Cancers

316 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules leucémiques leur sont transplantées par voie intraveineuse, puis elles reçoivent trois injections de molécules ou d'anticorps, pour tester de nouveaux traitements de la leucémie aiguë lymphoblastique, un cancer surtout pédiatrique. Le porteur décrit un point limite tardif, l'animal cessant de s'alimenter et présentant une pâleur liée à l'aplasie avant d'être euthanasié. Il indique avoir testé les composés in vitro au préalable et affirme que les études précliniques exigent le modèle murin.

Objectifs

La leucémie est un cancer des cellules précurseurs du tissu hématopoïétique caractérisé par un blocage de maturation et une prolifération excessive des cellules appelées blastes. La Leucémie Aiguë Lymphoblastique (LAL) concerne les cellules de la lignée issue du progéniteur lymphoïde. Elle représente environ 1,5 nouveau cas pour 100000 habitants par an, soit environ 1000 nouveaux cas par an en France. Elle se déclare en majorité chez l’enfant de 2 à 5 ans, 75% des malades ont moins de 18 ans, et représente 30% des cancers de l’enfant. La LAL est une maladie hétérogène qui touche les précurseurs des lymphocytes T ou B dans respectivement 25% et 75% des cas. Nous disposons de plusieurs modèles in vitro et in vivo incluant des xénogreffes de LAL-T et LAL-B issues de patients. Malgré les améliorations du traitement des LAL, les taux de rechute, de l’ordre de 25%, restent élevés avec des chances de survie faible, inférieures à 30%. Ainsi, pour réduire l’intensité de la chimiothérapie et traiter avec succès les patients en rechute, il est encore nécessaire de développer de nouvelles thérapies.

Bénéfices attendus

En effectuant des expérimentations in vitro sur nos modèles de leucémies (culture cellulaire), nous avons identifié trois nouveaux composés qui bloquent la prolifération des cellules cancéreuses. Après avoir validé in vitro leurs efficacités, nous souhaitons maintenant tester leurs efficacités sur nos modèles murins in vivo lors d’études précliniques. Les bénéfices attendus du projet concernent donc la découverte de nouvelles drogues et stratégies thérapeutiques dans le traitement des Leucémies Aiguës Lymphoblastiques (LAL).

Procédures

Les animaux seront soumis à des transplantations de cellules leucémiques par des injections intra-veineuses (I.V.) (une seule injection est prévue par souris, durée de 20 minutes). Après la transplantation, des injections intra-veineuses (I.V.) d’une molécule chimique ou d’un anticorps agoniste ou d’immunoliposomes (3 injections par souris sont prévues, à J+15, J+20, J+25 , durée par injection de 20 minutes). Un prélèvement de sang à partir de la veine de la queue (un seul prélèvement par souris, durée de 15-20 minutes) sera réalisé à J+35 jours après la transplantation.

Impact sur les animaux

Les animaux vont développer des cancers (leucémies), avec une multiplication proliférative des cellules leucémiques lymphoblastiques dans la moelle osseuse, le sang et la rate des animaux. Un point limite est fixé, il correspond à un état de fatigue de l’animal qui ne s’alimente plus et qui présente une couleur pâle de la peau au niveau des oreilles et aux extrémités des pattes avants et arrières. Quand l’animal présente des signes de souffrance, n’explore plus son environnement, ne s’alimente plus, est replié sur lui-même, montre des signes d’aplasie, et couleur pâle de la peau au niveau du museau et des oreilles, cela veut dire qu’il y a une aplasie trop importante consécutive au développement de la leucémie qui a alors atteint un stade trop avancé. Dès que ce point limite est observé, l’animal sera euthanasié.

Devenir

Dès que les souris développent les symptômes de la leucémie (point limite identifié), elles seront anesthésiées avec l’Isofluran, suivi d’une mort par dislocation cervicale.

Remplacement

Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler sur des cellules ou des tissus (in vitro). Le recours aux modèles in vitro doit être l’objectif du chercheur si son expérimentation le permet. La molécule chimique, l’agoniste et les immunoliposomes que nous allons tester dans ce projet préclinique ont d’ores et déjà été testé in vitro sur des méthodes alternatives ; sur des cellules primaires isolées de patients, ainsi que sur des lignées cellulaires. Ceci nous permet de limiter le nombre des animaux utilisés dans ce projet.

Réduction

Dans ce projet, nous allons diminuer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche par : la limitation aux seules expériences considérées comme absolument indispensables. S’il est essentiel d’utiliser le plus petit nombre d’animaux possibles, il faut néanmoins éviter que cet effort de réduction nuise à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a alors été intégrée à la construction de ce projet. Pour les courbes de survie, nous utiliserons des groupes de 7 souris afin d’effectuer des tests statistiques, pour les tests sur la viabilité cellulaire, nous utiliserons des groupes de 5 souris afin de réaliser des tests statistiques.

Raffinement

Afin de réduire, supprimer ou soulager la douleur ou la détresse des animaux, et ainsi d’améliorer leur bien-être, en amont des expériences, nous allons planifier les protocoles pour éviter le stress, nous allons aussi planifier et établir les points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure. Ces informations seront par ailleurs transmises au personnel de l’animalerie. Nous avons donc prévu la réduction de la durée de nos études précliniques dès que ce point limite est observé.

Choix des espèces

Pour qu’un nouveau traitement puisse être commercialisé, il est nécessaire de mener des études précliniques et cliniques, afin de prouver son efficacité, d'optimiser les dosages mais aussi d'identifier ses effets indésirables possibles. Les études précliniques nécessitent d’avoir recours à des animaux. Nous disposons d’échantillons de cellules leucémiques provenant de patients que l’on peut transplanter à des souris immunodéficientes. Quelques semaines après l’injection, les cellules leucémiques humaines sont présentes dans la moelle osseuse et la rate des souris qui constituent un modèle d’étude reproduisant la physiopathologie de cette maladie. Ces études ne peuvent se réaliser que dans le modèle murin ; Souris (Mus musculus) L’hématopoïèse et la leucémogénèse des souris (mus musculus) est celle qui se rapproche le plus de l’homme. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules hématopoïétiques saines et leucémiques.

396 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale de cellules cancéreuses pour développer une carcinose péritonéale, puis un traitement par injection ou par aérosol pressurisé sous anesthésie, avant une mise à mort par ponction cardiaque. Le porteur affirme que les animaux ne souffrent pas de la maladie et signale un risque de mortalité lié à la laparotomie du groupe traité par PIPAC. Il conclut que les expérimentations in vitro ne permettent pas de représenter la complexité d'un organisme vivant.

Objectifs

La carcinose péritonéale est associée à un mauvais pronostic avec une survie médiane sans traitement de 5 mois. Le traitement à visée curative de la carcinose péritonéale repose sur la chirurgie de réduction tumorale qui a pour but de retirer toute la maladie macroscopique suivie de la chimiothérapie hyperthermique intrapéritonéale CHIP (c’est-à-dire le traitement d’une chimiothérapie chauffée à 43°C directement dans l’abdomen qui a pour but d’agir sur les nodules microscopiques). Ce traitement est très efficace, le taux de survie à 5 ans est alors de 45- 51%, avec une médiane de survie de 41 mois. Cependant, ce protocole comporte un risque important de mortalité et de morbidité. C’est pour cela que notre unité a choisi de s’intéresser à une alternative à ce traitement. Nous nous sommes intéressés aux Vésicules extracellulaires (VEs) dérivées des cellules souches car il a été montré que les VEs chargées en mTHPC (molécule utilisée en thérapie photodynamique pour l'activation des macrophages; dans notre projet nous utiliserons de la chimiothérapie dans les VEs) avaient une plus grande affinité pour les nodules de carcinose alors que la forme libre de mTHPC ciblait tous les tissus. Le mTHPC (meta-tetra(hydroxyphenyl)chlorin) a été utilisé dans une étude précédente pour montrer l'efficacité des VEs. De plus, nous nous sommes aussi intéressés à la grande avancée depuis 15ans dans le traitement des carcinoses péritonéales : la technique PIPAC « Chimiothérapie Intra- Péritonéale Pressurisée par Aérosols » qui consiste à délivrer pendant une coelioscopie, au bloc opératoire, une chimiothérapie pour contrôler une carcinose péritonéale et peut être rendre des cas opérables secondairement. Cette méthode s’est avérée améliorer la biodisponibilité locale de la chimiothérapie dans les nodules péritonéaux par rapport au lavage péritonéal classique. Aussi, la concentration en chimiothérapie utilisée serait moins importante. C’est pourquoi, l'objectif est de comparer l’effet de cette technique PIPAC à la simple injection en intrapéritonéale pour l’administration des VEs chargées en chimiothérapie comparée à la forme libre sur l’évolution de la carcinose péritonéale d’origine colique et ovarienne.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus seraient de trouver une alternative au traitement classique de la carcinose péritonéale (chirurgie de cytoréduction suivie d'une CHIP (chimiothérapie hyperthermique intrapéritonéale) qui ne peut être pratiqué sur tous les patients. De plus, ce traitement alternatif engendrerait moins d'effets secondaires car la quantité en chimiothérapie serait moins importante et l'utilisation des VEs permettrait une thérapie ciblée sur les cellules cancéreuses.

Procédures

Les souris vigiles seront soumis à une injection de cellules cancéreuses en intrapéritonéale (1 fois 30 secondes). Elles seront soumises à un traitement soit par injection intrapéritonéale (1 à 2 fois par semaine 30 secondes) (de la chimiothérapie sous forme libre ou dans le VEs) soit par PIPAC (de la chimiothérapie sous forme libre ou dans le VEs) (1 fois 30minutes) sous anesthésie générale (une injection sous-cutanée de buprénorphine (1 fois 30 secondes) puis injection intrapéritonéale d'un mélange kétamine (100mg/kg) zylazine (10mg/kg) (1fois 30 secondes). Puis sous anesthésie, ils auront un suivi non invasif par bioluminescence pour suivre l'évolution tumorale (3 fois 20 minutes pour les bal/c; 12 fois 20 minutes pour les C57BL/6). A la fin de l'expérience elles auront une injection sous-cutanée de buprénorphine (1 fois 30 secondes) puis 30 minutes après elles seront sous anesthésie générale (isoflurane à 30%) pour réaliser un prélèvement intracardiaque de sang qui permettra une analyse postmortem.

Impact sur les animaux

A la suite de l'injection intrapéritonéale des cellules cancéreuses, les souris développeront une carcinose péritonéale qui sera suivie au cours du temps par bioluminescence car les cellules injectées expriment la luciférase. Ce suivi sera indolore mais peut engendrer un stress pour l'animal. Aussi, d'après notre expérience sur les modèles de carcinose péritonéale, les animaux ne souffrent pas de la maladie et le suivi par bioluminesce nous permettra d'arrêter la maladie avant qu'elle n'évolue trop. Enfin, nous pourrons observer un risque de mortalité chez les souris qui auront la PIPAC car nous devrons effectuer une laparotomie et, la procédure de PIPAC dure 30 minutes, alors que les autres groupes recevront une simple injection intrapéritonéale. C'est pour cela que les groupes qui auront la PIPAC seront composés de 12 souris alors que les autres seulement de 10 souris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à J14 ou à 12 semaines post-injection des cellules CT26-luc ou ID8-luc respectivement par ponction cardiaque puis dislocation cervicale sous anesthésie générale. Ce sera un prélèvement total de sang pour des analyses post mortem; mais aussi de tissus pour être analysés par le service d’anatomopathologie.

Remplacement

Pour le remplacement, nous ne pouvons remplacer le modèle murin car pour tester un éventuel traitement (ici analyser l’efficacité de la PIPAC et des VEs chargées en chimiothérapie) les expérimentations in vitro ne permettent pas de représenter la complexité d’un organisme vivant. Seul l'évaluation de l'effet de la chimiothérapie sous forme libre ou dans les VEs sera analysée in vitro sur les cellules. L'effet d'un traitement sur une monocouche de cellules cancéreuses in vitro nous permet de montrer l'efficacité de ce traitement sur ce type cellulaire mais le traitement devra être étudier in vivo pour être sûre de son efficacité dans un organisme vivant où il y a différents types cellulaires, et différents tissus qui seront touchés.

Réduction

Nous n'avons pas effectué de tests de puissance mais en dessous de 7 animaux par groupe, du fait des variations de nos modèles ou vitesse de propagation de la maladie il y a trop peu de données pour avoir un résultat solide. Compte tenu de notre expérience sur le modèle et de la variabilité observée, un nombre minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire. , 12 quand il y a un risque de mortalité lié à la procédure réalisée. Ce sont des règles de bonne pratique pour toutes expériences en oncologie sur l’animal, utilisant des xenogreffes. Aussi, nous allons utiliser deux groupes de souris contrôles pour 4 groupes de traitement. Cela permettra de diminuer le nombre d'animaux. Enfin, le suivi par bioluminescence permet également une réduction du nombre d'animaux car cette technique permet un suivi longitudinal sur le même animal sans sacrifice à des temps intermédiaires.

Raffinement

Les animaux disposeront une période d'acclimation de 5 jours minimum et seront observés quotidiennement. Différents points limites seront particulièrement surveillés tels que la perte de poids, le comportement (yeux fermés, dos voûté, isolement), l’apparence physique (automutilation, plaies) et la gêne pour se déplacer qui seront notifiés dans un cahier de suivi des animaux 2 fois par semaine. Les souris seront hébergées en portoir ventilé avec alimentation standard classique Harlan 20.16) et eau stérile ad libitum. Cycle nycthéméral 12h jour/12h nuit Température : 22°C Aussi, les souris disposeront d’enrichissement tels que maison rouge, nids en papier kraft ou buchette de bois à ronger pour leur permettre d’exprimer tout le comportement social normal d’une souris et ainsi améliorer leurs conditions d’hébergements. En cas d’atteinte des points limites, ils seront alors exclus de l'expérience dans les 24heures.

Choix des espèces

Il s’agit de souris femelles immunocompétentes (BALB/c ou C57BL6). Ces types de souris sont utilisés largement dans la recherche en cancérologie pour sa capacité d’incrémenter l’incidence tumorale après injection des cellules cancéreuses. Nous utiliserons des BALB/c pour créer une carcinose colique (lignée cellulaire CT26) et des C57BL6 pour créer une carcinose ovarienne (lignée cellulaire ID8). Les souris seront utilisées à l’âge de 7-8 semaines pour ne pas interagir avec les processus de vieillissement et pour qu’elles ne soient pas trop jeunes pour supporter la chimiothérapie.

530 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe de cellules tumorales de mélanome sous la peau, avec prélèvements de sang et de selles, pour tester l'effet de métabolites du microbiote sur la réponse à l'immunothérapie, avant d'être tuée pour prélever ses organes. Le porteur indique que l'immunothérapie ne bénéficie qu'à une minorité de patients et présente ce traitement comme "incontournable". Sur le remplacement, il répète qu'un système immunitaire ne peut être reconstitué in vitro et juge le recours à l'animal "indispensable".

Objectifs

L’immunothérapie est désormais incontournable dans la prise en charge des cancers du mélanome, du poumon et du rein. Ce traitement est basé sur la stimulation des défenses immunitaires de l’organisme favorisant la reconnaissance et la destruction des cellules cancéreuses. Bien qu’elle soit attractive, l’immunothérapie présente une efficacité restreinte, ne bénéficiant qu’à une minorité de patients répondeurs (35 %). Il est donc urgent de trouver de nouveaux biomarqueurs impliqués dans cette non-réponse à l'immunothérapie et d'en comprendre les mécanismes de résistance associés. Ce projet permettrait d'améliorer l'efficacité de l'immunothérapie des individus non-répondeurs à et in fine à en limiter la progression du cancer. Des études récentes suggèrent que le microbiote de l'hôte, c'est à dire l'ensemble des microorganismes de notre organisme, conditionne cette réponse immunitaire lors d'une l'immunothérapie et est indispensable à l'obtention d'un prognostique favorable du patient. Certains de ces effets bénéfiques du microbiote intestinal ont été attribués aux espèces bactériennes de l'hôte. Cependant, une simple corrélation de ces bactéries a été associée à une réponse efficace, sans démontrer leur causalité et les mécanismes associés. À l'heure actuelle, la métabolomique, est science récente qui permet d'étudier les métabolites issus de l'organisme et est utilisée pour identifier les métabolites, biomarqueurs d'impact sur le métabolisme complexe du patient et sur l'immunothérapie. Dans ce projet, nous sommes intéressés au métabolome de 3 cohortes de patients atteints de mélanome, recevant une immunothérapie. L’analyse du métabolome du sérum de patients hyper-répondeurs à l’immunothérapie et avec prognostique favorable, a permis d’identifier 17 métabolites d'origine de l'hôte et du microbiote. Basés sur ces résultats, l’objectif de notre projet est i) d’évaluer et valider in vivo l’effet de ces métabolites sur la croissance tumorale dans des modèles préclinique du mélanome, et d’en identifier les mécanismes métaboliques hôtes-microbiens associés, et ii) déterminer l’effet des meilleurs métabolites immunostimulants sur l'efficacité des agents immunothérapeutique dans le mélanome.

Bénéfices attendus

Ce projet sur les métabolites immunostimulateurs associé au mélanome et leur rôle potentiel dans l'efficacité de réponse à l'immunothérapie permettra: 1) de valider et de caractériser fonctionnellement les empreintes du microbiome intestinal associées au cancer et à l'immunothérapie 2) d'évaluer une pertinence clinique pour le pronostic des patients 3) développer des outils de diagnostic qui pourraient enrichir l'arsenal oncologique pour la prévention, la prédiction et la personnalisation de la thérapie du cancer.

Procédures

Au cours de l’expérimentation, nous prévoyons 2 prélèvements fécaux/souris récoltés de manière naturelle (lors de la prise de la souris engendrant une défécation naturelle) (2 à 3 fèces/ souris), au Jour 7, et lors de la fin de la procédure destiné à l'analyse de la composition du microbiote, métabolome, durée 10 secondes. Nous prévoyons également 2 prélèvements de sang/souris : sur souris vigiles après anesthésie locale (lidocaïne) à Jour 7, durée 5 minutes, , lors de la fin de la procédure pour l'étude du métabolome de l'hôte. Injections de cellules tumorales sous anesthésie générale: durée 2 minutes (une par animal).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont liées aux injections et prises de sang, ainsi qu'à la présence de tumeurs greffées par voie sous-cutanée.

Devenir

Les souris seront euthanasiées afin de prélèver différents organes pour analyse du métabolome et du microbiote intestinal.

Remplacement

Il est maintenant indispensable de valider leur effet anti-cancéreux et sur l’immunothérapie à l’échelle de l’organisme entier, de façon à prendre en compte les interactions complexe de la réponse immunitaire antitumorale, celle de l’hôte et du microbiote intestinal, d’où la nécessité d’utiliser un modèle animal. Ce projet pourra ainsi permettre d’améliorer l’efficacité des immunothérapies des non-répondeurs par l’intermédiaire de nouveaux biomarqueurs métaboliques. L’analyse de l’impact des métabolites sur le métabolisme de l’hôte et sur son système immunitaire nécessitant l’utilisation d’un organisme complexe, le recours à l’animal est indispensable. En effet, utiliser uniquement une approche in vitro exclurait la prise en compte des possibles interactions intervenant chez l’hôte. Nous avons besoin d’un modèle mimant le plus fidèlement possible l’environnement tumoral et le système immunitaire. Comme il est actuellement impossible de reconstituer un système immunitaire in vitro/ex vivo du fait de sa complexité, il est absolument nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire a été défini à l’aide d’études précédentes publiées dans la littérature scientifique, mais aussi grâce à un test de puissance afin de solliciter un nombre minimum d’animaux, tout en gardant la possibilité d’obtenir des résultats statistiques exploitables. Le nombre de groupes proposé inclut les groupes contrôles nécessaires. L’étude est divisée en plusieurs procédures séquentielles et sera arrêtée si une des procédures invalide l’hypothèse de travail ; le nombre de souris sera ainsi diminué. Par ailleurs, une veille bibliographique constante sera faite pour éviter toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature. Les expérimentations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal. Durant l’expérimentation, l’état de santé des animaux sera surveillé quptodiennement permettant l’intervention rapide en cas de problème. La mise en place d’une grille de suivi clinique et des points limites qui seraont strictement appliqués permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques: i) La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue, ii) La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Enfin dans la littérature, la souris C57Bl6/J s’avère être la souche la plus utilisée pour l’analyse du métabolisme et l’étude de l'interaction du microbiote intestinal sur son métabolisme. Les animaux seront utilisés au stade adulte (6-9 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire et le métabolisme est mature (développement thymique achevé). Ceci permet alors d’obtenir un modèle animal qui reflète au mieux la physiologie chez l’Homme adulte, âge où sont suivi est important. De plus, les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale, une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l’expérimentation.

2 520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris, d'une lignée fortement immunodéprimée, reçoit un conditionnement au busulfan puis des injections de cellules souches sanguines humaines, avant d'être tuée pour prélever moelle osseuse, rate et thymus. Le porteur indique que le busulfan entraîne une perte de poids et que de rares animaux développent une réaction du greffon contre l'hôte conduisant à leur euthanasie. Sur le remplacement, il affirme que le nichage des cellules souches dans l'organisme ne peut être reproduit in vitro.

Objectifs

Notre laboratoire a pour mission le développement et la conservation des greffons contenant des cellules souches sanguines humaines. Ces greffons sont utilisés pour le traitement par thérapie cellulaire de patients atteints de pathologies hématologiques telles que certaines leucémies, mais aussi dans certains cas, pour le traitement de cancers solides tels que le cancer du sein. Les procédures de greffe mises en oeuvre nécessitent une recherche permanente visant à améliorer et faciliter les procédures de greffe et à accroître l'efficacité de la greffe. L’objectif de ce projet vise l’optimisation de la qualité des greffons ainsi que le développement d'une nouvelle génération de greffon de cellules souches. Il s’agit principalement de préserver, voire augmenter, la capacité fonctionnelle (capacité de greffe) des greffons au cours des différentes étapes de préparation de ces greffons du donneur au receveur et notamment lors des protocoles de conservation, protocoles d’expansion, ou de manipulation géniques de ces greffons. Pour atteindre ces objectifs, il est indispensable de pouvoir analyser les cellules qui composent les greffons et notamment les cellules souches, et de pouvoir les étudier d'un point de vue fondamental.

Bénéfices attendus

Nos recherches sur les greffons hématopoïétiques et sur les cellules souches hématopoïétiques en particulier permettront une meilleure connaissance des mécanismes de régulation des CSH (survie, autorenouvellement, différenciation) d'un point de vue fondamental. Ces connaissances seront appliquées afin de (i) optimiser les conditions de conservation des greffons hématopoïétiques avant leur infusion aux patients, (ii) optimiser les protocoles d'expansion des greffons hématopoïétiques, et (iii) développer une nouvelle génération de greffons (à partir d'une source de cellules encore inexploitée (cellules du sang périphérique en homéostasie)).

Procédures

Les souris utilisées dans se projet seront soumises à des injections réalisées à l'aide d'une seringue et d'une aiguille. Il s'agit de piqûres réalisées en quelques secondes (minimum 5 secondes - maximum 90 secondes). Chaque souris subira un maximum de 3 piqûres réalisées à au moins 24h d'intervalle.

Impact sur les animaux

L'administration de bulsulfan pour le conditionnement des souris induit une légère perte de poids (

Devenir

A l'issue de la procédure, il est nécessaire de récupérer les moelles osseuses, la rate et le thymus des souris afin d'évaluer la prise greffe par les cellules injectées initialement. L'ensemble des souris est donc euthanasié afin de procéder à ces analyses et à l'obtention des résultats expérimentaux.

Remplacement

L’absence d’alternative à l’expérimentation animale pour l’ensemble de ces études est justifiée par le fait que la greffe des cellules souches du sang (« nichage » et développement chez l’hôte) fait intervenir des micro-environnements cellulaires et moléculaires extrêmement complexes et impossibles à reproduire en culture in vitro. Néanmoins, dans le cadre de ce projet, toutes les expérimentations in vitro (notamment analyses phénotypiques ciblant des populations cellulaires enrichies en CSH) seront réalisées chaque fois que possible.

Réduction

Pour chaque greffon utilisé et pour chacune des conditions expérimentales testées, le nombre d’animaux injectés est fixé à 7 afin d’obtenir les valeurs minimales nécessaires à la réalisation de tests statistiques lors de l’analyse des animaux. Afin d'éviter toute utilisation inutile d'animaux, les greffons sont testés pour leur contenu en cellules immatures (contenant potentiellement les cellules souches) sur des critères phénotypiques et/ou métaboliques afin d’estimer la qualité du greffon et d’éviter des injections inutiles en cas de greffons dont la qualité est jugée insuffisante.

Raffinement

Afin de respecter la notion de raffinement, le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort. Les souris recevront notamment de la nourriture enrichie dès le départ de l'expérimentation qui est marquée par la 1ère injection de busulfan (conditionnement des animaux avant greffe). Cette nourriture a pour but de limiter la perte de poids liée à la perte d'appétit elle-même liée à l'administration du busulfan. Ainsi pour une perte de poids attendue de 20% sans nourriture enrichie, cette perte est limitée à 10% grâce à l'utilisation d'une nourriture enrichie. Les souris seront hébergées en animalerie A2, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques. Elles seront hébergées en cages de type 2L en présence de leur congénères (à raison de 5 souris par cage) afin de maintenir leurs relations sociales. Les conditions d’hébergement sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids de « woodwoll ». S'agissant des animaux qui reçoivent une injection de cellules par voie intrafémorale sous anesthésie générale, une analgésie préventive est également administrée quelques minutes avant l’anesthésie générale afin de limiter toute éventuelle douleur au réveil. Tous les animaux concernés par l’injection intra-fémorale sont suivis avec une attention particulière jusqu’à leur réveil et jusqu’à la reprise d’une activité normale (locomotion, prise de boisson, relation avec les congénères…) qui intervient généralement dans les 5 à 10 minutes suivant le réveil.

Choix des espèces

Pour cette étude seront utilisés des souris NSG. Cette souche de souris est très largement utilisée dans la recherche sur les cellules souches hématopoïétiques en raison de sa capacité à permettre la génération d'une hématopoïèse humaine à partir des cellules souches injectées. Cette capacité est obtenue grâce à la forte immunodépression de cette souche de souris. Elle représente donc un modèle pertinent et efficace pour l'étude et la mise en évidence de cellules souches humaines ; ce modèle permet d'extrapoler la greffe chez l'humain. Les souris seront utilisées à l'âge adulte de 8 semaines à 12 semaines de vie. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l´inoculation de cellules.

16 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris porteuse d'une tumeur du foie reçoit cinq injections intraveineuses et neuf séances d'imagerie sous anesthésie sur quatre semaines, pour vérifier si des nanoparticules atteignent la tumeur. Le porteur indique que la croissance de la tumeur constitue une source de souffrance possible, se traduisant par la prostration et une grosseur abdominale, les souris étant ensuite tuées pour prélever le foie. Sur le remplacement, il affirme que les essais in vitro sur lignées cellulaires doivent être complétés par un test in vivo qu'il juge "indispensable".

Objectifs

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) représente 95% des types de cancer du foie. Il est au cinquième rang mondial en terme d’incidence et au deuxième en terme de décès par cancer et son incidence est en augmentation constante. L’introduction de l’immunothérapie dans le traitement du CHC à un stade avancé a récemment permis d’augmenter la survie globale de certains patients. Néanmoins, le sorafenib, un médicament utilisé depuis 15 ans, reste toujours une option thérapeutique. Le sorafenib limite la croissance de la tumeur. Malheureusement, des phénomènes de résistance au sorafenib apparaissent souvent. Identifier des molécules qui permettraient de lutter contre l’apparition de ces phénomènes de résistance est donc un enjeu très important pour améliorer la survie des patients atteints de CHC. Plusieurs molécules jouant ce rôle ont été identifiées in vitro, parmi lesquelles, des petits ARN, dits ARN interférants (siRNA). Comme la preuve en a été faite avec les vaccins contre le coronavirus, les ARN peuvent être transportés vers et délivrés à des cellules de l’organisme à l’aide de nanoparticules. Ils ont l’avantage 1) de présenter en général une plus faible toxicité que les médicaments classiques in vivo et 2) d’avoir également montré leur efficacité dans d’autres types de cancer. Le but du projet est de vérifier que l’on peut apporter des siRNA encapsulés dans des nanoparticules (LNP) au sein d’un CHC chez la souris. Si la réponse est positive, l’étape suivante consistera à déterminer si la combinaison sorafenib – siRNA permet d’augmenter l’effet du sorafenib seul et donc, d’entraîner la régression, voire la disparition des tumeurs.

Bénéfices attendus

Les siRNA encapsulés dans des nanoparticules (siRNA-LNP) sont de plus en plus utilisés dans la thérapie du cancer. De nombreux essais cliniques sont en cours et un siRNA avait déjà reçu l’autorisation de mise sur le marché de l’administration américaine (FDA) en 2018. Déterminer s’il est possible d’utiliser cette technologie dans un modèle de cancer du foie chez la souris est important pour pouvoir ensuite valider la capacité de siRNA sélectionnés à réduire, voire à faire disparaître des tumeurs du foie, en combinaison avec le sorafenib, médicament de référence dans le traitement de ce cancer, mais qui permet essentiellement de ralentir la croissance de la tumeur, quand il est employé seul.

Procédures

Les animaux seront endormis par anesthésie gazeuse avant les 5 injections intraveineuses (30 secondes par injection) et les 9 examens d’imagerie (5 à 10 minutes par examen) qu’ils subiront pendant les 4 semaines de l’expérience, de façon à limiter au maximum la douleur et l’angoisse. Pour améliorer les conditions d’anesthésie, la chambre d’accueil dans laquelle se trouve l’animal durant l’acquisition des images est chauffée à 37°C.

Impact sur les animaux

Le développement des tumeurs du foie pendant la durée de l’expérience constitue une source de souffrance possible. Elle se traduit généralement par un état de prostration et une grosseur abdominale. Concernant l’expérience elle-même, les injections par voie intraveineuse et les scanners seront effectués sous anesthésie gazeuse, par le personnel de la plateforme d’imagerie formé à ces gestes techniques, ce qui réduira l’angoisse et la douleur des animaux. Les produits injectés n’ont pas de toxicité décrite. Néanmoins, les souris seront particulièrement surveillées dans les 48 heures suivant l’injection des LNP pour détecter l’apparition éventuelle de signes de toxicité (ulcération cutanée, prostration, dyspnée).

Devenir

Les souris seront mises à mort à la fin de la procédure, leur foie prélevé pour vérifier l’absence de lésions hépatiques causées par l’administration des siRNA encapsulés dans des nanoparticules et pour confirmer la présence de la fluorescence dans la tumeur.

Remplacement

Des expériences in vitro sur des lignées cellulaires de cancer du foie ont montré l’efficacité des siRNA encapsulés dans des nanoparticules (siRNA-LNP) seuls et surtout en combinaison avec le sorafenib. Pour se rapprocher de conditions plus physio-pathologiques, il est indispensable de tester leur efficacité sur des modèles in vivo.

Réduction

Lors d’une précédente expérience, les bons résultats obtenus en cours d’expérience nous ont permis de ne pas utiliser tous les animaux prévus au départ. Ce sont ces animaux restants que nous utiliserons dans le présent projet. D’autre part, les effectifs définis ont été déterminés sur la base de notre connaissance de ces souris, en particulier de la cinétique de développement de leurs tumeurs du foie.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe de 2 à 5 souris de même sexe par cage. Les cages contiennent du coton pour permettre la formation d’un nid. L’acquisition des images aura lieu sous anesthésie gazeuse dans une chambre chauffée à 37°C, pour réduire l’inconfort et l’angoisse des animaux

Choix des espèces

Les souris transgéniques sont souvent le seul modèle dont on dispose en cancérogenèse, pour se rapprocher au mieux du développement tumoral chez le patient. C’est en particulier le cas du cancer du foie. Les souris utilisées dans le présent projet développent des tumeurs du foie aux alentours de 20 semaines. C’est donc à cet âge que les souris rentreront dans la procédure.

2400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe sous-cutanée de cellules cancéreuses, l'injection d'un candidat-médicament marqué à un isotope radioactif puis jusqu'à dix prélèvements sanguins, certaines étant isolées jusqu'à 96 heures en cage à métabolisme, pour suivre la distribution du produit dans les organes. Le porteur précise que ces études sont commandées par des entreprises clientes, selon un schéma répétitif de sélection de candidats-médicaments. Il indique que la tumeur peut atteindre 1500 mm3 ou se nécroser et que la toxicité peut entraîner une perte de poids supérieure à 20 pour cent, et affirme qu'aucun modèle ex vivo ou sur organoïdes ne reproduit la complexité physiologique de l'animal.

Objectifs

Les études de pharmacocinétique sanguine, de distribution tissulaire et d’élimination de candidats médicaments biologiques représentent une étape essentielle dans le développement d’un médicament. Ces études, demandées par les conseils scientifiques des entreprises clientes, ont pour but la compréhension et l’analyse du devenir du médicament dans l’organisme, d’évaluer une potentielle accumulation de ce dernier dans les organes et/ou tissus et ainsi de pouvoir mieux appréhender d’éventuels effets indésirables. Dans le cadre d'études en cancérologie, il est également crucial de vérifier le ciblage spécifique des candidats médicaments pour les cellules cancéreuses que ce soit à but diagnostic ou thérapeutique. Ces études in vivo s’inscrivent dans un contexte d’études répétitives car elles seront réalisées selon un même schéma directeur expérimental ayant pour unique objectif l’étude pharmacologique de sélection de candidats médicaments biologiques. Les variations peuvent porter sur la souche de souris sélectionnée pour l’évaluation du candidat, le mode d’administration du candidat, le nombre d’animaux par groupe et le nombre de groupes (différentes doses et/ou différents temps d’euthanasie à analyser). Ces études in vivo sont menées à partir de l’administration de candidats médicaments préalablement marqués par un isotope radioactif de faible énergie afin de tracer et de quantifier ces candidats dans les différents tissus dont le tissu tumoral et fluides biologiques d’intérêt. La radioactivité est administrée à des doses ne présentant aucun effet nocif pour la santé de l’animal.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont que la molécule testée soit spécifique du tissu tumoral ciblé afin dans un second temps de développer des candidats-médicaments spécifiques de ces tumeurs à but diagnostique et/ou thérapeutique.

Procédures

Toutes les souris sont injectées en sous-cutanée avec des cellules cancéreuses ; fréquence : 1 fois/animal durée : 30 sec. Les souris recevront toutes une injection d'un candidat-médicament ; voies possibles : IV, SC, IM, IP, voie orale et intravésicale fréquence : 1 fois/animal durée : 30 sec à 3 min. A l'exception des souris en cage à métabolisme, toutes les souris seront prélevées en sang : - Cas du microsampling : fréquence max 3 fois sur 24 heures puis 1 fois par 24 heures pendant 7 jours = 10 prélèments durée/prélèvement : 1 min - Cas des autres techniques de prélèvements: fréquence max 2 fois avec un intervale minimum de 1 heure et maximum de 5 jours durée/prélèvement : 1 min Les souris en cage à métabolisme sont isolées pendant 96 heures au maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables inattendus sont: - tumeur aggressive dépassant les 1500 mm3 et/ou nécrosante entrainant l'arrêt de l'étude pour les animaux concernés. - toxicité de la molécue testée se traduisant par une perte de poids >20% et/ou un état général dégradé ( poils piqués, réduction de la motricité , perte d'appétit...) entrainant l'arrêt de l'étude pour les animaux concernés.

Devenir

Tous les organes d'intéret doivent être prélevés d'où l'impossibilité de maintenir les animaux en vie.

Remplacement

Ces étude ne peuvent pas être remplaceées étant donné que le système d'intéraction tumeur et molécule à tester est complexe et qu'à l'heure actuelle ex-vivo, sur organoides ou modélisation ne permet de reproduire la complexité physiologique de l'animal.

Réduction

Un groupe composé de 6 individus au maximum est nécessaire et suffisant à la détermination d'un coefficient de variation prenant en compte la variabilité interindividuelle. La mesure radioactive est très précise et répétable ne nécessitant pas l'intégration d'animaux supplémentaires. Aucun test statistique n'est envisagé. Il sera uniquement prévu de calculer la moyenne et l'écart-type obtenus sur chaque groupe de 6 animaux.

Raffinement

Plusieurs mesures sont mises en place: Une une période d'acclimatation de 5 jours minimum avant l'entrée dans le protocole ; Des conditions d'hébergement adéquates incluant un enrichissement avec du papier accordéon et des tunnels teintées un suivi quotidien des animaux ; la mise en place de méthodes d'anesthésie et d'euthanasie reconnues et validées ; l'instauration de points limites pertinents et précoces le respect des volumes d'injection , de la fréquence et des volumes de prélèvements sanguinss

Choix des espèces

Les souris sont des animaux préférentiellement utilisés dans les phases précoces de recherche de biodistribution tissulaire. Le choix de la souche et du sexe dépendra ensuite des résultats antérieurs de la Société cliente. Les animaux sont utilisés à l'âge de jeune adulte (environ 6-8 semaines). Le système immunitaire à cet âge est mature.

176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules tumorales humaines sur chaque flanc, une injection de lymphocytes B et T modifiés, puis un suivi par bioluminescence sous anesthésie et des prélèvements sanguins, pour tester une immunothérapie censée diriger des globules blancs vers la tumeur. Le porteur indique que la greffe peut provoquer une ulcération des tissus cutanés et que les contentions induisent un stress modéré. Il affirme qu'on ne peut pas s'affranchir du modèle murin et conclut que le recours in vivo est "indispensable".

Objectifs

Les cancers représentent un problème de santé publique majeur causant environ 10 millions de décès par an. Les traitements disponibles présentent de nombreux effets secondaires et nécessitent souvent de multiples interventions, d’où la nécessité de nouvelles alternatives thérapeutiques plus efficaces, plus spécifiques, voir ciblées, et ce, sur le long terme. L'un des principaux problèmes expliquant la progression du cancer est l'incapacité du système immunitaire à éliminer les cellules tumorales. Récemment, des stratégies d'immunothérapie modulant le système immunitaire du patient pour augmenter son efficacité ont suscitées un fort intérêt. L’objectif du projet est d’améliorer le système immunitaire du patient, en modifiant un sous type de globules blancs, afin qu’il discrimine et détruise spécifiquement les cellules cancéreuses. Les propriétés de reconnaissance du globule blanc seront améliorées afin qu’il détecte les cellules tumorales et génère en réponse une forte réponse immunitaire anti-tumorale qui conduira à la destruction de la tumeur. L’un des principaux avantages de cette thérapie est qu’elle permet de prévenir des rechutes du cancer car les globules blancs modifiés persistent dans l’organisme sur le long terme et pourront être réactivés en cas de nouvelles poussées de la maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’évaluer dans un premier temps la capacité de nos cellules B à se diriger vers le site de la tumeur et l’activation du circuit des cellules B reprogrammées puis dans un second temps l’efficacité anti tumorale de ces cellules. Ces procédures vont nous permettre de vérifier la localisation des cellules modifiées et réinjectées ainsi que la libération localisée de la molécule thérapeutique par ces cellules in vivo.

Procédures

- Greffe sous anesthésie : Injection de cellules tumorales humaines sur chaque flanc (15 min/animaux). - Co injection de lymphocytes B et T sous anesthésie (2 min maximum en prenant en compte l'anesthésie et l'injection, le réveil est quasi immédiat) - Suivi de la bioluminescence sous anesthésie (entre 5 secondes et 8 minutes maximum en fonction de l’intensité lumineuse émise et les limites de saturation de la caméra photosensible). Pendant 3 semaines 1 fois par semaine -Injection du substrat pour la bioluminescence (moins d'1 minute en prenant en compte la contention et l'injection). Pendant 3 semaines 1 fois par semaine -Prélèvement sanguin, 1 fois sous anesthésie générale (moins d'1 minute). - Les animaux seront pesés une fois par semaine (environ 1 minute) pendant 28 jours. - Les tumeurs seront mesurées au pied à coulisse 2 fois par semaine (environ 2 minutes) pendant 28 jours.

Impact sur les animaux

Suite à la greffe de cellules tumorales en sous cutanée, une tumeur va se développer et peut induire des distensions et ulcérations des tissus cutanées. Dans notre cas les durées d’expérimentation ne sont pas suffisamment longues pour permettre l’installation de distension des tissus, le point limite le plus critique est l’apparition d’ulcération des tissus cutanés qui peuvent apparaître chez certains animaux avant la fin de l’expérimentation. Le phénotype des animaux est non dommageable car ils sont élevés dans les conditions appropriées (conditions d’hébergement et d’expériences). Un stress modéré sera induit par les contentions préalables aux anesthésie gazeuse et locale, aux pesées et aux mesures des tumeurs.

Devenir

A l'issue de ces procédures, les animaux seront mis à mort afin de quantifier la luminescence ainsi que la présence de lymphocytes B modifiés dans la tumeur et dans la rate.

Remplacement

Des expériences préliminaires ont été réalisées in vitro. Cependant, on ne peut pas s’affranchir du modèle murin. La nouveauté de ce traitement est la sécrétion locale des molécules thérapeutiques au niveau de la tumeur exprimant le marqueur ciblé. Or pour étudier la localisation des cellules modifiées dans l’organisme après injection ainsi que la zone anatomique de sécrétion de la molécule médicament par ces cellules, le modèle in vivo est indispensable. De plus, l’activation des lymphocytes B (globules blancs modifiés) est un processus relativement complexe et fait intervenir plusieurs organes où s’effectueront les étapes de maturation ainsi que de nombreux types cellulaires. Pour l’heure ces processus d’activation ne peuvent être reproduits in vitro, c’est pourquoi le recours à un modèle in vivo est indispensable.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe a été défini après discussion avec des statisticiens, ainsi que sur la littérature scientifique pour estimer les effets attendus et a été réduit au minimum sans mettre en péril une interprétation statistique des résultats. Le suivi de la bioluminescence des cellules B modifiées in vivo a permis de réduire le nombre d’animaux dans les procédures 1 et 2 en permettant de suivre la localisation et l’activation du circuit sans mettre systématiquement à mort les animaux à différents temps. Le nombre d’animaux par groupe (n=8) a été déterminé en prenant en compte le pourcentage de prise de greffe (80%).

Raffinement

Les manipulations des souris immunodéficientes seront effectuées dans un environnement complétement stérile garantissant ainsi un phénotype non dommageable. Tout au long des expériences, nous veillerons au bien-être des animaux, à réduire au maximum la souffrance et l'angoisse des souris grâce à la mise en place d’une grille de score clinique. Une période d’une semaine d’acclimatation sera mise en place avant le début du protocole et les animaux seront maintenus en groupes sociaux. La greffe des cellules tumorales ainsi que le suivi de la bioluminescence seront réalisées sous anesthésie afin d’éviter toute méthode de contention prolongée. La Co-injection des lymphocytes B et T sera faite sous anesthésie avec au préalable une anesthésie locale. Un prélèvement de sang total sera réalisé à la fin de l’expérimentation, sous anesthésie profonde au sinus retro-orbital ou intra cardiaque.

Choix des espèces

La souche de souris utilisée a été choisie pour son immunodéficience sévère permettant la xénogreffe de cellules humaines (cellules tumorales et immunitaires humaines). D’après notre expérience, pour cette souche de souris, un âge d’environ 6 semaines permet une bonne prise de greffe des cellules tumorales.

8 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Fortement immunodéprimées, elles reçoivent des cellules T humaines et des cellules tumorales, avec une à deux injections ou prélèvements par semaine, pour optimiser l'efficacité de ces cellules contre le lymphome. Le porteur indique une perte de poids possible et l'arrêt de l'expérience en cas de souffrance. Il affirme que cette analyse de cellules humaines ne peut se faire qu'in vivo, sur un modèle murin très immunodéprimé.

Objectifs

Le traitement des cancers des cellules du sang représente un enjeu majeur et dans ce contexte, de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le cancer ont récemment été développées en utilisant notre système de défense pour cibler et éliminer les tumeurs. Notamment, des immunothérapies basées sur l’injection de cellules immunitaires spécifiques de protéines tumorales, comme par exemple les approches utilisant des cellules T modifiées pour reconnaitre spécifiquement une tumeur, ont démontré leur potentiel thérapeutique, et sont maintenant approuvées en clinique pour certaines applications. Cependant des cas de résistances/rechutes pour ces patients restent trop nombreux et de nombreuses questions demeurent pour en comprendre les raisons et en conséquence, pouvoir optimiser la persistance et la réactivité des cellules T greffées chez ces patients. Dans ce projet, nous proposons de déterminer dans un modèle murin adapté : 1) l'efficacité anti-tumorales de cellules T humaines générées à partir d’échantillons de patients atteints de lymphome 2) de quelle manière le processus de préparation des cellules T et la nature de la tumeur, affectent le devenir et l’efficacité des cellules T greffées. Les résultats obtenus pourraient permettre une amélioration de l’efficacité de ces nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de notre projet sont tout d’abord une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans une réponse anti-tumorale efficace d’une population de cellules de notre système immunitaire, les cellules T. D’autre part, nous espérons que nos résultats auront pour conséquence l’amélioration dans un premier temps du traitement des lymphomes mais également, à plus long terme, d’autres types de cancers. Cette problématique reste en effet une problématique majeure puisque le traitement des cancers des cellules sanguines en général, et du lymphome en particulier, représente toujours un enjeu de santé majeur (plus de 5000 nouveaux cas/an dont 1/3 de cas réfractaires aux traitements de premières lignes). Dans ce contexte, comme indiqué ci-dessus, le développement de nouvelles stratégies anti-tumorales, basées sur les propriétés du système immunitaire pour cibler et éliminer les tumeurs, a permis d’améliorer les traitements contre le cancer et notamment les hémopathies. Ainsi, les traitements basés sur l’injection de cellules T anti-tumorales sont maintenant approuvés en clinique pour le traitement de différents cancers hématologiques tels que les leucémies ou les lymphomes. Toutefois, malgré des résultats spectaculaires, des formes réfractaires à cette approche persistent. Différentes explications peuvent être invoquées comme une faible/absence d’expansion des cellules T anti-tumorales après infusion, un défaut de persistance ou encore une altération de leur fonctionnalité. Ainsi, il est crucial de déterminer les causes de ces échecs afin d’optimiser l’efficacité de ces nouvelles thérapies pour cet enjeu majeur de santé publique. Ce projet permettra ainsi comme indiqué précédemment d’accroître nos connaissances sur les paramètres pouvant impacter l’efficacité des cellules T anti-tumorales et ainsi, identifier de nouvelles pistes pour optimiser cette approche thérapeutique prometteuse.

Procédures

Les animaux subiront différents types d'injections ou prélèvements pour lesquelles la douleur est faible à modérée et ne requièrent pas plus que quelques minutes par animal. Par souci du bien être animal et en fonction du type d'injection, l'intervention sera réalisée sous anesthésie ou contention appropriée de l'animal. En moyenne, un animal subira 1 à 2 injections ou prélèvements par semaine au cours d’une expérience.

Impact sur les animaux

Le protocole expérimental mis en place afin de répondre à nos objectifs peut induire une perte de poids transitoire chez l’animal. Les animaux seront observés et suivis régulièrement afin de détecter l’apparition de tout signe de douleur détaillée dans une fiche de suivi clinique (perte de poids, altération du comportement, de la qualité du poil, de la mobilité, …). En cas de souffrance de l'animal, l'expérimentation sera arrêtée.

Devenir

La totalité des animaux impliqués dans cette demande sera mise à mort en fin d'expérimentation afin de prélever les organes lymphoïdes et réaliser des analyses par cytométrie en flux et microscopie.

Remplacement

La caractérisation des effets anti-tumoraux des cellules T de patients modifiées ex vivo en parallèle du suivi du développement tumoral ne peut être abordé à ce stade qu’in vivo. Il n’existe pas d’approches in vitro ou in silico qui permettent de s’en affranchir. Le projet décrit dans le cadre de cette demande requiert une analyse intégrée in vivo de la fonctionnalité de cellules T humaines anti-tumorales, en présence de tumeurs. Toutefois, de nombreuses conditions de culture et/ou modifications des cellules T de patients seront, dans une première phase, testées ex vivo de manière à sélectionner et ainsi optimiser, le nombre de conditions testées in vivo.

Réduction

Cette étude est basée sur les données de la littérature et l’expertise de nos collaborateurs dans la réalisation d’expériences comparables. Par ailleurs, de nombreuses conditions de culture et/ou modifications des cellules T de patients seront dans une première phase testées ex vivo de manière à sélectionner et ainsi optimiser le nombre de conditions qui seront ensuite testées in vivo. Les modèles tumoraux utilisés dans cette étude permettent un suivi facilité du développement tumoral par bioluminescence et une limitation du nombre d’animaux utilisés. De plus, nous avons évalué en fonction des données connues, du degré d’hétérogénéité de la pathologie et de la prise des greffes, que le nombre d’animaux par groupe expérimental (n=8) permettait d’atteindre une puissance statistique suffisante. Les expériences proposées sont décrites en deux phases ce qui permettra de sélectionner et limiter les conditions à tester dans la deuxième phase et ajuster, si nécessaire, le nombre d’animaux requis. Par ailleurs, mâles et femelles pourront être utilisés dans ce projet afin d’optimiser au maximum l’utilisation des animaux. Enfin, les données obtenues seront systématiquement évaluées au moyen de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Durant les expériences, les animaux seront suivis quotidiennement par les zootechniciens et/ou chercheurs. Pour leur bien être et réduire le plus possible souffrance et angoisse, les animaux seront maintenus systématiquement à plusieurs par cage avec un enrichissement suffisant pour leur permettre de construire des nids et ainsi améliorer leur bien être. Afin d'évaluer la souffrance des animaux en expérimentation, la qualité du poil, la mobilité, la posture et le poids des souris seront monitorés (en utilisant une grille d'évaluation clinique). Une attention toute particulière sera portée à la perte de poids : ainsi, le poids des animaux sera mesuré régulièrement et un peu de nourriture humidifiée (et/ou substitut gélifié) sera déposé si besoin directement dans la cage afin d’éviter aux souris d’aller chercher en hauteur la nourriture et l’eau. L’expérimentation sera arrêtée immédiatement si un état de souffrance est détecté chez les animaux.

Choix des espèces

Le projet décrit dans le cadre de cette demande requiert une analyse intégrée in vivo de la fonctionnalité de cellules T humaines anti-tumorales, en présence ou en absence de tumeurs. Ces questions ne peuvent pas être abordées à l’heure actuelle au moyen de méthodes alternatives in vitro ou in silico, et demandent ainsi de faire appel à des modèles animaux, murins dans le cas présent, en raison des grandes similitudes du système immunitaire murin et humain. Par ailleurs, pour cette étude faisant appel au transfert adoptif de cellules T humaines, seul un modèle murin fortement immunodéprimé peut être utilisé. Dans cette optique, des animaux adultes males et femelles (agés de 8-15 semaines) seront utilisés pour les expérimentations proposées.