Cancers

314 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe d'un lymphome que le porteur décrit comme envahissant les tissus et aboutissant à la mort de l'animal, puis des injections de cellules et jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie. Toutes sont tuées par dislocation cervicale pour prélever leurs tissus. Le projet évalue des cellules NK humaines produites selon un procédé breveté comme immunothérapie anticancéreuse, en vue d'un dossier réglementaire pour un essai clinique.

Objectifs

Nous produisons des lymphocytes « Natural Killer » humains à partir de cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon, en passant par un stade de précurseur lymphoïde, selon une technique brevetée, qui permet d’obtenir en 2 à 3 semaines de très grandes quantités de lymphocytes NK immatures, présentant un degré de pureté supérieur à 90. Nous avons également montré que nous pouvions combiner la culture à une modification génétique par transduction lentivirale, qui permet d’apporter des propriétés antitumorales supplémentaires (par exemple un récepteur antigénique chimérique appelé CAR, dirigé contre un antigène tumoral). Les lymphocytes produits sont fonctionnels in vitro. Notre objectif est de caractériser in vivo la biodisponibilité et la fonction de ces cellules lymphocytaires, non modifiées ou modifiées génétiquement pour exprimer un CAR, et à les comparer à des lymphocytes matures du sang et des lymphocytes dérivées de cellules souches hématopoïétiques selon un protocole qui ne passe pas par l’étape précurseur lymphoïde. Ces deux sources de lymphocytes sont utilisées dans le cadre d’essais cliniques, mais présentent un certain nombre des défauts (résistance à la transduction, expansion limitée, apparition précoce de marqueurs d’épuisement). Nous utiliserons comme modèle une souris immunodéficiente humanisée et suivrons des schémas expérimentaux publiés. Nous répondrons à la question de la biodisponibilité in vivo des lymphocytes après greffe chez la souris. Nous validerons dans une étape pilote le modèle tumoral. Enfin, nous explorerons la capacité des lymphocytes armées avec un CAR à détruire des cellules tumorales par imagerie sur souris anesthésiée. Ce projet nous apportera les réponses scientifiques et les preuves précliniques du potentiel de ces cellules en immunothérapie anti-cancéreuse.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider la capacité des cellules NK produites dans nos conditions (brevetées) à persister après greffe. Il permettra également de valider la fonctionnalité des cellules NK. Au terme du projet, s’ils sont positifs, les résultats seront utilisés pour documenter le dossier exigé qui sera soumis aux autorités réglementaires pour la mise en place d’un essai clinique de phase I/II pour le traitement des lymphomes B. Les schémas expérimentaux et les résultats serviront de base à l’exploration de l’efficacité des cellules NK pour traiter des tumeurs solides.

Procédures

Aucun prélèvement sur animaux vigiles, ni procédures chirurgicales n'est prévu dans l'étude. Les interventions se limiteront à : 1) Injection d'agent de conditionnement. Durée de l’intervention : 30 secondes/souris. L’ensemble des souris (314) sont injectées 1 fois avec cet agent. Durée de l’intervention : 30 secondes/souris. 2) 3 jours après l’injection de l'agent de conditionnement, injection(s) de l'agent théeapeutique NK et/ou des cellules cancéreuses après anesthésie générale : 172 souris injectées 1 fois; Durée de l’intervention 5 minutes/ souris. 142 souris injectées 2 fois. Durée de l’intervention : 15 min/souris. 3) Injection de molécule pour permettre le suivi par bioluminescence après anesthésie générale. Maintien de l’anesthésie gaseuze durant l’aquisition au lecteur de bioluminescence. 164 souris injectées et anesthésiées 8 fois maximum pendant 1 mois. Durée de l’intervention : 15 min/souris. 4) Prélèvement de sang après anesthésie générale : 150 souris, 1 prélèvement par souris juste avant la mise à mort. Durée de l’intervention : 10 min/souris. 5) Mise à mort par dislocation cervicale immédiatement après le prélèvement de sang. Toutes les souris (314) sont concernées. Durée de l’intervention : 1 minute/souris. Au total, 150 souris subiront 4 injections et 1 prélèvement de sang. Les 22 aurtes souris subiront 12 injections et 8 séances d’imagerie. Les 142 souris restantes subiront 13 injections, 8 séances d’imagerie et 1 prélèvement de sang.

Impact sur les animaux

Le modèle tumoral est un modèle d’un lymphome de Burkitt, une tumeur liquide qui envahit les tissus hématopoïétiques (moelle osseuse, rate) et aboutit à la mort de l’animal. Les cellules NK ne provoquent pas d'effets indésirables. Les injections intrapéritonéales et intraveineuses par voie caudale provoquent une douleur localisée légère. Les injections intraveineuses par voie rétro-orbitaire provoquent une douleur localisée et un stress.

Devenir

Tous les animaux du projet (314) seront mis à mort pour prélèvement de tissus et leurs analyses (à J4 ou J7). Ces dernières nous permetteront d'étudier la biodisponibilté.

Remplacement

Notre protocole de production de cellules NK est, en soit, une méthode de Remplacement partiel, puisque nous partons de cellules souches humaines isolées de sang de cordon ou ou de donneurs adultes pour produire et expandre des cellules NK ex vivo avec un système complètement in vitro, sans nécessité de faire maturer les cellules humaines chez la souris. Les expériences chez l’animal interviennent au terme d’un long développement et s’inscrivent dans le cadre d’une validation in vivo de l’effet thérapeutique de ces cellules avant un développement clinique. Les cellules NK produites selon le nouveau procédé ont été complètement caractérisées phénotypiquement et fonctionnellement. Toutefois, les expériences in vitro ne permettent pas d’évaluer la biodisponibilité, des cellules NK dans les différents organes immunitaires, ou leur capacité à migrer dans les tumeurs, et à les détruire. L’efficacité des approches de thérapie cellulaires ne peut être évaluée in fine que in vivo dans un modèle mimant la maladie humaine. Les expériences sur l’animal sont donc justifiées avant leur application chez l’homme.

Réduction

Pour répondre à des questions de biologie cellulaire et moléculaire, nous utiliserons des cultures primaires, ce qui réduit fortement l’utilisation d’animaux. Cependant, les cultures cellulaires ne peuvent pas remplacer les études in vivo pour les réponses physiopathologiques liées à une manipulation génétique ou traitement pharmacologique. Le nombre total de souris impliquées dans les expériences a été réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données suffisantes tout en s’assurant d’une interprétation statistique fiable des résultats pour évaluer l’effet thérapeutique des produits testés. Afin de réduire le nombre d’animaux, les scores d’évaluation clinique les plus objectifs, prédictifs et robustes seront privilégiés.

Raffinement

Afin de limiter la souffrance et le stress infligés aux animaux, une surveillance rapprochée et l’utilisation d’antalgiques sont prévues. Des points limites ont été établis afin d’anticiper la mise à mort de l’animal si nécessaire. Dans le modèle tumoral en particulier, dans le cas où l’induction de la tumeur est à l'origine de douleurs visibles, de détresse ou de signes de toxicité (diminution des mouvements, perte d'appétit, perte d'intérêt de l'exploration, perte de poids, comportement stéréotypique lié au stress), l’expérience sera interrompue et l'animal mis à mort. Pour réduire le stress éventuel engendré par la procédure, les animaux seront hébergés dans un environnement exempt d’organisme pathogène, enrichi à l’aide de coton (pour la nidification), de tunnels de polycarbonate (pour les activités journalières) et de bâtons en bois (pour développer leurs exigences naturelles comme ronger, grimper et se cacher). D’autres outils seront disponibles à la demande pour éviter l’ennui si des animaux se retrouvent seuls dans les cages. Si une souffrance est avérée avec un score supérieur à 6 défini dans les procédures, les NSG-IL15 seront mises à mort pour une étude macroscopique des organes et/ou de l’immunohistochimie et/ou une analyse du statut sanitaire.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé car sa génétique est proche de celle de l’homme et elle permet d’avoir des nombres d’animaux suffisants pour faire des tests statistiques. Par ailleurs, il existe de nombreux outils (ex : anticorps) qui sont développés parfois exclusivement chez la souris. Les essais précliniques sur animaux sont exigés par les autorités réglementaires dans tout dossier préalable à la demande d’un essai clinique chez l’homme. Il est à noter que seuls les protocoles mis au point et validés in vitro seront testés chez l’animal. Les animaux utilisés seront au stade adulte, entre 10 et 12 semaines de vie. Ce choix se base sur l’âge auquel les lymphomes B se déclarent chez l’Homme et sur un protocole ayant montré des résultats encourageants.

121 animaux non-humains vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 16 chiens et 105 porcs. Les porcs subissent des interventions chirurgicales pouvant durer jusqu'à six heures sous anesthésie profonde, puis sont tués sans réveil du fait des lésions provoquées dans plusieurs organes, alors que les chiens, opérés lors de procédures présentées comme non délabrantes, sont réutilisés ensuite. Le projet vise à mettre au point des plateformes robotiques d'ablation tumorale et de biopsie destinées d'abord à la chirurgie humaine. Le porteur affirme choisir le porc et le chien pour leur proximité anatomique avec l'humain et décrit un modèle qu'il juge indispensable pour valider l'efficacité in vivo.

Objectifs

Le projet a pour objectif le développement de plateformes robotiques destinées à l'oncologie interventionnelle (ablations tumorales), au diagnostic (biopsies) et/ ou à des interventions osseuses, par voie percutanée. Les objectifs principaux des plateformes robotiques sont: - d’atteindre très précisément les tumeurs afin de s’assurer que ces dernières seront bien détruites en limitant au maximum la destruction de cellules saines environnantes. - de cibler très précisément des tumeurs de très petite taille afin de disposer d'outils diagnostics fiables et performants (biopsies sous IRM par exemple) pour une prise en charge précoce. - de pouvoir ponctionner l'os ou y délivrer une substance (ciment osseux par exemple) de façon précise

Bénéfices attendus

Les plateformes robotisées proposent une atteinte très précise et sécurisée des tumeurs / tissus par voie percutanée. Couplées à une modalité d'imagerie CT-scan ou IRM, elles offrent un vaste panel d'utilisations, tout en élargissant le nombre de patients pouvant bénéficier de ces traitements mini-invasifs. Principalement destinées à l'utilisation en oncologie / chirurgie humaine, elles pourront également être utilisées en médecine vétérinaire et ainsi améliorer la prise en charge des animaux de compagnie. Une plateforme robotique a d'ores et déjà pu être mise au point et installée en centre anticancer pour le traitement de patients avec tumeurs des organes abdominaux.

Procédures

Les animaux sont soumis à des procédures chirurgicales: 1) insertion de cibles synthétiques (intervention non systématique) - par laparotomie, sous anesthésie: durée env. 30min - par voie percutanée, sous contrôle echographique, sous anesthésie: durée inférieure à 15 minutes 2) procédure chirurgicale robotique: - chez le Chien, la durée d'anesthésie totale sera plafonnée à 3h, et limitée autant que possible à 2h30, afin d'assurer une récupération optimale aux animaux. La procédure chirurgicale ne pourra donc pas excéder ces temps. - chez le Porc, la procédure pourra durer jusqu'à 6h, les animaux n'étant pas réveillés, et placés sous anesthésie profonde et analgésie adaptée. Ces procédures longues permettent d'évaluer un maximum de paramètres sur un seul animal et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pour les animaux sont liés à la réalisation des chirurgies pour l'insertion de cibles syntéthiques dans les organes par laparotomie: risque d'inconfort lié à la cicatrice, stress lié à l'isolement post-opératoire.

Devenir

Les porcs sont mis à mort sans réveil à l'issue de la procédure de chirurgie robotisée, du fait de la durée d'intervention et des essais effectués, qui peuvent entrainer des lésions dans différents organes. La procédure effectuée sur chiens est non délabrante et les animaux pourront être réutilisés après la procédure soit sur le même projet, soit sur un projet différent ou lors d'activités pédagogiques.

Remplacement

Les tests in-vitro (tests réalisés sur un fantôme et sur pièces anatomiques/cadavres) précédemment réalisés ont permis de vérifier et valider plusieurs paramètres dont la précision d’atteinte de la tumeur. En revanche, ils ne permettent pas de s’assurer que cette atteinte sera similaire sur un organisme vivant. En effet, ils ne prennent pas en considération les mouvements liés à la respiration et les risques potentiels d’atteinte d’autres structures tels que des vaisseaux sanguins ou organes lors du geste. Le projet a pour objectif de valider les aspects d’efficacité et de sécurité dans un modèle in-vivo, ne pouvant être validés lors des tests in-vitro.

Réduction

La réalisation d'une majorité de tests préalable in vitro ou sur pièces anatomiques permet de réduire le nombre d'animaux utilisés au strict minimum nécessaire pour la mise au point du protocole opératoire et l'obtention des données d'efficacité et de sûreté exigées par les autorités réglementaires (les robots opératoires sont des dispositifs médicaux). Les animaux sont opérés un par un, ou par petites séries de 2 animaux: cela permet de traiter les données obtenues au fur et à mesure, de réaliser des ajustements s'il le faut, et de stopper les procédures dès que les données nécessaires sont obtenues. Ainsi aucun animal "surnuméraire" n'est opéré.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leurs besoins éthologiques avec enrichissements propres à l’espèce. : ils disposent de vastes boxes, d'une taille supérieure à celle requise par la législation. Le sol est recouvert d'une litière végétale changée tous les jours. La nourriture est distribuée dans les gamelles et dans la litière pour leur permettre de prendre le temps de la trouver. Le suivi quotidien des animaux et les pesées hebdomadaires sont assurés par le personnel technique et animalier formés aux soins et à la manipulation de ces espèces. Les animaux suivront également un programme de socialisation avec renforcement positif afin de réduire le stress engendré par les actes quotidiens. Tout acte douloureux ou fortement stressant sera réalisé sous sédation ou sous anesthésie générale selon les besoins. Si nécessaire, la douleur sera prise en charge par l'administration de traitements analgésiques adaptés.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce animale se rapprochant anatomiquement le plus de l’Homme. Pour ce projet, nous avons besoin d’avoir des organes similaires à l’Homme en terme de structure et de taille, afin de pouvoir évaluer l’effet attendu en clinique. Les organes abdominaux du porc de 35 à 80kg (dont le foie) sont parmi ceux qui se rapprochent le plus de l’Homme. Le chien est l'espèce cible du robot de biopsie prostatique, donc le modèle de choix pour l'obtention des données recherchées. Par ailleurs les caractéristiques anatomiques de la prostate canine en font également un modèle intéressant pour l'obtention de données applicables à l'Homme, pour lequel ce robot pourra être adapté par la suite. Les animaux utilisés permettront donc de générer des données à double fin: le passage rapide en essais cliniques chez le Chien, et le développement utltérieur de la même technologie destinée à l'Homme. Les porcs utilisés en étude sont de jeunes animaux qui arrivent à maturité sexuelle, leur croissance n’est pas terminée mais leur taille permet un hébergement en animalerie conventionnelle dans de bonnes conditions. D’autre part, leur poids de 35kg à 80kg permet de travailler sur des organes abdominaux, notamment un foie de taille comparable à un foie humain, indispensable pour reproduire les conditions attendues en clinique. Les chiens seront des animaux adultes de plus d'1 an, de façon a avoir une prostate de taille définitive.

1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur pulmonaire leur est greffée puis suivie par imagerie répétée sous anesthésie, jusqu'à 39 manipulations par animal, une plateforme réalisant ces études "à la demande de chercheurs extérieurs". Le porteur indique que les tumeurs peuvent provoquer une perte de poids et une gêne respiratoire, et que les organes sont prélevés après la mort "à la demande du client". Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer "l'animal entier" et écarte le poisson zèbre, jugé peu adapté à ses appareils d'imagerie.

Objectifs

Au niveau mondial, le cancer pulmonaire représente le type de cancer avec la plus forte mortalité. Parmi les sous-types de cancer du poumon, le cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules (ou CPNPC) représente 87% des cas de cancer du poumon avec un pronostic des plus sombres parmi tous les cas de cancers pulmonaires. La majorité des patients avec ce type de cancer sont malheureusement diagnostiqués à un stade avancé, voire très avancé. Notre lanoratoire est une plateforme de services et de R&D spécialisée dans l'imagerie préclinique. Sa mission est de répondre aux besoins d'imagerie de la communauté scientifique, particulièrement dans le domaine de l'oncologie expérimentale. Ce projet a pour but de réaliser, à la demande de chercheur extérieurs à notre laboratoire, des études sur des modèles murins de cancer pulmonaire afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la progression tumorale ou d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

En fonction des études clients, les bénéfices attendus sont: - Une meilleure connaissance des cancers pulmonaires. - L'étude de nouveaux traitements contre le cancer pulmonaire.

Procédures

Dans le cas des souris induites en sous-cutanée (procédure 1) : Les animaux seront anesthésiés lors de l’induction par piqure d’aiguille. Ensuite, chaque animal aura au maximum, un suivi hebdomadaire par imagerie de bioluminescence suivi d’une mesure au pied à coulisse de la tumeur et d’une imagerie échographique. (soit 3 manipulations/sem x 12 semaines = 36 manipulations). Les autres imageries (photoacoustique, radioisotopique) pourront être mises en oeuvre ponctuellement en fonction des résultats obtenus en cours d'étude soit 3 manipulations supplémentaires. Au maximun 1 souris sera soumise à 39 manipulations sous anesthésie sur 12 semaines. Dans le cas des souris induites par dépôt pulmonaire, les inductions se font sous anesthésie chimique et sur animal vigile pour l’induction par voie intraveineuse (Procédure 2). Chaque animal aura au maximum, un suivi hebdomadaire par imagerie de bioluminescence auquel peut s'ajouter 2 scanners espacés de minimum 2 semaines, 2 imageries radioisotopiques espacés de minimum 2 semaines. ((soit 2 manipulations/sem x 12 semaines) +4 =28 manipulations sur 12 semaines)12 BLI + 2+2 = 16 manipulations sous anesthésie sur 12 semaines Procédure 1 et 2 : Dans le cas où il faudrait injecter des candidats médicaments, suivant la voie d’administration il y aura au maximum 5 traitements par semaine sur souris vigiles (pour IP IV, SC, per Os) ou anesthésiées (pour intranasale ou intratrachéale) sur 12 semaines d’étude Ces administrations seront réalisées par du personnel formé et entraîné Nous pourrons être amené à prélever du sang sur animal vigile au niveau sub mandibulaire: du sang sera prélevé 3 fois en 24h.

Impact sur les animaux

Les nuissances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont: - La perte de poids. - La gène respiratoire occasionnée par les tumeurs se développant au niveau de la trachée.

Devenir

Procédure 1: Modèle sous-cutané: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort. Les tumeurs sous cutanées ainsi que différents organes seront prélevés à la demande du client pour des études histologiques complémentaires qui complèteront les résultats d'imagerie. Procédure 2: Modèle orthotopique: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort. Les tumeurs pulmonaires ainsi que différents organes pourront être prélevés à la demande du client pour des études histologiques complémentaires qui complèteront les résultats d'imagerie.

Remplacement

Aucun modèle in vitro n'est à même de remplacer l'animal entier étant donné la complexité des processus mis en jeu, notamment les interactions avec le microenvironnement tumoral. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle in vitro permettant d’étudier la biodistribution d'un composé dans tous les organes d'un individu. Le recours à l'animal entier, vivant, est indispensable. Avant de débuter les études chez l’animal, des tests d’efficacité in vitro seront effectués par nos clients sur des cellules de cancer pulmonaire en culture. Ainsi, les molécules qui ne présentent pas d’effet in vitro ne seront pas testées in vivo.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous mettons en œuvre des techniques d’imagerie qui permettent de réaliser un suivi longitudinal des animaux et ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles, évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Des tests non paramétriques seront utilisés pour comparer les valeurs obtenues pour les différents lots de souris. Nombre d’animaux utilisé dans ce projet : Sur 5 ans nous prévoyons 20 études qui seront réparties ainsi : -Pour le modèle sous-cutanée (procédure 1), 10 études, 800 souris sur 5 ans. -Pour le modèle orthotopique (procédure 2): 10 études, soit par induction en intraveineuse, soit par dépôt pulmonaire 800 souris sur 5 ans. Soit un total de 1600 animaux pour ce projet sur 5 ans. Ce nombre pourra être revu à la baisse en fonction des études clients.

Raffinement

Pour ces procédures expérimentales, la stratégie d’observation des animaux retenue est l’étude comportementale des animaux. La bonne connaissance de l’état clinique normal de la souche de souris utilisée nous permettra d’observer précisément et d’interpréter rigoureusement les signes cliniques de souffrance des animaux. Les souris seront suivies par inspection visuelle chaque jour de la semaine et les critères comportementaux, et tumoraux pris en comptes pour l’évaluation du palier de douleur. Lorsqu’un des points limites est atteint, l’animal est mise à mort afin d’arrêter sa souffrance car elle ne peut être ni diminuer ni stopper. Ces point limites sont présentés dans chacune des procédures. Les animaux seront étudiés par imagerie in vivo non invasive qui n'induit pas de douleur supérieure à celle d’une piqure d’aiguille et permet de réduire le stress infligé au cours de l’expérimentation puisque les animaux sont anesthésiés durant les examens d'imagerie.

Choix des espèces

Les modèles de cancer humain et murins sont classiquement mis en oeuvre chez la souris pour les études de tumorigenèse, de progression tumorale et métastatique. Les modèles orthotopiques de carcinome pulmonaire H460, LL-2, A549, 4T1 et mélanome B16 sont uniquement disponibles chez cette espèce animale. Le modèle zebrafish utilisé en cancérologie pour les xénogreffes pourrait être intéressant car de moindre degré de douleur mais le poisson reste peu adapté aux modalités d'imagerie mises en oeuvre dans notre établissement qui ne dispose pas d'un agrément pour ce modèle . Par ailleurs, la transplantation orthotopique n'est pas possible chez le poisson pour des cellules issues de cancer du poumon et du sein. (Raby et al., "Bulletin du cancer", Vol 107, janv 2020) Modèle de cancer réalisable chez le jeune animal (6 à 10 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale. Ce modèle est validé au laboratoire depuis 10 ans.

432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de tumeur de lymphome humain sous la peau, puis jusqu'à trois injections de composés sur animal vigile, la pousse tumorale étant surveillée jusqu'à un point limite. Le porteur teste une molécule immunostimulante déjà évaluée dans ce modèle et vise un futur essai clinique. Il affirme que la sensibilité des cellules tumorales dépend du microenvironnement et qu'il faut donc travailler sur un organisme entier.

Objectifs

Ce projet vise à étudier et quantifier l’efficacité antitumorale d'une molécule seule ou formulée avec des molécules encapsulées (qui rends la molécule moins toxique) sur un modèle humain de tumeur. Que ce soit la molécule ou la molécule encapsulée, les deux sont conçues stérilement et développées spécifiquement pour être compatible avec une injection intraveineuse. Cette molécule "prototype" seule ou encapsulée a déjà été évalué dans ce même modèle humain de tumeur. Dans les deux cas il a été observé une très bonne tolérance et des très bonnes réponses anti-tumorales. Afin d'évaluer la molécule dans des essais cliniques et pour répondre aux contraintes de la production à grande échelle, la molécule seule et la molécule encapsulée ont été optimisées. C'est pourquoi la Dose Maximale Tolérée (DMT) de la molécule industrielle doit être déterminée et son efficacité antitumorale doit être confirmée.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à moyen terme. Ce projet permettra de tester l’efficacité antitumorale d’une molécule immunostimulante. Le projet va permettre de développer en phase préclinique des molécules et des combinaisons qui permettront au mieux de guérir les patients atteints de ces cancers, au pire de ralentir la progression tumorale.

Procédures

- Implantation de tumeur en sous-cutané sur animal vigile (une fois au début de l'expérimentation, degré de gravité léger, quelques minutes) - Pousse tumorale : gêne si le volume tumoral au site d’injection atteint le point limite (lorsqu'il n'y a pas de réponse au traitement, la pousse tumorale prend une vingtaine de jours) - injection intraveineuse ou intrapéritonéale de composés thérapeutiques non toxiques (degré de gravité léger, quelques minutes), pour un maximum de 3 injections espacées de 7 jours.

Impact sur les animaux

- Perte de poids >10% non améliorée par ajout de nourriture humidifiée dans le fond de la cage en maximum 24h (peu probable) - Perte de poids >20% (très peu probable qui conduirait à la mise à mort de l’animal) - Injection de cellules tumorales en sous cutané : quelques minutes - Pousse tumorale : gêne si le volume tumoral au site d’injection atteint le point limite. Il n’y a pas de métastase attendue avec ce modèle tumoral. - Injection dans la veine caudale sur animal vigile sous contention de composés thérapeutiques: douleur caudale si inflammation du point d’injection (très peu probable), 2 heures maximum, pour un maximum de 3 injections espacées de 7 jours.

Devenir

Pour les deux procédures, tous les animaux seront mis à mort 100 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai.

Remplacement

Avant le passage chez l’animal, l’efficacité de notre molécule et de notre formulation a déjà été validée sur un modèle in vitro utilisé au laboratoire. En effet, nous avons déjà pré-validé notre molécule et notre formulation liposomale en in vitro par toutes les techniques pertinentes pour l'étude de nos produits. Nous devons passer maintenant à l'in vivo pour évaluer son effet sur un organisme entier. En effet, la sensibilité des cellules tumorales aux traitements anticancéreux dépend fortement du microenvironnement. Par ailleurs plusieurs paramètres impactant sur l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans la tumeur nécessite de travailler sur un organisme entier. Pour toutes ces raisons nous devons effectuer les études d’efficacité sur la souris.

Réduction

Les procédures seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de façon statistiquement fiable. Les résultats seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire au autant que possible le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

vant toute manipulation les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en prenant la température corporelle par voie rectale (avec une sonde enveloppée avec un gel anesthésiant) une fois par jour pendant 5 jours. les souris seront observées quotidiennement 5 jours sur 7 . les expérimentateurs ont une très bonne expérience et détectent très rapidement le moindre signe de douleur afin d'appliquer les meilleurs mesures. Leur état général sera aussi suivi et annoter dans le cadre de l’expérimentation. Pour les deux procédures, tous les animaux seront mis à mort 100 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai. Les animaux feront l’objet d’un suivi très soutenu le jour J de l’injection, puis toutes les 24h jusqu’à 72h par les expérimentateurs. Par ailleurs, le personnel animalier inspecte quotidiennement les animaux et renseigne une grille de suivi basée sur des critères comportementaux (activité, isolement ...), physiques (poils hérissés, dos vouté …) qui permettent de détecter rapidement une souffrance ou l’atteinte d’un point limite.

Choix des espèces

Nous souhaitons évaluer nos traitements anticancéreux in vivo, grâce à l’utilisation d’une lignée cellulaire tumorales d'origine humaine (implantées chez la souris), avec des traitements utilisés en clinique humaine. L'utilisation d'une souche murine fortement immunodéprimée est donc nécessaire pour éviter les phénomènes de rejet des cellules ou des tissus implantés et favoriser la prise des greffes. En effet la souris immunodéprimée est un modèle reconnu pour l’implantation de xénogreffes. Notre équipe a une forte expérience de l’utilisation de souris immunodéprimées pour l’étude d'implantation de cellules humaines. Les autres modèles de mammifères immunodéprimés sont peu nombreux (rats) et il est préférable d’avoir recours aux modèles murins. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser a prise tumorale.

2 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris immunodéprimées, elles reçoivent des greffes de tumeurs d'ostéosarcome puis des traitements par voie orale deux à quatre fois par semaine pendant trois à dix semaines, en portant sous la peau des tumeurs pouvant donner des métastases. Le porteur décrit une molécule première de sa classe censée vaincre la résistance aux chimiothérapies, les bénéfices pour les patients étant renvoyés aux essais cliniques à venir. Il affirme que les modèles cellulaires ne rendent pas la complexité de l'organisme et conclut au caractère indispensable du recours à l'animal.

Objectifs

L’objectif principal de ce projet est d’évaluer l’activité d'une molécule et d'évaluer spn efficacité anti- tumorale et de mieux comprendre les mécanismes ciblés par cette molécule, en vue de vaincre la résistance aux traitements et d’améliorer la réponse des patients à mauvais pronostics (ostéosarcome pédiatrique). Après nos résultats prometteurs obtenus avec la molécule seule et en association avec des chimiothérapies in vitro, nous évaluerons la sensibilité de cette molécule in vivo sur des modèles d’ostéosarcome (lignées cellulaires et des modèles dérivés de patients), administré seul et en combinaison avec les traitements standards qui devraient avoir une synergie avec la nouvelle molécule. Nous étudierons les mécanismes d’action de cette molécule et évaluerons leur application thérapeutique pour des ostéosarcomes de mauvais pronostic.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera les éléments précliniques permettant d’évaluer l’effet thérapeutique d'une nouvelle molécule et de mieux comprendre les mécanismes liés à cette molécule. Cette molécule a le potentiel de vaincre la résistance des cancers à certaines chimiothérapies et est la première de sa classe à entrer en clinique prochainement. Le traitement pourra être utilisé dans des essais cliniques sur l’ostéosarcome pour améliorer la survie des patients de mauvais pronostic.

Procédures

Une procedure chirurgicale unique sera réalisée pour le développement des greffes de tissus de patients, avec une durée maximale de 5-10min par souris. Les souris seront soumises à des traitements par voie orale de 2 à 4 fois par semaine pendant 3 à 10 semaines (durée 1 minute). Un prélèvement de sang unique sera réalisé, sous anesthésie générale, pour les études fonctionnelles (durée: 5-10 minutes).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables seront liés aux interventions (greffes, gavages) et à la présence de tumeurs sous la peau. Dans le cas des modèles d’ostéosarcome sous-cutané les animaux peuvent aussi potentiellement développer des métastases.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin d'étudier au mieux la réponse antitumorale mise en place après traitement par notre molécule.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, osseux…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Ces modèles vont à la fois nous permettre d'étudier l’efficacité de la molécule XCE853 et son lien avec les mécanismes oncogéniques et métastatiques des cancers à mauvais pronostics mais également explorer et valider l'efficacité de thérapies susceptibles d’être utilisées chez les patients.

Réduction

Peu de modèles d’ostéosarcome sont décrits, ce qui montre la difficulté d'obtenir un modèle stable et représentatif de cette maladie. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les doses seront calibrées par rapport à la littérature et sur nos résultats obtenus in vitro. Pour les modèles issus des patients, la quantité de tissu disponible est limitée donc, selon les évaluations sur les lignées cellulaires in vivo, les modèles PDX seront choisis afin de compléter les observations sur les lignées cellulaires in vivo. Considérant un taux d'échec de greffe de 50%, nous considérons donc un effectif de 30 animaux par groupe pour obtenir 15 animaux traités par groupe pour l’efficacité et un effectif de 20 animaux par groupe pour obtenir 10 animaux traités pour la pharmacodynamique.. Trois modèles cellulaires (2 lignées résistants au traitement actuel et la lignée parental) et 5 modèles PDX d'ostéosarcome, représentant l'hétérogénéité de la maladie seront utilisés et chaque modèle sera traité avec la molécule d'intérêt administrée seule et en combinaison avec des chimiothérapies utilisées dans le traitement de la maladie et supposées avoir une synergie avec la nouvelle molécule d’après nos études préliminaires. Afin de réduire le nombre d'animaux implantés, nous avons choisi de réaliser un suivi du développement tumoral longitudinal par imagerie. Dans notre étude, l’imagerie sera utilisée pour une analyse, de façon à confirmer la présence/croissance tumorale et le développement des métastases.

Raffinement

Les souris sont greffées et imagées sous anesthésie générale . Les animaux sont surveillés chaque jour après la chirurgie afin de détecter toute modification dans le comportement/déplacement de l'animal. Les zones implantées sont également observées quotidiennement afin de détecter précocement un développement de la tumeur. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués. De plus, si nous détections des signes de douleur, nous donnerions un antalgique ou morphinique pour soulager les animaux. Toutes les injections seront précédées d’une anesthésie locale . Les animaux sont stabulés en groupe, avec accès illimité à la nourriture et à la boisson. Un enrichissement adapté à l'espèce sera systématiquement ajouté dans les cages. Un enrichissement supplémentaire pourra être ajouté si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé en oncologie notamment du fait de l'existence de souches immunodéprimées qui permettent le développement de tumeur d'origine humaine. D'après notre expérience, nous avons pu observer que l’ostéosarcome se développe mieux chez la souris immunodéficiente, aussi les métastases semblent se développer davantage chez ces souris, ce qui en fait un modèle de choix pour notre projet. Nous travaillons sur des cancers qui atteignent des individus entre l'enfance et l'adolescence. De ce fait, nous serons amenés à utiliser des jeunes animaux âgés de 4 semaines à 6 semaines afin de pouvoir mimer le stade de développement.

1 130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue car porteuses d'une pathologie qualifiée de létale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie, des injections répétées par plusieurs voies et une nébulisation pour tester des nanoparticules chargées de chimiothérapie contre la carcinose péritonéale. Le porteur indique des douleurs post-opératoires, un gonflement de l'abdomen et une possible perte de poids, l'imagerie servant à repérer les points limites. Il affirme que les interactions entre système immunitaire et tumeur ne peuvent être reproduites in vitro, les bénéfices étant présentés comme une amélioration attendue du traitement.

Objectifs

Ce projet vise à étudier de nouveaux traitements à base de nanoparticules pour la carcinose du péritoine. La carcinose péritonéale est une évolution fréquente de plusieurs cancers intestinaux et gynécologiques et constitue la principale cause de décès chez ces patients. Les thérapies actuelles ne permettent pas aux agents de chimiothérapie d’atteindre efficacement le péritoine. Cela entraîne une mauvaise distribution et pénétration des principes actifs dans la tumeur, générant une mauvaise réponse au traitement pouvant évoluer vers une résistance aux thérapies.

Bénéfices attendus

L'intérêt de cette approche réside dans l'amélioration du traitement et du pronostic des patients souffrant de carcinose péritonéale. Plus largement, l'utilisation de la nébulisation combinée à l'utilisation de nanoparticules pour délivrer des chimiothérapies améliorera la diffusion des médicaments dans la cavité péritonéale et augmentera la pénétration des médicaments dans les nodules tumoraux. Le bénéfice immédiat pour les patients sera la réduction de la fréquence des traitements, la réduction des effets secondaires dus à l'administration systémique des principes actifs et la détermination d’un nouveau mécanisme d’action des nanoparticules basé sur la modulation de la réponse immunitaire.

Procédures

- procédure chirurgicale - 15 min ; imagerie par bioluminescence - 2 min ; injections - >1 min (voie intraveineuse, voie intrapéritonéale, voie sous-cutanée); nebulisation 5 sec; anesthesie - max 20 min. Nombre d'injections: Si bioluminescence: 15 maximum (1 chaque dueux jours) (voie intrapéritonéale) Si tumeur: 1 (voie intrapéritonéale) Si traitment:1 (voie intrapéritonéale ou voie intraveineuse) Si analgesie: maximum 3 ( voie sous-cutanée)

Impact sur les animaux

Effets dus à la chirurgie: - doleur post-operatoire - diminution des mouvements dans la cage. Effets dus au modele tumoral: - un gonflement de l'abdomen - une éventuelle perte de poids. Effet dus à l'administration des produits: - aucun

Devenir

Tous les animaux sont mis a mort a la fin des procedures car, ils sont tous atteint d'une pathologie lethale

Remplacement

L’utilité prédictive des modèles tumoraux chez la souris ne peut pas être remplacée par des études in vitro. L'activité des cellules immunitaires liée à des tumeurs est régulée par de nombreux facteurs dont la plupart sont encore inconnus et donc impossible à reproduire in vitro. Il est très compliqué de recréer in vitro toutes les interactions entre le système immunitaire, les cellules accessoires secondaires et la tumeur car, à l'heure actuelle, toutes ces interactions ne sont pas encore totalement maitrisées. De plus, l'évaluation d'une nouvelle approche thérapeutique, comme celle décrite dans ce projet, doit tenir compte de l'effet du principe actif et de la procédure sur la santé globale de l'animal, ce qui ne peut être réalisé in vitro. Des tests in vitro ont déjà été réalisés pour évaluer la cytotoxicité des nanoparticules sur les lignées tumorales et la capacité des nanoparticules à libérer correctement le médicament et le moment de la libération.

Réduction

Le nombre d'animaux a été estimé par les biostatisticiens comme étant le minimum nécessaire pour obtenir des résultats exploitables. Cette estimation permettra d'analyser avec précision un nombre suffisant d'animaux et d'obtenir des résultats avec une marge d'erreur très faible, évitant ainsi des résultats non concluants et la nécessité de répéter l'étude pour valider les données. Le projet étant conçu par étapes successives, le nombre d'animaux calculé à chaque étape peut être réduit en fonction des résultats obtenus aux étapes précédentes : en fonction de la précision et de la reproductibilité interindividuelle de la croissance tumorale dans le temps, il sera possible de réduire le nombre d'animaux requis pour les expériences suivantes. Par ailleurs, en cas de croissance tumorale lente, il sera possible d'échelonner les séances de bioluminescence afin de réduire le nombre d'anesthésies et d'injections intrapéritonéales que les animaux devront subir.

Raffinement

Les protocoles les moins invasif et le moins douloureux possibles sont privilégies. Des mesures sont prises pour améliorer les conditions d’élevage et de bien-être afin d’enrichir l’environnement des souris. Les animaux porteurs de tumeur sont suivis quotidiennement pour éviter tout souffrances inutiles, et prendre les mesures adéquate dans le cas éventuelle d’apparition de nuisances. Les animaux ayant subit une chirurgie seront monitorés plus suivant et un protocole antalgique est mis en place. L’imagerie par bioluminescence nous permet de déterminer de manière précoce l’apparition des signes de catégorie point limite et ainsi, d’intensifié le suivi des animaux lors de cette étape intermédiaire et d’agir en conséquence (Analgésique ou mise a mort). L’apparition de signe point limite conduit automatiquement a une mise à mort de l’animale concerné pour lui éviter toute souffrance inutile

Choix des espèces

Les souris utilisées sont le modèle primaire et le plus utilisé pour les études oncologiques impliquant le système immunitaire. Le mécanisme immunitaire des souris est largement décrit dans la littérature et de nombreux outils de diagnostic sont disponibles pour effectuer des analyses immunologiques par rapport à d'autres modèles comme les rats. De plus, la disponibilité de différentes lignées cellulaires tumorales murines qui imitent les tumeurs humaines permet d'utiliser des animaux immunocompétents. Les souris seront adultes, âgées de 8 à 10 semaines, car il est nécessaire que le système immunitaire soit développé et mature.

3 860 souris et 120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever la rate et la tumeur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux reçoivent une immunisation sous la peau et, pour une partie, une implantation de cellules tumorales, le porteur les mettant à mort dès que la tumeur s'ulcère, se nécrose ou dépasse un volume fixé. Il indique tester un adjuvant à base de mélanine pour un futur vaccin contre le glioblastome, tout en affirmant que la souris est l'espèce "la plus adaptée" et que le modèle de gliome implantable n'existe que chez le rat. Les retombées cliniques sont renvoyées après sélection d'un candidat et poursuite du développement pharmaceutique.

Objectifs

Le cancer reste une maladie souvent mortelle, pour laquelle la recherche de traitements innovants est requise. L’induction d’une immunité contre un antigène cible par vaccination à l’aide d’adjuvants classiques (tels que ceux utilisés dans les vaccins anti-infectieux) permet d’obtenir facilement des anticorps circulants. Ces anticorps sont cependant peu efficaces pour lutter contre les tumeurs. L’obtention de lymphocytes T capables de tuer les cellules cancéreuses est plus difficile car les adjuvants disponibles actuellement donnent généralement des réponses faibles ne permettant pas d’induire une réponse antitumorale satisfaisante. Nous avons récemment découvert que la mélanine synthétique utilisée en tant qu’adjuvant vaccinal permettait de stimuler de façon exceptionnelle la réponse immunitaire lymphocytaire contre un antigène peptidique donné (i.e. un fragment de protéine surexprimée ou bien anormalement exprimée par les cellules cancéreuses et présenté à leur surface). Notre but est de poursuivre le développement de notre adjuvant afin d’obtenir à terme un vaccin thérapeutique pour le traitement des cancers humains, en nous concentrant plus particulièrement sur le glioblastome, la plus fréquente des tumeurs cérébrales, pour lequel il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement satisfaisant. Des peptides cibles issus de protéines exprimées dans les glioblastomes humains seront sélectionnés, puis validés par des tests in vitro. La capacité de ces peptides associés à notre adjuvant à base de mélanine à induire une réponse immunitaire et à contrôler la croissance tumorale, sera évaluée in vivo chez la Souris ou le Rat. L’étude chez l’animal est indispensable pour mesurer une réponse immunitaire par lymphocyte et la Souris constitue l’espèce la plus adaptée pour les études immunologiques. Comme il n'existe pas de modèle de gliome implantable en sous-cutané chez la Souris, les effets anti-tumoraux de nos formulations seront évalués chez le Rat, pour lesquels un tel modèle existe.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra la sélection d’un candidat vaccin pour le traitement du glioblastome, dont nous poursuivrons le développement pharmaceutique avant d’initier les essais cliniques chez l’Homme. A l'issue de ce projet nous aurons : 1- Sélectionné deux peptides-candidats issus de protéines surexprimées ou anormalement exprimées par les gliomes humains 2- Déterminé la formulation (ratio peptide/mélanine, temps de contact) permettant d'obtenir une réponse imunitaire optimale pour chacun des deux peptides 3- Réalisé les études de stabilité de notre adjuvant à base de mélanine synthétique sur 3 ans

Procédures

Les immunisations seront réalisées par injection sous la peau sur animaux anesthésiés. L’ensemble de la procédure dure environ 5 minutes. Une ou deux injections (à deux semaines d'intervalle) seront réalisées par animal. Les implantations de cellules tumorales sous la peau seront réalisées sur animaux anesthésiés. L’ensemble de la procédure dure environ 5 minutes. Une seule implantation sera effectuée par animal.

Impact sur les animaux

L’injection du vaccin est susceptible de provoquer une rougeur, un gonflement, une démangeaison ou une douleur au point d'injection, ce qui fera l'objet d'une surveillance quotidienne. Il est cependant à noter qu'aucune des expériences menées à ce jour n'a mis en évidence de tels effets indésirables. Dans les expériences impliquant l’implantation d’une tumeur sous la peau, un effet indésirable potentiel est l'apparition d'une ulcération ou d'une nécrose de la tumeur. Une surveillance quotidienne des animaux sera mise en place et il sera procédé à leur mise à mort en cas d'ulcération ou de nécrose de la tumeur ou bien dès que celle-ci atteindra un volume déterminé à l’avance et adapté à l’espèce.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chacune des procédures afin de pouvoir obtenir le matériel biologique (rate, tumeur) nécessaire à l'évaluation de la réponse immunitaire.

Remplacement

Il s’agit d’une étude qui nécessite d’être réalisée in vivo pour évaluer la réponse immunitaire et antitumorale après immunisation par voie sous-cutanée. Aucun modèle in vitro n’est en effet prédictif d’une réponse immune chez l’animal ou chez l’Homme, en raison de la complexité des mécanismes biologiques impliqués (interactions cellules présentatrices des antigènes-lymphocytes, interactions cellules immunitaires-tumeur (y compris microenvironnement tumoral)). Cependant, les corrélations entre les résultats obtenus chez l’animal et les résultats des études in vitro menées en parallèle seront évaluées en permanence dans l’objectif de remplacer le modèle in vivo par la prédiction in vitro lorsque cela sera possible.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au nombre minimum nécessaire et suffisant pour permettre l’analyse statistique des données. Les protocoles de ce projet utiliseront des modèles validés par la littérature, permettant d’obtenir des résultats reproductibles et ainsi de limiter la multiplication des expériences. De plus, les expériences sont conçues de façon à utiliser les mêmes groupes contrôles pour plusieurs préparations vaccinales ce qui permettra de limiter encore davantage le nombre d’animaux. Au total, 3980 animaux seront utilisés dans ce projet, 3860 souris et 120 rats.

Raffinement

Les expériences nécessiteront des procédures peu traumatisantes. Toutes les injections sont effectuées sous anesthésie générale. Les vaccins sont formulés de façon à être bien tolérés et à ne pas induire de douleur ou de réaction indésirable au point d’injection. Chez les animaux porteurs de tumeurs, la croissance tumorale est mesurée tous les 2 à 3 jours à l’aide d’un pied à coulisse, ce qui constitue une procédure non invasive, non douloureuse et peu perturbante pour l’animal. Les animaux font l’objet d’une surveillance quotidienne afin de déceler précocement des signes de souffrance et d’y mettre un terme par une mise à mort anticipée si nécessaire.

Choix des espèces

Souris : La souris est le modèle de choix pour l'étude de la réponse immunitaire. Le système immunitaire des souches utilisées dans ce projet est bien caractérisé et de nombreux outils immunologiques sont disponibles (bases de données et outils de prédiction in silico, réactifs et méthodes permettant d’étudier et de mesurer l’intensité la réponse immunitaire). Il existe un modèle de souris transgéniques dont le système immunitaire est capable de reconnaitre les antigènes tumoraux humains, que nous pourrons utiliser pour valider notre candidat vaccin avant passage aux essais cliniques chez l’Homme. Rat : Il n’existe pas de modèle de glioblastome implantable en sous-cutané chez la Souris. En revanche, il existe un modèle reconnu chez le Rat, que nous allons utiliser dans ce projet. Les animaux seront agés de 5 à 7 semaines en début d’expérimentation, ce qui permet d’utiliser des animaux jeunes adultes dotés d’un système immunitaire mature.

284 souris femelles immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules humaines de cancer de l'os sont injectées sous leur peau sur animal vigile, la tumeur est mesurée trois fois par semaine et des composés sont administrés dans l'eau de boisson et par injection, pour tester si l'inhibition d'une protéine renforce la chimiothérapie. Le porteur décrit une gêne possible à la locomotion et des effets tardifs de la chimiothérapie sur la reproduction. Il justifie le recours à l'animal par les limites des cultures in vitro en deux dimensions et présente les femelles comme moins agressives.

Objectifs

Le cancer reste un enjeu clinique important en France (382 000 nouveaux cas et 158 000 morts par an). Bien que le cancer soit mieux pris en charge aujourd’hui, les options thérapeutiques sont limitées pour certains cancers, comme pour le cancer de l’os. Sa prise en charge repose essentiellement sur les chimiothérapies qui sont associées à des effets indésirables ou à de la résistance. Il est nécessaire de remplacer celles-ci par des alternatives thérapeutiques ou de limiter les doses de chimiothérapies en les combinant à de nouvelles thérapies. Pour cela, il faut (1) identifier de nouvelles protéines qui jouent un rôle dans la réponse aux chimiothérapies et (2) évaluer le bénéfice à cibler ces protéines en combinaison avec les chimiothérapies. A l’aide d’une lignée cellulaire dérivée de l’os, il a été montré que la réduction de la quantité de la protéine P induit un arrêt de la prolifération des cellules cancéreuses en réponse à une chimiothérapie. Aujourd’hui il reste à démontrer que l’inhibition de la protéine P améliore la réponse aux chimiothérapies chez l’animal. L’objectif principal est de déterminer si l’inactivation de la protéine P est suffisante pour augmenter l’effet anti-tumoral des chimiothérapies. L’objectif secondaire est de déterminer si la protéine P joue un rôle dans le développement d’une tumeur, démontrant que l’inhibition de la protéine P peut être une approche anti-cancer à elle seule. Pour cela, une greffe de cellules génétiquement modifiées présentant une diminution de la quantité de la protéine P sera pratiquée chez la souris.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont de contribuer à valider une nouvelle stratégie thérapeutique anti-cancer en santé humaine. Ce projet permettra d’évaluer le bénéfice thérapeutique de la perte de fonction d’une protéine P dans le traitement de cancers par chimiothérapies. Cette stratégie thérapeutique innovante permettra de réduire la dose des chimiothérapies utilisées tout en augmentant leur efficacité et ainsi diminuer les effets indésirables associés aux chimiothérapies.

Procédures

Des cellules humaines de cancer de l’os sont injectées sous la peau des souris. Pour effectuer ce geste, la souris est maintenue environ 15 sec, une seule injection de 0.1 ml. A la suite de cette injection, la souris développera une tumeur sous-cutanée. La croissance tumorale est suivie par des mesures au pied à coulisse 3 fois par semaine, l’animal est maintenu immobile environ 25 secondes. Les composés sont administrés par voie orale dans l’eau de boisson (à partir de l’entrée des souris en protocole jusqu’à la mise à mort),ou par injection intrapéritonéale (1x/semaine, 10 sec, pendant 5 semaines).

Impact sur les animaux

La greffe de cellules humaines par injection sous-cutanée est réalisée sur animal vigile. La tumeur pourrait entrainer dans de très rare cas une gêne à la locomotion. Le traitement ajouté dans l’eau de boisson donne un goût amer. Les effets non désirables des chimiothérapies sont observés à long terme (au-delà de 10 semaines de traitement), par exemple une atteint de fonction reproductrice chez la femelle.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les tumeurs pour des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques. Si des animaux ne développent pas de tumeur, ils seront mis à mort 8 semaines post-greffe. En effet, les animaux ayant subi une injection de cellules tumorales, ne peuvent pas être réutilisés dans un autre projet.

Remplacement

En amont de ces expérimentations in vivo, les chimiothérapies et le médicament-candidat ont été testés sur les cellules in vitro. Les approches in vitro sont nécessaires mais elles restent limitées à un seul type cellulaire ayant une structure en 2D. La deuxième étape de validation du médicament-candidat est in vivo, c’est-à-dire d’étudier son action dans des conditions physiologiques et seul un organisme entier le permet.

Réduction

Une étude préliminaire de validation du modèle est conduite sur un nombre limité de souris (20 souris). Si les résultats de cette étude sont concluants, l’étape 2 sera alors mise en œuvre pour déterminer la concentration de chimiothérapie à utiliser. Cette procédure sera également faite sur un nombre limité d’animaux (50) pour 3 chimiothérapies testées (chimiothérapies classiquement administrées chez l’homme pour le cancer de l’os). Enfin, à l’issu de cette 2ème étape, la procédure 3 sera conduite en séquentielle afin de ne pas avoir à gérer un nombre d'animaux trop important (une chimiothérapie à la fois). Le but de cette procédure est d’étudier s’il est possible de réduire les effets indésirables des chimiothérapies en co-administrant un médicament-candidat.

Raffinement

Le traitement ajouté dans l’eau de boisson ayant un goût amer, 3% de sucrose sont additionnés pour permettre une bonne hydratation. Les analyses de croissance des tumeurs sont non invasives (mesure au pied à coulisse) et ne requiert pas d'injection d'anesthésiant ou d'antalgique. L'effet des composés sur l'état physiologique des souris est suivi par la pesée des animaux, et la mesure du développement tumoral. De l'aliment sera mis en fonds de cage si une souris présentait une gêne à la locomotion. Des points limites adaptés sont définis de manière objective pour chaque procédure, incluant des critères d'arrêt de l'expérience en cas de souffrance.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour l’analyse de greffes de lignées cellulaires en oncologie. Les expérimentations sont réalisées sur des souris immunodéprimées pour qu’il n’y ait pas de rejet de la greffe des cellules humaines. Des femelles sont mises en œuvre car elles présentent un caractère moins agressif que les mâles, ce qui permet un remaniement plus facile de la composition des cages lors de constitution des groupes de traitement des animaux. Les souris femelles sont également choisies car les cellules humaines ont été obtenues à partir d’une tumeur développée chez une femme. La greffe est pratiquée sur les souris de 6–8 semaines, pour des raisons d’efficacité de prise tumorale et de reproductibilité.