Cancers

7 500 souris et 3 300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une molécule par diverses voies, avec prélèvements répétés de sang, d'urines et de fèces, une partie des rats subissant la pose d'un cathéter sur le canal biliaire et un séjour en cage métabolique, avant des prélèvements terminaux d'organes. Le projet mesure le comportement pharmacocinétique de composés candidats. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro fiable et que le recours aux animaux est "indispensable".

Objectifs

Les caractéristiques pharmacocinétiques sont les premières données générées in vivo après que les tests in vitro aient été concluants. Ils vont permettre de décrire les différentes phases que va subir le composé quand il entre dans l’organisme du rongeur par différentes voies. Le rongeur a été choisi dans ce projet car c’est un modèle de choix du fait de la bonne disponibilité de la littérature, d’études rétrospectives en pharmacocinétique, de sa facilité d’utilisation et de son anatomie et sa physiologie bien connues.

Bénéfices attendus

La connaissance des propriétés pharmacocinétique d’un produit chez l’animal avant le design des études de pharmacologie permet d’utiliser le meilleur traitement (dose, voie d’administration) et participe à réduire le nombre d’animaux utilisés en pharmacologie. A terme, les résultats précliniques de ce projet permettront de mieux comprendre la pharmacocinétique de nos composés afin de de développer en clinique des composés prometteurs ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients.

Procédures

Procédure 1 : Etude de pharmacocinétique d'une durée de 24 heures pour un composé pharmaceutique administré chez le rat ou la souris avec prélèvements de sang, urines, fèces et tissus. Un maximum de 4 prélèvements de sang pour la souris et de 7 prélèvements pour le rat seront effectués sur ces 24h. Procédure 2 : Etude d’excrétion d’une molécule administrée chez le rat avec prélèvement de la bile via un cathéter au niveau du canal cholédoque, urines, fèces. Les sécrétions biliaires et urinaires seront collectées en continu sur une période de 24 heures en cage métabolique apre sune période d'acclimation de 15 heures. la procédure en elle même dure 39 heures.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux recevront des molécules issues de notre recherche. Les nuisances attendues : stress en cage métabolique ou suite de chirugie pour pose de pompe osmotique en s.c.. : mis en place d'un suivi analgésique et d'une observation réguliere des animaux.

Devenir

Tous les animaux des ces procédures seront mis à mort à la fin de l'étude afin de permettre la réalisation de prélévements terminaux (sang et organes).

Remplacement

Il n’existe pas de modèle fiable in vitro permettant de prédire de manière exacte et approfondie le comportement pharmacocinétique d’un produit chez l’homme. L’utilisation d’animaux est donc indispensable pour déterminer les paramètres pharmacocinétiques d’un composé.

Réduction

Dans un but de diminution du nombre d’animaux et d’augmentation de l’information, le nombre d’animaux de l’étude est basé sur notre expérience. Nous utiliserons le plus petit nombre d’animaux qui permet d’obtenir des résultats avec une variabilité acceptable. Ainsi en screening, 2 animaux sont utilisés pour la voie intra veineuse et 3 animaux pour la voie orale pour décrire la pharmacocinétique des produits sur 24h. L’étude pharmacocinétique est réalisée par prélèvements multiples.

Raffinement

Animaux qui entrent dans l’étude : suivi régulier du comportement. Nous utilisons les Guides d'évaluation du Bien-Etre pour évaluer l'inconfort ou la souffrance de nos animaux. Nous avons défini des critères d'alarme et d'interruption adaptés à la procédure. Le nombre de groupes dans chaque expérience est optimisé en fonction des temps de prélèvements nécessaires, notamment de la durée de l’étude. Pour obtenir plus d’informations les échantillons utilisés pour le dosage du produit administré peuvent aussi être utilisés pour la bioanalyse des métabolites.

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat. Nos modèles ont été sélectionnés et seront mis au point, sur la base de la littérature existante et en s’appuyant sur l’expertise du fournisseur, afin de limiter l’utilisation de gros animaux pour les études précoces de recherche. Le rat et la souris sont choisis pour ces études parce que ces espèces sont aussi très représentées dans les modèles pharmacologiques et dans les études de toxicologie. L’étude des corrélations entre les données vitro et les données vivo obtenues chez le rat et la souris permettent de mieux définir la prédiction de la pharmacocinétique chez l’homme avant les premières études cliniques. Les rats et les souris utilisés dans ce projet seront des adultes afin que leur métabolisme soit mature (pas de forme pédiatrique dans nos aires thérapeutiques)

180 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules cancéreuses humaines de côlon, pancréas ou foie sont greffées sous leur peau, puis un anticorps ou un placebo est injecté trois fois par semaine pendant jusqu'à soixante jours, avant l'euthanasie pour prélever les tumeurs. Le porteur affirme n'avoir observé aucun effet secondaire des traitements dans des projets antérieurs, la surveillance portant surtout sur la taille des tumeurs. Il indique qu'il est "indispensable" d'évaluer l'anticorps dans un organisme entier, la culture cellulaire ne reproduisant pas l'environnement tumoral.

Objectifs

La transplantation de cellules cancéreuses humaines chez la souris permet d'en approfondir la caractérisation biologique. Dans ce travail, nous souhaitons évaluer les effets anticancéreux d'un anticorps, développé dans notre laboratoire, sur la croissance des cellules cancéreuse humaines (côlon, pancréas, foie) greffées chez la souris. Nous savons que ces cellules ne forment pas de métastases dans nos conditions de croissance chez la souris. Les animaux greffés seront soignés dans des conditions standard (portoir avec cages ventilées et enrichissement) et nourris sans restriction avec une alimentation standard. Ce modèle permettra d'étudier les effets du traitement avec l'anticorps d’intérêt. Même si certaines données ont d'ores et déjà pu être obtenues sur le rôle de l'anticorps dans les modèles de cellules en culture, il est indispensable d'évaluer leur efficacité dans un modèle animal plus intégré, impliquant tous les types cellulaires de l'environnement de la tumeur chez la souris. Une expérience se déroulera sur 60 jours entre le moment où les cellules cancéreuses sont greffées et l'analyse des résultats. Si nous envisageons un délai de 5 ans, celui-ci englobe le temps de plusieurs expériences et le temps de l'écriture d'une publication pour valoriser le travail.

Bénéfices attendus

Nous nous attendons à ce que l'anticorps d’intérêt diminue la croissance des tumeurs chez la souris dans le but de développer une nouvelle piste thérapeutique dans le traitement des cancers digestifs chez l'homme.

Procédures

Les souris utilisées sont des femelles adultes de 6 semaines à leur arrivée à l'animalerie. Nous avons choisi des femelles pour éviter l'agressivité des mâles liée au sexe et des adultes pour avoir un système mature et des animaux qui sont adultes du début à la fin de l'expérience. Après un temps d'acclimatation de 4 jours, elles entrent dans un protocole de suivi de croissance tumorale pour une durée maximum de 60 jours. On réalise une injection de cellules tumorales humaines digestives sous la peau de souris femelles adultes sous anesthésie. Les cellules vont être tolérées par la souris et vont commencer à croître à l’endroit de l’injection. Cette injection dure moins de 30 secondes. A partir du jour d’implantation, les souris vont recevoir un composé visant à diminuer ou ralentir la croissance tumorale. Ces injections se font 3 fois par semaine sur animal non endormi et sont composées soit d’un placebo, soit de la molécule d’intérêt. L’ensemble des souris est également évalué 3 fois par semaine quant à leur état général, leur poids et la taille des tumeurs au cours du temps. Cette évaluation se fait le même jour que les injections pour éviter l’accumulation de stress soumis aux animaux. L’ensemble de ces actes (injection et évaluation) ne dépassent pas 1 minute par animal. A la toute fin de l’expérience tous les animaux sont euthanasiés.

Impact sur les animaux

L’utilisation des molécules d'intérêt ou des molécules chimio-thérapeutiques utilisées dans les traitements des cancers digestifs, a d’ores et déjà été réalisée et validée dans des projets antérieurs et aucun effet secondaire nuisible n’a été noté. Les différents traitements n’affectent ni l’état général, ni le poids des animaux. Seules la taille des tumeurs et la nuisance liée aux injections répétées pour le traitement en cours d’expérience doivent être surveillée de manière vigilante, car ils peuvent être susceptibles d’altérer le bien-être animal et être à l’origine d’une perte de poids importante.

Devenir

A la fin de l’expérience ou lorsqu’un animal a été jugé avoir atteint un point limite affectant le bien-être animal, il sera euthanasié pour prélever les tumeurs greffées et les analyser. Aucun autre organe ne sera prélevé.

Remplacement

Les connaissances issues de cette étude sur l’animal ne peuvent pas être obtenues actuellement par d’autres méthodes compte tenu de la complexité physiologique de l’environnement de la tumeur comprenant plusieurs types cellulaires impossible à reproduire avec des cellules en culture, nous obligeant à travailler à l'échelle d'un organisme. Des études sur cellules en culture sont, par ailleurs, prévues pour étudier d’autres paramètres qui complèteront ce volet d’expérimentation animale sans pouvoir le remplacer.

Réduction

Nous avons déterminé le nombre d'animaux nécessaire et suffisant dans chaque sous-groupe pour avoir des résultats exploitables. Ce nombre est de 5 souris par sous-groupe, chacune greffée de 2 tumeurs sur chaque flanc, c'est à dire 10 tumeurs greffées par groupe, ceci dans le but de diminuer de moitié le nombre d'animaux inclus dans une expérience.

Raffinement

Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les animaux seront anesthésiés au moment de la greffe des cellules cancéreuses sous la peau. Au cours de l’expérience, une surveillance visuelle quotidienne et un suivi clinique (3 fois par semaine) seront réalisés dans le calme pour limiter au maximum le stress des animaux. L’administration d’analgésique sera réalisée si nécessaire (en cas de douleur). Des conditions d’hébergement standard adaptées sont appliquées avec une alimentation standard sans limite de quantité. Enfin, un enrichissement composé de coton et de lanières cartonnées en accordéon sera proposé aux animaux afin qu’ils puissent se confectionner des nids.

Choix des espèces

Les souris utilisées sont des femelles adultes de 6 semaines à leur arrivée à l'animalerie. Nous avons choisi des femelles pour éviter l'agressivité des mâles liée au sexe et des adultes pour avoir un système mature et des animaux qui sont adultes du début à la fin de l'expérience. Après un temps d'acclimatation de 4 jours, elles entrent dans un protocole de suivi de croissance tumorale pour une durée maximum de 60 jours. Nous avons choisi l'utilisation de la souris qui est une espèce animale qui se rapproche au mieux sur le plan physiologique à l’espèce humaine. Seule la souris nous permettra de répondre clairement aux questions que nous nous posons sur les effets anticancéreux d'un anticorps sur les cancers digestifs humains. De plus, le modèle souris apporte 2 autres avantages : sa taille et sa masse qui limite les quantités de traitement à administrer et le nombre extrêmement grand d'outils biologiques qui permettent la caractérisation des tissus cancéreux chez la souris. Les souris utilisées sont des femelles adultes pour que les animaux restent au même stade mature tout au long de l’expérience. Nous avons privilégié des femelles pour limiter les conflits entre mâles greffés dans une même cage.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales humaines sous la peau puis des injections intraveineuses de molécules-vecteurs, la mise à mort se faisant par dislocation cervicale pour collecter sang et organes. Le porteur cite comme effets possibles des chocs anaphylactiques et des détresses cardio-respiratoires. Il affirme qu'aucune alternative ne donne accès aux fonctions physiologiques des mammifères et conclut que le développement de ces vecteurs ne peut se faire qu'in vivo.

Objectifs

Le cancer est encore aujourd’hui une des causes majeures de mortalité dans le monde et pour lequel les besoins médicaux actuels restent très insatisfaits, avec certains cancers nécessitant de nouvelles approches thérapeutiques. Ainsi, les cancers du pancréas, les cancers des poumons et de la prostate (ainsi que leurs métastastases) sont des exemples d’enjeux de santé publique. Ces dernières années, les recherches privées et publiques ont augmenté leurs efforts, suscitant de grands espoirs pour les patients malades et leurs familles. Cette demande de projet s’inscrit dans cette dynamique, avec pour objectif d’améliorer les perspectives thérapeutiques. Ce projet innovant a pour objectif d’évaluer si des molécules conjugués à des vecteurs (V-molécule) ciblants les récepteurs aux lipoprotéines LDL (LDLR) ou à la Transferine (TfR) permettent d’observer un effet clinique (thérapeutique, de distribution, d'extinction de gènes...) sur des modèles de tumeurs humaines implantées sur le modèle de souris. L’objectif principal de ce projet sera donc de développer, tester et optimiser nos molécules-vecteurs (V-molécule) pour améliorer la délivrance d’agents thérapeutiques au niveau des tumeurs. Par ces approches systémiques nous tenterons d’améliorer le potentiel d’actions de nos vecteur-médicaments. Les statines sont le traitement de référence pour soigner l’excès de cholestérol, ou plus exactement le LDL-cholestérol (lipoprotéine de faible densité), il s’agit d’un des médicaments les plus couramment utilisés dans le monde. Cette inhibition stimule secondairement l’expression des récepteurs aux LDL, permettant leur entrée dans la cellule cible. Il est fort probable que certains patients traités pour des cancers prennent des traitements à base de statine. Il est donc très important d’étudier l’effet de la prise de statine dans nos modèles tumoraux afin de voir leur effet sur l’expression du récepteur au LDL dans les tumeurs et autres tissus.

Bénéfices attendus

En ce qui concerne la partie expérimentale, notre procédure met en avant la sensibilité d’action de nos V-molécules et les faibles quantités administrées, ce qui réduit également les risques de toxicités pour les animaux. D'un point de vue médical, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos molécules Vecteurs (V-molécules) constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Les implantations des cellules tumorales se font en sous-cutanée sur le flanc de l’animal anesthésié (anesthésie gazeuse isoflurane). Cet acte chirurgical sera effectué une seule fois par souris et cela prend environ 1 minute. Les injections des "V-molécules" : les souris recevront une injection IV (veine caudale) de V-molécule et de molécule controle. Les animaux sont endormis pour injecter les molécules en solution isotonique stérile. Il y a l'injection d'une molécule par animal et cela prend environ 2 min.

Impact sur les animaux

Dans ce projet nous proposons d’étudier la biodistribution de nos V-molécules sur des temps d’incubation relativement courts. Les effets indésirables pour les souris sont principalement le stress causé par la capture, l'implantation des cellules tumorales en sous cutanées, les injections en IV des composés V-molécules, ainsi que le développement de la tumeur chez l’animal en tant que pathologie. Les composés pharmacologiques peuvent (éventuellement) causer des effets secondaires observés post-administration comme des chocs immunitaires (anaphylactique), des réactions allergiques, des détresses cardio-respiratoires et des modifications et des troubles comportementaux.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale afin de collecter le sang et les organes qui seront utilisés pour faire des analyses complémentaires.

Remplacement

Toute étude de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. La partie développement de nos V-molécules ne peut être réalisée que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des conjugués développés. L'utilisation de rongeurs impose la prise en compte de la règle des 3 R, la conformité vis à vis des recommandations et cahier des charges.

Réduction

L’optimisation de nos vecteurs in vitro nous permet aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux se répartit sur des groupes de n=15 (V-molecule et molecule controle), à raison de 120 souris par an, réparties sur 4 études de 30 individus, sera suffisant pour appréhender un effet de nos molécules sur la croissance tumorale. Cette estimation a été faite d’après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par la société. Ce nombre d'animaux pour ces procédure nécessaire à l'obtention d'une significativité statistique (réduction, règle des 3Rs) a été défini en déterminant: -le test statistique : T-test (2 groupes), -l'effet biologique et la dispersion escomptées, cette estimation a été faite d'après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par la société, -le risque alpha.

Raffinement

La formation initiale et l’expérience du personnel permettent d’avoir suffisamment de recul pour appréhender tout signe et ou comportement caractéristique d’une douleur ou gène chez l’animal, appuyés si besoin par la présence sur site d’un pharmacien et vétérinaire pour exercer dans le respect des 3R. Nous porterons une attention particulière à la phase amont de l’expérimentation qui regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux. Au minimum la veille des tests, les souris sont déplacées dans une pièce cyclée, insonorisée, armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont ainsi maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), avec la même cage (taille standard pour portoir ventilé+couvercle à filtre), un maximum de 5 individus par cage, litières (copeaux de bois) et raffinements (maison en carton et Sizzle-Nest). Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Une personne compétente (formation en experimentation animale + chirurgie) réalisera les implantations sous-cutanées de cellules tumorales. Une observation quotidienne des animaux (poids, douleurs, souffrance) sera faite ainsi qu'une surveillance du volume des tumeurs et des antalgiques sont prévus en cas de nécessité. Toute perte de poids, signe de douleur (analgésiques prévus en cas de nécessité) ou souffrance notable (cardiaque, respiratoire) de l'animal éveillé après anesthesie (anesthésie gazeuse isoflurane) ou au cours du developpement tumoral constituera le point limite de l'expérience. Un enrichissement materiel (twists, cocon ou nid) de l'environnement des animaux est mis en place dans toutes les cages afin qu'ils expriment un répertoire diversifié de comportements normaux. Dans cette procédure, nous utiliserons des animaux issus d’élevages extérieurs d'un seul fournisseur extérieur.

Choix des espèces

- Facilité d'utilisation en général, espèce athymique (NU(NCr)-Foxn1nu ) comme modèle in vivo, pour faciliter la mise en place et la prise de tumeurs solides en sous-cutanée (facilité et maîtrise de l’injection, déficience du système immunitaire), ainsi que pour le suivi de leur croissance. - Modèle d’injection de lignées tumeurs en sous-cutanée bien décrit dans la littérature et déjà utilisé dans le passé par des membres du laboratoire ou membres du projet collaboratif. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ce type de modèle d’injection de lignées cancéreuses, c’est à dire des souris athymiques « jeunes adultes » âgés de 6 semaines au moment de l’implantation de la lignée tumorale et 10 à 12 semaines au moment du traitement (injection de la V-molécule) en fonction de la taille des tumeurs.

1 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des immunomodulateurs par voies intrapéritonéale et orale, pour tester une molécule associée à la radiothérapie contre le cancer du côlon et le mélanome. Le porteur décrit les atteintes très brièvement, la tumeur et le traitement pouvant "affaiblir la souris", sans détailler les points limites. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le micro-environnement tumoral et conclut que le projet doit être mené sur un organisme disposant d'un système immunitaire.

Objectifs

L’efficacité des immunothérapies ciblant l’axe PD-1/PD-L1, est très prometteuse, mais il semblerait que, dans certaines situations, ce traitement ne soit pas suffisant pour complètement activer la réponse immunitaire antitumorale. Dans ces cas, l’association de ce traitement avec notre molécule d’intérêt pourrait présenter une activité synergique bénéfique in vivo. De plus, l’efficacité accrue des traitements combinés radiothérapie/immunothérapie en comparaison avec les monothérapies est un des axes les plus prometteurs en ce qui concerne la lutte contre le cancer du colon et du mélanome.

Bénéfices attendus

L'ajout de la molécule (ACB1801) dont l’activité semble augmenter l’activité de protéines impliquées dans la présentation d’antigène in vitro, semble améliorer la réponse aux monothérapies ciblant PD-1 dans des modèles in vivo. Nous souhaitons donc combiner ces traitements avec la radiothérapie, afin d’améliorer l’efficacité de ces thérapies dans le cadre du cancer du colon et du mélanome. Déterminer si il y a une toxicité de la triple combinaison sur l'animal afin d'éviter les effets seconduires chez le patient.

Procédures

Les seules interventions prévues sont l'injection de cellules tumorales en sous cutané ainsi que l'injection en intrapéritonéal et par administration orale des immunomodulateurs pour les deux procédures.

Impact sur les animaux

Le traitement ainsi que la façon dont pousse la tumeur peuvent, dans certains cas, affaiblir la souris.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés du fait des greffes qu'ils ont eues et pour effectuer des prélèvements d'organes en vue d'analyses sur certains d'entre eux.

Remplacement

Le recours à des modèles animaux nous permettra d’étudier les effets des combinaisons thérapeutiques dans un contexte qui inclut le micro environnement tumoral et qui permet donc l’interaction des cellules tumorales avec le stroma (dont les cellules immunitaires sous dépendance de médiateurs type cytokines ou cellules provenant du reste de l'organisme). Cela est indispensable dans le contexte de la radiothérapie (par exemple: effet «bystander» de l’irradiation i.e. effets que les cellules irradiées pourraient exercer sur des cellules non irradiées à proximité ou à distance par exemple). Il n’existe pas de modèle in vitro permettant une telle étude. Le projet nécessite donc d’être mené sur un organisme vivant disposant d’un système immunitaire.

Réduction

Nous avons choisi d'utiliser les modèles du cancer du colon et des mélanomes pour lesquels il y a beaucoup de données dans la littérature ainsi que dans notre laboratoire concernant la réponse à la radiothérapie et l'immunothérapie. Ceci nous permettra de réduire les conditions expérimentales (dose d'irradiation et d'immunomodulateurs) et donc le nombre d'animaux nécessaires pour tester nos hypothèses. De plus nous nous sommes basés sur des analyses statistiques pour déterminer le nombre nécessaire d'animaux.

Raffinement

Le développement de la tumeur sera suivi par la mesure du volume tumoral et les souris seront pesées très régulièrement. Un suivi quotidien de signes éventuels de souffrance sera effectué. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les procédures seront effectuées sous anesthésie locale ou générale. En cas de besoin, une analgésie sera utilisée. Les souris seront élevées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Leur environnement sera enrichi (sizzlenests, maisons en cartons).

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie. Les souris C57BL/6 et Balb/C ont été choisies pour leur capacité à développer rapidement et efficacement des tumeurs et pour l’homogénéité et donc la fiabilité des résultats que l’on peut générer avec ce modèle (souris congéniques, avec recul important sur les données antérieures). Les souris seront âgées de 8 ou 9 semaines, un âge où la souris est suffisamment développée (jeune adulte).

850 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de lignées de cancer colorectal humain, subissent une ou deux chirurgies sous anesthésie, des résections de tumeur et pour certaines cinq séances d'irradiation, avant d'être tuées pour prélèvement. Le projet évalue un dispositif d'imagerie par fluorescence censé guider le chirurgien, le porteur reconnaissant inflammation, perte de poids et douleur postopératoire. Il affirme que la validation du dispositif rend l'étape animale "indispensable" avant tout essai clinique.

Objectifs

Le cancer colorectal est l’un des cancers les plus fréquents et mortels chez les hommes et les femmes avec un taux de survie de 63 % à 5 ans malgré la mise en place d’un programme de dépistage. Des cancers colorectaux (CCR), 30 % sont localisées dans le rectum (CR). Le CR nécessite un diagnostic et un traitement spécifiques. La résection chirurgicale est le traitement de référence, mais elle induit une morbidité importante et une qualité de vie réduite. Les chirurgiens doivent se reposer sur leurs sens de la vision et du toucher afin de distinguer les tissus malades devant être retirés des tissus sains à préserver. Cette absence de guidage est critique ; une identification inadéquate des zones de résection peut être responsable du développement de métastases, d’une récidive locale et de la diminution de la survie. Pour répondre à cette problématique, l’imagerie est devenue un domaine de recherche majeur, notamment autour de l’imagerie de fluorescence. Cette technique non-irradiante est adaptée aux contraintes d’un bloc chirurgical. Elle nécessite l’usage d’un fluorophore sensible et spécifique au tissu malade ciblé. La stratégie « Watch and Wait » (observer et attendre) est une approche permettant de préserver les organes. Un suivi précis de ces patients est crucial pour identifier toute (re)croissance tumorale locale ou dans des organes avoisinants. C'est pourquoi de nouvelles technologies de surveillance ont été développées afin de permettre un suivi plus précis et plus objectif et de minimiser le risque de récidive et d’améliorer les résultats cliniques et la qualité de vie des patients. Dans ce contexte, ce projet aura comme objectif l’évaluation d’un nouveau système d’imagerie avec un fluorophore cible comparé à différents systèmes d’imagerie et à d’autres fluorophores. Pour ce faire, un modèle murin de xénogreffe de cancers colorectaux permettant de reproduire les conditions du cancer colorectal humain sera utilisé. Ce nouveau dispositif d’imagerie, s’il est validé, pourrait être utilisé au cours d’une chirurgie CRC ou d’une coloscopie afin d’aider les chirurgiens dans leur prise de décision. Ce projet sera donc réalisé sur un effectif total de 850 animaux dans le respect de la règle des 3 R.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait contribuer à optimiser les thérapies chirurgicales des cancers colorectaux en réduisant le nombre d'opérations inutiles après une réponse clinique complète et d'assurer un meilleur suivi des patients. En effet, le traitement à visée curative du cancer colorectal consiste en une chimioradiothérapie néoadjuvante suivie d'une résection chirurgicale. Cette technique a permis de diminuer la récidive avec de meilleurs résultats à long terme. Toutefois, il est difficile pour les chirurgiens de distinguer les tissus cancéreux des tissus sains. Ainsi, de nouveaux outils d'imagerie diagnostique pourraient améliorer le contraste entre les tissus cancéreux et les tissus sains adjacents pendant la chirurgie. L'imagerie moléculaire ciblée sur la tumeur est une technologie émergente qui pourrait répondre au besoin d'évaluation nécessaire aux chirurgiens. Cette technique innovante peut permettre une visualisation peropératoire en temps réel de la tumeur en mettant en évidence de manière sélective les cellules cancéreuses. Ainsi, cette étude pourrait permettre la mise en place d’essais cliniques chez l’homme et fournir de meilleurs outils d'orientation aux chirurgiens traitant des patients atteints de cancers colorectaux.

Procédures

Les animaux des différentes procédures expérimentales seront soumis à : - Implantation d’une lignée cellulaire au niveau des deux flancs sous anesthésie générale gazeuse sur 72 animaux (PE1, partie 1) - Implantation de 3 lignées cellulaires sous anesthésie générale gazeuse sur 778 animaux (PE1, partie 2 et PE2-PE9) - 1 chirurgie sous anesthésie générale gazeuse pour exposer la tumeur sur 666 animaux pendant environ 1 heure (PE1, 2, 3, 4, 5, 7 et 8) - 2 chirurgies sous anesthésie générale gazeuse sur 184 animaux pendant 1 heure (PE6 et 9) - 1 résection de tumeur complète sous anesthésie générale gazeuse sur 697 animaux pendant 1 heure (PE2, 3, 4, 5, 6 résection totale, 7, 8 et 9) - 1 résection de tumeur incomplète sous anesthésie générale gazeuse sur 69 animaux pendant 1 heure (PE6 résection partielle) - imagerie (non invasive) sous anesthésie générale gazeuse sur 850 animaux pendant 5 minutes - 5 séances d’irradiation sous anesthésie générale gazeuse sur 46 animaux pendant 10 minutes une séance par jour pendant 5 jours - Euthanasie prélèvements d’organes terminaux sous anesthésie générale sur tous les animaux (850).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables qui pourraient être observés sur notre modèle de souris de cancers colorectaux sont : - Inflammation ou nécrose de la tumeur, - Perte de poids, - Douleur suite à la chirurgie. Une grille d’évaluation de la souffrance/points limites des souris établies tous les 2-3 jours permettra de détecter et suivre la totalité des effets secondaires et de les gérer en cas de besoin.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure afin de prélever les tissus pour des études et validations post-mortem.

Remplacement

Après un début de développement du dispositif d’imagerie grâce à des approches « in silico » (numériques) et « in vitro » (substrats de synthèse, tissus, organes isolés), le recours à l’animal s’avère essentiel pour avancer dans la validation de cette nouvelle technologie. Il s’agit de démontrer l’efficacité du dispositif d’imagerie en temps réel au cours d’une chirurgie, en validant des paramètres spécifiques dans différentes procédures expérimentales réalisées sur un modèle de cancers colorectaux. L’objectif principal est de démontrer que le nouveau dispositif d’imagerie permet de distinguer les tissus sains des tissus cancéreux pour guider le chirurgien lors de son opération. Cette étape sur l’animal est indispensable afin de pouvoir envisager, par la suite, la mise en place d’essais cliniques chez l’homme.

Réduction

Le nombre de mesures réalisées par animal a été optimisé (plusieurs systèmes d’imagerie seront utilisés sur un même animal) afin de réduire le nombre d’animaux au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les études seront réalisées par étapes, avec des phases préalables de validation et d’optimisation des modèles sur de faibles effectifs avant de passer aux étapes suivantes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés avec du matériel pour la nidification. Les animaux seront acclimatés à leur hébergement quelques jours avant de démarrer les procédures expérimentales ; la mesure de leurs tumeurs et leur poids sera réalisée 3 fois par semaine. L’implantation des tumeurs, les chirurgies et les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale. L’usage d’analgésie avant les opérations permettra une meilleure gestion de la douleur. Une partie des animaux sera sacrifiée sans réveil après la chirurgie. Les animaux qui seront réveillés après chirurgie seront suivi quotidiennement afin de pouvoir détecter et gérer la douleur en cas de besoin. La surveillance et les soins des animaux avant l’intervention seront assurés par une équipe qualifiée de zootechniciens, vétérinaires, techniciens et chirurgiens. La structure en charge du bien-être animal accompagnera le projet dans sa mise en œuvre, avec les conseils du vétérinaire désigné qui prendra les dispositions nécessaires au maintien du bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus utilisée en expérimentation en oncologie. Il est ainsi possible d’obtenir un modèle standardisé optimal de tumeurs colorectales, modèles plus difficiles à réaliser chez d’autres espèces. La raison la plus importante du choix de la souris pour notre étude est sa similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. Sa petite taille, sa prolificité, les facilités zootechniques, les risques sanitaires moindres et une littérature abondante sont autant d’arguments complémentaires en faveur du choix de cette espèce. Nous utiliserons des souris nude. Ce modèle de souris permettra l’implantation de lignées cancéreuses humaines et le développement des tumeurs. Ces souris sont connues pour être de bons modèles pour le développement de tumeurs sous-cutanées. Les animaux seront livrés à partir de l'âge de 5 semaines. A cet âge, nous pourrons réaliser les analyses prévues sur les tumeurs. L’utilisation de souris nude, sans poils, fera en sorte que la couleur de la peau et les poils n'interfèrent pas avec les différentes technologies d'imagerie utilisées.

1404 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une colite est provoquée par ajout de dextran sulfate de sodium dans l'eau de boisson, avec pour une partie des animaux une induction de cancer intestinal par injection, puis une injection de cellules B régulatrices et des prélèvements sanguins. Le projet teste une thérapie cellulaire contre les maladies inflammatoires de l'intestin, les souris étant tuées pour caractériser leur réponse immunitaire. Le porteur affirme que les migrations et interactions cellulaires en jeu ne peuvent pas être modélisées in vitro.

Objectifs

L’objectif du projet est de caractériser l’effet protecteur d’une thérapie cellulaire utilisant des cellules B régulatrices (Bresg) dans des modèles de maladies inflammatoires de l'intestin (MII). Les MII incluent la colite ulcéreuse (CU) et la maladie de Crohn (MC) qui sont des troubles chroniques et récidivants, dont le cancer est une complication à long terme potentiellement mortelle. Plus de 2 millions d'Européens et 1,5 million de Nord-Américains sont atteints de MII. Bien que les traitements actuels permettent de ralentir la progression de ces maladies chez certains patients, une rémission durable et la prévention du cancer associé ne sont pas toujours possibles, et il n'existe actuellement aucun traitement curatif pour les MII. Les MII impliquent des cellules du système immunitaire responsables de la pathologie intestinale. L’activation de ces cellules pathogènes est normalement empêchée par un autre type de cellules du système immunitaire appelées Bregs. Les Bregs sont déficitaires chez les patients atteints de MII si bien qu’elles ne bloquent plus l’activation des cellules qui causent la maladie. Il y a un grand espoir qu’il soit possible de traiter les MII en transférant des Bregs protectrices chez ces patients. Des Bregs peuvent être produites en grand nombre en utilisant un protocole récemment établi. Les MII peuvent être modélisées chez la souris. En utilisant ces modèles les objectifs de ce projet sont de caractériser l’effet des Bregs produites in vitro sur la progression de la maladie, leur localisation dans les souris traitées, les mécanismes moléculaires impliqués dans leur effet bénéfique, et leur capacité à compenser pour des défauts dans d’autres mécanismes régulateurs importants dans l’inflammation intestinale. Le projet évaluera également la capacité de ces Bregs à empêcher le développement de cancer intestinal provoqué par l’inflammation.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est l'optimisation d'une nouvelle approche de thérapie cellulaire basée sur les Bregs pour traiter les MII et empêcher le développement de cancers associés, ainsi que la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans cet effet thérapeutique au niveau de l'organe affecté, l'intestin. Les MII, y compris la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn, sont des troubles chroniques et récidivants du tractus gastro-intestinal. Il n'existe actuellement aucun traitement curatif des MII. Les dysfonctionnements du système immunitaire contribuent à l'inflammation intestinale aberrante chez ces patients. L'activation de la réponse immunitaire est normalement contrebalancée par des lymphocytes régulateurs, tels que les lymphocytes B régulateurs (Bregs). Les Bregs sont déficients dans les MII et donc incapables de bloquer la réponse inflammatoire conduisant à la maladie. Il existe un grand espoir qu'il soit possible de traiter les MII en transférant des Bregs protectrices à ces patients. Les Bregs peuvent être produits en grand nombre par différenciation des cellules B naïves à l'aide d'un protocole récemment établi.

Procédures

La colite sera induite dans 1404 souris par ajout de dextran sodium sulfate (DSS) à l'eau de boisson. Ces souris suivront 8 traitements différents. Le nombre de souris est indiqué pour chacun de ces traitements. 1) injection de Bregs, prélèvement de sang par la veine mandibulaire, analyse J10 : 90 souris. 2) injection de PBS, prélèvement de sang par la veine mandibulaire, analyse J10 : 15 souris. 3) injection de Bregs, analyse J10 : 345 souris. 4) injection de PBS, analyse J10 : 210 souris. 5) Injection de Bregs, analyse J28 : 384 souris. 6) Injection de PBS, analyse J28 : 96 souris. 7) pré-traitement AOM, injection de Bregs, analyse semaine 12 : 216 souris. 8) pré-traitement AOM, injection de PBS, analyse semaine 12 : 48 souris.

Impact sur les animaux

La colite aiguë est induite par ajout de DSS dans l'eau de boisson pendant une semaine à une concentration de 4,0 % (modèle aigu). Pour le modèle chronique, les souris ont une eau de boisson avec du DSS à 2,5 % pendant une semaine, puis une semaine pendant laquelle l’eau de boisson ne contient pas de DSS, suivie par une semaine avec de l’eau de boisson à 2,5% en DSS (modèle chronique). Dans le modèle aigu, les souris développent la colite quelques jours après l'administration de DSS. Pour le modèle chronique, la concentration de DSS a été optimisée afin que les souris développent une maladie plus légère. Dans le modèle chronique, les souris développent progressivement la colite après le premier cycle d'administration de DSS et sont en rémission pendant la semaine suivante, puis la maladie rechute avec le deuxième cycle d'administration de DSS et se rétablit progressivement après le retrait du DSS. L'induction d'un cancer associé à une colite se fait par injection intrapéritonéale d'AOM suivie de trois cycles d'administration de DSS via l’eau de boisson (modèle AOM/DSS). Dans ce modèle de cancer, les symptômes sont provoqués par des poussées de colite pendant les cycles de traitement par DSS. Les symptômes cliniquement apparents liés à la tumeur sont généralement peu nombreux et le nombre d’animaux devant être mis à mort pour atteinte de point limite est généralement

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures. Ceci est justifié par le fait que la réponse au traitement, et leur système immunitaire seront alors caractérisés.

Remplacement

Les protocoles expérimentaux nécessaires à ce projet ont été optimisés par des expériences in vitro en vue d'un remplacement afin de réduire le nombre de souris nécessaires. En outre, le protocole de production des Bregs a été sélectionné suite à un long travail d'optimisation in vitro afin de générer des cultures contenant uniquement des Bregs. Les propriétés moléculaires de ces Bregs ont déjà été étudiées in vitro afin de réduire le besoin d'expérimentation animale. Ce projet vise à caractériser l'effet Bregs dans des modèles de MII et de cancer du côlon associé. Les réponses immunitaires se développent dans les organes lymphoïdes secondaires et impliquent des processus d'interaction entre différents types de cellules et des migrations cellulaires qui ne peuvent actuellement pas être modélisés in vitro. Les maladies inflammatoires intestinales impliquent également la migration des cellules du système immunitaire vers l'intestin, puis l'interaction de ces cellules avec les cellules intestinales locales. Ces processus ne peuvent pas être étudiés in vitro. Il n'y a donc pas d'alternative à la réalisation des études décrites chez la souris.

Réduction

Le protocole d'induction des MII a été optimisé de manière à ce que les maladies se développent de façon homogène chez des souris génétiquement identiques, ce qui permet de réduire le nombre de souris nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement valides. Des mesures de remplacement et d'affinement ont également permis de réduire le nombre de souris nécessaires à ce projet. Le nombre de souris utilisées est maintenu au minimum pour obtenir des résultats statistiquement interprétables. Ces estimations sont basées sur notre expérience, et sur les estimations obtenues avec le programme d'analyse de puissance statistique G*Power. Nous comparerons le jour d'apparition des signes cliniques, le score clinique maximum et l'incidence de la maladie avec le test de Mann-Whitney, et le niveau global de la maladie avec des ANOVA à mesures répétées. En outre, nous utiliserons une stratégie d'imagerie par luciférase pour suivre le devenir des Bregs au fil du temps sur le même animal, ce qui réduit le nombre d'animaux à utiliser.

Raffinement

Le protocole d'induction des MII a été affiné de manière à ce que l'évolution de la maladie ne dure que 10 jours dans le modèle aigu, si bien que les souris ne sont malades que pour quelques jours, et soit plus douce dans le modèle chronique afin de réduire la souffrance des animaux. Dans le modèle de cancer associé à la colite, les symptômes sont causés par des poussées de colite pendant les cycles de traitement par le DSS. Le protocole a été raffiné au niveau des doses utilisées afin que les symptômes cliniquement apparents liés à la tumeur soient généralement rares. Nous avons établi des points finaux pour chaque procédure afin d'éviter toute souffrance indésirable des souris. Les animaux sont logés en groupes de 5 par cage maximum et ne sont jamais isolés. Des objets sont ajoutés à leurs cages pour enrichir leur environnement. Ils sont observés quotidiennement par le personnel de l'animalerie formé au bien-être des animaux, et par les expérimentateurs. Le score clinique et le poids sont mesurés quotidiennement pour les expériences avec le modèle de colite aiguë et deux fois par semaine pour les modèles de colite chronique et de cancer de l'intestin.

Choix des espèces

Les modèles de MII et de cancer colorectal proposés ici sont bien standardisés. Les connaissances disponibles sur ces modèles permettent de mieux définir les plans expérimentaux et donc de réduire le nombre de souris nécessaires. De nombreux outils sont disponibles pour ces modèles, ce qui permet d'aborder les problèmes posés de la manière la plus pertinente, et de récupérer le maximum d'informations. Ces modèles expérimentaux ont été utilisés pour le développement de thérapies actuellement utilisées chez les patients atteints de MII. Même si ces modèles ne sont pas une copie parfaite des MII ou des cancers associés, ils constituent des modèles utiles pour le développement de pistes thérapeutiques pour la pathologie humaine. L’utilisation de souris de fond génétique C57BL/6 de 6 à 14 semaines est approprié pour ces études car cela correspond à l’âge pendant lequel la maturité du système immunitaire est appropriée pour étudier cette maladie.

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer un cancer de l'estomac, elles reçoivent neuf injections de chimiothérapie en trois semaines, pour tester le rôle du gène SCRIB dans la maladie. Le porteur indique que la tumeur et les injections peuvent provoquer inflammation, déshydratation, douleur et perte de poids. Il affirme que le modèle animal est "indispensable" et que la souris est le "seul modèle" où la mutation étudiée est possible.

Objectifs

Le but de ce projet est de créer et étudier une nouvelle lignée de souris mutante pour le gène SCRIB qui semble impliqué dans les cancers gastriques (estomac). En effet, lorsque que ce gène ne fonctionne pas correctement (en étant modifié), le cancer a plus de chance de se déclarer. Une version mutée de ce gène SCRIB est trouvée chez des patients atteints de cancers gastriques. Ces souris mutantes qui déclareraient des cancers gastriques nous permettrait de tester l’efficacité des traitements chimio-thérapeutiques sur ces cancers.

Bénéfices attendus

Les cancers gastriques sont la 5ème cause de mortalité par cancer dans le monde, avec plus de 1 millions de nouveaux cas par an. Ces cancers se caractérisent par une forte agressivité avec une survie à 5 ans de moins de 25%. Les raisons de cette mortalité élevée sont multiples et peuvent s’expliquer notamment par un diagnostic tardif. Une meilleure connaissance des mécanismes liés au cancer nous permettrait d’améliorer les diagnostics et les traitements. A terme, le gène étudié ici pourrait être utilisé à l’avenir comme cible thérapeutiques si les traitements s’avèrent efficaces dans ce projet.

Procédures

Les souris engagées dans ce projet sont porteuses de mutations qui induisent un cancer gastrique. Elles auront donc des tumeurs qui se développeront au niveau de l'estomac. Afin d'évaluer l'efficacité de 4 chimiothérapies, les souris recevront ces traitements par injection, 9 au total sur une durée de 3 semaines. Chaque injection prend quelques dizaines de secondes pour être réalisée et peut entraîner du stress et de l'inconfort chez l'animal. L'impact des anticancéreux sur ce modèle réalisé n'est pas connu actuellement.

Impact sur les animaux

Les souris transgéniques utilisées dans ce projet développeront des tumeurs au cours du temps. De plus, les souris subiront toutes 9 injections en IP en 3 semaines. Les souris pourront présenter de l’inflammation de la déshydratation et une douleur transitoire suite aux injections ainsi qu’une perte de poids et d’appétit dues au développement de la tumeur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure. En effet, le but, en plus d'observer les animaux et d'évaluer l'efficacité des traitements, est de mener ensuite des analyses sur plusieurs de leurs tissus (tumeurs et organes).

Remplacement

Au laboratoire, des travaux in vitro encourageants démontrent que la dérégulation de SCRIB, notamment sa perte de fonction, favorise la prolifération cellulaire des cellules de cancer gastriques et diminue l’adhésion cellulaire. L’utilisation d’un modèle animal est maintenant indispensable pour identifier le rôle de SCRIB au niveau d’un organisme et ainsi définir le potentiel statut de SCRIB en tant que gène suppresseur de tumeur. La souris est à ce jour le seul modèle où la mutation sur notre gène d’intérêt est possible.

Réduction

Ce nombre a été réduit au maximum tout en restant suffisant et statistiquement robuste pour apporter des réponses claires à notre projet.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions sanitaires contrôlées et disposeront d’un enrichissement adapté (tunnels, maisonnettes, carrés de coton pour la fabrication de nid). Les animaux seront surveillés quotidiennement. Les injections seront réalisées par des personnels compétents. Un suivi régulier comprenant l’observation des critères définis (point d’injection, poids et état de maigreur, état général) sera effectué. Les effets secondaires de la chimiothérapie chez la souris peuvent se traduire par de la diarrhée. Aux doses décrites dans ce projet, le risque est extrêmement faible. Si toutefois des diarrhées apparaissaient, nous mettrons en place un suivi déshydratation (pli de peau) associé à un suivi de poids tous les jours et du gel nutritif sera mis au fond de la cage. Des points limites ont été établis permettant de détecter le plus précocement possible tout signe de souffrance ou de douleur et ainsi de soustraire l’animal de la procédure rapidement si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est utilisée comme organisme modèle. L'animal est absolument nécessaire par son côté physiologique intégratif. Les animaux utilisés dans ce projet sont génétiquement modifiés et ces lignées sont disponible chez la souris. C’est un modèle de référence dans le domaine de la cancérologie et nous possédons les lignées d’intérêt. Enfin, fort de notre expérience sur ce modèle dans des projets antérieurs, nous choisissons de rester sur le modèle murin. La première partie du projet consiste à évaluer les cancers sur les souris mutantes pendant 12 mois. Les souris seront suivies de la naissance jusqu’à maximum l’âge d’un an. Pour la deuxième partie du projet, l’efficacité des traitements sera tester par chimiothérapie à l’âge adulte. Ainsi, les traitements commenceront entre 6 et 12 semaines.

13 200 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules ou de fragments tumoraux en sous-cutané, puis des administrations répétées de substances, pour tester l'efficacité d'anticancéreux pour le compte de clients industriels ou de laboratoires. Le porteur indique que le développement tumoral peut provoquer perte de poids, hypothermie, épanchement abdominal et difficultés respiratoires. Il décrit une activité de prestation commerciale et affirme que ce modèle ne peut "pas être remplacé" par des méthodes in vitro.

Objectifs

Le cancer est un problème de santé publique majeure et représente la deuxième cause de décès dans le monde. Les modèles animaux de cancer humain et murin demeurent des éléments critiques dans la compréhension de la physiopathologie du cancer, l’identification de nouvelles cibles et de nouveaux candidats médicaments et la compréhension des mécanismes de résistance. Le modèle d’injection de cellules en sous-cutané, dit hétérotopique, permet d’examiner de larges cohortes de tumeurs dont la croissance et la réponse aux médicaments peuvent facilement être évaluées grâce à un suivi cinétique de la croissance tumorale par des mesures au pied à coulisse. Bien que la greffe de cellules ou de tissu cancéreux n’est pas réalisée dans l’organe d’origine dont est issue la tumeur, ce type de modèle a pu montrer un caractère prédictif satisfaisant afin d’identifier des molécules à activité thérapeutique pour la clinique humaine, qui en fait un modèle standard de la recherche en oncologie. La procédure décrite dans ce projet correspond à la création de différents modèles de tumeurs chez le rongeur (souris ou rat). L’objectif est d’administrer des cellules tumorales issues de différents types de tumeurs et de mesurer différents critères (taille de la tumeur, survie...) afin d’évaluer l'efficacité ou la toxicité de molécules aux propriétés anticancéreuses décrites ou potentielles. La création de ce type de modèle dans ce projet ne peut pas être remplacée par des méthodes alternatives car l'induction de tumeur s'accompagne de modifications physiopathologiques et micro-environnementales spécifiques ne pouvant actuellement pas être reproduites in vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux.

Bénéfices attendus

Le projet consistera à développer des modèles de tumeur chez le rongeur pour les différentes indications en oncologie, qui permettra de tester l'efficacité d'anticancéreux pour des clients du secteur industriel privé ou des laboratoires de recherche publique ou dans un contexte de recherche interne. De plus, il permettra aussi d'évaluer l'expression de certains biomarqueurs en amont d'une étude de pharmacologie ou de générer des modèles animaux pour des procédures de test dans un autre laboratoire dans le cas de collaboration. Dans ces buts, la procédure consistera à injecter des lignées cellulaires humaines (xénogreffes) ou murines (allogreffes), des cellules primaires obtenues à partir biopsies de patients ou d’explants tissulaires en sous cutané chez des animaux immunocompétents (souris ou rats), immunodéprimés (souris ou rats), transgéniques ou humanisés dépendant du modèle. Un suivi de la croissance du volume tumoral sera réalisé avec un pied à coulisse ou d’autres modalités d’imagerie par bioluminescence ou fluorescence (utilisant des cellules reportrices adaptées à ce type de modalité) mais aussi par rayons X ou échographie. De plus, le poids et l'état général des animaux seront suivis au cours du temps. Cependant les modèles de mélanome, aussi injectés en sous cutanés, ne seront pas considérés dans ce projet car induisent la formation de métastases agressives. Les animaux présentant une immunodéficience nécessitant un cloisonnement ou certains animaux transgéniques seront hébergés en condition Biosafety level 2 (BSL2) afin de maintenir leur statut Specific and Opportunistic Pathogen Free (SOPF) et éviter toutes contaminations chez ces animaux plus sensibles.

Procédures

Les animaux subiront une anesthésie d’environ 5 à 10 min pendant laquelle ils seront tatoués dans la pulpe de leurs doigts en utilisant une aiguille imbibée d’encre de tatouage pour animaux. Toujours sous anesthésie, les animaux subiront une injection rapide (

Impact sur les animaux

Plusieurs effets indésirables inhérents au développement tumoral pourront apparaître pendant une étude. - Une perte de poids corporel - Un comportement amorphe marqué pendant les périodes de vigilance. - Une hypothermie persistante - Une distension anormale de l’abdomen pouvant être le signe d’un épanchement - Des problèmes de respiration pour l’animal - Une incapacité de se nourrir ou boire L’ensemble de ces symptômes sera monitoré pendant l’étude afin d’appliquer des mesures pouvant amener à l'euthanasie de l’animal avant la fin de l’étude pour raison éthique.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin d’étude car les animaux présentent des tumeurs et ne permettent pas un maintien des animaux en vie dans de bonnes conditions de santé.

Remplacement

Ce modèle ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car l'induction de tumeur s'accompagne de modifications physiopathologiques et micro-environnementales spécifiques ne pouvant actuellement pas être reproduites in-vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux. De plus, les traitements utilisés subissent toutes les différentes phases incluant administration, distribution, métabolisme et élimination, étapes ne pouvant être reproduites in-vitro.

Réduction

Des analyses in-vitro pourront être réaliser en amont de l'étude permettent de sélectionner des lignées/types de cellules présentant une sensibilité à la substance d'essai afin de limiter le nombre d'animaux. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet, la comparaison par rapport à une substance de référence, et un effectif suffisant de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. Dans cet objectif, une analyse sera réalisée afin d’estimer le nombre d’animaux nécessaire pour observer une diminution du volume tumoral mesuré d'au moins 50%.

Raffinement

Le raffinement des méthodes expérimentales afin de réduire au maximum la souffrance animale est mis en œuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids, …), permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse. Le programme d’anesthésie, d’analgésie et de chirurgie (incluant oxygène à concentration ajustable et des tapis chauffants) est défini en accord avec un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères.... En cas de doute, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu’à normalisation ou jusqu’à atteinte des points limites. Tous les points limites et leur cotation sont décrits dans un formulaire interne. Cette observation inclue une surveillance de l'aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal sous stimulation, la respiration l’appétit, l’état d’hydratation, les tremblements ou convulsions… Une évaluation interne incluant la cellule de bien-être animal pourra permettre de réévaluer et d’adapter à postériori la catégorie si nécessaire.

Choix des espèces

Les tumeurs présentent une accumulation de multiples aberrations génétiques qui transforment les cellules, entraînant une croissance anormale, une prolifération et des métastases des cellules. Des études de ces aberrations et la compréhension de leur contribution à la physiopathologie du cancer sont nécessaires pour améliorer le diagnostic et la thérapie. Aujourd’hui encore, les rongeurs rats et souris demeurent essentiel à étudier les tumeurs in vivo et à comprendre les mécanismes moléculaires de la pathogenèse du cancer. Tous les animaux utilisés seront utilisés à partir de 5 semaines développement que ce soit des rats ou des souris.

1000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules cancéreuses humaines, puis pour une partie d'entre elles une injection intra-tumorale de particules d'oxyde d'hafnium et une à trois expositions aux rayonnements ionisants, la croissance tumorale ne permettant pas de les maintenir en vie dans des conditions confortables. Le projet vise à démontrer l'efficacité antitumorale de ces particules contre les cancers de la tête et du cou, bénéfice pour l'humain formulé au conditionnel. Le porteur affirme que le recours à l'animal est "incontournable" et "nécessaire" pour disposer d'un système immunitaire complet et se conformer aux standards réglementaires.

Objectifs

Notre objectif général est d’étendre les modalités du traitement des sarcomes des tissus mous (STS) par des particules d’oxyde d’hafnium aux cancers de la tête et du cou (Head &Neck abrégé en H & N). Plus précisément, l’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet antitumoral de particules administrées par injection intra-tumorale (IT) unique et activées par les rayonnements ionisants, par comparaison avec la radiothérapie seule, en termes de retard de croissance tumorale et de survie, associés à une très bonne tolérance chez les animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de démontrer l’efficacité d’un traitement par des particules d’oxyde d’hafnium activées par radiothérapie (retard de croissance tumoral, tolérance chez l’animal) sur un modèle de cancer supplémentaire (cancers de la tête et du cou). Plusieurs modèles de lignées cellulaires humaines sont prévus afin de couvrir un panel de situation dans lesquelles les particules d’oxyde d’hafnium activées pourront avoir un bénéfice concernant l’efficacité antitumorale et la tolérance par rapport à la radiothérapie seule : une efficacité tumorale plus forte associée à des effets indésirables plus faibles. Le bénéfice final du projet étant de prouver l’augmentation du temps et de la qualité de vie sur des souris porteuses de tumeur par rapport à un traitement par radiothérapie seul. Ce projet permet alors de mettre en exergue les bénéfices attendus pour un traitement chez l'homme sur des modèles similaires.

Procédures

Geste pratiqué n°1 : Contention manuelle et injection sous-cutanée de cellules cancéreuses sur animal vigile (une dizaine de seconde). Utilisation de lidocaïne localement sur la zone d'injection. Injection unique pour chaque animal. Tous les animaux de cette étude sont concernés par ce geste. Contention manuelle sur animal vigile pour mesure de la croissance tumorale (une dizaine de seconde par mesure) 2 à 3 fois par semaine, pendant une à deux semaines avant le geste pratiqué n°2. Geste pratiqué n°2 : Uniquement sur les souris dont les tumeurs se sont développées (taille environ 100mm3). Anesthésie gazeuse (isoflurane) et utilisation de lidocaïne localement sur la zone d'injection (tumeur). Injection intra-tumorale d'un contrôle (véhicule - glucose) ou de particules d'oxyde d'hafnium (10-15 secondes par injection). Injection unique pour les animaux sélectionnés. D’après les groupes établis, deux tiers des animaux de cette étude sont concernés par ce geste. Geste pratiqué n°3 : Contention de l'animal vigile dans un système de protection adapté (environ 1 minute). Exposition à des radiations ionisantes sur la zone tumorale (le reste de l’animal est protégé dans un système de contention). Chaque animal est exposé une à trois fois (une exposition par jour) selon la lignée cellulaire d’étude. Dans le cas de plusieurs expositions, elles se font sur des jours consécutifs. Chaque exposition dure en moyenne 5 minutes. Un suivi clinique est effectué sur l’animal afin de surveiller sa nutrition et son hydratation. D’après les groupes établis, près de la moitié des animaux de cette étude sont concernées par ce geste.

Impact sur les animaux

Angoisse et douleur peuvent être associées aux injections (injections sous-cutanées de cellules tumorales et injections intra-tumorale de particules d’oxyde d’hafnium). L’injection intra-tumorale de particules peut également entrainer une gêne liée à la pression intratumorale. L’anesthésie effectuée afin de limiter ces nuisances et de permettre les injections peut entrainer des conditions d’hypothermie chez l’animal. Une perte de poids peut être attendue à la suite de l’exposition aux rayonnements ionisants. Cette perte de poids peut être associée à une dégradation de l’état général (prostration, refus de s’alimenter ou de boire). La croissance tumorale peut aboutir à des volumes de tumeur important pouvant être une nuisance pour l’animal. Le risque de nécrose de la tumeur est à prendre en compte également. Enfin, la contention des souris (identification, suivi et mesures des tumeurs) peut également engendrer un stress.

Devenir

Les animaux dont les points limites sont atteints seront euthanasiés. Durant cette étude, les souris sont injectées avec des cellules tumorales et la croissance tumorale ne permet pas un maintien en vie dans des conditions confortables. De plus, des prélèvements et analyses post-mortem impliquent une euthanasie de l'ensemble des animaux.

Remplacement

Le recours à l’animal pour ce projet est incontournable. Les interactions avec un système immunitaire complet est nécessaire pour étudier les effets des particules d’oxyde d’hafnium dans le cancer de la tête et du cou, tout en déterminant et en évaluant les risques à prendre en compte pour un développement en thérapeutique humaine. De plus, le recours à l’animal est actuellement nécessaire pour être en conformité avec les standards internationaux exigés par les instances réglementaires.

Réduction

La première partie du projet permet d'optimiser les conditions d'étude (paramètres d'injection, croissance tumorale, état de la tumeur) avec deux lignées cellulaires de cancer de la tête et du cou actuellement non-renseignées dans la littérature et dans les projets précédents. Si cette première partie du projet ne permet pas d'isoler des conditions d'étude adéquates avec l'une de ces lignées cellulaires, celles-ci ne seront pas inclus dans la seconde partie du projet qui se fera sur 3 lignées cellulaires au lieu de 4, réduisant le nombre total de souris de 25% dans l'étude (passant de 1000 à 720 souris pour cette étude). La robustesse de l'étude en diminuant au maximum le nombre de souris inclus dans ces procédures a été assurée par un calcul de puissance (test statistique). Les résultats de cette étude seront interprétés par des tests statistiques.

Raffinement

Après leur réception à l’animalerie, les animaux ne seront pas utilisés pendant une semaine (période d’acclimatation). Les animaux seront hébergés en groupe de 5 animaux/cage maximum, dans des conditions sanitaires et environnementales contrôlées (nourriture stérilisée et eau disponible à volonté). De l’enrichissement sera prévu : du coton ou des lanières de Kraft (E-Kube) sera mis à disposition dans la cage afin que les souris puissent faire un nid ainsi que des maisons ou qui leur servent d’abri. L’inconfort, la douleur ou l’angoisse ressentie par les animaux seront pris en compte. Une anesthésie locale à la lidocaïne sera pratiquée systématiquement avant un geste pouvant occasionner une angoisse ou de la douleur (injection des cellules tumorales en sous cutané ou injection de particules par voie intratumorale). Une anesthésie gazeuse à l’isoflurane sera mise en place pour l’injection des particules par voie intratumorale afin de faciliter le geste et la rapidité d’exécution, et diminuer le stress et l’inconfort de l’animal. L’anesthésie gazeuse est privilégiée afin d’avoir un réveil rapide (1 à 2 minutes) de l’animal et de s’émanciper des risques d’hypothermie associés à une plus longue anesthésie générale. Néanmoins, l’animal sera placé sur un tapis chauffant afin de s’affranchir totalement de ce risque. La surveillance clinique quotidienne (examen de santé) lors des jours ouvrés permettra de détecter précocement tout signe clinique et de le traiter. Une mesure de l’évolution de la taille de la tumeur et du poids sera réalisée deux à trois fois par semaine. Pour les périodes de week-end, l’état de l’animal et son évolution seront évalués les jours précédents et il sera alors décidé si 1/ les points limites sont atteints ou sur le point de l’être 2/ si aucun risque n’est estimé pour le week-end ou 3/ si le doute nécessite un suivi au cours du week-end. Les points limites seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Dans la recherche en oncologie, le modèle de tumeurs humaines xenogreffées chez la souris nude est le modèle de référence pour l’étude des traitements anti-cancéreux. En ce sens, cette espèce de rongeur a été choisi pour l’évaluation de l’efficacité antitumorale d’oxyde d’hafnium activé par la radiothérapie. Souris de 7 semaines, jeunes adultes. Pour des raisons techniques, le poids des animaux doit être au minimum de 20 grammes afin d’assurer de bonnes conditions de traitement par radiothérapie. Pour les irradiations localisées, les animaux sont disposés dans des systèmes de contention exposant uniquement la zone d’intérêt. Ces systèmes sont adaptés à des souris de taille adulte.