Cancers

4 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une implantation de tumeur cérébrale par stéréotaxie, un suivi par IRM répété, des injections intraveineuses, sous-cutanées ou intracérébrales sur plusieurs cycles et des gavages, pour tester un peptide et des nanotechnologies portés par une société de biotechnologies. Le porteur décrit des effets possibles d'hyperpression intracrânienne, d'œdème et de perte de poids, et justifie l'effectif élevé par les 17 procédures prévues. Il qualifie le passage par un modèle animal d'"indispensable" et conclut que le glioblastome ne peut être reproduit in vitro, les bénéfices pour les patients restant conditionnés à des étapes réglementaires ultérieures.

Objectifs

Le glioblastome (GBM) est le cancer cérébral le plus fréquent et le plus agressif, avec 200 000 décès par an dans le monde, une survie médiane de 14 mois et aucun traitement curatif. Le traitement actuel consiste en une extraction chirurgicale de la tumeur suivie par le protocole de Stupp (radiothérapie et chimiothérapie avec le témozolomide). Des travaux ont montré l’activité anticancéreuse du peptide NFL sur des cellules de GBM (rats, souris, humain) cultivées en laboratoire et sur des rats porteurs d'un GBM (après une simple administration directement dans la tumeur). Ce peptide tue également les cellules responsables de l'apparition du GBM. De plus, lorsque le peptide se trouve à la surface de nanotechnologies, ce peptide augmente leur entrée dans des cellules de GBM de souris comparativement aux nanotechnologies seules. Chez l'animal (souris), une seule injection des nanotechnologies couplées au peptide et chargées en un anticancéreux, directement dans la tumeur, diminue de manière plus efficace le volume de la tumeur comparativement aux nanotechnologies chargées en anticancéreux mais sans peptide à leur surface. Une société de biotechnologies en santé travaille sur les formulations de ce peptide seul et combiné à des nanotechnologies pour en faire de futurs candidats-médicaments pour le traitement du GBM. Leur développement pharmaceutique a permis de les formuler pour une utilisation clinique. Le but de ce projet de recherche pré-clinique non réglementaire est d’étudier la tolérance et l’efficacité de ce peptide seul ou combiné à des nanotechnologies après administrations chez des souris saines ou porteuses de GBM humain en déterminant la voie d’administration la plus adaptée afin de développer un traitement contre le GBM et prévenir les rechutes chez les patients.

Bénéfices attendus

La société de biotechnologies en santé qui travaille sur les formulations du peptide NFL seul et combiné à des nanotechnologies visent à en faire de futurs candidats-médicaments dans le traitement du GBM. Ces travaux avancés de recherche pré-clinique non réglementaire ont pour but de valider l’innocuité des traitements et leur efficacité et ainsi, confirmer leur intérêt thérapeutique. Si l’intérêt thérapeutique est attesté et la posologie déterminée, ces travaux pourront servir de base pour la mise en place d’essais pré-cliniques règlementaires avant la mise en place d’essais cliniques chez l'Homme. Le but de ce projet est de développer un traitement contre le GBM et prévenir les rechutes chez les patients opérables ou non.

Procédures

Dans la mise au point du modèle, les animaux subiront 3 types d'intervention : l’implantation tumorale par stéréotaxie qui dure plusieurs minutes, le suivi de la croissante tumorale par IRM (4 IRM de suivi qui dureront environ une heure chacune et qui seront espacées de plusieurs jours) et une injection intraveineuse. Dans l'étude de toxicité, les animaux subiront un type d'intervention : des injections intraveineuses ou sous-cutanées (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours suivies de 2 jours de repos, sur 5 cycles) ou une injection intracérébrale. Dans l’étude de biodistribution et pharmacocinétique tissulaire, les animaux subiront jusqu'à 5 types d’intervention : l’implantation tumorale par stéréotaxie qui dure plusieurs minutes, le suivi de la croissante tumorale par IRM (3 IRM de suivi qui dureront environ une heure chacune et qui seront espacées de plusieurs jours), des injections intraveineuses ou sous-cutanées sur une période de 5 semaines (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours suivies de 2 jours de repos, sur 5 cycles) ou une injection intracérébrale qui durera plusieurs minutes et une perfusion cardiaque. Dans l’étude de pharmacocinétique, les animaux subiront deux types d’intervention, une injection unique intraveineuse ou sous-cutanée ou intracérébrale qui durera plusieurs minutes et des prélèvements répétés de sang au niveau de la veine caudal, de la veine jugulaire ou du sinus retro-orbital (3 prélèvements maximum, qui dureront quelques minutes chacun et qui seront espacés de plusieurs minutes à plusieurs heures). Dans l’étude d'efficacité, les animaux subiront quatre types d’intervention : l’implantation tumorale par stéréotaxie qui dure plusieurs minutes, le suivi de la croissante tumorale par IRM (1 à 6 IRM de suivi qui dureront environ une heure chacune et qui seront espacées de plusieurs jours), des injections intraveineuses ou sous-cutanées (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours) ou une injection intracérébrale qui durera plusieurs minutes et des gavages répétés (1 gavage par jour pendant 5 jours suivi de 2 jours de repos, sur 5 cycles maximum).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables des candidats médicaments seront évalués lors de chaque phase du projet. Les nanotechnologies pouvant être chargés d’anticancéreux (paclitaxel, etc.), des effets indésirables communément retrouvés après injection de ce type de composé pourraient être observés (modification de la formulation sanguine, perte de poids, faiblesse, etc.). Les effets indésirables peuvent être également liés à l’acte chirurgical et la croissance tumorale (hyperpression intracrânienne, oedème, etc.) ainsi qu’à l’injection des traitements (rougeur, inflammation, etc.).

Devenir

A l’issue de toutes les procédures, les animaux seront tous mis à mort pour prélèvements de sang et/ou d’organes.

Remplacement

L’utilisation des candidats médicaments étant à visée humaine, dans le domaine de la neuro-oncologie, il est nécessaire de réaliser des études précliniques pharmacologiques non-réglementaires, comme ici des études toxicologiques et d’efficacité pour démontrer et valider sans aucune ambiguïté leur innocuité et efficacité avant les études précliniques réglementaires et les essais cliniques chez l’Homme. Des travaux menés sur des cultures de cellules tumorales et saines ont déjà été réalisées ou sont en cours pour valider les molécules et formulations testées. Pour compléter l’étude, il est indispensable de passer sur un modèle animal mimant les conditions de développement du GBM humain avant de pouvoir tester les molécules sur des patients atteints de ce cancer. Le développement de ce type de modèle (modèle CDX) dans ce projet ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car l'induction de tumeur s'accompagne de modifications physiopathologiques dans un microenvironnement particulier, notamment dans le cas du glioblastome, ne pouvant actuellement pas être reproduites in vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux.

Réduction

L'étude de toxicité permettra de raffiner la dose administrée, et ainsi de réduire le nombre de lot d’animaux à tester dans les études suivantes (études 2, 3 et 4). Une seule dose à la fois sera testée. Ainsi, si la plus haute dose n’est pas toxique, les doses plus basses ne seront pas systématiquement testées. Le nombre de souris immunodéprimées pourra également être réduit au strict minimum en fonction des résultats obtenus chez les souris immunocompétentes. Pour finir, lors de l’étude d’efficacité, seuls les traitements ayant montré la meilleure biodistribution et pharmacocinétique tissulaires seront testés pour réduire le nombre d’animaux. Enfin, ce traitement étant destiné aux hommes et aux femmes, ces études seront d'abord effectuées sur un premier sexe, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux pour le deuxième sexe. Ce nombre n'est pas inclu dans cette saisine mais est estimé à 1526 comparativement à 4640 pour le premier sexe. Le nombre d’animaux choisi par groupe est suffisant pour garantir des données précises, représentatives de l’espèce, et statistiquement exploitables. Il n’est pas utile d’avoir plus d’animaux, mais il est préférable de ne pas en utiliser moins, au risque d’être confronté à des variations entre des animaux d’un même groupe. L’effectif des souris utilisées (4640) est très important, toutefois il est justifié par le nombre de procédures (17) dont la logique de déroulement est clairement établie. Si certaines de ces procédures étaient un échec complet (peu probable et non souhaitable), cela pourrait entraîner un arrêt du projet tel qu’il est établi aujourd’hui et diminuerait le nombre de vies animales utilisées, afin d’éviter de recourir inutilement à des vies animales.

Raffinement

La douleur et l’angoisse de chaque animal seront évaluées par un suivi quotidien. Afin d’évaluer de façon raffiner la souffrance/douleur des animaux tout au long de l’expérimentation, un système de score sera mis en place pour chaque animal et pour chaque paramètre contrôlé. Dans le cas où un animal présenterait un ou des signes de souffrance, un médicament contre la douleur serait administrée jusqu’à ce que ces signes disparaissent. L'atteinte d'un des points limites par un animal impliquera sa mise à mort. Plusieurs personnes seront impliquées dans ce suivi, mais la décision finale sera prise dans les 24h par le porteur de projet. Au fur et à mesure des études précédentes, nous avons pu affiner cette grille et la prise en compte de la douleur animale.

Choix des espèces

Des recherches bibliographiques montrent que la souris est l'espèce la plus utilisée et adaptée pour l’implantation de cellules de GBM, qu’elles soient issues de lignées immortalisés ou de patients. Il s'agit de l'espèce la mieux décrite dans la littérature. Les souris seront utilisées entre 6 et 8 semaines d’âge. Cet âge est majoritairement retrouvé dans les études bibliographiques in vivo sur modèle orthotopique de GBM chez la souris.

192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'anticancéreux (oxaliplatine, paclitaxel, bortézomib, vincristine) pour induire une neuropathie douloureuse, puis subissent chaque semaine des tests comportementaux de douleur (test du von Frey électronique, test d'immersion de la patte), avant un prélèvement terminal du système nerveux. Le porteur reconnaît que l'induction de la neuropathie est une nuisance qu'il qualifie d'"indispensable", et que les anticancéreux réduisent le gain de poids des animaux. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne remplace encore l'animal vivant pour explorer la douleur, la retombée pour les patients restant renvoyée au conditionnel.

Objectifs

La neuropathie périphérique chimio-induite (CIPN) est un effet indésirable classique et dose limitant des anticancéreux neurotoxiques (sels de platine, taxanes, vinca alcaloïdes, bortézomib), qui altère profondément la qualité de vie des patients et dont la prise en charge thérapeutique reste très limité. Aucun traitement préventif ne peut être recommandé et seule la duloxétine est modérément recommandée sur les douleurs associées. En conséquence, les oncologues sont fréquemment contraints de diminuer voire d’arrêter les anticancéreux neurotoxiques lors de l’apparition des premiers symptômes de CIPN. Des travaux récents au sein de notre équipe de recherche ont démontré l’efficacité analgésique du donépézil sur des modèles animaux de CIPN. L’effet analgésique du donépézil (inhibiteur de cholinestérase) implique l’activation des récepteurs muscariniques M2 (m2AChRs) au niveau spinal. Cependant, l’action anticholinestérasique du donépézil pourrait être responsable de l’activation d’autres récepteurs cholinergiques et le mécanisme analgésique des m2AChRs n’est pas totalement connu (à priori inhibition des cellules excitatrices et pronociceptives glutamatergiques). Ainsi, l’objectif de ce projet sera d’évaluer l’implication du système cholinergique (m2AChRs) au niveau spinal et du système nerveux périphérique (ganglions spinaux - DRG) dans des modèles animaux de CIPN : mesure de l’expression génique et de la localisation des récepteurs cholinergiques au niveau spinal et des DRG, et exploration de l’effet analgésique d’agonistes spécifiques des m2AChRs.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d’étudier de nouvelles cibles thérapeutiques des CIPN. Rappelons qu’à ce jour la prise en charge des CIPN est très limitée (aucun traitement préventif et seule la duloxétine modérément recommandée sur les douleurs). Nos précédents travaux ont démontré l’intérêt analgésiques du donépézil sur ces modèles animaux de CIPN, et ont permis la mise en place d’une étude clinique évaluant l’effet analgésique du donépézil chez des patients souffrant de neuropathie induite par l’oxaliplatine. Le projet proposé vise à préciser l’implication des m2AChRs comme nouvelle cible thérapeutique, et dont l’objectif à terme sera de développer des agonistes de ces m2AChRs pour le traitement des CIPN, et qui pourront être testé chez l’homme à moyen terme.

Procédures

Tous les animaux recevront des injections d'anticancéreux ou du véhicule. Le nombre d’injection et leur voie d’administration sera fonction du modèle animal : - Oxaliplatine : 2 injections par semaine (lundi et vendredi) pendant 4 semaines, voie intraveineuse, durée injection de 20 secondes (max) - Paclitaxel : 4 injections (J0, J2, J4, et J7), voie intrapéritonéale, durée injection de 10 secondes (max) - Bortézomib : 5 injections (J0, J1, J3, J4 et J7), voie intrapéritonéale, durée injection de 10 secondes (max) - Vincristine : 5 Injections (J0, J2, J4, J7 et J9), voie intraveineuse, durée injection de 20 secondes (max) Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaire et jusqu’à une semaine après la fin des injections : - Test du von Frey électronique : durée du test pour un animal de 60 minutes (max). Le test en lui-même est beaucoup plus court, mais cette durée correspond à la durée maximale de mobilisation d’un animal (stabulation dans des portoirs (box) individuel pour 24 rats) - Test d’immersion de la patte : durée du test pour un animal 5 minutes (max)

Impact sur les animaux

L’induction de la CIPN chez l’animal sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. La CIPN sera associée à des désordres nociceptifs qui seront évalués dans le cadre du projet (allodynie tactile et thermique). Les administrations répétées d’anticancéreux seront responsables d’une diminution du gain de poids des animaux. A noter que le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations d’anticancéreux (dose en mg/kg), et permettra de contrôler la tolérance des animaux au traitement anticancéreux. A noter que ce type d’étude ayant recours à des tests comportementaux nécessitent un bon état général des animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue des expérimentations, après une sédation profonde et rapide. Car l’objectif sera, in fine, de prélever des échantillons tissulaires du système nerveux central et périphérique afin d’étudier des anomalies d’expression des récepteurs à l’acétylcholine dans une perspective thérapeutique.

Remplacement

Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Des travaux sont en cours sur cellules souches humaines de neurones. Mais pour le moment ces modèles in vitro ne permettent pas encore d'appréhender la complexicité de la physiopathologie des CIPN, qui n'est elle même pas encore élucidée. Enfin, s'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer et évaluer de nouvelles stratégies pharmacologiques et par le biais de tests comportementaux.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au maximum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux. Mais le plus souvent, nosu devons fractionner les études en nombre d'animaux plus petits et avec une approche par bloc de traitement. Cette méthodologie peut permettre de réduire les effectifs d'animaux si par exemple avec n=6 ou 8, les résultats attendus sont significatifs.

Raffinement

Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont eux aussi bien maitrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles nociceptifs seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant les seuils d’allodynie tactile ou thermique (stimulus non douloureux perçu comme douloureux), plutôt que des seuils d’hyperalgésie (stimulus douloureux). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire.

Choix des espèces

Le rat Sprague-Dawley est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les CIPN. D’autres travaux de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche (Ferrier et al. J Neurosci 2015 ; Selvy et al. Biomed Pharmacother. 2022), ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures. Enfin, le rat Sprague-Dawley possède une activité et un comportement tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de test comportementaux. Les animaux auront 5 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 6 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6 semaines est communément choisi pour ce type de projet. A noter que des animaux plus âgés (voire « âgés ») pourraient être pertinents car mieux corrélés à la clinique humaine (cancer = maladie du sénior), mais ces animaux âgés ont un coût important et sont rarement utilisés dans la littérature scientifique.

2 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis des traitements par voie orale et par injections répétées pendant quinze jours, sur des modèles de cancers pédiatriques dérivés de patients. Le porteur situe les retombées dans l'objectif "final" d'augmenter la survie des patients, alors que le prélèvement des tumeurs et des organes après la mort des animaux est immédiat. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le comportement tumoral et conclut que le modèle in vivo reste "indispensable".

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont : i) D’évaluer l’impact des inhibiteurs d’épissage connus ii) Et des nouvelles molécules duales inhibitrices du complexe spliceosome et et histone désacétylase comme immunomodulatrices sur la réponse anticancéreuse dans les cancers pédiatriques. Après plusieurs tests in vitro, nous avons isolé plusieurs molécules candidates et ce, sur plusieurs lignées de cellules murines à l’origine du neuroblastome (8 molécules), d’ostéosarcome (8 molécules), et de rhabdomyosarcome (8 molécules). Dans une première étape nous testerons ces molécules sur des modèles de tumeurs sous cutané ectopique dans des souris immunocompétentes afin de sélectionner les molécules efficaces et les voies d’injections des molécules. Ceci nous permettra d’utiliser un nombre minimal de souris dans ce projet de modèles PDX. Pour cela, nous utiliserons les méthodes et modèles expérimentaux suivants : i) Des souris NSG qui serviront de modèles de souris PDX. Pour cela des biopsies de patients seront utilisés. Nous utiliserons deux neuroblastomes, deux ostéosarcomes, deux sarcomes d’Ewing et deux rhabdomyosarcomes

Bénéfices attendus

Les résultats du projet démontreront si le spliceosome peut être une cible thérapeutique dans les cancers pédiatriques avec comme objectif final l’identification de potentielles combinaisons médicamenteuses capables d’augmenter ultérieurement la survie des patients.Ce projet apportera les éléments précliniques permettant d’évaluer l’effet thérapeutique de nos molécules et de mieux comprendre les mécanismes liés à ces molécules. Afin de modéliser ces modèles tumoraux pédiatriques, nous utiliserons des modèles dérivés des patients (PDX) dont deux neuroblastomes, deux ostéosarcomes, deux sarcomes d’Ewing et deux rhabdomyosarcomes

Procédures

Une injection unique de cellules tumorales sera réalisée pour le developpement des tumeurs pédiatriques (durée 5 minutes). Dans le cas de la voie d'administration per os, les souris seront administrées 2 à 4 fois par semaine pendant 2 semaines (durée 30 secondes). Un prélevement de sang unique, sera réalisé sous anesthésie générale. Les traitements par injection seront faits toutes les 24h, 48h ou 72h et ce durant 15 jours (durée 30 secondes).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables potentiels seront ceux liés à la présence de tumeurs uniques sur le flanc, sous la peau, ainsi que ceux liés aux traitements par injection ou administration orale..

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront euthanasiés pour prélèvements d'organes et de tumeurs post-mortem.

Remplacement

Il n’existe pas actuellement de modèle in vitro permettant d’évaluer les interactions entre les différents compartiments cellulaires (cellules du système immunitaire, cellules tumorales, etc.). Ainsi, la faisabilité et l’efficacité d’une nouvelle approche à visée thérapeutique a recours à un modèle animal. Les modèles cellulaires alternatifs ne permettent pas d'appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents système au sein de l'organisme (systeme vasculaire, immunitaire...), l'utilisation des modèles appliqués in vivo reste donc indispensable. Ces modèles vont à la fois nous permettre d'étudier l'efficacité de nos molécules et leurs liens avec les mécanismes oncogéniques et metastiques des cancers mais également explorer et valider l'efficacitté de thérapies susceptibles d'être utilisées chez les patients.

Réduction

Une étude approfondie de la littérature a été menée avant d’initier ce projet pour s’assurer de l’absence de résultats publiés s’approchant des objectifs de notre étude. Le nombre d’animaux utilisé lors des expériences sera établi de façon à obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux utilisé tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d'utiliser un nombre suffisant d'animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan statistique. Les analyses statistiques seront effectuées en utilisant des tests non-paramétriques dont l'application ne requiert pas la vérification préalable de la normalité incompatible avec les petits échantillons.

Raffinement

Les animaux sont surveillés chaque jour afin de détecter toute modification dans le comportement/déplacement de l'animal. Les zones implantées sont également observées quotidiennement afin de detecter précocement un developpement de la tumeur. Les procédures expérimentales peuvent engendrer une douleur modérée. Pour la limiter, nous avons établie une grille d’observation visant à définir des points limites précoces à partir desquels l’expérience sera arrêtée et cadrant les mesures prises à l’apparition des premiers signes de contrainte/ douleur. Si nous détectons des signes de stress ou de douleur anormaux, nous donnerions un antalgique morphinique pour soulager les animaux. Toutes les injections seront précédées d'une anesthésie locale. Les animaux seront stabulés en groupe, avec accès illimité à la nourriture et à la boisson. Un enrichissement du milieu est également apporté par des sizzlenests et de maisons en cartons.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé en oncologie notamment du fait de l'existence de souches immunodéprimées qui permettent le développement de tumeur d'origine humaine. Nous utiliserons des souris jeunes (animaux âgés entre 4 et 6 semaines au début de protocole) au moment de l'injection des cellules tumorales. Nous travaillons sur des cancers qui atteignent des individus entre l'enfance et l'adolescence. De ce fait, nous serons amenés à utiliser des jeunes animaux âgés de 4 semaines à 6 semaines afin de pouvoir mimer le stade de développement

768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées par voies intraveineuse, sous-cutanée, intra-tumorale et intra-péritonéale, portent une tumeur de mélanome et subissent une radiothérapie interne associée à des immunothérapies. Le porteur indique que la croissance tumorale peut provoquer perte de poids, nécrose ou infection de la tumeur, et qu'une étude de survie ne permet pas de garder les animaux en vie. Il conclut qu'un "modèle syngénique" est indispensable pour étudier la réponse immunitaire, ce qui "impose" selon lui le recours à la souris.

Objectifs

Au cours de ce projet préclinique évaluant différents schémas d’associations de la radiothérapie interne vectorisée (RIV) par le radioligand de la mélanine avec des inhibiteurs de checkpoints immunitaires (ICI), nous chercherons à déterminer quelle séquence de traitement (concomitant ou séquentiel) et quelles modalités (1 ou plusieurs injections de RIV) donnent les meilleurs résultats en terme de survie, de croissance tumorale et de synergie, dans des modèle in vivo de mélanome.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de compléter nos connaissances sur les modifications de laréponse immunitaire antitumorale induite par la RIV et de déterminer la meilleure séquence thérapeutique d’association de la RIV avec l’immunothérapie pour le mélanome métastatique.

Procédures

Sur animal vigile : - Injection intraveineuse veine caudale (1 à 3 injections par animal en fonction des études, 1 minute par injection) Sur animal anesthésié - Injection sous-cutanée (1 injection par animal pour les animaux concernés, 1 minute par injection) - Injection intra-tumorale (1 injection par animal pour les animaux concernés, 1 minute par injection) - Injection intra-péritonéale (4 injections par animal pour les animaux concernés, 1 minute par injection)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus dans cette étude sont principalement liés à la croissance tumorale (perte de poids, altération de l’état général de l’animal, nécrose ou infection de la tumeur, difficulté de mobilisation).

Devenir

Les procédures prévus pour ces études (prélèvement des tumeurs, étude de survie) ne permettent pas de maintenir les animaux en vie à la fin de la procédure.

Remplacement

Les études de l’impact d’un traitement ou d’une combinaison de traitements sur le système immunitaire requièrent des modèles animaux adaptés. En effet, la physiologie globale de l’individu entre en jeu et une étude ex vivo ou in vitro ne peut représenter la complexité du vivant. Notamment, la mise au point de nouvelles stratégies de combinaisons de traitements anticancéreux demande des études précliniques sur des modèles animaux. Les immunothérapies anticancéreuses requièrent de plus la présence du système immunitaire, imposant donc le recours à un modèle syngénique.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum tout en permettant l’exploitation des résultats. Ce nombre a été calculé afin de garantir une signification statistique à l'étude menée. Dans la procédure 1, des groupes contrôle communs à différents modèles ont également été prévus. De plus, la procédure 2 permet également de réduire le nombre d’animaux en ne testant qu’une seule hypothèse en procédure 3. Le nombre total d’animaux est de 736 souris maximum sur une période de 5 ans.

Raffinement

Les modèles animaux choisis sont reconnus par la littérature pour reproduire les caractéristiques de la pathologie humaine. Des méthodes sont utilisés afin d’optimiser au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimisées (portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, densité animale – minimum 3 animaux/cage-, enrichissement de milieu avec coton pour la nidification, bâtonnet de bois pour ronger et cabane de cachette). De façon usuelle, les cages (litière, cage, grille, couvercle et biberon) sont changées toutes les semaines. Une surveillance quotidienne des animaux permettra de déceler les premiers signaux de stress, de douleur ou d'inconfort pour l'animal qui pourront être améliorés par l'administration d'antalgiques (Rimadyl, 5mg/kg en sous-cutanée, 1 fois par jours pendant 5 jours maximum) avant l'atteinte des points limites définis (perte de poids supérieure à 20% du poids maximal observé, prostration, hérissement du poil, volume tumoral, aspect du point d’injection……). Si aucune amélioration n’est observée, l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle souris est adapté pour les études fondamentales et appliquées de développement et traitements des cancers. Un modèle syngénique est indispensable pour étudier in vivo une réponse immunitaire. Les animaux utilisés seront des adultes de 4-5 semaines ayant atteint leur maturité sexuelle afin d'éviter l'influence des variations hormonales liées à la puberté.

4 776 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des injections quotidiennes de molécules anticancéreuses pendant trois semaines, avec un suivi de la tumeur trois fois par semaine. Le porteur indique que les traitements peuvent provoquer perte de poids, diarrhée et cachexie, et que la croissance tumorale peut entraîner des métastases. Il affirme que le recours à des animaux vivants est "indispensable" parce que la réponse immunitaire à la chimiothérapie ne serait pas reproductible in vitro.

Objectifs

Les lysosomes sont des compartiments cellulaires impliqués dans la dégradation et le recyclage du matériel de la cellule. Les lysosomes ont un rôle important dans le bon fonctionnement des cellules mais une fois endommagés ils peuvent déclencher la mort des cellules. Depuis quelques années, un intéret important est porte en médecine sur les composés qui ont la capacité d’endommager les lysosomes et provoquer la mort des cellules cancéreuses en induisant la perméabilisation de la membrane lysosomale. Nous avons sélectionné in vitro plusieurs nouveaux composés capables d’induire la mort des cellules cancéreuses via la perturbation des lysosomes. Ce projet vise a tester le potentiel anti-cancéreux de ces molécules dans des modèles murins de croissance et vaccination anti-tumorale. Nos objectifs sont : i) déterminer les molécules les plus efficaces dans les modèles tumoraux; ii) étudier la réponse de l’immunité tumorale; iii) explorer l’effet thérapeutique des molécules en monothérapie ou en combinaison avec d’autres thérapies.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique des nouvelles molécules anti-tumorales efficaces dans plusieurs types de cancer en monothérapie et/ou en association avec d’autres thérapies.

Procédures

Toutes les souris de ce projet seront injectées via sous-cutanée (1 fois) avec des cellules tumorales afin d’induire la croissance d’une tumeur. Les injections s.c. seront effectuées sur l’animal anesthésié (via anesthésie gazeuse) pour une durée maximale de 2 minutes. Les traitements anti-tumoraux seront administrés (maximum 1 fois par jour sur 3 semaines) via des injections intra-péritonéales, qui ne provoquent pas de symptômes majeurs et seront effectuées sur l’animal vigile pour une durée maximale de 30 secondes. La mesure des tumeurs s’effectuera sur souris vigiles au moins 3 fois par semaine avec une durée maximale d’une minute à l’aide d’un pied à coulisse.

Impact sur les animaux

Les traitement anti-tumoraux peuvent induire une perte de poids/d’appetit et de la diarrée. Le site des injections pourrait s’infecter. L’induction de la croissance tumorale peut conduire à des effets indésirables (apparition de métastases, cachexie).

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, la réponse du système immunitaire à la chimiothérapie vu sa complexité.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 4776 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs tests statistiques seront utilisés pour comparer les divers groupes de traitements.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie, tapis chauffants,). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Pour nos études, nous utilisons principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé́).

5 568 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales pour développer des tumeurs pédiatriques, puis des traitements par voie orale et par injection pendant une quinzaine de jours, avant d'être mises à mort pour prélever leurs organes et leurs tumeurs, dans une étude de molécules inhibitrices d'épissage contre les cancers de l'enfant. Le porteur limite la description des effets indésirables aux tumeurs sous-cutanées du flanc et aux traitements. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne rend compte du comportement tumoral dans toute sa complexité.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont d’évaluer l’impact de modificateurs de la traduction des protéines comme immunomodulateurs sur la réponse anticancéreuse dans les cancers pédiatriques. Après plusieurs tests in vitro, nous avons isolé huit molécules candidates et ce, sur plusieurs lignées de cellules murines à l’origine cancers très graves de l'enfant.

Bénéfices attendus

Ces résultats démontreront les composants biologiques importants dans la traduction des protéines ont un potentiel dans les cancers pédiatriques avec comme objectif final l’identification de potentielles combinaisons médicamenteuses capables d’augmenter ultérieurement la survie des patients.

Procédures

Une injection unique de cellules tumorales sera réalisée pour le developpement des tumeurs pédiatriques (durée 5 minutes). Dans le cas de la voie d'administration per os, les souris seront administrées 2 à 4 fois par semaine pendant 2 semaines (durée 30 secondes). Un prélevement de sang unique, sera réalisé sous anesthésie générale. Les traitements par injection seront faits toutes les 24h, 48h ou 72h et ce durant 15 jours (durée 30 secondes).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables potentiels seront ceux liés à la présence de tumeurs uniques sur le flanc, sous la peau, ainsi que ceux liés aux traitements par injection ou administration orale.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront euthanasiés pour prélèvements d'organes et de tumeurs post-mortem.

Remplacement

Il n’existe pas actuellement de modèle in vitro permettant d’évaluer les interactions entre les différents compartiments cellulaires (cellules du système immunitaire, cellules tumorales, etc.). Ainsi, la faisabilité et l’efficacité d’une nouvelle approche à visée thérapeutique a recours à un modèle animal. Les modèles cellulaires alternatifs ne permettent pas d'appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents système au sein de l'organisme (systeme vasculaire, immunitaire...), l'utilisation des modèles appliqués in vivo reste donc indispensable. Ces modèles vont à la fois nous permettre d'étudier l'efficacité de nos molécules et leurs liens avec les mécanismes oncogéniques et metastiques des cancers mais également explorer et valider l'efficacitté de thérapies susceptibles d'être utilisées chez les patients.

Réduction

Une étude approfondie de la littérature a été menée avant d’initier ce projet pour s’assurer de l’absence de résultats publiés s’approchant des objectifs de notre étude. Le nombre d’animaux utilisé lors des expériences sera établi de façon à obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux utilisé tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d'utiliser un nombre suffisant d'animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan statistique. Les analyses statistiques seront effectuées en utilisant des tests non-paramétriques dont l'application ne requiert pas la vérification préalable de la normalité incompatible avec les petits échantillons.

Raffinement

Les animaux sont surveillés chaque jour afin de détecter toute modification dans le comportement/déplacement de l'animal. Les zones implantées sont également observées quotidiennement afin de detecter précocement un developpement de la tumeur. Les procédures expérimentales peuvent engendrer une douleur modérée. Pour la limiter, nous avons établie une grille d’observation visant à définir des points limites précoces à partir desquels l’expérience sera arrêtée et cadrant les mesures prises à l’apparition des premiers signes de contrainte/ douleur. Si nous détectons des signes de stress ou de douleur anormaux, nous donnerions un antalgique morphinique pour soulager les animaux. Toutes les injections seront précédées d'une anesthésie locale. Les animaux seront stabulés en groupe, avec accès illimité à la nourriture et à la boisson. Un enrichissement du milieu est également apporté par des sizzlenests et de maisons en cartons.

Choix des espèces

Les modèles murins sont les modèles les plus utilisés pour étudier l’effet des médicaments sur la croissance tumorale. Dans ce projet, nous utiliserons des souris immunocompétentes ce qui nous permettra d’évaluer au mieux les coopérations entre les cellules immunitaires et les cellules tumorales. Nous utiliserons des souris jeunes (animaux âgés entre 4 et 6 semaines au début de protocole) au moment de l’injection des cellules tumorales. Nous utiliserons des souris jeunes afin de pouvoir etudier nos molécules sur des cancers pédiatriques.

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses du sein sous la peau, puis une résection chirurgicale de la tumeur sous anesthésie et un suivi de l'évolution métastatique. Le porteur mène un criblage pan-génomique par CRISPRi pour identifier des gènes régulant la progression métastatique du cancer du sein. La mise à mort sert à prélever les organes et à rechercher les métastases par imagerie et analyse moléculaire.

Objectifs

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent dans le monde (2,26 millions) et malgré les progrès des thérapies, un grand nombre de patientes décède chaque année des suites métastatiques (685,000). La majorité des cancers du sein sont d’origine canalaire, et 15% sont diagnostiquées in situ, c’est-à-dire qu’ils n’ont pas franchi la barrière physique qui les entoure constituée par la lame basale. Au moins un tiers des tumeurs resteraient in situ et bénignes, et près de deux tiers de ces tumeurs évoluant vers un stade invasif. A ce jour, en absence de marqueurs prédictifs de l’évolution vers le stade invasif, les médecins traitent les patientes porteuses de tumeurs in situ comme si elles avaient des tumeurs malignes. Ceci a un coût humain et économique important qui va en augmentant avec les progrès des techniques d’imagerie. En outre, il n’existe pas de traitement spécifique contre la transition in situ-invasif ou la progression métastatique. Il est urgent d’identifier des biomarqueurs prédictifs pour évaluer le risque de transition vers le stade invasif - première étape du processus métastatique - pour éviter un traitement lourd et inutile aux patientes porteuses de tumeurs bénignes. Il est tout aussi nécessaire de trouver des cibles thérapeutiques pour combattre la dissémination des cellules tumorales. Nous souhaitons identifier de nouvelles protéines inhibitrices de l’invasion, dont la réduction de l’expression a une action pro-métastatique. Jusqu’alors, les divers criblages génomiques de nombreux cancers n'ont pas permis d'identifier de mutations somatiques responsables spécifiquement de la progression métastatique. Une raison possible est que l'acquisition des capacités métastatiques, contrairement à la transformation et à la prolifération, serait principalement causée par des mécanismes de régulation épigénétique, post-transcriptionnelle ou post-traductionnelle. Nous proposons de réaliser un criblage in vivo afin d'identifier les gènes dont la répression de l’expression confèrerait aux cellules tumorales des propriétés agressives et métastatiques. Nous utiliserons les métastases générées après xénogreffe de cellules mammaires humaines comme sources pour identifier les ARN enrichis dans les métastases comparées aux tumeurs primaires. Notre modèle d'étude est le cancer du sein mais les gènes identifiés dans notre étude pourraient permettre de dessiner un paradigme pour d'autres cancers invasifs.

Bénéfices attendus

Au travers de ce projet, nous identifierons de nouveaux gènes régulateurs du processus métastatique dont l’étude permettra une meilleure compréhension de la progression de la maladie cancéreuse et de la transition d’une tumeur in situ à une tumeur invasive. Les gènes identifiés serviront à établir une signature du risque de développer des tumeurs invasives pour aider au pronostic et diagnostic. Enfin, les voies de signalisation associées à ces gènes ouvriront de nouvelles perspectives dans la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques des cancers métastatiques.

Procédures

Sur le plan des gestes chirurgicaux prévus dans ce projet, les animaux receveurs de greffe par voie sous cutanée seront soumis à une résection de la tumeur au site initial d’injection. Les procédures expérimentales de transplantation et de résection seront réalisées sous anesthésie, et la mise en place d’une analgésie pré, per et post opératoire sera assurée pour une bonne prise en charge de la douleur chez les animaux. La durée estimée pour la transplantation (de l’induction de l’anesthésie à la greffe) est de 5 minutes par animal. La procédure de résection (de l’induction de l’anesthésie à la phase de réveil sur tapis chauffant) représente 15 minutes par animal. Le retrait des agrafes qui interviendra 10 à 15 jours après l’exérèse des greffons nécessite 5 minutes par animal. En complément de ces approches, dans le contexte du suivi hebdomadaire, les souris feront l’objet d’une mesure du greffon induit. Ce geste basé sur la de préhension nécessite 1 minute par animal. La surveillance de la survenue métastatique par imagerie optique -de l’induction de l’anesthésie à l’acquisition des signaux bioluminescents - est estimée à 10 minutes pour chaque animal

Impact sur les animaux

Les principaux effets délétères attendus portent sur l’induction d’une pathologie cancéreuse chez le modèle murin. Par ailleurs, l’injection sous-cutanée d’une grande quantité de cellules est connue pour engendrer une réaction inflammatoire mais qui est contenue en raison du statut immunodéprimé de la souche murine utilisée. Outre l’application du principe des 3Rs, afin que ces dommages soient réduits à un minimum, nous procéderons par étape tout au long de ce projet et nous nous appuierons sur la mise en place d’une grille de score pour définir une fréquence d’interventions la plus adaptée afin de garantir le bien-être des animaux. L’expérience préliminaire servira de base pour déterminer l’impact de l’injection de 30x10E6 de cellules, évaluer les caractéristiques cinétiques de croissance tumorale et ajuster au mieux le suivi des animaux. Par ailleurs, les souris feront l’objet d’une phase d’acclimatation en vue de leur inclusion dans les procédures expérimentales et seules les manipulations nécessaires seront effectuées. Nous veillerons à conserver les caractéristiques de l’espèce par le maintien des animaux en groupe tout au long de leur stabulation et l’apport d’enrichissement dans les cages pour améliorer leur bien-être.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure en vue de l'investigation tissulaire ex-vivo. L’analyse des tissus (organes) par imagerie optique nous permet d’explorer la présence de métastases. Les foyers tumoraux distants ainsi mis en évidence seront préparés pour l’extraction de matériel biologique en vue de l’identification des gènes associés à l’évolution métastatique de la pathologie par analyse moléculaire.

Remplacement

Le processus métastatique très complexe impliquant l’organe d’origine de la tumeur, les organes receveurs des métastases et les systèmes de circulation des cellules invasives par voie sanguine ou lymphatique ne peut pas encore être reconstitué in vitro. Si la recherche de nouveaux gènes impliqués dans ce processus par un criblage pan-génomique ne peut pas être effectué in vitro, des méthodes complémentaires pourront tout de même être utilisées pour certaines étapes du projet. Sur la base des gènes identifiés in vivo, on utilisera donc des approches in vitro dès que possible et dès qu’elle sera pertinente en vue de disposer de modèles d’études complémentaires notamment en matière de caractérisation moléculaire. In fine ces modèles d’étude complémentaires nous permettront d’utiliser moins de souris.

Réduction

Dans un souci de réduction du nombre d’animaux, le suivi du développement de la pathologie maligne chez les animaux transplantés se fera par des mesures cinétiques utilisant des procédés non invasifs, tels que la mesure des greffons à l’aide d’un pied à coulisse et le recours à l'imagerie optique in vivo par bioluminescence. Tout au long de ce projet, nous procéderons par étape et nous mettrons en place des groupes contrôles pour nous assurer de la pertinence de notre modèle et passer à l’étape suivante.

Raffinement

Afin d’améliorer le cadre de vie des animaux, les besoins physiologiques seront respectés (nourriture et eau ad libitum). Nous optimiserons les conditions d’hébergement des animaux par la présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés, lanières de papier et/ou coton) et par leur maintien en groupes de 3 à 5 afin d’éviter le stress de l’isolement. Les procédures expérimentales de transplantation seront réalisées sous anesthésie, et la mise en place d’une analgésie pré, per et post opératoire sera assurée pour une bonne prise en charge de la douleur chez les animaux. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.

Choix des espèces

Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. L’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de notre approche, permettant la transplantation de cellules d’une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d’une espèce différente (souris). C’est de plus, le modèle le plus fourni en études pour ce qui concerne le domaine de la cancérologie. Les animaux utilisés dans ce projet seront des animaux à l’âge adulte (8-10 semaines) De par notre expérience et selon les données de la littérature, cette fenêtre d’âge est optimale pour la prise de greffe de cellules tumorales chez le modèle murin dans un contexte de xénogreffe.

3 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dont la croissance est suivie deux à trois fois par semaine, la mise à mort intervenant quand la tumeur dépasse 1,2 à 1,5 cm ou s'ulcère, seuils présentés comme des points limites. Le porteur valide de nouvelles lignées de cellules tumorales destinées à être commercialisées auprès de laboratoires travaillant sur des thérapies anticancéreuses. Il affirme que l'interaction entre l'hôte et les cellules tumorales ne peut être reproduite que chez un animal vivant.

Objectifs

Des lignées cellulaires tumorales murines génétiquement modifiées exprimant des cibles humaines sont développées pour valider des thérapies anti-cancer dans des souris de laboratoire génétiquement modifiées ou non. Ces lignées cellulaires permettent de tester les composés spécifiques des cibles humaines sans passer par un composé de remplacement spécifique de la forme murine de la cible. Cet outil doit être validé pour ses propriétés tumorales in vivo, le meilleur clone sera choisi et la fonctionnalité de la cible humaine in vivo doit être démontrée. A la création d‘une lignée cellulaire murine tumorale génétiquement modifiée, différents clones sont obtenus. Ils sont testés in vitro pour leur capacité de croissance, l’expression et la fonctionnalité de la cible humaine d’intérêt. Après ces tests, 2 clones sont sélectionnés pour être testés in vivo. La validation in vivo comporte est en 2 étapes : Une 1ère étape de croissance tumorale en souris de laboratoire génétiquement modifiées ou non, définit le pourcentage de prise tumorale et la cinétique de pousse. Les 2 clones sont comparées à un ou des clones non modifiés de la même lignée. L’expression de la cible d’intérêt dans la tumeur est testée. Sur ces critères, l’un des clones est sélectionné. L’injection de la lignée tumorale ne dure pas plus d’1 minute et le développement tumoral est suivi pendant 2 à 3 semaines La tumeur est mesurée par des techniques ni invasives ni douloureuses et dure au maximum 5 minutes. La 2ème étape valide la fonctionnalité in vivo de la cible humaine exprimée par le clone choisi. C’est une expérience d’inhibition de la croissance tumorale en souris de laboratoire génétiquement modifiées ou non. Une thérapie spécifique de la cible humaine exprimée par la lignée cellulaire est utilisée pour inhiber la pousse tumorale (étape finale de validation). Cette étape comprend l’injection des cellules tumorales et la mesure et des tumeurs dans les mêmes conditions que la 1ère étape. S’ajoute l’administration du traitement pour valider la fonctionnalité de la cible thérapeutique. Son administration prend moins d’1 minute et il est administré au maximum 3 fois/semaine. La règle des 3R sera respectée en limitant le nombre d’animaux au strict nécessaire pour faire les analyses et assurer la pertinence des résultats. Les procédures ne doivent pas entrainer de souffrance aigue et longue. En cas de souffrance, des analgésiques seront administrés. L’environnement des animaux sera enrichi.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de valider in vivo dans des souris de laboratoire génétiquement modifiées ou non des lignées cellulaires murines tumorales génétiquement modifiées pour exprimer des cibles humaines. Ces lignées auront pour application l’évaluation et la sélection de thérapies humaines contre le cancer en évitant de passer par un composé de remplacement spécifique de la forme murine de la cible d’intérêt. Elles seront suite à ce projet (cette validation) commercialisées pour être disponibles pour les laboratoires développant ce type de composés.

Procédures

La nature des procédures inclues dans le projet nécessite l’implantation de cellules tumorales (durée maximum de l’injection 1 minut)e, la pousse de tumeur (durée de 2 à 3 semaines) et leur suivi ( durée maximum de 5 minutes / souris / mesure à raison de 2 à 3 mesures par semaine). Le diamètre tumoral moyen défini comme point limite est de 1,2 cm pour une pousse tumorale sans traitement et 1,5 cm pour une étude thérapeutique. Par ailleurs, toute apparition d’ulcération sur les tumeurs est aussi un critère de surveillance et une ulcération de grade 4 de la tumeur est défini comme un point limite. Dans les 2 cas (diamètre moyen supérieur à 1,2 ou 1,5cm selon les cas ou ulcération grade 4), les animaux seront immédiatement mis à mort. Si des administrations répétées de composés sont réalisées, elles peuvent, selon la voie choisie et si le site d’administration est conservé, conduire à une souffrance passagère. Les effets douloureux devraient être limités à quelques minutes ou heures. L’administration du composé dure environ 1 minute et peut-être réalisé jusqu’à 3 fois / semaine. Dans la mesure du possible, le site d’administration sera changé entre 2 administrations et/ou l’application en local d’une crème anesthésiante sera réalisée afin de limiter la souffrance animale.

Impact sur les animaux

La nature des procédures inclues dans le projet nécessite l’implantation de cellules tumorales (durée maximum de l’injection 1 minut)e, la pousse de tumeur (durée de 2 à 3 semaines) et leur suivi ( durée maximum de 5 minutes / souris / mesure à raison de 2 à 3 mesures par semaine). Le diamètre tumoral moyen défini comme point limite est de 1,2 cm pour une pousse tumorale sans traitement et 1,5 cm pour une étude thérapeutique. Par ailleurs, toute apparition d’ulcération sur les tumeurs est aussi un critère de surveillance et une ulcération de grade 4 de la tumeur est défini comme un point limite. Dans les 2 cas (diamètre moyen supérieur à 1,2 ou 1,5cm selon les cas ou ulcération grade 4), les animaux seront immédiatement mis à mort. Si des administrations répétées de composés sont réalisées, elles peuvent, selon la voie choisie et si le site d’administration est conservé, conduire à une souffrance passagère. Les effets douloureux devraient être limités à quelques minutes ou heures. L’administration du composé dure environ 1 minute et peut-être réalisé jusqu’à 3 fois / semaine. Dans la mesure du possible, le site d’administration sera changé entre 2 administrations et/ou l’application en local d’une crème anesthésiante sera réalisée afin de limiter la souffrance animale. Une dégradation de l’état général de l’animal pouvant se traduire par une modification du comportement, une perte de poids peut se produire. Des critères de points limites seront appliqués afin de limiter la souffrance animale. Les modèles de tumeurs liquides sont connus comme plus aggressifs et la survillance des animaux pour ces modèles sera renforcée.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de permettre des analyses sur les différents organes et complétés les observations faites sur le sang au cours de la procédure.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative non animale pour ce projet car le projet est de valider les propriétés tumorales des lignées murines génétiquement modifiées in vivo pour leur utilisation ultérieure en modèles murins. L’interaction complexe hôte/cellules tumorales ne peut être mimée que dans le contexte d’un animal vivant complet pour valider les lignées tumorales développées.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par lot est calculé pour obtenir des résultats qui soient statistiquement interprétables et en tenant compte de la variabilité potentielle de la taille des tumeurs au sein d’un même groupe afin d’obtenir des résultats exploitables et ne nécessitant pas la répétition de l’expérience utilisant des animaux additionnels. Les volumes de prélèvements de sang seront limités pour obtenir la quantité nécessaire mais sans excès de sérum afin de faire les mesures voulues. Cela doit permettre de prélever plusieurs fois le même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. Dans la mesure du possible, nous limiterons les groupes contrôle, sans impacter pour autant l’interprétation de l’expérience. En fin d’étude, à la mise à mort des animaux, plusieurs organes pourront être prélevés pour faire diverses explorations et ainsi mutualiser l’utilisation des animaux pour explorer plusieurs questions et paramètres au sein de la même expérience et ainsi limiter le nombre global d’animaux utilisés pour répondre à la question scientifique posée.

Raffinement

Dans le cadre des études décrites ici, les animaux seront surveillés quotidiennement. Une crème anesthésiante pourra être appliquée au site d’injection en cas d’injection répétées sans changement de site et dans la mesure du possible, les injections répétées seront faites en changeant réguDans le cadre des études décrites ici, les animaux seront surveillés quotidiennement. Une crème anesthésiante pourra être appliquée au site d’injection en cas d’injection répétées sans changement de site et dans la mesure du possible, les injections répétées seront faites en changeant régulièrement de site d’injection pour limiter la douleur. Cette même crème pourra être appliquée pour les prélèvements sanguins répétés. Là encore le site de prélèvement voire la voie pourront être modifiés dans la mesure du possible et en cas d’apparition de lésion cutanée et de dommages au niveau de la veine prélevée. En cas de lésion, des soins seront réalisés (désinfectant et cicatrisant cutané) et l’évolution sera surveillée avec application des points limites le cas échéant. Les volumes et diamètres tumoraux seront mesurés 2 à 3 fois par semaine et les souris présentant une tumeur proche du diamètre moyen limite de 1,2 ou 1,5 cm selon le contexte de l’étude et/ou un début d’ulcération de la tumeur seront plus particulièrement surveillées au quotidien. Un analgésique pourra être administré à toute souris présentant un signe de souffrance (changement de comportement, de l’aspect de la fourrure, …etc…).

Choix des espèces

Le rongeur par sa taille et sa manipulation aisée, est un modèle de choix pour l’humanisation de certaines cibles thérapeutiques. Aujourd’hui les conditions zootechniques et le niveau d’ingénierie génétique sont tels que la construction à façon de lignées présentant l’humanisation d’une ou plusieurs cibles thérapeutiques est possible. En correspondance, des lignées cellulaires murines tumorales humanisées pour les cibles d’intérêt notamment en immuno-oncologie sont créées. Ces cellules doivent être validées dans des modèles de souris afin de permettre l’étude préclinique de nouvelles thérapies. Les souris de laboratoire génétiquement modifiées ou non seront utilisées dès l’âge de 6 semaines et jusqu’à un âge d’environ 16 semaines, et au maximum 20 semaines. En effet, il faut que les souris inclues dans ces études soient suffisamment matures notamment d’un point de vue du système immunitaire pour que les résultats observés soient pertinents.