HER2 positives. Le porteur reconnaît des nuisances tumorales, perte de poids et nécrose, et prévoit une mise à mort selon des points limites. Il qualifie la recherche de nouveaux traitements d'"indispensable" et renvoie les bénéfices pour les patientes, une toxicité réduite, au conditionnel.

Objectifs

Le cancer du sein est le premier cancer chez la femme en France, dont 10 à 20% sont HER2 positifs (protéine exprimée à la surface des cellules positives). Cependant, des résistances aux traitements proposés actuellement se développent, et la toxicité systémique (toxicité qui affecte l’ensemble de l’organisme) des traitements existants reste problématique. Il reste donc indispensable de chercher de nouveaux traitements contre le cancer du sein. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est de valider l’efficacité thérapeutique de nouvelles molécules associées à des nanoparticules ciblant HER2, réduisant les effets secondaires dans le traitement du cancer du sein. Nous espérons ainsi ouvrir de nouvelles pistes pour résoudre cette problématique de santé publique.

Bénéfices attendus

Menée à bien, cette étude devrait permettre de connaître la place des différentes nanoparticules dans l’arsenal thérapeutique actuel du cancer du sein. La comparaison des différentes nanoparticules ciblées devrait permettre de mieux comprendre l’influence de la taille et de la composition des nanoparticules sur le ciblage de la tumeur, et de montrer leur intérêt d’un point de vue pharmacocinétique. Cela montrera l’intérêt des nanoparticules pour réduire les toxicités associées aux traitements du cancer du sein humain grâce à l’amélioration de la pharmacocinétique par rapport aux chimiothérapies classiques.

Procédures

- Un groupe de 700 souris subira 1 injection du médicament sur animal vigile d’une durée de 10 secondes, puis 2 prélèvements sanguin à deux jours d’intervalle, sous anesthésie (durée : environ 30 secondes). Les souris subiront cette séquence d’une semaine sur 4 semaines (4 injections et 8 prélèvements au total). - Un groupe de 2100 souris subira 1 injection du médicament sur animal vigile d’une durée de 10 secondes, puis un prélèvement sanguin sous anesthésie terminale (sans réveil) (durée : 30 secondes). - Un groupe de 210 souris subira 2 injections de cellules cancéreuses (10 secondes chacunes) sur animal anesthésié, puis une injection du médicament (7 à 15 jours après) sur animal vigile d’une durée de 10 secondes ; puis sera observée à 7 temps différents par imagerie sous anesthésie (durée : 30 secondes) réparties sur 3 jours. - Un groupe de 1001 souris subira 1 incision sous anesthésie et analgésique (durée 10 secondes) suivie d’une injection de cellules cancéreuses dans la glande mamaire sous anesthésie et analgésique (durée 10 secondes), puis 10 à 20 jours plus tard, huit injections du médicament (10 secondes) sur animal vigile, et deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’étude (4 mois maximum), une injection de la luciférine (nécessaire à l’imagerie) sur animal vigile (durée 10 secondes) suivie de l’examen en imagerie (durée 1 min) sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Il n’y a pas de nuisances attendues sur les souris saines autre que la toxicité éventuelle de la molécule à haute dose (perte de poids, perte de poils). Le poids, le comportement et l’apparence physique de la souris sera alors contrôlée quotidiennement pour l’euthanasier selon des points limites prédéfinis. Les nuisances attendues pour l’incision du flanc sont des douleurs au niveau de la zone incisée. Les nuisances attendues pour les souris porteuses de tumeurs sont la nuisance due à la tumeur : perte de poids, nécrose, etc. Le poids, le comportement et l’apparence physique de la souris sera alors contrôlée quotidiennement pour l’euthanasier selon des points limites prédéfinis. Après injection intraveineuse, des irritations au point d’injections peuvent apparaître et seront surveillés.

Devenir

Les souris sont prélevées post-mortem pour des analyses ultérieures, elles seront donc toutes mises à mort. Les souris dont la pousse tumorale n'a pas prise seront mises à mort car elles ont étés injectées avec des cellules tumorales.

Remplacement

Nous avons préalablement réalisé des études in vitro afin de remplacer en partie l’expérimentation in vivo autant que possible, mais à ce stade du projet, l’utilisation de modèles animaux reste inévitable pour examiner l’aspect translationnel de nos travaux. En effet, cette étude préclinique, visant à évaluer la pertinence clinique de l’utilisation des nanoparticules pour le traitement du cancer du sein nécessite obligatoirement l’utilisation d’animaux entiers pour déterminer la biodistribution des nanoparticules, leur pharmacocinétique et leur efficacité.

Réduction

Les effectifs sont justifiés par l’importante variabilité des résultats obtenus pour l’efficacité du traitement pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre de paramètres mesurés par animal a été optimisé et nous avons privilégié les études longitudinales lorsque cela était possible grâce au suivi par imagerie non invasive et non irradiante (croissance tumorale et biodistribution des formulations dans les modèles de souris porteuses du cancer du sein). Une étude préliminaire, avec un nombre restreint de groupes conditionnera la suite du projet, le nombre d’animaux annoncé est donc un nombre maximum.

Raffinement

Toutes les manipulations susceptibles de générer de l’inconfort ou de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale. Un analgésique sera localement appliqué sur les sites d’ouverture de la souris. Les souris seront observées quotidiennement et la croissance des tumeurs sera mesurée tous les 3 jours. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin d’éviter toute souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en portoir ventilés en groupe sociaux selon les normes en vigueur avec des conditions d’hébergement et d’enrichissement de leur environnement conformes à la validation de la structure du bien-être animale.

Choix des espèces

La raison la plus importante du choix des souris pour nos études est leur similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. La plupart des antécédents génomiques de la souris sont similaire à ceux de l’homme (env. 95%), ce qui rend les souris particulièrement utiles pour la recherche sur les maladies humaines. Les souris seront utilisées à partir de l’âge de 6-8 semaines, âge adulte de manière à avoir un poids corporel plutôt stable d’environ 20g.

482 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie sont des souriceaux nouveau-nés soumis à des injections dans le foie pour caler le geste technique, avec une mortalité attendue, les autres reçoivent une greffe tumorale et des injections répétées sur plusieurs semaines. Le porteur teste des cellules progénitrices modifiées contre un lymphome, l'application clinique restant présentée comme un espoir à valider. Il affirme qu'aucun modèle in vitro n'obtient des globules blancs matures et que seule la xénogreffe le permet.

Objectifs

Une nouvelle approche thérapeutique pour traiter les patients atteints de cancer consiste à prélever leurs globules blancs en les modifiant pour leur permettre de reconnaitre et de cibler des protéines présentes à la surface des cellules cancéreuses. Après réinjection aux patients, ces cellules modifiées sont ainsi capables de reconnaitre et de détruire spécifiquement les cellules cancéreuses. Elles représentent aujourd’hui un espoir dans le traitement de certaines leucémies réfractaires ou en rechute et ont considérablement amélioré le résultat global des patients. Cependant plusieurs obstacles restent à résoudre dans ce domaine. Tout d'abord, malgré un taux élevé de patients montrant une réponse complète à ce traitement par thérapie cellulaire, la rechute de la maladie reste un défi important avec des taux de survie sans progression inférieurs à 50 %. Après le traitement, la survie à 3 ans est de seulement 16,1 %. Plusieurs raisons expliquent cet échec à obtenir des rémissions durables. La perte précoce, la faible expansion et l'épuisement des cellules thérapeutiques modifiées, sont des facteurs d’échec importants. La reconstitution tardive des cellules immunitaires effectrices possédant une activité anti-tumorale après la thérapie cellulaire, représente un autre défi important. Cette immunodéficience augmente non seulement les risques de rechute, mais entraîne également un taux important d’infection post-greffe. Dans ce contexte, une stratégie d'implantation de cellules progénitrices pourrait contourner certains de ces principaux défis (disponibilité immédiate, expansion efficace et réponse antitumorale durable) en accélérant la reconstitution d'un thymus chez les patients. Le modèle animal développant une tumeur de lymphome, ainsi que l’efficacité des cellules thérapeutiques modifiées matures ont été validés précédemment. Dans le cadre de ce projet, nous allons évaluer l’effet thérapeutique des cellules progénitrices, en suivant notamment la régression des tumeurs, la maturation des cellules anti-cancéreuses et leur persistance in vivo.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de valider et justifier la mise en place d'une stratégie thérapeutique utilisant des cellules progénitrices, et donc d'une plateforme de développement de ces cellules à visée d'utilisation clinique. L’acquisition de ces données est indispensable au développement de cette thérapie innovante, à fort potentiel translationnel. Cette stratégie pourrait offrir des réponses anti-cancéreuses durables et efficaces en contournant les obstacles majeurs reportés à ce jour dans le domaine des immunothérapies pour le cancer.

Procédures

Durant cette étude, nous procéderons à : - des injections intrahépatiques (1X; durée 5 sec); - des injections par voie sous-cutanée (1X/sem pendant 5 semaines; durée 5-10 sec); - des injections par voie intraveineuse (1 ou 2X selon la procédure; durée 2-3 minutes); - des injections par voie intrapéritonéale (6X/sem pendant 6 à 14 semaines selon la procédure; durée 5-10 sec); - des anesthésies sous isoflurane (1X/semaine, pendant 5 à 13 semaines selon la procédure; durée 20 min maximum ); - des prélèvements sanguins par ponction dans la veine temporale superficielle (1X ou 3X maximum selon la procédure; durée 2-3 min); - un prélèvement sanguin par ponction intracardiaque (1X, après euthanasie).

Impact sur les animaux

Les animaux seront maintenus en hébergement en cage individuelle ventilée et manipulés sous hotte par du personnel compétent pour éviter tout risque d’infection lié à leur immunodéficience. Lors de la mise au point de la technique d’injection intra-hépatique, une perte du nombre d’animaux peut être attendue en raison du jeune âge des animaux, ainsi que du rejet de la mère après les manipulations. Par ailleurs, les cellules matures pourraient occasionner au long cours une réaction des globules blancs humains contre les tissus de souris. Cet effet peut être observé chez la souris immunodéficiente greffée depuis plus de six mois avec des cellules-souches sanguines humaines. Bien que cet effet soit moins attendu avec les cellules progénitrices grâce à leur maturation dans le thymus de la souris, et donc une tolérance contre les cellules murines, la durée de nos études ne dépassera pas six mois pour éviter cet éventuel effet indésirable. D'autre part, ce projet comprenant l’apparition de tumeurs, le bien-être des animaux sera surveillé de manière attentive. Le poids des animaux et la croissance tumorale suivie par imagerie seront ainsi enregistrés tout au long de l’étude. Enfin, des difficultés respiratoires peuvent apparaitre, signe de présence de cellules tumorales au niveau des poumons, ou de métastases.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des procédures afin de prélever le sang en vue d'analyses post-mortem.

Remplacement

Toutes les étapes visant à améliorer la performance du produit de thérapie cellulaire ont été mises au point avec des expériences exclusivement in vitro et notamment des caractérisations du produit final par des méthodes de séquençage et d'analyse de populations cellulaires. Néanmoins il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro permettant d’obtenir les globules blancs matures du point de vue fonctionnel. La seule méthode existante consiste en un système de co-culture des cellules-souches sanguines avec des cellules-souches nourricières . Bien que ce modèle permette d’obtenir des globules blancs exprimant les marqueurs de différenciation, les cellules n’atteignent pas la maturité fonctionnelle. Seule l’injection dans un modèle de xénogreffe permettra de répondre à ce point, modèle où le greffon provient d'une espèce différente du receveur, respectivement cellules d'origine humaine implantées dans un modèle de souris. Cette xénogreffe permettra la maturation et la différenciation complète des progéniteurs des globules blancs dans l’environnement du thymus de la souris. Les expériences chez l’animal interviennent donc au terme d’un long processus et s’inscrivent dans le cadre d’une validation in vivo de l’effet thérapeutique de ces cellules avant un développement clinique.

Réduction

La première étape de ce projet vise à acquérir le geste technique d’injection intra-hépatique chez le souriceau nouveau-né, notamment la reproductibilité du mode opératoire et l’inter-opérabilité, ainsi que le suivi de la survie des animaux. Nous utiliserons à cet effet 4 portées par stade post-natal, soit environ 152 souriceaux agés de 0 à 3 jours. Il n'y aura pas d'analyse statistique pour cette première étape de mise au point technique. La deuxième étape du projet consiste à injecter les cellules progénitrices et à valider leur effet thérapeutique dans un modèle de cancer . Le produit avec lequel nous envisageons d’effectuer les tests fonctionnels in vivo a été optimisé au préalable, augmentant ainsi la probabilité d’obtention de réponses favorables dès les premières séries d’expérimentations. Par ailleurs, le modèle animal choisi dans cette étude est un modèle murin immunodéficient, utilisé avec succès comme souris receveuses de greffe de cellules-souches sanguines humaines. L’utilisation de ces souris nous permettra d’obtenir des résultats homogènes et de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental; nous utiliserons ainsi 6 souris par groupe et par condition. En utilisant des tests statistiques non paramétriques, selon le paramètre mesuré (croissance tumorale, poids des souris, analyse des globules blancs), nous réaliserons des études permettant de mettre en évidence des différences significatives entre les groupes expérimentaux.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en hébergement en cage individuelle ventilée et manipulés sous hotte par du personnel compétent pour éviter tout risque d’infection lié à leur immunodéficience. Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance de l'animal. Une surveillance quotidienne de l'état de santé des animaux sera assurée, avec un suivi de leur poids et de la croissance tumorale. En cas de signe de souffrance, le personnel qualifié et le vétérinaire pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l'euthanasie de l'animal.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes sont utilisées avec succès comme souris receveuses de greffe de cellules humaines. Cette lignée ne présente pas de phénotype dommageable. Le profond déficit immunitaire de ces souris permet la prise de greffe de cellules-souches sanguines humaines, et offre la possibilité d’étudier l’effet d’immunothérapies avec des cellules humaines dans un hôte murin. Ce modèle est notamment très utilisé pour tester l’efficacité anti-cancéreuse de globules blancs modifiés ou de leurs cellules progénitrices. Par ailleurs, le thymus de ces souris, tout comme celui des patients atteints de déficits immunitaires ou conditionnés pour recevoir une allogreffe de cellules-souches sanguines (greffon et hôte de même espèce), sont caractérisés par une atrophie majeure et une architecture altérée. Ces souris présentent donc un environment similaire à celui des patients. Nous utiliserons des souris nouveaux-nés (P0), permettant une bonne prise de greffe des cellules progénitrices. Nos précédentes études ont démontré que les cellules progénitrices pourraient se greffer dans le thymus sans conditionnement (irradiation ou chimiothérapie) chez les souriceaux nouveau-nés (0 à 3 jours post naissance). Une fois cette période passée, afin d’obtenir une prise de greffe dans le thymus, il faut irradier les animaux et co-administrer les cellules progénitrices modifiées avec les cellules souche hématopoïétiques.

1080 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de tumeurs implantées sous la peau ou en profondeur, elles subissent des injections, des séances d'imagerie et une illumination laser de la tumeur sous anesthésies répétées, avant la mise à mort pour analyse des organes. Le porteur résume les bénéfices attendus au "développement de nouvelles nanoparticules PDT et de nouveaux traitements pour le cancer". Il affirme que la biodistribution ne s'obtient que sur l'animal, sans autre modèle possible.

Objectifs

La PDT (thérapie photodynamique) consiste à sensibiliser les tissus cancéreux à l’action de la lumière par l’injection préalable d’une molécule photosensibilisante préférentiellement captée et retenue dans les tumeurs cancéreuses. Après injection intraveineuse du photosensibilisant en soi inactif, celui-ci va être capté et fixé préférentiellement par les tumeurs cancéreuses pour des raisons diverses. Dans un deuxième temps, l’exposition de la tumeur à une lumière de type laser va provoquer une photo activation définie par le changement d’état des molécules chromophores induit par la lumière. La molécule excitée possède un excès d’énergie qu’elle va perdre rapidement et spontanément soit sous forme de chaleur, soit en émettant une fluorescence (photo diagnostic), soit enfin, en passant par un état intermédiaire dit «triplet» responsable des phénomènes de photosensibilisation. La cytotoxicité induite par la PDT est donc principalement le fait de phénomènes d’oxydation entraînant la dégradation des acides aminés, de certaines bases nucléiques et des lipides composant les membranes cellulaires et les mitochondries. La thérapie photodynamique est une méthode thérapeutique originale et séduisante ; après une période de doute, un renouveau apparaît grâce à l’apport de nouvelles technologies, notamment au niveau des sources de lumières laser plus accessibles sur le plan financier et technique et aussi par le développement actuel de nouvelles molécules photosensibilisantes plus adaptées aux différentes pathologies cancéreuses. Le but ici sera d'évaluer l'efficacité de plusieurs nouvelles nanoparticule PDT.

Bénéfices attendus

Développement de nouvelles nanoparticules PDT et de nouveaux traitements pour le cancer.

Procédures

Dans le cadre du développement de tumeurs sous-cutanée, les animaux subiront des injections sous-cutanées sous anesthésie gazeuse (1 fois, 2 minutes). Dans le cadre du développement de tumeurs orthotopiques, les animaux subiront des procédures chirurgicales d'implantations orthotopiques de cellules cancéreuses dans leur environnement, sous anti-douleurs et sous anesthésie gazeuse (1 fois, 10 minutes) puis des injections intrapéritonéales chaque semaine dans le cadre du suivi par bioluminescence (1 fois par semaine, 1 minute)suivi d'une anesthésie gazeuse le temps de l'imagerie (1fois par semaine, 5 minutes). Dans le cadre des procédures d’imagerie, les animaux subiront une injection IV sous anesthésie gazeuses (1 fois, 2 minutes) puis seront simplement anesthésiés au gaz pendant l'imagerie (6 fois, 5 minutes). Dans le cadre des procédures d'efficacité PDT les animaux subiront une illumination de la tumeur sous anesthésie gazeuse (3 fois, 5 minutes).

Impact sur les animaux

Dans cette étude la principale nuisance attendue sera une exposition répétée à l'anesthésie gazeuse (pour l'implantation de tumeurs, pour l'imagerie et pour l'illumination des tumeurs). Certaines souris subiront une chirurgie pouvant également entrainer des nuisances (contrôlées grace à des antidouleurs). Ces souris auront également chaque semaine une injection intrapéritonéale.

Devenir

A l'issus des procédures 1 et 2, les animaux sont mis à mort pour analyse des organes en fluorescence invivo. A l'issus des procédures 3 et 4, les animaux sont mis à mort pour analyse des organes en histologique

Remplacement

Les tests in vitro permettront de réduire le nombre de composés/particules à tester ainsi que le nombre de lignées de cellules. Les paramètres de biodistribution sont obtenus uniquement par l’emploi d’animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés afin d’obtenir des résultats significativement exploitables et valides. Les nombres de souris indiqués par condition sont nécessaires pour une analyse statistique fiable, évitant de refaire l’expérience. (test satistique utilisé : Mann and Whitney). De plus, comme expliqué dans le projet, si la bioditribution d'une nanoparticule n'est pas satisfaisante, nous ne la passeront à l'étape P2, ce qui permettera de réduire le nombre d'animaux réelement utile à l'étude.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales seront réalisées dans un établissement autorisé et en stricte conformité avec le comité local de protection des animaux, les lignes directrices de l'UE (directive 2010/63/UE) et le Comité national français (2010/63). Les animaux seront hébergés et surveillés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément. La conception et l’application des procédures expérimentales, le soin et l’hébergement des animaux seront effectuées par du personnel compétent et formé. La plus grande vigilance sera apportée aux animaux afin de prévenir, minimiser et/ou abroger la souffrance et le stress. La mise à mort sera faite sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Les souris immunodéprimées permettent le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. Les méthodes utilisées pour induire une tumeur sont rapides et reproductibles et la bonne connaissance de ces modèles de pathologie chez la souris fait que les limites éthiques de ce type d’expérimentation sont bien connues. Les modèles animaux permettent d’avancer dans la mise au point de nouvelles thérapies et procéder à leur évaluation préclinique avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. La souris est l’espèce la plus adaptée et la mieux décrite pour la mise en oeuvre de protocoles de thérapie in vivo. Les souris seront utilisées à 5 semaines. Ce stade de développement permet d’avoir des souris adultes avec une prise tumorale optimale.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections, une greffe sous-cutanée de cellules de lymphome puis des injections intraveineuses d'immunoliposomes, avec un prélèvement sanguin. Le porteur indique que les tumeurs peuvent atteindre 1500 mm3 et provoquer une détresse de l'animal isolé. Il affirme qu'après une validation in vitro, le remplacement "n'est plus possible à ce stade" du projet préclinique.

Objectifs

Le Lymphome représente la moitié des cancers du sang, c’est un cancer des cellules du tissu hématopoïétique caractérisé par un blocage de maturation et une prolifération cancéreuse des cellules lymphocytaires matures. Le lymphome se caractérise par la prolifération excessive des lymphocytes au niveau des ganglions, du foie, de la rate, plus rarement d'autres organes. Ils provoquent une augmentation de leur taille. Les principaux symptômes consistent donc en une augmentation de la taille des ganglions. Malgré les améliorations des traitements actuels chez l’homme, les taux de rechute restent élevés. Ainsi, pour réduire l’intensité de la chimiothérapie et traiter avec succès les patients en rechute, il est encore nécessaire de développer de nouvelles thérapies. Nous avons identifié de nouveaux candidats thérapeutiques (liposomes) que nous avons validé dans un premier temps par des méthodes alternatives, à l’aide d’outils in vitro. Nous souhaitons maintenant étudier leurs efficacités dans cette étude préclinique in vivo. Pour cela, nous allons utiliser des modèles murins incluant des xénogreffes de cellules humaines dans des souris immunodéficientes ou des greffes de cellules lymphomateuses murines dans des souris. Lors de cette étude préclinique, les souris seront traitées avec ces liposomes afin d’étudier leurs effets sur l’activation de l’immunité antitumorale et le ralentissement de la croissance tumorale.

Bénéfices attendus

En effectuant des expérimentations in vitro sur nos modèles de Lymphomes, nous avons identifié de nouveaux composés (Immunoliposomes artificiels ou liposomes biologiques issus de la culture cellulaire des cellules de Lymphome) qui bloquent la prolifération des cellules cancéreuses. Après avoir validé in vitro leurs actions, nous souhaitons maintenant tester leurs efficacités sur nos modèles murins in vivo lors d’études précliniques. Le bénéfice attendu du projet concerne la découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le traitement des Lymphomes.

Procédures

Les animaux seront soumis à des traitements par voie intra péritonéale (i.p.) 15 et 7 jours (J-15 et J-7) avant l’injection des tumeurs. Les animaux seront soumis à des transplantations de cellules lymphomateuses par des injections sous cutanées (s.c.) dans leur flanc. Une seule injection est prévue par souris, durée de 30 secondes). Après la greffe, des injections intra-veineuses (i.v.) d’immunoliposomes (3 injections par souris sont prévues, à J+6, J+9, J+12, durée par injection de 5 secondes). Un prélèvement de sang à partir de la veine de la queue (un seul prélèvement par souris, durée de 1 minute) sera réalisé à J+15 jours après la greffe.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables causés durant les actes expérimentaux sont des injections intraveinales et intraperitonéales, des contentions des souris dans un tube de contention afin de prélever le sang, des coupures sur la veine caudale pour prélever le sang. Les animaux vont développer des cancers, avec une multiplication proliférative des cellules lymphomateuses au niveau de la zone d’injection du flanc de l’animal, jusqu’à 1500 mm3. Ce développement tumoral peut engendrer une détresse de l’animal qui peut se trouver isolé. L’ensemble de ces nuissances justifient la classe de sévérité des expérimentations.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des expériences

Remplacement

Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler sur des cellules ou des tissus (in vitro). Le recours aux modèles in vitro doit être l’objectif du chercheur si son expérimentation le permet. Les immunoliposomes et les liposomes biologiques que nous allons tester dans ce projet préclinique ont d’ores et déjà été testé in vitro sur des méthodes alternatives, sur des lignées cellulaires. Ceci nous permet d’être sûr que les composés qui vont être étudiés in vivo sont fonctionnelles sur les cellules cancéreuses. Il nous faut maintenant valider sur des études précliniques in vivo l’efficacité de ces molécules et le remplacement par des méthodes alternatives n’est plus possible à ce stade du projet de recherche.

Réduction

Dans ce projet, nous allons diminuer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche. S’il est essentiel d’utiliser le plus petit nombre d’animaux possibles, il faut néanmoins éviter que cet effort de réduction nuise à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a alors été intégrée à la construction de ce projet. Les effectifs des souris seront déterminés et nos résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Afin de réduire, supprimer ou soulager la douleur ou la détresse des animaux, et ainsi améliorer leur bien-être, en amont des expériences, nous allons planifier les protocoles nous allons aussi planifier et établir les points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure. Afin de limiter le stress des animaux, ils sont placés par groupe de 5 à 10 dans des cages agrémentées d’éléments en carton ou en plastique leur permettant de se regrouper dans un nid. La litière des cages est changée une fois par semaine et les animaliers veillent plusieurs fois par jour à ce que les animaux ne manquent ni d’eau, ni de nourriture. Ces informations seront par ailleurs transmises au personnel de l’animalerie.

Choix des espèces

Pour qu’un nouveau traitement puisse être commercialisé, il est nécessaire de mener des études précliniques et cliniques, afin de prouver son efficacité, d'optimiser les dosages mais aussi d'identifier ses effets indésirables possibles. Les études précliniques nécessitent d’avoir recours à des animaux. Nous disposons d’échantillons de cellules Lymphomateuses qui sont des lignées cellulaires établies et commercialisées. Trois jours après l’injection, les cellules lymphomateuses forment une boule qui peut être palpable au niveau du site de l’injection sous cutané. Ces études ne peuvent se réaliser que dans le modèle murin (A1, mus musculus). L’étude sur l’immunité anti tumorale des souris est en effet celle qui se rapproche le plus de l’homme est c’est ce modèle qui est choisi dans la littérature afin de réaliser des études précliniques sur les Lymphomes en général. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules lymphomateuses sur le flanc des animaux.

192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection d'azoxyméthane, un cancérogène, puis sont nourris de charcuteries testées et placés en cage à métabolisme pendant 48 heures. Le porteur indique que l'étude s'arrête au stade des lésions précancéreuses microscopiques et qu'aucune douleur n'est attendue. Tous les rats sont tués pour prélever le côlon et le sang, afin de comparer l'effet des nitrites et d'antioxydants sur le risque de cancer.

Objectifs

La consommation de charcuteries est associée à une augmentation du risque de cancer du côlon. Sur la base de données épidémiologiques (données issues de questionnaires de volontaires humains et de santé humaine), l’organisation mondiale de la santé (OMS) a classé la charcuterie comme cancérigène avéré pour l’Homme (Classe I). Ces données ont été consolidées par des études expérimentales à l’aide de modèles animaux (rats et souris). Les mécanismes mis en jeu impliquent la production de composés toxiques par la présence de lipide dans l’alimentation et de constituants de la charcuterie tel que le rouge de la viande (fer héminique) et les nitrites ajoutés. Des travaux précédents ont démontré que les antioxydants dans le régime ou ajoutés dans la charcuterie peuvent limiter l’effet néfaste des viandes dont les charcuteries. De plus, ces travaux ont permis d’observer un déséquilibre de la flore intestinale chez le rat comparable à celle observée pendant la cancérogenèse colique. Nous proposons de modifier la production des charcuteries pour limiter le risque de cancer du côlon associé à leur consommation. Nous évaluerons l’effet d’un régime riche en charcuteries et de régimes riches en charcuteries modifiées (réduction de concentration en sel nitrité ou ajout d’antioxydant) sur la formation des composés toxiques, l’inflammation, le microbiote intestinal et la promotion de la carcinogenèse colorectale au stade très précoce. Dans ce projet, nous proposons une procédure où 192 rats Fisher 344 mâles seront nourris avec un régime contenant de la charcuterie modèle type jambon cuit et type saucisson pendant 100 jours. Leur urine et leur fèces seront récupérés séparément et leur côlon post mortem sera prélevé à la fin de l’expérimentation. Ces échantillons permettront des mesures des produits d’oxydation des lipides, de l’inflammation, du microbiote, de marqueurs de la promotion de la cancérogenèse colique et des analyses pour la compréhension mécanistique au niveau du tissu colique.

Bénéfices attendus

Nous proposons d'évaluer des indicateurs de la cancérogenèse précoce tels que le microbiote, son déséquilibre, l'inflammation, la formation de composés toxiques et les lésions précancéreuses coliques (lésions à l'échelle cellulaire). Ce projet nous permettra de comparer différentes charcuteries selon qu’elles contiennent autant de nitrite ou moins que celles du marché ou encore selon qu’elles contiennent des antioxydants ou non.

Procédures

Une injection en intrapéritonéale durant 30 secondes / Tatouage d’identification durant 5 secondes / Passage en cage à métabolisme durant 48h précédé de 3h d'habituation / Aucun prélèvement invasif n'est prévu sur les animaux, seulement la récupération des urines et des fèces, sans contention de l'animal

Impact sur les animaux

Injection d'azoxyméthane en intrapéritonéale : douleur contrôlée / Tatouage : douleur contrôlée (un seul point de tatouage à une oreille) / Passage en cage à métabolisme durant 48h précédé de 3h d'habituation : stress contrôlé / les prélèvements de fèces et urines se font sans contention et l'étude est arrêtée au stade des lésions prénéoplasiques dites précancéreuses microscopiques qui ne concernent que quelques cryptes intestinales et ne provoquent pas de douleur : pas de douleur attendue / les charcuteries ont pour majorité été testées lors d'autres études sur ce modèle rat sans observation de modification sanitaire, les antioxydants ont été testés in-vitro et sélectionnés en fonction de leur non toxicité sur les cellules : pas d’effets indésirables attendus. Cependant les animaux sont continuellement surveillés à l'aide d'une fiche de suivi (sanitaire et comportement) construite spécifiquement pour le rat F344 mâle utilisé dans cette étude (sous couvert de la SBEA qui l'a validée).

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin que le côlon et le sang soient prélevés pour analyses.

Remplacement

Les antioxydants choisis pour ce projet sont testés au préalable pour qu’ils soient efficaces au niveau de leur capacité anti effet du nitrite, antioxydante et au niveau organoleptique (couleur et goût acceptable pour le consommateur). Cependant, aucune étude in vitro ne permet d'évaluer les répercussions de ces composés, sur la physiologie et le métabolisme d'un organisme entier. L'utilisation d'animaux permet de mesurer et/ou d’examiner des atteintes dans les voies intestinales et coliques (inflammation, atteinte tissulaire). Seule une approche in vivo permet de prendre en compte la complexité de l'épithélium colique sur la physiologie intestinale et leurs rôles dans l'inflammation et l'apparition de dommages à l'ADN dans l'épithélium ainsi que les modifications possibles du microbiote intestinal.

Réduction

Dans l'objectif de réduire au strict minimum l'utilisation d'animaux de laboratoire, leur nombre a été limité au maximum (n=12 animaux/lot). Lors d’expérimentations précédentes conduites sur ce même format et confirmé par un calcul de test de puissance statistique (paramètre suivi : nombre ACF (Aberrant Crypt Foci), un nombre de 12 rats par groupe a été déterminé pour mettre en évidence une modulation significative de la carcinogenèse.

Raffinement

Les animaux auront 5 jours d'acclimatation à leur arrivée de J-12 à J-7. La nourriture, expérimentale et l'eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière sera réalisé 1 fois par semaine au moins. Les animaux seront suivis et surveillés quotidiennement à l'aide d'une fiche de suivi sanitaire (spécifique à cet animal et à cette étude ; validée par la SBEA). Pour ne pas souffrir d'isolement, les rats seront maintenus à 2 par cage (cage conventionnelle). Elles contiendront un enrichissement. Les animaux seront hébergés dans des cages à métabolisme individuelle pendant 48h (J70) précédées de 3h d'habituation (recueil des fèces et urines séparées). Les animaux seront euthanasiés en fin d’étude par 2 (même cage conventionnelle) et dans une salle différente de la salle d’hébergement (stress contrôlé).

Choix des espèces

Depuis les années 80, l’étude de la relation entre l’alimentation et le cancer est basée sur les études épidémiologiques mais aussi sur des approches expérimentales in vivo qui reposent sur les modèles animaux. Le modèle le plus utilisé est le rat chimio-induit (par injection intrapéritonéale d’azoxyméthane) qui a l’avantage de présenter une évolution cellulaire vers le cancer colorectal du tissu colique comparable à la situation humaine. Le rat F344 chimio-induit est un bon modèle pour étudier la modulation des biomarqueurs urinaires, fécaux et coliques associés à l’effet promoteur de l’hème des charcuteries sur une durée de 100 jours. Les mâles adultes sont privilégiés pour analyser le développement des pathologies à l’âge adulte afin d’éviter les effets hormonaux liés aux cycles de la femelle (observés sur l’inflammation et carcinogenèse). L'ensemble des études précédentes ont été menées sur des rats adultes dont la fonction digestive est totalement fonctionnelle. Afin de rester en accord avec ces résultats précédents, il est important de rester au même stade de développement.