Cancers

4 650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous anesthésie une greffe de cellules cancéreuses sous la peau du dos, puis des chimiothérapies par voie intra-péritonéale et des molécules par gavage pendant quatre semaines, avec des effets attendus de fatigue, diarrhées, troubles cognitifs et perte de poids. Les souris sont tuées après un prélèvement de sang par ponction cardiaque, pour étudier le rôle de certains lipides dans la résistance des tumeurs aux traitements. Le porteur affirme que des études précliniques sur animaux sont "incontournables" pour saisir la pharmacocinétique des molécules.

Objectifs

Dans la lutte contre le cancer, des échecs thérapeutiques persistent à cause de mécanismes de résistance des tumeurs aux traitements en partie dû à une production accrue de lipides qui constituent la matière grasse du vivant. Dans le cadre des cancers colorectaux (CCR), les travaux de notre équipe ont montré que la résistance des cellules coliques aux traitements des CCR est associée à une augmentation de la quantité de gouttelettes lipidiques (GL), réservoirs de lipides régulant les besoins énergétiques de la cellule, ainsi qu’à la surexpression de l’enzyme lysophosphatidylcholine acyltransferase 2 (LPCAT2), impliquée dans la production de la phosphatidylcholine (PC). La PC est un lipide majeur des membranes cellulaires, séparant l’intérieur des cellules de leur environnement extérieur. Ainsi, l’utilisation de molécules capables de réduire et/ou moduler les taux de PC et GL semble être une approche prometteuse afin de restaurer une sensibilité des cellules résistantes aux agents anticancéreux. La 1ère partie de ce projet s’attachera donc à confirmer chez la souris la capacité de 4 composés candidats à agir comme modulateurs de la production de PC et des GL et sensibiliser les cellules tumorales coliques aux chimiothérapies utilisées en clinique. Nous utiliserons des modèles de souris greffés par des cellules coliques murines surexprimant ou non LPCAT2 et des souris dépourvues de système immunitaire greffées par des cellules coliques humaines résistantes et sensibles aux traitements. La 2ème partie de ce projet concerne l’étude d’autres lipides que sont les cardiolipines (CL), dans la progression et résistance aux chimiothérapies. Les résultats de l’équipe ont montré que des cellules du cancer du col de l’utérus résistantes à un agent anticancéreux, l’Aplidine®, présentent des teneurs en CL supérieures à celles des cellules sensibles. De plus, ces altérations sont associées à une modulation de la composition des CL, corrélée à une altération des enzymes de production dont la cardiolipin synthase 1 (CRLS1) et la tafazzin (TAZ), contribuant à diminuer la sensibilité des cellules à la mort cellulaire induite par l’Aplidine®. Ainsi, il s’agira de confirmer l’implication des enzymes de production des CL dans la résistance à l’Aplidine®. Nous utiliserons des modèles de souris immunodéficientes greffés par 2 modèles cellulaires humains de cancer du col de l’utérus, des cellules sensibles et résistantes génétiquement modifiées pour CRLS1 et TAZ.

Bénéfices attendus

La première partie de ce projet de recherche devrait permettre d’approfondir les relations existantes entre les altérations des voies de biosynthèse des lipides complexes, en particulier, celles de la phosphatidylcholine (PC) et les phénotypes de résistance des cancers colorectaux (CCR). Ce projet viendrait également soutenir le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à augmenter l’efficacité des traitements chimiothérapeutiques notamment grâce à l’identification de nouvelles molécules bioactives/d’origine naturelles ou de formulations capables de cibler/d’inhiber la production de PC des tumeurs coliques et d’agir en synergie avec les chimiothérapies conventionnelles, réduisant la toxicité et les effets secondaires de ces dernières. Ainsi, ces travaux conforteraient l’utilisation potentielle en clinique de certaines de ces molécules en complément des traitements conventionnels des CCR. De plus, cette étude devrait mettre en exergue le potentiel de l’analyse des teneurs plasmatique en PC en tant que nouveau biomarqueur pronostique non invasif des CCR. La seconde partie de ce projet viendra renforcer les quelques données de la littérature suggérant qu’une dérégulation de la quantité et de la qualité (composition) des cardiolipines (CL) pourrait influencer la sensibilité des cellules tumorales aux drogues de chimiothérapie. Par ailleurs, à ce jour, la contribution d’une production exacerbée des CL via l’enzyme cardiolipin synthase 1 (CRLS1) dans la résistance tumorale a été montré uniquement dans un contexte de carcinome hépatocellulaire résistant à la radiothérapie. De plus, ce projet permettrait, à plus long terme, d’étendre ces observations à d’autres agents chimiothérapeutiques, ainsi qu’à d’autres types de cancers tels que le cancer colorectal, un cancer récidivant et agressif, ce qui permettrait d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques afin de contrecarrer les mécanismes de résistance.

Procédures

Les souris seront soumises à une anesthésie gazeuse pendant 10 minutes maximum et recevront une injection sous-cutanée de cellules cancéreuses sur le bas du dos à l’aide d’une seringue. Cette injection se réalise en 10 secondes par souris. A partir de ce moment-là, chaque souris entre dans une phase d’expérimentation de 5 semaines maximum avant la mise à mort. Un suivi de la croissance tumorale et du poids des animaux seront réalisés tous les 2 jours, des mesures qui se font respectivement en 10 et 5 secondes pour chaque animal. Les traitements par 2 chimiothérapies et 4 molécules naturelles/chimiques seront administrés respectivement par voie intra-péritonéale (ip) à raison d’1 à 5 fois par semaine pendant 1-3 semaines , et par voie orale (gavage) quotidiennement pendant 4 semaines, et à raison de 1 à 3 concentrations par molécule. Chacune de ces administrations se fera en 15 secondes maximum par animal, prise de l’animal par l’expérimentateur comprise. Sur une partie des animaux sera réalisé un prélèvement sanguin par ponction intra-cardiaque sous anesthésie préalable. Ce prélèvement se réalise en 20 secondes environ pour chaque animal.

Impact sur les animaux

Bien que la croissance et la masse tumorale puissent entrainer une potentielle gêne pour l’animal au cours du temps, la gêne au mouvement pouvant contribuer à une diminution de la mobilité dans la cage devrait être minime compte tenu de notre choix de localiser la greffe de cellules cancéreuses sur la région dorsale de l’animal. Des effets secondaires associées au traitement chimiothérapeutique pourront être observés tels que des signes de fatigue, des diarrhées, des troubles cognitifs et une perte de poids. Afin de prévenir ou diminuer toutes nuisances qui pourraient survenir suite à la répétition des injections en intrapéritonéal (inconfort lié au volume et à la température des solutions injectés, risque de contamination qui peut causer une infection et irritation au site de l’injection), nous veillerons à respecter les règles décrites dans la partie Raffinement (5.10.3).

Devenir

A la fin de la procédure expérimentale, tous les animaux seront euthanasiés. Pour les expériences de mise au point des doses de traitement, compte tenu du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, même si des régressions tumorales pourront être observées en fonction des traitements, une reprise de la croissance tumorale après la période d’arrêt des traitements est toujours possible et nécessite le sacrifice de l’ensemble des souris pour se prémunir de la souffrance qui peut en résulter. Concernant les expériences avec la dose adéquate de traitement, des analyses des teneurs et composition en lipides plasmatiques seront réalisées à partir du sang des souris. De ce fait, les souris seront mises à mort après prélèvement sanguin.

Remplacement

Les travaux réalisés jusqu’à présent sur différents modèles cellulaires ont pu montrer d’une part, que des molécules d’origine chimique ou naturelle sont capables de chimiosensibiliser les cellules résistantes aux chimiothérapies conventionnelles au travers l’inhibition du métabolisme lipidique, en particulier celui de la phosphatidylcholine (PC), et d’autre part, que des lipides complexes tels que les cardiolipines (CL) peuvent constituer des cibles thérapeutiques prometteuses pour contrecarrer les mécanismes de résistance. Des études précliniques avec des animaux sont incontournables pour la finalité de ce projet puisqu’il est nécessaire d’identifier les effets indésirables potentiels des traitements utilisés ou non en combinaison, mais également de considérer l’aspect pharmacocinétique et pharmacodynamique des molécules incluant le processus de transformation de ces molécules par l’organisme (pouvant conduire à une augmentation de leur efficacité ou bien une perte de leur efficacité). En outre, l’utilisation de souris immunocompétentes et au système immunitaire déficient, permettra d’évaluer si le système immunitaire joue un rôle clé dans le processus de chimiosensibilisation des molécules.

Réduction

Les différents modèles cellulaires utilisés au cours de ce projet chez des souris présentant un système immunitaire déficient ou non est parfaitement maitrisée au sein de notre équipe, évitant ainsi de réaliser des étapes de mise au point de greffes de cellules tumorales et réduisant le nombre d’animaux. Pour chacune des expériences, nous utiliserons des groupes de 10 souris maximum, ce qui correspond à la taille d’échantillon minimum nécessaires à la réalisation de tests statistiques.

Raffinement

Afin de prendre les mesures nécessaires pour améliorer le bien-être animal, les souris seront observées quotidiennement par le personnel de l’animalerie et lors de chaque intervention des expérimentateurs (injection, pesées, mesures de tumeurs…). Les souris disposeront d’une phase d’habituation à être manipulées par les expérimentateurs pour réduire leur appréhension. Des antalgiques seront utilisés en cas de douleur observée. Si les points limites que nous avons établis sont atteints, les souris seront euthanasiées selon la méthode choisie. Les souris seront hébergées en groupe pour favoriser les contacts sociaux, avec un enrichissement du milieu approprié. Un contenant sera placé dans chaque cage leur permettant de se cacher et de développer leur répertoire comportemental. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum.

Choix des espèces

Étant donné que l’objectif à long terme sera d’évaluer l’efficacité de nos molécules d'intérêt en thérapie anticancéreuse, nous devons utiliser une espèce présentant une physiologie proche de l’Homme, telle que la souris, qui est un modèle de référence en cancérologie. Par ailleurs, les études antérieures pré-cliniques de notre équipe ont été réalisées chez la souris, dont les résultats ont pu être transposés chez des patients. L’injection de cellules cancéreuses humaines nécessite l’utilisation d’animaux NSG qui sont des modèles génétiquement modifiés présentant un système immunitaire déficient. Les souris d’espèces BALB/c (immunocompétente) seront également utilisées afin de se rapprocher au maximum des conditions physiologiques en présence d’un système immunitaire compétent. De plus, le modèle cellulaire de cancer du côlon murin CT26 que nous utilisons présente le même fond génétique que la souris d’espèce BALB/c. Nous utiliserons des souris âgées de 8- 12 semaines car elles sont considérées comme adultes. En effet, dans le cadre de notre étude, nous avons besoin que les animaux aient atteints l’âge adulte et, en ce qui concerne les modèles de souris immunocompétentes, soient dotées d’un système immunitaire fonctionnel.

6 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardés en vie et réutilisés. Chaque animal subit sous anesthésie une injection sous-cutanée, seize prélèvements sanguins sur cinq semaines et deux biopsies de peau, pour comparer une nouvelle formulation d'un médicament anticancéreux à un traitement de référence. Le porteur mentionne des hématomes et une inflammation possible au site d'injection. Il présente le motif du projet comme économique, proposer aux hôpitaux une alternative "à moindre coût", et affirme qu'aucun modèle autre que le primate ne convient.

Objectifs

Le cancer du sein est une maladie qui touche de nombreuses femmes, une sur huit sera confrontée à cette maladie au cours de sa vie. Seules 20 à 30 % des cas, peuvent bénéficier d’un traitement par un anticorps commercialisé sous le nom d’Herceptin®. Il a transformé la maladie cancéreuse aiguë en maladie chronique pour une majorité de patiente. Actuellement, le schéma thérapeutique consiste en plusieurs perfusions intraveineuses toutes les 3 semaines sur 1 an. Le 2 septembre 2013, une nouvelle voie d’administration, la voie sous-cutanée a été autorisée par la Commission de l’Union européenne pour le traitement de ce type de cancer. Cette nouvelle voie est très prometteuse en termes de confort pour la patiente et de gain de temps pour le personnel hospitalier. Depuis, des médicaments biosimilaires (équivalents des médicaments génériques dans le cas des petites molécules) sont apparus sur le marché. Ces derniers ne sont actuellement disponibles que pour des traitements par voie intraveineuse. Avec l’arrivée des biosimilaires IV, les cliniques/hopitaux sont revenus pour des questions de coûts aux injections IV au détriment de l’utilisation de la forme sous-cutanée d’Herceptin. Dans ce projet, nous proposons de développer une formulation sous-cutanée pour la diffusion progressive de l’anticorps, permettant donc de proposer une alternative à moindre coût pour les cliniques/hôpitaux, mais améliorant grandement le confort des patientes tout en conservant la même efficacité. Dans ce projet, 6 macaques cynomolgus seront utilisés et répartis en deux groupes (anticorps testé versus traitement de référence).

Bénéfices attendus

Si ce projet démontre que l’utilisation de cette nouvelle formulation d’un médicament biosimilaire est équivalente à l’utilisation du médicament de référence, cela permettra aux patientes atteintes d’une forme spécifique de cancer du sein de bénéficier du même confort de traitement (administrations sous-cutanées versus intraveineuses répétées) à un coût beaucoup moindre, donc une meilleure accessibilité du traitement pour les patientes.

Procédures

Les procédures réalisées sur chaque animal (sous anesthésie générale) seront : - 1 injection sous-cutanée - 16 prélèvements sanguins sur 5 semaines (semaine 1 : 10 prélèvements, semaine 2, à 4 : 2 prélèvements/ semaine espacés au moins d’un jour) - 2 biopsies cutanée Chaque intervention durera au maximum 20 minutes.

Impact sur les animaux

Les dommages attendus seront principalement liés aux injections de l’anesthésique et aux conséquences des prélèvements sanguins répétés (potentiels hématomes aux sites de prélèvement) et d’une biopsie (plaies en cicatrisation). L’injection du traitement pourrait entraîner une possible inflammation au site d’injection.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie à la fin du projet. Ils sont examinés par un vétérinaire pour vérifier qu’ils ont recouvré leur état de santé en fin de protocole.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative au model primate non-humain pour cette expérimentation. Les modèles rongeurs utilisés précédemment ont montré la non-toxicité de l’élément d’essai mais ne permettent pas d’injecter un volume suffisant similaire à celui utilisé chez l’Homme et permettant d’étudier la biodégradation du gel. Il en est de même avec les modèles sous-cutanés de peau humain ne permettant pas l’injection d’un volume suffisant pour valider la biodégradation du gel. De plus, les primates non-humains possèdent un récepteur de l’anticorps testé similaire à celui de l’humain.

Réduction

Dans ce projet, le nombre d’animaux utilisés a été réduit à son maximum pour répondre aux questions posées. Compte-tenu de l’apport des études préliminaires réalisées sur le modèle rongeurs, 3 animaux par groupe seront suffisants pour obtenir les données de pharmacocinétique, de biodégradation et évaluer la réponse inflammatoire (au niveau du site d’injection) et au niveau global (dans la circulation sanguine). Ce projet représente une phase préliminaire aux études réglementaires utilisant un effectif plus important.

Raffinement

- Hébergement : les animaux seront hébergés au minimum par paire. Un programme d’enrichissement spécifique à l’éspèce et à l’âge des animaux utilisés est mis en place sur tout le site, et supervisé par le responsable du bien-être animal. Les enrichissements sont structurels (perchoirs, balançoire…), alimentaires (graines pour fourragement, fruits, friandises…) ou consistent en l’apport d’objets de manipulation changés régulièrement. - Procédures : les animaux seront anesthésiés pour chaque intervention et seront sous couverture analgésique pour les biopsies. - Des points limites ont été définis pour arrêter la procédure en cas de souffrance des animaux, évaluée grâce à une grille de scoring

Choix des espèces

Dans ce projet, des macaques cynomolgus seront utilisés, car ils possèdent un récepteur de l’anticorps testé similaire à celui de l’humain. Ce projet ne justifie pas d’utilisation d’animaux d’un stade de développement particulier. Néanmoins, les animaux seront âgés de plus de 18 mois (animaux juvéniles ou adultes).

21 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie sous anesthésie générale pour l'implantation de bioprothèses mammaires, avec chez une partie un prélèvement de graisse réinjecté, puis des pesées et échographies deux fois par semaine pendant quatre à neuf mois avant mise à mort. Le porteur indique un stress aux pesées, des pertes de poids après chaque anesthésie, des douleurs post-opératoires et des démangeaisons, pouvant s'aggraver si la prothèse est mal tolérée. Il affirme qu'aucun test in vitro ne permet de prédire la tolérance de la bioprothèse ni le temps de son absorption.

Objectifs

Le cancer du sein est le 1er cancer de la femme dans le monde, avec plus de 58000 nouveaux cas diagnostiqués en France en 2018. La qualité de vie des patientes touchés par un cancer du sein fait partie intégrante de leur plan de soins. 40% des patientes bénéficient d’une ablation totale du sein, induisant des séquelles physiques et psychologiques. Des études récentes mettent en évidence une amélioration significative de la qualité de vie des patientes lorsqu’une reconstruction mammaire est réalisée. Elle est effectuée soit au cours de la même chirurgie que la mastectomie totale, soit lors d’une 2ème intervention chirurgicale avec un bioprothèse mammaire (ou prothèse à changer tous les 10-15 ans), ou par greffe utilisant les tissus de la patiente avec un risque d’évolution asymétrique entre les deux seins à court et moyen terme, entraine des cicatrices au niveau des zones de prélèvement mais l’évolution à long terme sera plus naturelle et symétrique par rapport à l’autre sein, sans nécessité de nouvelles chirurgies dans le temps). C’est dans ce contexte qu'une bioprothèse biodégradable, favorisant la régénération tissulaire grâce à une greffe de graisse sera testée dans ce projet qui cherche à évaluer le temps d’absorption d’une bioprothèse de taille humaine et la qualité de l’infiltration de la bioprothèse par le tissu graisseux.

Bénéfices attendus

L’ablation d’un sein pour une femme est assimilé à une amputation. Les méthodes pour pallier cette chirurgie sont lourdes. La bioprothèse testée ici pourrait permettre un retour à la normal pour la femme moins douloureux et plus naturel.

Procédures

Les animaux seront pesés et échographiés 2 fois par semaine pendant 4 à 9 mois. Ils subiront une chirurgie sous anesthésie générale avec antidouleur (2 incisons de la peau de 4 cm) qui durera entre 45 min et 1h15. Une partie des animaux sera anesthésié pour un prélèvement de graisse qui sera réinjectée dans la bioprothèse (environ 30 min).

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un stress lors de chaque pesée qui devraient diminuer au cours du temps. Chaque anesthésie (chirurgie, Prélèvement et réinjection de graisse différé) entraine une perte de poids car l’animal s’alimente moins pendant un jour avec un retour à la normal rapide. Parfois, l’animal ne reprend pas son alimentation. Il est alors traité le lendemain et reste donc moins de 48 h sans manger et boire. La chirurgie peut entrainer des douleurs post opératoire au niveau de l’incision malgré les antalgiques (probabilité faible). Le processus de cicatrisation entraine des démangeaisons. Si la bioprothèse est mal tolérée, les démangeaisons seront plus importantes et des douleurs pourront être engendrées par une inflammation. Le prélèvement de graisse pour injection dans la bioprothèse bien que réalisé sous anesthésie et antidouleur peut générer une douleur passagère.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort car les bioprothèses et tissus nouvellement formés seront prélevés pour analyses.

Remplacement

De nombreux tests in vitro ont été réalisés : tests biomécaniques, tests de colonisation cellulaire, test de résistance à la radiothérapie. Cependant, il n’est pas possible de prédire la tolérance de la bioprothèse qui nécessite l’intervention complexe du système immunitaire ni le temps d’absorption et la colonisation par le tissu graisseux qui font intervenir de nombreux mécanismes.

Réduction

La première partie du projet consistera à mettre au point de la technique et ne donnera pas lieu à une étude statistique. C’est pourquoi 3 lapins seront mis à mort à chaque temps (4, 6, 9 mois). Au cours de la seconde procédure, le diamètre des bioprothèses sera également mesuré. Les diamètres seront comparés entre bioprothèse avec et sans greffe de graisse.

Raffinement

Dès l’acclimatation, les animaux auront des temps de jeux dans un espace plus grand que leur cage avec de nombreux enrichissements leur permettant d’exprimer leur comportement de curiosité (temps de 20-30 min max). Après la chirurgie, les animaux se réveilleront seuls dans leur cage et seront remis ensemble (par deux) dès l’observation de la reprise d’alimentation (pesées quotidiennes de l’aliment). Si une consommation faible d’aliment est observée pour un groupe d’animaux, ils seront également séparés afin d’identifier l’animal et de prendre les mesures nécessaires. L’animal sera réchauffé à l’aide d’un tapis chauffant durant l’anesthésie et de l’air chaud le réchauffera pendant le réveil. Les mêmes procédures d’anesthésie et antidouleur que chez l’homme seront utilisées pour la chirurgie et la greffe de graisse. Si le processus de cicatrisation engendre des démangeaisons, la cicatrice sera massée ave une pommade cicatrisante. Un scoring simple à mettre en œuvre permettant de déceler facilement un problème chez l’animal sera utilisé quotidiennement.

Choix des espèces

Le modèle lapin est le plus petit animal sur lequel des bioprothèses de taille « humaine » peuvent être implantées. La taille de 75 cm3 correspond à la plus petite taille nécessaire afin d’observer une recolonisation par les cellules graisseuses. Les animaux seront adultes et de grandes tailles afin de disposer d’un abdomen suffisamment grand pour placer les deux bioprothèses.

2 100 souris et 2 100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur est implantée dans leur cerveau, un geste que le porteur décrit comme sévèrement douloureux, avec irradiation, traitements répétés et exsanguination terminale. L'établissement réalise une douzaine d'études par an selon les commandes de clients. Il affirme que les méthodes alternatives ne permettent pas de prévoir l'efficacité in vivo, les retombées cliniques étant renvoyées aux essais ultérieurs.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de tumeur intracrâniennes (tumeur implantée dans le cerveau des animaux, = tumeur stéréotaxique), déjà mis en place dans nos laboratoires ou bien d’en développer de nouveaux (dans nos laboratoires) chez les rongeurs (rats ou souris) afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter le cancer. L’évaluation des traitements potentiels chez l’animal permettra d’étudier ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte physiologique le plus proche possible de la pathologie humaine et d’arriver, avant les essais cliniques, à réaliser une réelle évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles précliniques de cancer, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques ou diagnostiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, représentant un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent la première évaluation de l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés. Au cours des expériences, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur ou mimer l’apparition de sites métastatiques dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance/échappement après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme des moyens de défense.

Procédures

- Identification des animaux (implantation d’un transpondeur ou clips aux oreilles ou tatouage), sous anesthésie - Transport vers le site ou est réalisé l’irradiation (durée totale moins de 30 minutes, les animaux restant dans leur cage de stabulation). - Irradiation - Greffe des cellules tumorale dans le cerveau, sous anesthésie et antalgie. - Traitements par voies intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée sous anesthésie, mais pouvant être réalisés sur animaux vigiles - Traitements par voies intradermique ou intramusculaire, sous anesthésie et analgésie - Traitements par voie orale, sur animaux vigiles sous contention. - Suivi des animaux (poids) - Suivi des animaux par imagerie (sous anesthésie) - Prélèvements de sang, sur animaux anesthésiés, par ponction dans : la veine jugulaire. - Prélèvements de sang, sur animaux vigiles sous contention, par piqure dans la veine saphène (possibilité de déposer de la poudre hémostatique pour limiter le saignement s’il se produit après le prélèvement). - Prélèvements de sang, sur animaux vigiles sous contention, par piqure dans la veine caudale (animal placé dans 1 boite thermorégulée à +37°C). - Prélèvement d’un grand volume de sang lors de l’euthanasie (« exsanguination terminale ») par ponction intracardiaque ou via l’aorte abdominale, sous anesthésie profonde, suivi d’une confirmation de la mort par une deuxième méthode physique - Mise à mort en fin de procédure (overdose d’anesthésique confirmée par une deuxième méthode physique, CO2 suivi d’une deuxième méthode physique - Prélèvements de tissus après euthanasie (post-mortem)

Impact sur les animaux

Une douleur sévère sera induite par la procédure de greffe, l’analgésie mise en place permettra de l’atténuer très significativement. Un stress sera ressenti par les animaux, pendant 1 ou 2 jours, lors de la randomisation et/ou le début des traitements. De même un stress léger sera ressenti lors de la réalisation des gestes techniques pour identification des animaux (tatouage par exemple), lors d’un transport de courte durée, ainsi que pour les traitements (par voie intraveineuse, orale, sous-cutanée ou intrapéritonéale) et le suivi des animaux (mesures des poids et par imagerie). Une douleur légère sera également ressentie lors de la piqure pour traitement par voies intraveineuse et intrapéritonéale. Un stress et une douleur légère liée à la piqure seront ressentis par les animaux lors des prélèvements de sang (en cours d’étude). Une douleur forte sera ressentie dans le cas d’injections intramusculaires et intradermiques, celle-ci sera fortement atténuée par une analgésie adaptée. Les animaux pourront perdre du poids à la suite des traitements avec de nouveaux composés. Une douleur forte sera ressentie par l’animal lors de prélèvements de sang à l’euthanasie par ponction intracardiaque, elle sera fortement réduite par une analgésie adaptée.

Devenir

A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort (la méthode utilisée étant l’une de celles autorisées par la Directive 2010/63). Les animaux étant porteur de tumeur dans le cerveau et ayant fait l’objets de gestes techniques, aucune autre utilisation ne peut être envisagée.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments En effet, les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D peuvent être utilisées mais reste toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes sera ajusté à la question scientifique posée et aux paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la survie des animaux entre les différents groupes de l’étude seront comparées pour évaluer l’efficacité des composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter individuelles. L’analyse statistique sera effectuée au moyen d’un test d'analyse de la variance (ANOVA). Près de 12 études seront réalisées chaque année, mais le nombre pourra varier en fonction des commandes des clients. Une étude peut être composée de 3 à 10 groupes [un groupe contrôle (= véhicule), un groupe recevant un médicament de référence, 1 à 8 groupes recevant des nouvelles molécules]. Le nombre d’animaux par groupe varie généralement entre 7 et 20. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser, si possible, des biomarqueurs (cytokine plasmatique par exemple) et des techniques faiblement invasives d’imagerie (IRM par exemple) chez le petit animal. Ces techniques permettent de suivre les biomarqueurs sur le même animal tout au long de l’étude, ceci réduisant la taille de la cohorte nécessaire pour la réalisation de l’expérience. Ces techniques peuvent également constituer un moyen d’atteindre les objectifs de l’étude avant l’apparition des signes cliniques, et donc limiter la souffrance des animaux.

Raffinement

Toutes les procédures sur les animaux seront réalisées par des techniciens formés et qualifiés, selon des modes opératoires validés. La greffe des tumeurs sera réalisée sous anesthésie et analgésie pour atténuer fortement la douleur que ce geste technique engendre. Les animaux bénéficieront également de soins adaptés après la greffe. Les animaux ressentiront un stress léger lorsque ceux-ci seront attribués aux groupes de traitement, stress toutefois limité par l’enrichissement de leur environnement. Un stress léger sera également perçu lors des manipulations pour suivre le poids des animaux ou bien lors des séances d’imagerie (pour suivi de l’évolution de la tumeur). La fréquence des mesures de poids sera adaptée, elle pourra être quotidienne et ce afin de prodiguer des soins adaptés aux animaux dès que nécessaire et éviter toute souffrance. Les traitements avec des nouveaux produits à tester induiront un stress léger. C’est pourquoi, la plupart seront réalisés sous anesthésie. Si jamais des traitements engendre une douleur quelconque, les animaux bénéficieront d’une analgésie adaptée pour la supprimer. Des prélèvements de sang pourront être réalisés. Ils induiront un stress léger de l’animal. C’est pourquoi, ils seront réalisés sous anesthésie. Une douleur légère liée à la piqure sera également ressentie. La perte de poids des animaux sera suivie. Un animal montrant une perte de poids égale ou supérieure à 15% de son poids initial sera euthanasié. Toute intervention sur un animal qui pourrait engendrer une douleur sera réalisée avec une analgésie adaptée afin de l’atténuer fortement.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. Diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. Enfin, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvements et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 semaines minimum à la date d’induction tumorale). L’utilisation d’animaux adultes garantit la reproductibilité l’injection des cellules tumorales, c’est-à-dire que cette injection est toujours réalisée au niveau des coordonnées souhaités. Cela garantit également que la vitesse de croissance des tumeurs sera similaire d’une expérience à l’autre. L’utilisation d’animaux plus jeunes ne permet pas de garantir que l’injection des cellules est réalisée au niveau des coordonnées souhaitées (une injection au niveau de coordonnées non connues peut induire des effets neurologiques néfastes).

5 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un fragment de tumeur humaine leur est greffé pour développer des modèles dits PDX, avec traitements et prélèvements sanguins, y compris par ponction intracardiaque terminale. L'établissement, prestataire, développe ces modèles pour des partenaires afin de cribler des molécules. Le porteur affirme que les PDX sont les seuls à reconstituer la complexité des tumeurs humaines, une perte de poids déclenchant supplémentation ou arrêt du traitement.

Objectifs

En Europe, les cancers pédiatriques sont la 1ère cause de mortalité infantile non accidentelle. 20% des enfants et adolescents diagnostiqués meurent chaque année et bien que 80% survivent, les 2/3 d’entre eux souffrent au long terme d’effets secondaires associés à un traitement souvent inadapté. Le développement de thérapies efficaces en oncologie pédiatrique est aujourd'hui devenu un enjeu majeur. Ces dernières années, grâce à l’avancée des thérapies ciblées, une augmentation très importante de nouvelles molécules approuvées pour le traitement des cancers chez l’adulte a été enregistrée. Or, il existe encore peu d’options thérapeutiques accessibles aux enfants et adolescents atteints de cancers. Pour pallier à ce retard, ce projet a été mis en place pour permettre le développement de systèmes de criblages performants dans le but de tester de nouvelles molécules développées chez l'enfant et des molécules développées ou en cours de développement chez l'adulte qui pourraient aussi être efficaces chez l'enfant. Dans le cadre de ce projet, notre société est chargée de finaliser le développement de modèles de tumeurs humaines xénogreffées sur souris ou Patient Derived Xenografts (PDX) représentants au mieux l'hétérogénéité et la variété des cancers pédiatriques solides. Ces modèles seront utilisés pour réaliser des études précliniques avec un nombre d'animaux réduit afin d'identifier les meilleures thérapies potentielles dont pourraient bénéficier les enfants et les adolescents malades. Le développement de modèles PDX est indispensable car ces modèles sont les seuls permettant de reconstituer la complexité des tumeurs humaines et bien que l'environnement cellulaire qui entoure les greffons est constitué de tissus de souris, ce sont sans doute les modèles qui s'approchent le plus de la maladie humaine. Ces PDX sont donc, à l'heure actuelle, les outils les plus performants pour mimer les réponses observées chez les patients en clinique et établir une liste des meilleurs traitements potentiels pour lutter contre les cancers pédiatriques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de développer les modèles nécessaires pour déterminer l’efficacité de nouvelles molécules développées chez l'enfant ou de molécules développées ou en cours de développement chez l’adulte afin d’améliorer et d'identifer des thérapies efficaces pour le traitement des différents types de cancers pédiatriques solides. Dans le cadre de développement de médicaments pour des populations bien définies (médecine personnalisée), il est indispensable de développer de nouveaux modèles sur un organisme complexe (souris) avec une activité du métabolisme pouvant changer la distribution et l’efficacité thérapeutique. Parmi un très grand nombre de molécules à tester, incluant de nouvelles molécules ou des molécules développées ou en cours de développement chez l’adulte, et dont l’efficacité doit être démontrée chez l’enfant, les études précliniques avec un nombre d'animaux réduit sont une première étape vers l’identification des traitements les plus efficaces pour l’ensemble des cancers pédiatriques.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une greffe correspondant à l'implantation d'un fragment de tissus tumoral. Avant la greffe, les souris sont anesthésiées (anesthésie générale). La peau est incisée au niveau du dos de l'animal après désinfection préalable. La greffe est réalisée par l'implantation d'un fragment tumoral. Afin d'identifier avec précision le modèle implanté, les souris seront marquées au niveau des oreilles ou avec une puce insérée en sous cutané. L'incision est alors refermée par 2-3 agrafes préalablement aseptisées. La procédure a une durée globale de 30 minutes maximum par souris. Le réveil des animaux sera surveillé au maximum 24h après l'anesthésie. Les animaux seront observés quotidiennement pour s'assurer de leur bien-être et de leur comportement (isolement du groupe, prostration, aspect du poil...). Les animaux seront manipulés une à trois fois par semaine si leur état général ne nécessite pas une surveillance renforcée: les souris seront pesées 1 fois par semaine et les tumeurs seront mesurées jusqu'à 3 fois par semaine en fonction de la croissance tumorale. Selon les molécules, l’administration sera réalisée par voie orale, intrapéritonéale, intraveineuse ou sous-cutané en fonction du schéma de traitement associé. Dans le cadre d'une meilleure connaissance des modèles des prélèvements de sangs pourront être effectués au niveau du sinus retro-orbital (sous anesthésie gazeuse) ou de la veine caudale, dans le respect des directives européennes. Des ponctions intracardiaques pourront être pratiquées lors de prélèvements terminaux, sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Certains modèles de PDX sont susceptibles d’induire une perte de poids chez la souris. L'administration de molécules est susceptible d’induire une perte de poids chez la souris. En cas d'une perte de poids supérieure à 15% du poids en début d'expérimentation pour les souris porteuses de modèles en développement ou une perte de poids supérieure à 10% pour les souris porteuses de modèles en traitement, une supplémentation sous forme de gel sera ajoutée dans la cage. Dans ce cas, la mesure du poids corporel est effectuée tous les jours jusqu'au retour à une perte de poids

Devenir

L'ensemble des animaux de ce projet étant porteur d'un fragment tumoral, à l'issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés. La réutilisation ne peut pas être possible car les effets des procédures précédentes que les animaux ont subies (greffe de fragment tumoral, traitement par des molécules) pourraient introduire une variabilité indésirable dans les résultats de toute étude ultérieure.

Remplacement

Ce projet a pour objectif de développer les modèles nécessaires pour déterminer l’efficacité de nouvelles molécules développées chez l'enfant ou de molécules développées ou en cours de développement chez l’adulte afin d’améliorer et d’identifier des thérapies efficaces pour le traitement des différents types de cancers pédiatriques solides. Dans le cadre de développement de médicaments pour des populations bien définies (médecine personnalisée), il est indispensable de développer de nouveaux modèles sur un organisme complexe (souris) avec une activité du métabolisme pouvant changer la distribution et l’efficacité thérapeutique. Il n'existe pas de méthode alternative autre qu’in vivo dans le modèle murin permettant de valider les résultats avant un transfert chez l'homme.

Réduction

Le développement de PDX est standardisé et la parfaite connaissance de ce type de modèles permet de mettre en place une stratégie expérimentale n’utilisant que le nombre strictement nécessaire d’animaux. Nous estimons développer 100% des modèles transférés par les partenaires du projet. L'approche sélectionnée pour la réalisation d'études précliniques permet d'évaluer, sur un nombre réduit de souris, l'efficacité et la toxicité de molécules sur une large cohorte de modèles. Ce format d'étude permet de réduire le champ d’investigation en diminuant le nombre important de molécules à tester dans des études précliniques plus approfondies et donc de réduire le nombre global d'animaux utilisés. La taille des groupes des études précliniques sur un nombre d'animaux réduit se base également sur la valeur classiquement utilisée du taux d'inhibition présentant un intérêt qui permet de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tous en garantissant la puissance de l'expérimentation. A partir de nos données, nous avons pu déterminer les variables liées à la croissance tumorale de ce type de modèles et définir le nombre d’animaux minimum et nécessaire à l’observation significative d’un effet >58%.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement pour monitorer leur bien-être général et leur comportement (isolement du groupe, prostration, aspect du poil...). Pour chaque animal, tout signe clinique observé susceptible de causer une douleur, une souffrance ou une angoisse, sera immédiatement enregistré. En cas d’apparition de signes cliniques importants, l’observation pourra être portée à 4 fois par jour au lieu d'une. Lors de l’acte chirurgical, la greffe se fera sous anesthésie générale par une injection par voie intrapéritonéale. Le réveil des animaux sera surveillé au maximum 24h après l'anesthésie. En cas d’une perte de poids supérieur à 15% du poids en début d'expérimentation, une supplémentation sous forme de gel alimentaire sera ajoutée dans la cage et/ou les traitements seront arrêtés jusqu'à ce que la perte de poids soit inférieure à 10% du poids en début d'expérimentation. En cas de diarrhée causant une perte de poids, les dispositions associées à la perte de poids seront prises. L'ensemble de ces mesures permet d'anticiper et de réduire une éventuelle souffrance de l'animal.

Choix des espèces

L'objectif du projet est le développement de modèles nécessaires pour la détermination de l’efficacité de nouvelles thérapies pour le traitement des différents types de cancers pédiatriques solides. Dans le cadre de développement de médicaments pour des populations définies (médecine personnalisée), il est indispensable de développer de nouveaux modèles sur un organisme complexe (souris) avec une activité du métabolisme pouvant changer la distribution et l’efficacité thérapeutique. Il n'existe pas de méthode alternative autre qu’in vivo permettant de valider les résultats avant un transfert chez l'homme. Nous utilisons des souches murines immunodéprimés qui sont classiquement utilisées pour des greffes de tumeurs humaines et dans le cadre d'évaluations pharmacologiques et qui ont été utilisées lors du pré-développement des modèles par les partenaire du projet. Les souris présentant un système immunitaire résiduel qui se développe avec l'âge et qui peut réduire le taux de prise de greffe, nous utiliserons des animaux, en fin de période d'acclimatation, de plus de 18g, âgés entre 6 et 10 semaines pour augmenter nos chances de succès.

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur humaine leur est inoculée, avec des injections de traitement deux fois par semaine pendant quatre semaines, puis mise à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur indique que la tumeur peut nécroser ou s'ulcérer, l'animal étant tué si elle dépasse 2 000 mm³. Il affirme que la validation de ces anticorps ne peut s'effectuer que chez l'animal vivant, l'entrée en essai clinique restant une perspective.

Objectifs

L’immunothérapie constitue un véritable espoir dans le traitement de nombreux cancers, notamment dans ceux sans prise en charge efficace actuellement. Ce traitement consiste principalement en l’administration d’anticorps monoclonaux dirigés contre les cellules tumorales ou leur microenvironnement afin de limiter la croissance tumorale. Plusieurs types d’anticorps monoclonaux peuvent être utilisés dans ce but, sous réserve que le patient présente bien la protéine ciblée au sein de sa tumeur. D’autres anticorps monoclonaux ont une action immunomodulatrice en levant le mécanisme d’inhibition du système immunitaire induit par la tumeur. Ces mécanismes sont communs à plusieurs cancers et ces traitements récents ont des indications dans déjà sept types de cancers : poumon, rein, vessie, tête et cou, mélanome , maladie de Hodgkin et maladie de Merkel et sont actuellement évalués dans de nombreux autres cancers. Bien que des réponses remarquables et prolongées aient pu être observées chez des patients atteints de cancers avancés métastatiques, un nombre important de patients (80 à 60% selon les cancers) restent réfractaires au traitement.

Bénéfices attendus

La première partie de ce projet permettra de compléter la caractérisation de notre produit par confirmation des marqueurs tumoraux identifiés et permettra de de débuter un essai clinique chez l’homme , dans des cancers ou le besoin médical est très important. Dans le cadre du lymphome cette étude permettra de confirmer l’intérêt thérapeutique de notre candidat médicament et ainsi d’offrir une vrai alternative thérapeutique aux patients atteints de lymphomes T périphériques et ne bénéficiant d’aucune prise en charge actuellement

Procédures

Les animaux seront soumis à une inoculation de tumeur humaine via injection en sous-cutanée sous anesthésie ou via injection en intra-péritonéale sur animal vigile. Pour le suivi de chaque modèle, les animaux seront également soumis à des injections en intrapéritonéal pour les traitements (2 fois par semaine pendant 4 semaines) sur animaux vigiles. L'anesthésie pour l'injection en sous-cutanée sera de courte durée :< à 5 min par souris. Pour les injections en intrapéritonéale la manipulation des souris n'excédera pas 1 min.

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux sous-cutanées peuvent provoquer de la douleur si la tumeur nécrose ou s’ulcère (points-limites). La tumeur ne devant pas provoquer de gêne pour la mobilité de l’animal, celui-ci sera mis à mort si la tumeur atteint 2000mm3 (soit moins de 10% de la masse corporelle). Aucun autre effet indésirable n’a été remarqué sur ce type de modèle au laboratoire. Les modèles tumoraux sous-cutanés sont considérés comme des procédures modérées. Les modèles de lymphomes T périphériques peuvent induire une splénomegalie, mais aucune autre altération majeure n’est attendue. L’état clinique et le poids des souris seront suivies 3 fois par semaine. Ces modèles sont également considérés comme des procédures modérées.Une contention légère sera fait sur les souris pour l'administration intrapéritonéale par du personnel qualifié afin de ne pas engendrer de stress sur les souris. Cette manipulation ainsi que la piqure ne durera que quelques secondes et la souris sera rapidement remise avec ses congénères. La manipulation des souris pour mesurer la masse tumorale n’excédera pas 1 min. elle se fera 3 fois par semaine dont 2 fois en même temps que l’injection des traitements afin d’éviter les manipulations intempestives.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêts pourront être récupérés pour compléter les analyses.

Remplacement

Du fait du contexte physiologique et de la complexité du système immunitaire, la validation d’un traitement par anticorps polyclonaux ne peut s’effectuer que dans un modèle in vivo. Il est nécessaire d’utiliser des animaux pour atteindre les objectifs du projet car cette étude a pour objet l'évaluation de l’efficacité thérapeutique d’un ou plusieurs traitements en préclinique. Les animaux sont indispensables à cette étape d’évaluation thérapeutique du traitement car ils permettent de tester in vivo l’efficacité ou la non-efficacité du (des) traitement(s), de caractériser le fonctionnement du (des) traitement(s), ainsi que les effets secondaires possiblement liés avant de le tester en clinique chez l’Homme si celui (ceux)-ci est efficace.

Réduction

Dans le but d'utiliser un nombre d'animaux cohérent avec une pertinence statistique, nous avons défini le nombre d'animaux par groupe de 10 -15 animaux selon les étapes pour l’ensemble des groupes. Les tests statistiques utilisés reposent sur l’analyse de données non paramétriques, calculée quand le nombre de sujet est inférieur à 30. Ces tests nous permettent d’analyser nos données en combinant un test statistique fiable et un nombre d’animaux réduit.

Raffinement

Une étape d’acclimatation de 4 jours minimum sera systématiquement réalisée à l’arrivée des animaux pour éliminer le stress dû au transport et permettre l’habituation aux nouveaux locaux et personnels animaliers avant tout acte sur l’animal. La douleur sera dans la mesure du possible évitée en euthanasiant les animaux si leur score clinique global atteint 8 sur deux jours consécutifs tel que décrit dans le tableau de score clinique général ou par injection d’analgésique dans le cas de morsure par exemple. En outre, les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 5 pour limiter le stress de la surpopulation. Des brindilles de papier sont placées dans la cage pour permettre aux souris de s’enfouir et se cacher. L’analgésie quant à elle dépendra de la cause. Pour les animaux en souffrance tels que les animaux ayant un score clinique > à 7 sur deux jours consécutifs, l’animal se verra administrer en sous-cutané une injection de buprénorphine à 0.1mg/kg deux fois par jour jusqu’à diminution du score ou exclusion de l’étude. Pour les plaies de surface comme les morsures, après désinfection, les animaux pourront recevoir directement sur la plaie de la tétracaïne.

Choix des espèces

La souris NMRI nude est très largement utilisée pour la mise en place de modèle xénogreffe. De plus elle présente une activité résiduelle du complément murin, ce qui la rend pertinente pour l’évaluer l’activité biologique de nos traitements à base de d’anticorps polyclonaux. Tous les modèles xénogreffe décrit dans ce projet ont été validé et caractérisé dans des publications. Adulte-8-10 semaines, car la prise tumorale est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse anti-tumorale, et donc un stade tumoral différent.

1 200 souris et 300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur mammaire leur est greffée, avec jusqu'à deux chirurgies, radiothérapie, imagerie et prélèvements sanguins, puis mise à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur indique que la tumeur peut réduire la mobilité, se nécroser ou métastaser jusqu'aux poumons. Il affirme que l'animal est un passage obligatoire avant l'humain, les bénéfices étant renvoyés au long terme.

Objectifs

Les cancers du sein sont les cancers les plus fréquents chez la femme. Ils représentent une pathologie très hétérogène. Ainsi, deux patients ayant le même diagnostic initial pourront présenter des réponses aux traitements conventionnels très différentes. Un seul type de modèle ne peut donc représenter l’ensemble de ces pathologies. Ce projet vise à évaluer les propriétés anti-tumorales de différentes approches thérapeutiques incluant notamment des candidats médicaments, la radiothérapie ou encore l'utilisation de dispositifs médicaux dans des modèles de tumeurs mammaires obtenues par greffe de cellules cancéreuses.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter les cancers du sein. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé ou le dispositif médical testé est actif dans un modèle expérimental de tumeurs mammaires ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques.

Procédures

En fonction de l'étude, les animaux pourront subir au maximum 2 chirurgies de 5 à 15 min chacune, sous anesthésie générale, pour l'implantation d'un dispositif médical et l'exérèse chirurgicale de la tumeur mammaire. Ils seront également anesthésiés au moins une fois, généralement par anesthésie gazeuse, pour l'implantation des cellules tumorales. Ils pourront également être anesthésiés plusieurs autres fois au cours de l'étude pendant quelques minutes, généralement par anesthésie gazeuse, afin de procéder à des traitements comme la radiothérapie et/ou à des suivis par imagerie. Dans le cas de radiothérapie, les animaux seront traités généralement pendant 5 jours consécutifs. Les suivis par imagerie se feront eux généralement 1 fois tous les 7 à 15 jours pendant environ 2 mois. Les animaux pourront également subir plusieurs prélèvements de sang dans le respect des recommandations éthiques (volumes prélevés, fréquences et temps de récupération).

Impact sur les animaux

Le développement de la tumeur mammaire peut entrainer un inconfort voire une réduction de la mobilité des animaux. Les tumeurs peuvent également développer une nécrose. Des métastases, en particulier au niveau des poumons, peuvent entrainer des difficultés respiratoires. Par ailleurs, les effets potentiellement indésirables du/des produits testé(s) font l’objet d’échange avec nos promoteurs et les responsables Bien-Etre Animal pour adapter les outils d’observations des animaux afin d'anticiper au mieux de potentiels signes cliniques.

Devenir

Mise à mort de l'ensemble des animaux à la fin de l'étude pour réaliser des prélèvements d'organes et/ou des observations macroscopiques.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rongeur car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les tumeurs mammaires. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris et le rat sont les espèces qui sont les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 6-10 animaux/groupe.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • le suivi d’éventuel signes cliniques, • la détermination des points limites, • le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire. • un protocole analgésique adapté pour les chirurgies et la période post-opératoire ainsi qu'un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • la réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse.

Choix des espèces

La souris et le rat sont les espèces animales les plus adaptées et les plus couramment utilisées dans les modèles animaux de tumeurs mammaires obtenues par greffe de matériel biologique d’origine tumorale. Les animaux utilisés sont des animaux adultes âgés de 6 à 10 semaines au moment de l’implantation des cellules tumorales. La prise tumorale est connue pour être moins bonne chez des individus plus âgés.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent six injections de tamoxifène, une greffe de cellules tumorales, et pour une partie une chirurgie d'ablation des ganglions lymphatiques, avec un suivi par imagerie sous anesthésie deux fois par semaine. Elles sont ensuite tuées pour prélever plusieurs organes. Le projet étudie le rôle d'une protéine dans les métastases et le lymphœdème, le porteur affirmant que l'étude d'un "organisme entier" ne peut être reproduite in vitro.

Objectifs

Le projet vise à déterminer le rôle de notre protéine d’intérêt, une phosphatase, dans les vaisseaux lymphatiques dans deux contextes liés au cancer : (1) les métastases d’origine lymphatique et (2) les lymphoedèmes post-résection des ganglions lymphatiques. Les métastases représentent la dissémination d’une tumeur dans le corps. Les lymphoedèmes sont des accumulations de fluide dû à un défaut des vaisseaux lymphatiques pour évacuer le surplus de fluide. Dans certains cancers, la résection des ganglions, soit l’opération de retirer les ganglions lymphatiques proches de la tumeur, est souvent nécessaire pour prévenir la formation des métastases. Malheureusement, cela peut avoir des effets négatifs tels que le lymphoedème. Par cette étude, nous voudrions répondre aux questions suivantes : (1) est-ce que l’expression de cette protéine dans les cellules lymphatiques joue un rôle majeur dans le développement de métastases, notamment dans la lymphangiogenèse associée ? (2) Cette protéine est-elle impliqué dans la formation de lymphoedème suite à une résection de ganglions lymphatiques ?

Bénéfices attendus

Les résultats préliminaires in vitro montrent que notre protéine d’intérêt, une phosphatase, a un effet sur la prolifération, la migration et le bourgeonnement des cellules endothéliales lymphatiques. Ceci suggère que cette protéine pourrait donc avoir un rôle dans la régulation de la formation des vaisseaux lymphatiques (lymphangiogenèse). Si cela est aussi observé in vivo, ce projet nous permettra d’ajouter un nouveau régulateur dans le processus et également une meilleure compréhension du rôle des phosphatases dans la lymphangiogenèse. La formation des vaisseaux lymphatiques est un processus important pour le bon fonctionnement de l’organisme et un dérèglement de ce processus entraîne souvent le développement ou l’aggravation d’une pathologie comme par exemple les lymphoedèmes (accumulation de fluide dans une partie du corps) ou les métastases (dissémination de cellules tumorales). Ainsi, tout régulateur de la lymphangiogenèse peut devenir une cible thérapeutique pour activer ou inhiber la formation des vaisseaux lymphatiques afin de prévenir ou de guérir les pathologies. Par exemple, dans le cas des cancers avec un risque de métastase, les deux voies les plus probables pour les cellules tumorales sont les vaisseaux sanguins et lymphatiques. Donc, en inhibant la formation de ces vaisseaux à la périphérie de la tumeur, le risque de métastase diminue. Ainsi, l’utilisation d’un inhibiteur de lymphangiogenèse comme traitement additionnel pourrait améliorer le traitement des cancers. On observe déjà ce type de traitement pour inhiber la formation de vaisseaux sanguins autour de la tumeur. Cependant, pour inhiber la lymphangiogenèse, il est nécessaire de mieux comprendre le mécanisme de formation des vaisseaux pour pouvoir cibler les régulateurs. Dans notre cas, notre protéine d’intérêt pourrait devenir une cible pour inhiber la formation des vaisseaux lymphatiques dans les tumeurs. Cela pourrait également devenir une cible thérapeutique contre la formation de lymphoedème qui a aussi pour origine un dysfonctionnement des vaisseaux lymphatiques.

Procédures

Avant chaque procédure, tous les animaux (soit 320 max) recevront 6 injections de tamoxifen réparties sur 2 semaines. Chaque injection dure moins d’une minute par souris. Pour chaque procédure, les animaux sont anesthésiés sous isoflurane (un gaz) ou par injection d’anesthésiants. Pour l'injection de cellules tumorales en sous-cutanée, les animaux recevront une application d'analgésique local avant l'injection de cellules. Les animaux subissant une chirurgie plus importante recevront une injection d’analgésique avant chirurgie. 160 souris auront une injection de cellules tumorales (mélanome ou cancer du poumon) en sous-cutané, 80 souris auront une injection de cellules du cancer du sein au niveau des glandes mammaires et 80 souris subiront une chirurgie pour retirer les ganglions lymphatiques de la patte. Chaque chirurgie n’excède pas 5 minutes par souris. Après chirurgie, tous les animaux seront gardés en observation pendant le développement de la maladie jusqu’à la mise à mort. Si nécessaire, les souris recevront 1 ou 2 injections supplémentaires d’analgésique contre la douleur ou l’application d’un désinfectant cutané contre le risque d’infection. Les souris ayant reçu une injection de cellules tumorales auront un suivi du développement de la tumeur par imagerie 2 fois par semaine. Pour cela, les souris seront anesthésiées par isoflurane et recevront une injection d’un composé permettant la localisation des cellules tumorales avant d'être placé dans un imageur adapté pour une acquisition d’image sur animal vivant. L'acquisition d'image prend 6 à 25 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront suivis quotidiennement avec une fiche de suivi hebdomadaire et une pesée 3 fois par semaine. L’apparence et le comportement des animaux seront marqués sur la fiche de suivi. Pour chaque expérience, les animaux pourront présenter une perte de poids, des signes de douleur ou de gêne avec possible prostration, cachexie, tremblement ou isolement (voir chaque procédure pour plus de détails). Tous ces critères sont considérés comme des points limites lorsqu’ils dépassent un certain seuil. Le seuil est déterminé par le personnel de l’animalerie qui a une longue expérience de ce type de procédure. Lorsqu’un point limite est atteint, l’animal est immédiatement euthanasié pour éviter toute souffrance inutile.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les tissus nécessaires aux analyses visant à déterminer s’il y a une différence au niveau de la formation des métastases et de lymphoedème. Ainsi plusieurs tissus et/ou organes seront prélevés sur chaque animal.

Remplacement

Le projet vise à caractériser le rôle d’une protéine spécifique au niveau des vaisseaux lymphatiques lors de métastases (dissémination de cellules tumorales) et de lymphoedème (accumulation de fluide dans une partie du corps). Ceci nécessite donc l’utilisation d’un modèle in vivo car il n’est pas possible de reproduire ces conditions in vitro. L’étude des métastases demande un organisme entier puisque les cellules tumorales circulent d’un organe à un autre en utilisant le système circulatoire de l’organisme. Le lymphoedème est également une pathologie qui s’étudie à l'échelle d'un corps entier. Il est également important de noter que des interactions complexes entre différents types cellulaires est nécessaire pour l’observation de ces phénomènes.

Réduction

Pour être statistiquement significatif et scientifiquement irréprochables, un nombre de 10 souris par génotype sera nécessaire pour chaque expérience et les expériences seront répétées 4 fois (1 expérience pour ajuster les protocoles et 3 expériences pour prouver la reproductibilité des résultats) pour chaque procédure. La variabilité entre les expériences et entre les animaux pouvant être importante, un nombre d’animaux suffisant et plusieurs expériences permet d’avoir des résultats scientifiquement robustes. Nos 2 génotypes d’intérêt sont les souris avec une délétion inductible de notre protéine et les souris sans délétion inductible. Nous avons optimisé nos croisements pour n’obtenir que les génotypes d’intérêt à chaque portée pour limiter le nombre d’animaux. Donc 2 x 10 souris = 20 souris/expérience. Donc pour la procédure 1, où nous avons 2 lignées cellulaires différentes : 20 souris x 4 expériences x 2 lignées cellulaires = 160 souris. Pour la procédure 2 : 20 souris x 4 expériences = 80 souris. De même pour la procédure 3. Donc, nous estimons le nombre maximal d’animaux à 320. Pour la procédure 2, nous n’utiliserons que des souris femelles pour l’étude sur le cancer du sein. Afin de ne pas perdre les mâles des mêmes portées, nous les utiliserons pour les autres procédures en essayant de garder quand même une certaine mixité. Le ratio femelle/mâle des procédures 1 et 3 sera donc plus de l’ordre du 1 pour 3 que du 1 pour 1 dans certaines expériences en parallèles avec celles de la procédure 2. Les études statistiques seront réalisées avec les tests statistiques adaptés aux résultats.

Raffinement

Une surveillance d’une grande attention sera faite après chaque geste expérimental. Pour les injections de tamoxifen de chaque procédure, 10 minutes d’observation et une vérification 1h après. En cas d’inconfort ou de souffrance, l’animal sera tout de suite pris en charge par les soigneurs et sacrifié si son état est trop grave. En cas de saignement grave au niveau du site d'injection, l’animal sera immédiatement sacrifié. Pour chaque acte chirurgical, les souris seront anesthésiées et placées sur un tapis chauffant (37°C) avec une application de gel ophtalmique sur les yeux pour prévenir le dessèchement oculaire. Lors de l’injection des cellules tumorales en sous-cutané (procédure 1), un analgésique local sera utilisé pour prévenir la douleur dû à l’injection. Lors de l’injection des cellules tumorales dans la glande mammaire (procédure 2) et l'opération de retrait des ganglions lymphatiques (procédure 3), un analgésique et un désinfectant cutané seront utilisés pour réduire la douleur et prévenir les infections. Après chirurgie/implantation, les souris sont remis dans leurs cages avec leurs congénères (5 souris/cage) et observées jusqu’à leur réveil avec une vérification 1h après. Les cages seront enrichies en accord avec la procédure expérimentale. Des tunnels seront présents dans chaque cage. De la nourriture humide sera mise à disposition dans les cages si nécessaire, par exemple pour aider à l’alimentation suite à la chirurgie. Pour toutes les procédures expérimentales, il y aura un suivi quotidien des animaux et chaque changement physique ou comportemental sera noté sur une fiche de suivi quotidienne. Tout comportement anormal grave comme la prostration ou des tremblements entraînera l’euthanasie immédiate de l’animal. Pour des changements plus légers, l’avis d’un vétérinaire sera demandé et une décision sera prise en concertation avec le vétérinaire, les soigneurs et le responsable du projet pour définir la meilleure prise en charge de l’animal. Les soins seront toujours effectués par les mêmes expérimentateurs pour réduire le stress des animaux et tout le personnel de l’animalerie impliqué dans ce projet a les compétences et l’expérience nécessaire pour la partie expérimentale. Au cours du projet, nous nous maintiendrons informer des possibles améliorations de raffinement adaptables à nos procédures.

Choix des espèces

Le projet vise à caractériser le rôle de notre protéine d’intérêt au niveau des vaisseaux lymphatiques lors de métastases (dissémination de cellules tumorales) et de lymphoedème (accumulation de fluide dans une partie du corps). Ceci nécessite donc l’utilisation d’un modèle in vivo car il n’est pas possible de reproduire ces conditions in vitro puisque cela demande une conformation 3D à l’échelle d’un organisme entier, mais également des interactions complexes entre différents types cellulaires. L’implantation de tumeur chez la souris est par ailleurs une expérience couramment utilisée pour l’étude de la formation des métastases. La lignée de souris de notre projet, déjà existantes, permettra de déléter spécifiquement notre protéine au niveau des vaisseaux lymphatiques. Ce modèle nous permettra d’étudier l’implication de l’expression de notre protéine d’intérêt au niveau des vaisseaux lymphatiques dans les cas de métastases et de lymphoedème. Les souris sont également immunocompétentes car les cellules immunitaires peuvent avoir une grande influence sur les vaisseaux lymphatiques, notamment dans les cas de cancers où le microenvironnement est important. Nous commencerons les expériences sur des souris âgées entre 6 et 8 semaines afin d’avoir une bonne induction de la délétion de la protéine. L’utilisation de jeunes animaux permet également une croissance tumorale optimale et un système immunitaire performant. En effet, dans notre étude, il se peut que le système immunitaire ait un rôle important en lien avec les vaisseaux lymphatiques que nous étudions. Ces expériences d’implantation de tumeur peuvent prendre plusieurs semaines à plusieurs mois, particulièrement pour l’observation de métastases, donc il est mieux de commencer le plus tôt possible.