Maladies infectieuses

100 souris et 12 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris reçoivent des injections, portent une capsule fixée sur le dos et sont infestées par des tiques, les lapins étant utilisés pour produire du sérum, avant mise à mort pour prélever le sang et les organes. Le porteur indique que l'alimentation des tiques provoque un inconfort modéré et que la pose des capsules a été optimisée pour le limiter. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la réponse immunitaire de la souris à une vaccination anti-microbiote de tique.

Objectifs

L'implication du microbiote (bactéries symbiotique de la tique) de la tique dans la survie des tiques et dans la transmission des agents pathogènes transmis par ces dernières a déjà été signalée pour différentes espèces de tiques. Ces preuves renforcent le fort potentiel du microbiote des tiques en tant que cible pour le développement de stratégies de contrôle. Il est prouvé que la présence de certaines espèces de ces bactéries (symbiotes) favorise l'établissement d’agents pathogènes chez les tiques, alors que la présence d'autres espèces de bactéries a été associée à l'absence d’agents pathogènes chez la tique. Dans ce contexte, l'objectif principal de ce projet de recherche est de cibler deux types de bactéries symbiotiques pour évaluer les effets de la vaccination de souris par ces bactéries sur la composition du microbiote de la tique, sur l'limentation et la survie de tique et enfin sur l'acquisition d'un agent pathogène par la tique.

Bénéfices attendus

Les tiques transmettent des maladies graves à l'homme et aux animaux. Cependant, la lutte contre les tiques repose uniquement sur les acaricides, qui peuvent contaminer l'environnement et les produits d'origine animale (par exemple, le lait et la viande) consommés par l'homme. En outre, les acaricides peuvent sélectionner des populations de tiques résistantes. Malgré la gravité des maladies transmises par les tiques, la prévention repose uniquement sur l'évitement des piqûres de tiques. Les tiques abritent une communauté de microbes (microbiote) comme les autres animaux. Chez les tiques, le microbiote joue un rôle dans la survie et le développement des tiques ainsi que dans leur capacité à transmettre des agents pathogènes. Ce projet vise à développer une stratégie plus sûre de lutte contre les tiques, basée sur des vaccins anti-microbiote de tique utilisés chez la souris.

Procédures

Souris animaux vigiles : 2 injections et 3 prélèvements. Pose de capsule sur le dos des souris. Infestation avec tiques Lapins = Animaux vigiles : 2 injections et 2 prélèvements.

Impact sur les animaux

Chez les souris, l’alimentation des tiques induit un inconfort modéré. De plus, les souris peuvent simplement se sentir mal à l'aise lorsque la capsule est placée sur leur dos. Cependant, le placement des capsules sur le dos de l'animal a été optimisé pour minimiser l'inconfort chez l'animal et maximiser les résultats expérimentaux. Pas de symptômes attendus suite à l'inoculation des agents pathogènes mais surveillance quotidienne des animaux (souris et lapins).

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupération du sang total et des organes.

Remplacement

Ce projet vise à nourrir des tiques sur des souris préalablement immunisées avec des bactéries non pathogènes afin d'évaluer les effets sur la composition du microbiote de la tique, l'alimentation/survie de la tique et l'acquisition d'une bactérie pathogène (Rickettsia) par la tique. Il n'existe pas de modèle in vitro pour remplacer la réponse immunitaire des souris à une infection bactérienne afin d'analyser les effets sur le microbiote des tiques et la colonisation des pathogènes. Afin de disposer d'un plus grand volume de sérums pour des études supplémentaires in vitro, nous immuniserons également des lapins, évitant ainsi l'utilisation de souris supplémentaires. Dans le cadre de ce projet nous ne cherchons pas à simplement infecter des tiques par des bactéries, nous avons besoin d’évaluer l’efficacité d’une vaccination chez la souris avec deux bactéries sur le gorgement/survie et capacité à s’infecter des tiques. Il existe des systèmes de gorgement et d’infection artificielle des tiques mais ces systèmes ne permettent pas d’évaluer la réponse immunitaire des souris suite à une vaccination. La production/cultures des bactéries est par ailleurs réalisée par culture cellulaire in vitro.

Réduction

Chaque souris peut nourrir au maximum 30 tiques. Mais par souris entre 20-25 tiques vont se détacher sans faire un repas complet ou mourir donc nous obtiendrons 5-10 tiques gorgées par souris donc il faut prévoir 5 souris pour groupe pour obtenir 25-50 tiques gorgées par groupe au total, nombre nécessaire à nos analyses. Le nombre d'animaux a été comptabilisé pour être le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir le nombre de tiques gorgées nécessaires à nos analyses. Nous avons comptabilisé le nombre minimal de lapin nécessaire à l’obtention du volume necessaire de serum pour nos futures experimentations in vitro. Pour nos expérimentations futures in vitro, nous avons besoin durant les 5 années du projet d’un volume total de 60ml de sérums de lapins immunisé pour chaque bactérie (deux bactéries) et le même volume pour chaque lapin contrôle (deux contrôles). Nous avons donc estimé avoir besoin de 3 lapins par groupe (environ 20ml de sérum pouvant être récupéré par Lapin) soit un total de 12 lapins sur les 5 ans du projet.

Raffinement

Les souris seront hébergées par lot de 3 dans leurs conditions classiques avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (carré de coton, maison en plastique pour les souris). Il n’y a aucune souffrance attendue suite à l’infection par les bactéries lors des immunisations, les infections sont asymptomatiques chez les souris et les lapins. Pas de points limites dans ces conditions. Cependant, après inoculation des agents pathogènes, l’état clinique des animaux (état général) sera contrôlé chaque jour, pour arrêter l'expérience si nécessaire par mise à mort des animaux. Les animaux seront mis à mort en cas de déshydratation ou signes neurologiques (début de paralysie notamment). Nous n'attendons donc pas de symptômes importants tels que des paralysies chez les souris, mais nous suivrons les animaux tous les jours afin de contrôler l'apparition de symptômes éventuels. Lorsque les souris auront des capsules sur le dos avec des tiques, elles devront être hébergées en cage individuelle, en effet les souris sont capables d'enlever les capsules du dos des autres souris et de manger les tiques. Mais ces souris seront hébergées dans les conditions classiques avec l'enrichissement nécessaire à leur bien être en augmentant le nombre de carré de coton et même si elles sont seules elles pourront voir les autres souris des cages d'à côté. Pour les lapins, à leur arrivée, les animaux seront hébergés dans des cages munies d’une plateforme de repos avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (balles, branches en bois pour les dents et branches végétales). Les lapins seront observés quotidiennement pendant toute l'expérimentation. Comme les lapins sont des animaux très sensibles à la manipulation, ils seront quotidiennement contrôlés et manipulés par les animaliers et l’expérimentateur pour les habituer à leur présence et aux manipulations.

Choix des espèces

Les 3 lignées de souris ont été sélectionnées car elles sont les plus sensibles aux agents pathogènes (bactéries notamment) transmis par les tiques. Lapin blanc de Nouvelle-Zélande car ce sont les animaux les plus appropriés pour obtenir un grand volume de sérum vacciné en une seule expérience et permettra d'obtenir suffisamment d'anticorps spécifiques contre les bacteries à l'étude. De plus ils ne peuvent pas être utilisés pour infecter des souris car ils ne développement pas de bactériemie suffisante. Souris 7-8 semaines. Lapins = 4-5 semaines. Adaptation des animaux durant une semaine avant l'expérimentation. Souris gardées au plus 39 jours (entre 20 et 39 jours selon procédure). Lapins seront gardés au maximum 30 jours. Mise à mort de tous les animaux au maximum à J39.

Entre 6 et 10 babouins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent, sous anesthésie, des ponctions de sang, de liquide céphalo-rachidien, de salive et de selles, dont un prélèvement sanguin terminal de 450 mL, et une partie reçoit un médicament destiné à réactiver un virus proche du HTLV-1 humain. Le porteur reconnaît un risque de traumatisme de la moelle épinière lors des ponctions et présente la mise à mort comme imposée par le statut sanitaire de ces animaux, qualifiant l'étude de "valorisation scientifique". Il décrit le modèle primate comme "incontournable" faute d'autre colonie naturellement infectée en Europe.

Objectifs

Le rétrovirus oncogène humain T-lymphotrope de type 1 (HTLV-1) infecte cinq à dix millions de personnes dans le monde. Trois à dix pourcents d’entre elles développeront une des maladies graves associées à l’infection, dont la leucémie / lymphome T de l’adulte, ou la paraparésie spastique tropicale / myélopathie associée à HTLV-1. Le dépistage des infections à HTLV-1 est réalisé par un test sanguin de type ELISA. Les individus ne présentant pas de réaction à ce test ELISA sont considérés HTLV-1-négatifs.. Le statut « infecté » des individus ayant réagi au test ELISA est confirmé par un autre test de dépistage sanguin, le plus souvent de type "Western Blot". En cas de réaction à ce test, le statut « infecté » est alors définitivement confirmé par recherche du virus dans le sang par une technique de biologie moléculaire (PCR). Le rétrovirus simien T-lymphotrope de type 1 (STLV-1) est un virus très étroitement apparenté au virus humain HTLV-1. Une colonie de Papio anubis naturellement infectée par STLV-1 est présente en France. Au cours de nos précédents projets, nous avons obtenus des résultats intrigants : quelques animaux négatifs en ELISA, et donc considérés comme « non infectés », se sont révélés positifs en PCR, indiquant que de telles infections « occultes » pourraient être plus fréquentes que couramment accepté. Nous proposons d’explorer les mécanismes virologiques et immunologiques à la base de ce profil d’infection « occulte », en réalisant le suivi longitudinal (i) du statut de dépsitage sanguin ; (ii) de la charge du virus dans le sang, le liquide céphalo-rachidien (LCR), la salive et les fèces ; (iii) de l’expression virale dans le sang ; (iv) de la réponse immunitaire. En fin de protocole, la distribution du virus dans les organes sera explorée. Si seule une très faible présence du virus dans le sang est observée, nous posons l’hypothèse qu’elle pourrait expliquer l'absence de réaction au test de dépistage sanguin classique. Nous proposons de tester cette hypothèse en essayant de réactiver le virus dans le sang à l'aide d'un médicament et de voir si les animaux réagissent alors au test de dépistage classique. Ce projet permettra de mieux caractériser les bases virologiques et immunologiques des infections « occultes » à STLV-1, et pourrait permettre de plaider pour une ré-évaluation des méthodes de diagnostic chez l’homme.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, le dépistage des infections à STLV-1/HTLV-1 est réalisé par test sanguin de type ELISA, que ce soit lors des contrôles sanitaires dans les élevages de primates non humains, ou chez l’homme. Nos observations indiquent que des infections « occultes », caractérisées par une absence de réaction à ce tes, pourraient être plus fréquentes que couramment accepté. Si certains cas d’absence de réactions ont été rapportés chez l’homme, ces cas sont peu documentés, peu compris, et restent ignorés des politiques de dépistage mises en œuvre dans les populations. Ce projet permettra à court terme de caractériser ces infections « occultes », sur le plan virologique et immunologique. A moyen terme, il permettra d’obtenir les données indiquant qu’un dépistage par ELISA n’est pas suffisant, et qu’un dépistage par PCR pourrait être plus sensible, du moins chez Papio anubis. A plus long terme, ces données obtenues dans ce modèle de primates non humains pourront justifier la mise en place d’études épidémiologiques d’envergure chez l’humain, afin de déterminer la fréquence de ces infections « occultes » chez l’homme, et, le cas échéant, d’appeler à la révision des politiques de dépistage de cette infection grave.

Procédures

Tous les prélèvements seront réalisés sous anesthésie qui devrait durer entre 20 min et 1h maximum. Le nombre de prélèvements pour chaque animal dépendra de l’évolution de son statut sérologique au fil du projet, mais chaque animal subira maximum : 4 prélèvements sanguins de 50mL, 4 prélèvements de LCR, 4 prélèvements de salive par écouvillon, 4 prélèvements de selles et 1 prélèvement sanguin terminal de 450 mL. Les animaux seront isolés 24h maximum après les prélèvements pour surveillance avant d'être réintroduits dans leurs groupes. Si une très faible expression du virus dans le sang est constaté lors des premières analyses, un médicament sera administré par voie orale à 4 animaux pendant 1 semaine pour stimuler l'activation du virus dans le sang.

Impact sur les animaux

Stress lors des captures. Anesthésies. Prélèvement sanguin (risque hématome). Prélèvement LCR (traumastisme iatrogène de la moelle épinière). Isolement par paire ou plus pour surveillance après le prélèvement de LCR (moins de 24h en général). Administration d'un médicament aux effets indésirables possibles suivants : nausées, tremblements, troubles digestifs (vomissements diarrhée), prise de poids, réaction allergique.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en raison de leur statut sanitaire. En effet ces animaux sont porteurs d'une maladie contagieuse qui est en plus une zoonose, et la gestion sanitaire de l'élevage de la station de primatologie impose leur euthanasie. De plus, des prélèvements seront prélevés après l'euthanasie et permettront d'étudier la distribution du virus dans les organes.

Remplacement

Ces données épidémiologiques ne peuvent être obtenues que sur des animaux vivants. Pour l’étude de cette infection, le modèle primate est incontournable. Les individus qui participeront à cette étude sont des individus naturellement infectés par STLV-1 et, à notre connaissance, la seule colonie européenne de primates non humains présentant ces caractéristiques. Les observations ne peuvent donc être réalisées sur aucun autre modèle animal. Dans ce contexte, il est impossible de remplacer l’utilisation d’animaux vivants par des méthodes alternatives.

Réduction

Notre objectif est de réaliser le suivi longitudinal pendant 12 mois de 6 animaux conservant un statut « ELISA-négatif / PCR-positif » sur la durée de l’étude. Si certains animaux deviennent positifs au test sanguin ELISA au cours de l’étude, ils seront euthanasiés, et d’autres individus seront inclus en remplacement, avec un maximum de 10 animaux inclus au total. L’inclusion sera arrêtée dès que le suivi longitudinal de 6 individus est obtenu. Le nombre final d’animaux inclus sera donc compris entre 6 et 10 animaux. Le protocole complet tel qu’il est prévu comporte deux groupes, un groupe sans médicament et un groupe avec médicament, ce dernier étant une expérience pilote pour tester l'hypothèse d'un lien entre l'expression du virus dans le sang et la réaction au test de dépistage sanguin classique. Un nombre de 6 animaux au total, et de 4 animaux dans le groupe médicament, est le minimum nécessaire pour obtenir caractériser de statut infecté « occulte », et le lien éventuel avec une expression virale faible. On s'attend à ce que l’expression virale soit fortement affectée par le traitement, dans environ 50% des animaux traités. Par conséquent, l'analyse de 4 animaux devrait permettre l'observation de 2 animaux au moins répondant bien, ce qui sera nécessaire pour établir un lien éventuel de cause à effet entre expression virale et réaction au test sanguin. L'effet du médicament sera examiné en comparant les échantillons sanguins de base avec ceux prélevés après l’administration. Si on obtient en effet 2 animaux au moins répondant au traitement, cela sera suffisant pour cette expérience pilote. Aucun test statistique ne sera réalisé. Dans le bras sans médicament, nous avons besoin de 2 animaux au minimum à euthanasier en fin de protocole, ce qui amène à 6 le nombre total d'animaux à inclure.

Raffinement

Les animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires...), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises...). Ce programme est supervisé par les responsables du bien-être animal et validé par la structure en charge du bien-être animal. Concernant la capture, elle est toujours réalisée en privilégiant une méthode sans contention (ni chimique, ni physique). Elle consiste d’abord à isoler l’animal lors de son passage dans le tunnel de son hébergement. Une fois isolé dans le tunnel, l’animal est transféré dans une boite de transport accolée au tunnel puis transféré dans une zone d’isolement temporaire avec une cage à fond amovible. En cas d’échec de cette méthode, l’animal sera capturé par télé-anesthésie. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie chimique par injection intramamusculaire avant d’être stabilisé sous anesthésie gazeuse. Chaque anesthésie devrait durer entre 20 minutes et 1 heure maximum. Pendant toute l’anesthésie les individus seront surveillés et monitorés par les vétérinaires. Les animaux ne seront isolés de leur groupe d’origine que transitoirement (24h à 36h, 2 jours maximum) et toujours avec un congénère. Les animaux seront réintroduits le lendemain des prélèvements après validation de l’état de santé par un vétérinaire, dans leurs groupes sociaux suivant la procédure validée par la SBEA. Des points limites sont définis et mis en place. Notamment, en cas d'effets secondaires liés au médicament, les animaux seront pris en charge par l'équipe vétérinaire par un traitement symptomatique et adapté.

Choix des espèces

D'autres modèles animaux existent pour l'étude du virus HTLV-1. Cependant, la colonie de Papio anubis proposée est la seule colonie, à notre connaisance, naturellement infectée par le virus STLV-1 en Europe. Dans le cadre de la gestion sanitaire des colonies, tous les animaux infectés par STLV-1 seront mis à mort. Il s'agit ici donc d'une valorisation scientifique des animaux dont l’euthanasie est par ailleurs inévitable, du fait de leur statut infecté. Dans la mesure du possible, tous les individus seront des individus adultes, présentant le même statut sanitaire. Si nous n’avons pas assez d’animaux adultes à inclure, alors des jeunes pourront être inclus.

484 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le virus Langat, subissent une petite incision de la queue chaque jour pendant quinze jours et sont exposées à des piqûres de tiques pendant plusieurs jours, pour étudier la vitesse de transmission du virus de l'encéphalite à tiques. Le porteur indique que l'infection peut provoquer perte de poids, poil ébouriffé et paralysie des membres postérieurs, et affirme que les piqûres de tiques sont "indolores". Il conclut qu'il est "très difficile voire impossible" de reproduire cette transmission vectorielle in vitro.

Objectifs

Le virus de l’encéphalite à tique (TBEV) est présent dans les glandes salivaires de la tique avant d’être transmis par la salive de la tique lors du gorgement sur un hôte vertébré. Les tiques vectrices appartiennent à différentes espèces : Ixodes ricinus à l'ouest (sous-type européen) et Ixodes persulcatus (sous-types sibérien et extrême-oriental) Les humains sont des hôtes accidentels qui jouent un rôle insignifiant dans l'épidémiologie de la maladie. L'infection par le sous-type de l'Extrême-Orient peut être plus grave, 20 à 40 % des patients développant une maladie neurologique sévère avec un taux de létalité de 20 à 40 % pour ceux qui progressent. L'étude de la vitesse de transmission du virus de l'encéphalite à tique par les tiques revêt plusieurs intérêts importants : 1. Prévention et sensibilisation : Comprendre la vitesse de transmission du virus TBE permet de sensibiliser les populations vivant dans des zones à risque et de leur fournir des informations précises sur les mesures de prévention. 2. Détection précoce : En comprenant combien de temps il faut pour que le TBEV soit transmis, les professionnels de la santé peuvent être mieux informés pour diagnostiquer rapidement les cas d'encéphalite à tique chez les personnes mordues par une tique infectée. 3. Développement de vaccins : L'étude de la vitesse de transmission du virus TBE peut aider à orienter la recherche et le développement de vaccins efficaces. 4. Évaluation des risques : L'analyse de la vitesse de transmission du virus TBE par les tiques peut aider à évaluer les risques associés à certaines régions géographiques ou à certaines espèces de tiques. Cela permet aux autorités sanitaires de mettre en place des mesures de surveillance et de prévention ciblées pour réduire la propagation de la maladie. 5. En résumé, étudier la vitesse de transmission du virus de l'encéphalite à tique par les tiques est essentiel pour la prévention, le diagnostic précoce, le développement de vaccins et l'évaluation des risques.

Bénéfices attendus

Le risque d'infection par le virus de l'encéphalite à tiques (TBEV) après une morsure de tique reste largement inconnu. L’étude de la vitesse de transmission du virus de l'encéphalite à tique par les tiques est essentielle pour la prévention, le diagnostic précoce, le développement de vaccins et l'évaluation des risques. Ces informations sont essentielles pour lutter contre l'encéphalite à tique et minimiser son impact sur la santé publique.

Procédures

Le virus sera injecté une fois en début de procédure. La durée de l’injection est de quelques secondes. Des prélèvements seront réalisés tous les jours à la queue après une petite incision pendant 15 jours consécutifs. Chaque prélèvement ne dure que quelques secondes. Un prélèvement final sera réalisé par voie rétro-mandibulaire juste avant la mise à mort (30 secondes). Les souris seront exposées à des piqûres de tiques pendant 4-5 j pour les larves et les nymphes et environ 7 jours pour les adultes. Les piqûres de tiques sont indolores pour l’animal.

Impact sur les animaux

Les animaux infectés peuvent présenter selon la dose de virus des symptômes qui peuvent consister en une perte de poids, un malaise se traduisant par un poil ébouriffé et une perte de vivacité, une atteinte neurologique se manifestant par une paralysie des membres postérieurs.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront été infectés par un virus.

Remplacement

La transmission vectorielle est un phénomène complexe. Elle nécessite de bien comprendre les interactions entre le vecteur : la tique, le virus et l’hôte vertébré. La tique transmet l’agent pathogène lors d’un repas de sang au cours duquel le virus, une fois amplifié dans les glandes salivaires se transmet dans la salive de la tique. Or cette salive possède de nombreux rôles dont certains permettent de moduler la réponse immunitaire de l’hôte vertébré. L’agent pathogène est alors moins bien reconnu par le système immunitaire et peut donc mieux se développer. Il est donc très difficile voire impossible de mimer cette interaction in vitro sur des cellules. Le modèle animal est donc beaucoup plus pertinent.

Réduction

Nous envisageons lors de la première procédure de travailler sur un petit nombre d’animaux par groupe (8 animaux des deux sexes) afin de déterminer la dose de virus adaptée à notre expérience soit un sous-total (par expérimentation) de 108 individus répartis en 2 cages par groupe (4 individus de sexe différent par cage). Dans le cadre de la deuxième expérience, nous prévoyons d’utiliser de 20 à 24 individus par groupe. Dans le cadre de la troisième expérience, nous utiliserons 10 souris par groupe, soit un effectif total de 20 souris par expérience, ce qui nécessitera d’utiliser des tests statistiques non paramétriques. En prenant en compte un effet cage, les effectifs proposés devraient nous permettre d'obtenir, pour chaque répétition de l'expérimentation, des résultats significatifs pour effets forts à très forts.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement dès l’apparition d’une gêne quelconque. Nous utiliserons une grille d’évaluation de la douleur prenant en compte l’ensemble des symptômes susceptibles d’être déclarés lors de l’infection, notamment les symptômes neurologiques. Plusieurs points limites ont été définis. Lorsque le premier point limite sera atteint, les animaux seront observés bi-quotidiennement. Du gel hydrique sera ajouté dans la cage si les animaux présentent un amaigrissement important ou bien si leur mobilité diminue. Les animaux seront mis à mort lorsque les points limites terminaux seront atteints. Des igloos en carton ou du coton seront mis à disposition dans chaque cage, afin que les animaux soient dans une ambiance confortable.

Choix des espèces

Nous souhaitons posséder un modèle simple d’infection de tiques sur des souris. Il est nécessaire qu’il s’agisse d’un modèle proche de la réalité de la transmission par des vecteurs. L’utilisation de membranes de gorgement n’est pas satisfaisant car elle ne mime que très partiellement la transmission naturelle. Les souris sont des animaux déjà retrouvés infectés dans la nature par le virus de l’encéphalite à tique. Les souris seront des mâles et femelles âgés de 4 à 7 semaines car il a été montré à travers la littérature que les jeunes souris développaient une meilleure allure de la courbe de l’infection, à savoir, plus lente et progressive permettant ainsi de pouvoir avoir le temps d’apposer nos tiques et qu’elles se mettent en gorgement avant le pic de virémie. Par ailleurs, les souris seront observées pendant 15jours.

1 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par Staphylococcus aureus en intraveineuse, puis reçoivent des composés par voie intrapéritonéale chaque jour pendant cinq jours, avec des prélèvements de sang répétés à la queue sur animal vigile, pour tester de nouvelles molécules antibactériennes. Le porteur suit la survie des animaux et indique que les injections et prélèvements provoquent une douleur légère et un stress lié à la contention. Il justifie le recours à la souris par un nombre croissant de souches résistantes qui font de la recherche de nouvelles molécules un "véritable challenge thérapeutique".

Objectifs

Staphylococcus aureus est une bactérie à la fois commensale et pathogène opportuniste. C’est l’une des bactéries le plus souvent isolée à partir de prélèvements sanguins et d’infections invasives. L’incidence annuelle des bactériémies à Staphylococcus aureus (BSA) dans la population générale est évaluée à 28 pour 100 000 en Europe avec un taux de létalité variant de 22 à 26%, et la BSA est un facteur de mauvais pronostic au cours des pneumonies nosocomiales à Staphylococcus aureus. Également, les infections ostéoarticulaires à Staphylococcus aureus sont caractérisées par un risque élevé d’échec thérapeutique, de séquelles, et de morbidité à long terme. En effet, si un traitement antibiotique existe contre les infections à Staphylococcus aureus, on observe un nombre croissant de souches résistantes (10 à 40 % des cas de BSA) faisant de la recherche de nouvelles molécules actives contre ce type d’infection un véritable challenge thérapeutique. Dans le cadre d’une collaboration, nous avons identifié un certain nombre de nouveaux composés de synthèse ayant une forte activité antibactérienne contre différentes espèces de bactéries parmi lesquelles Staphylococcus aureus. Le but de ce projet est donc de confirmer les résultats obtenus in vitro sur des cultures de Staphylococcus aureus dans un modèle murin d’infection.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est la recherche de nouveaux traitements contre les infections à Staphylococcus aureus. S’il existe un traitement antibiotique de référence contre ce type d’infection, de plus en plus de souches résistantes apparaissent, et la découverte de nouveaux traitements constituerait une avancée significative dans le traitement de ces infections.

Procédures

Les souris seront infectées une fois par voie intraveineuse, puis traitées une fois par jour pendant 5 jours par voie intrapéritonéale avec les composés à tester. Des prises de sang seront effectuées sur les souris vigiles par prélèvement de 5 microlitres dans la veine caudale, 4h, et 1, 2, 3, 5, 7 et 10 jours post infection. Nous utiliserons des doses infectantes déterminées par ailleurs. Les animaux infectés seront traités avec les composés chimiques sélectionnés et la survie des animaux sera suivie au cours du temps et comparée avec des animaux traités avec une solution saline.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront au cours de ce projet une injection intraveineuse et des injections intra péritonéales répétées (une fois par jour pendant 5 jours) ainsi que plusieurs prises de sang par incision de la veine caudale. Tous ces actes entrainent une douleur légère et un stress dû à la contention.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux en fin de procédure. Ces animaux ayant été infectés, il n’est donc pas possible de les réutiliser, de les replacer ou de les adopter.

Remplacement

Les différents composés étudiés ont été testés in vitro sur des cultures de Staphylococcus aureus et les concentrations minimales inhibitrices déterminées pour chaque composé actif contre cette bactérie. Nous devons maintenant vérifier que cet effet observé sur des bactéries en culture se retrouve dans un modèle d’infection in vivo. Dans un souci de remplacement et de raffinement, des tests de toxicité sur cellules nous ont permis de déterminer les doses de chaque composé n'entrainant pas de mort cellulaire. Ce sont ces doses qui seront utilisées dans ce projet.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d'animaux le plus restreint possible nous permettant d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ce nombre sera calculé en tenant compte de nos résultats précédents.

Raffinement

En termes de raffinement, les animaux seront réceptionnés à l’animalerie une semaine avant le début des expériences pour adaptation et hébergés par groupe de 5 dans un environnement enrichi (igloo et baguette en papier). Les animaux seront surveillés quotidiennement et à chaque intervention par les responsables du projet. En cas d’apparition de signes de souffrance et/ou de lésions, la surveillance serait renforcée et les plaies désinfectées. En cas de persistance de l’un ou l’autre de ces signes au-delà de 24h, le ou les animaux concernés serai(en)t immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement décrit dans la littérature comme modèle de l'infection in vivo. De plus, les systèmes de défense contre les bactéries pathogènes sont très conservés de la Drosophile aux Mammifères, et en particulier, les réponses cellulaires de l'hôte vis-à-vis du pathogène sont très similaires entre la souris et l'homme. Nous utiliserons des animaux âgés de 6 à 8 semaines pour être dans les mêmes conditions que nos travaux antérieurs.

188 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 132 d'entre eux passant d'une procédure à la suivante avant d'être tués. Ils sont immunisés sous anesthésie, subissent des prises de sang, puis sont infectés par le SARS-CoV-2 par voie nasale et suivis pour la perte de poids, afin de tester un rappel avec un vaccin à ARN "générique". Le porteur relie ce candidat à un objectif d'accès aux vaccins dans les pays "à revenu faible et intermédiaire", et présente les essais précliniques sur animaux comme une étape "indispensable". Les manipulations ayant lieu en laboratoire de haute sécurité, tous les survivants sont tués à la fin.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans une initiative qui a pour mission de faciliter le développement et d'améliorer l'accès aux médicaments essentiels dans les pays à revenu faible et intermédiaire, et notamment l’accès aux vaccins contre la COVID-19. Ce projet propose d’évaluer chez le modèle hamster l’efficacité d’un boost avec le vaccin ARN ‘générique’ à distance d’une immunisation complète, c’est-à-dire lorsque les anticorps produits suite à l’immunisation avec un autre vaccin commercialisé contre le SARS-CoV-2 auront disparus. L’évaluation de l’efficacité s’effectuera sur 2 critères principaux : - L’Immunogénicité induite par le boost avec le vaccin générique. - La protection induite par le vaccin grâce à la réalisation de challenge infectieux en regardant plusieurs critères d’efficacité : la réplication virale au sein de différents organes (prélèvements post-mortem), la symptomatologie (apparition de signes cliniques et utilisation de points limites adaptés pour prévenir la souffrance animale) et l’histopathologie (réalisée sur des organes prélevés post-mortem). C’est un projet multisite impliquant deux laboratoires différents situés dans le même bâtiment.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de vérifier l'efficacité d'un boost réalisé avec un vaccin 'ARN' générique produit par le Centre de Transfert de la Technologie des vaccins à ARN messager afin de réduire les inégalités dans l’accès aux vaccins contre la COVID-19 dans les pays à revenu faible et intermédiaire.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur : Les animaux seront immunisés par voie intramusculaire (une injection dans une cuisse). Cette intervention dure en moyenne 5 minutes (anesthésie + immunisation). Une dose de rappel sera effectuée 21 jours après cette première injection (dans l'autre cuisse), selon les mêmes conditions, puis une dose de boost environ 210 jours après la dernière injection. Cette immunisation n’induit qu’une douleur légère et de courte durée. Ces immunisations seront réalisées sous anesthésie générale. Des prélèvements sanguins seront réalisées sous anesthésie générale (trois maximum par animal, avec un intervalle d’au moins 21 jours entre deux prélèvements). Cette intervention dure en moyenne 6 minutes (anesthésie + prélèvement). Les animaux sont également pesés régulièrement (1 minute). Après leur transfert dans le deuxième établissement utilisateur : Les animaux, anesthésiés au préalable, seront infectés par le SARS-CoV-2 par voix intranasale. Cette intervention dure en moyenne 4 minutes (anesthésie + infection) et ne s'effectue qu'une seule fois. Les animaux sont également pesés tous les jours (1 minute). Un ou deux prélèvements seront effectués sur chaque animal: le lavage nasal. Il sera réalisé une seule fois par jour, au maximum deux jours consécutivement et dure en moyenne 4 minutes (anesthésie + lavage nasal).

Impact sur les animaux

Concernant l’immunisation : l’administration d’un vaccin chez le hamster induit une douleur légère et de courte durée. Les animaux sont anesthésiés pour l’immunisation par voie intramusculaire, la réalisation de prélèvements sanguins et l’infection par voie intranasale. Les animaux sont également pesés tous les jours. Le SARS-CoV-2 entraine une pathologie pulmonaire non mortelle et spontanément résolutive chez le hamster. Le principal symptôme observé est une perte de poids survenant généralement entre le 4ème et le 7ème jour post-infection. Un lavage nasal, sous anesthésie, est réalisé une ou deux fois pour chaque animal.

Devenir

Les manipulations s'effectuant avec un virus infectieux et ayant lieu dans un laboratoire NSB3, l'ensemble des animaux survivants sont mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Le développement d’un vaccin passe par plusieurs étapes indispensables. La première est sa construction : l’objectif est de présenter des éléments caractéristiques du microbe ciblé au système immunitaire. La seconde correspond aux essais précliniques, qui est le cadre dans lequel s'inscrit notre projet. C’est une étape indispensable pour sélectionner les meilleurs candidats et éviter d’administrer à des humains des vaccins inefficaces ou qui seraient trop inflammatoires. L’utilisation d’animaux est indispensable car elle permet d’évaluer l’efficacité du candidat vaccin en condition réelle, mettant en jeu le système immunitaire complet d’un être vivant. Enfin, la dernière consiste à réaliser des essais cliniques chez l’Homme.

Réduction

Les effectifs ont été calculés grâce au logiciel G*Power, pour une puissance de 80%, un risque alpha de 5%. Au sein de la littérature, ainsi qu’au cours de nos expériences précédentes, nous avons observé et obtenu un écart type de 0.5log (en quantité de particules virales) chez les animaux non immunisés et de 0.4log (en unités arbitraires, pour les sérologies) chez les animaux immunisés. Pour considérer une différence de 1log comme significative (en quantité de particules virales et en unités arbitraires pour les sérologies), nous avons donc utilisé une « taille d'effet » de 2 pour le calcul (Taille d'effet = Δ/écart-type).

Raffinement

Pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse, les animaux seront anesthésiés (isoflurane) pour l’immunisation par voie intramusculaire, la réalisation de prélèvements sanguins, l’infection par voie intranasale et lors de la réalisation d’un lavage nasal (Induction au sein d’une boite : Isoflurane 5%, 2L/min). D’autre part, un traitement analgésique (buprénorphine) sera administré lorsque les hamsters présentent une atteinte de l’état général (mesuré quantitativement grâce à une grille de score). Par ailleurs, des points limites adaptés, entrainant la mise à mort de l’animal, ont été choisis. Les animaux (3 ou 4 par cage) seront hébergés en cage enrichie par un « aspen brick » et des « paper shaving », et ne seront soumis à aucune privation de nourriture ou d’eau. Ils seront surveillés cliniquement et pesés régulièrement durant la période d’expérimentation (quotidiennement après infection). Le transport des animaux entre les 2 établissements utilisateurs sera effectué de la façon suivante (les 2 établissements sont dans le même bâtiment à un étage de distance) : Les cages contenant 3 animaux (enrichies en aspen brick et paper shaving et sans privation de nourriture et boisson) seront opacifiées par l’ajout de couvertures sombres et le transfert aura lieu en période de faible affluence.

Choix des espèces

Mesocricetus auratus est le modèle de référence pour le virus du SARS-CoV-2 puisque la souche originelle de SARS-CoV-2 est capable d’infecter naturellement les hamsters syriens dorés. Animaux âgés de 3 à 10 semaines. Ces âges correspondent aux stades de développement des hamsters utilisés par la communauté scientifique pour les études précliniques sur le SARS-CoV-2.

188 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent plusieurs immunisations sous anesthésie et des prélèvements sanguins, puis sont infectés par le SARS-CoV-2 par le nez, pour évaluer un rappel d'un vaccin à ARN destiné aux pays à faible revenu. Le porteur indique que l'infection provoque une perte de poids entre le quatrième et le septième jour et que tous les animaux survivants sont mis à mort, les manipulations ayant lieu en laboratoire de haute sécurité. Sur le remplacement, il affirme que l'usage d'animaux est "indispensable" pour évaluer le vaccin sur un système immunitaire complet.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans une initiative qui a pour mission de faciliter le développement et d'améliorer l'accès aux médicaments essentiels dans les pays à revenu faible et intermédiaire, et notamment l’accès aux vaccins contre la COVID-19. Ce projet propose d’évaluer chez le modèle hamster l’efficacité d’un boost avec le vaccin ARN ‘générique’ à distance d’une immunisation complète, c’est-à-dire lorsque les anticorps produits suite à l’immunisation avec un autre vaccin commercialisé contre le SARS-CoV-2 auront disparus. L’évaluation de l’efficacité s’effectuera sur 2 critères principaux : - L’Immunogénicité induite par le boost avec le vaccin générique. - La protection induite par le vaccin grâce à la réalisation de challenge infectieux en regardant plusieurs critères d’efficacité : la réplication virale au sein de différents organes (prélèvements post-mortem), la symptomatologie (apparition de signes cliniques et utilisation de points limites adaptés pour prévenir la souffrance animale) et l’histopathologie (réalisée sur des organes prélevés post-mortem). C’est un projet multisite impliquant deux laboratoires différents situés dans le même bâtiment.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de vérifier l'efficacité d'un boost réalisé avec un vaccin 'ARN' générique produit par le Centre de Transfert de la Technologie des vaccins à ARN messager afin de réduire les inégalités dans l’accès aux vaccins contre la COVID-19 dans les pays à revenu faible et intermédiaire.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur : Les animaux seront immunisés par voie intramusculaire (une injection dans une cuisse). Cette intervention dure en moyenne 5 minutes (anesthésie + immunisation). Une dose de rappel sera effectuée 21 jours après cette première injection (dans l'autre cuisse), selon les mêmes conditions, puis une dose de boost environ 210 jours après la dernière injection. Cette immunisation n’induit qu’une douleur légère et de courte durée. Ces immunisations seront réalisées sous anesthésie générale. Des prélèvements sanguins seront réalisées sous anesthésie générale (trois maximum par animal, avec un intervalle d’au moins 21 jours entre deux prélèvements). Cette intervention dure en moyenne 6 minutes (anesthésie + prélèvement). Les animaux sont également pesés régulièrement (1 minute). Après leur transfert dans le deuxième établissement utilisateur : Les animaux, anesthésiés au préalable, seront infectés par le SARS-CoV-2 par voix intranasale. Cette intervention dure en moyenne 4 minutes (anesthésie + infection) et ne s'effectue qu'une seule fois. Les animaux sont également pesés tous les jours (1 minute). Un ou deux prélèvements seront effectués sur chaque animal: le lavage nasal. Il sera réalisé une seule fois par jour, au maximum deux jours consécutivement et dure en moyenne 4 minutes (anesthésie + lavage nasal).

Impact sur les animaux

Concernant l’immunisation : l’administration d’un vaccin chez le hamster induit une douleur légère et de courte durée. Les animaux sont anesthésiés pour l’immunisation par voie intramusculaire, la réalisation de prélèvements sanguins et l’infection par voie intranasale. Les animaux sont également pesés tous les jours. Le SARS-CoV-2 entraine une pathologie pulmonaire non mortelle et spontanément résolutive chez le hamster. Le principal symptôme observé est une perte de poids survenant généralement entre le 4ème et le 7ème jour post-infection. Un lavage nasal, sous anesthésie, est réalisé une ou deux fois pour chaque animal.

Devenir

Les manipulations s'effectuant avec un virus infectieux et ayant lieu dans un laboratoire NSB3, l'ensemble des animaux survivants sont mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Le développement d’un vaccin passe par plusieurs étapes indispensables. La première est sa construction : l’objectif est de présenter des éléments caractéristiques du microbe ciblé au système immunitaire. La seconde correspond aux essais précliniques, qui est le cadre dans lequel s'inscrit notre projet. C’est une étape indispensable pour sélectionner les meilleurs candidats et éviter d’administrer à des humains des vaccins inefficaces ou qui seraient trop inflammatoires. L’utilisation d’animaux est indispensable car elle permet d’évaluer l’efficacité du candidat vaccin en condition réelle, mettant en jeu le système immunitaire complet d’un être vivant. Enfin, la dernière consiste à réaliser des essais cliniques chez l’Homme.

Réduction

Les effectifs ont été calculés grâce au logiciel G*Power, pour une puissance de 80%, un risque alpha de 5%. Au sein de la littérature, ainsi qu’au cours de nos expériences précédentes, nous avons observé et obtenu un écart type de 0.5log (en quantité de particules virales) chez les animaux non immunisés et de 0.4log (en unités arbitraires, pour les sérologies) chez les animaux immunisés. Pour considérer une différence de 1log comme significative (en quantité de particules virales et en unités arbitraires pour les sérologies), nous avons donc utilisé une « taille d'effet » de 2 pour le calcul (Taille d'effet = Δ/écart-type).

Raffinement

Pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse, les animaux seront anesthésiés (isoflurane) pour l’immunisation par voie intramusculaire, la réalisation de prélèvements sanguins, l’infection par voie intranasale et lors de la réalisation d’un lavage nasal (Induction au sein d’une boite : Isoflurane 5%, 2L/min). D’autre part, un traitement analgésique (buprénorphine) sera administré lorsque les hamsters présentent une atteinte de l’état général (mesuré quantitativement grâce à une grille de score). Par ailleurs, des points limites adaptés, entrainant la mise à mort de l’animal, ont été choisis. Les animaux (3 ou 4 par cage) seront hébergés en cage enrichie par un « aspen brick » et des « paper shaving », et ne seront soumis à aucune privation de nourriture ou d’eau. Ils seront surveillés cliniquement et pesés régulièrement durant la période d’expérimentation (quotidiennement après infection). Le transport des animaux entre les 2 établissements utilisateurs sera effectué de la façon suivante (les 2 établissements sont dans le même bâtiment à un étage de distance) : Les cages contenant 3 animaux (enrichies en aspen brick et paper shaving et sans privation de nourriture et boisson) seront opacifiées par l’ajout de couvertures sombres et le transfert aura lieu en période de faible affluence.

Choix des espèces

Mesocricetus auratus est le modèle de référence pour le virus du SARS-CoV-2 puisque la souche originelle de SARS-CoV-2 est capable d’infecter naturellement les hamsters syriens dorés. Animaux âgés de 3 à 10 semaines. Ces âges correspondent aux stades de développement des hamsters utilisés par la communauté scientifique pour les études précliniques sur le SARS-CoV-2.

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une brûlure du troisième degré, une greffe de peau humaine puis une infection par une bactérie, pour tester un traitement au plasma froid contre les biofilms, avant d'être tuées pour prélever la peau et le sang. Le porteur reconnaît que la brûlure est un dommage inhérent au projet, avec un stress thermique et une infection attendus, et évoque un risque de diffusion sanguine des bactéries. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle de peau reconstruite ne reproduit la véritable inflammation et conclut qu'il est "indispensable" de tester in vivo.

Objectifs

La peau est une barrière physique essentielle pour le corps humain : elle protège l’organisme contre le milieu extérieur. Cependant, lorsqu’elle subit une grave agression comme une brûlure profonde ou que les mécanismes de cicatrisation sont mis à mal comme dans le cas d’ulcères diabétiques, la fonction barrière de la peau n’est plus efficace et l’organisme entier peut être mis en danger. En effet, dans le cas des brûlures étendues ou des plaies chroniques, les infections sont très fréquentes et peuvent mener à des complications comme des amputations ou des septicémies, premières causes de mortalité des grands brûlés. Les infections les plus fréquentes sont provoquées par la bactérie pathogène opportuniste Staphylococcus (S.) aureus. Hypothèse de travail et contexte scientifique : Le plasma froid (PF) contient des électrons, des ions positifs et négatifs, des radicaux, des molécules excitées, des ultraviolets (UV) et génère un champ électrique transitoire. La température du gaz généré est proche de la température ambiante. Le PF est capable d’initier des réactions variées dans les systèmes biologiques et pourrait être utilisé dans le traitement de désordre cutané comme les brûlures et les plaies chroniques. Le plasma permet un traitement local et non pas systémique et n’induit pas de sous-produits à éliminer. Nos expériences in vitro non publiées ont démontré que le plasma froid active des molécules toxiques pour les bactéries. Projet : Pour donner suite à ces résultats prometteurs, nous souhaitons caractériser les mécanismes antibactériens du PF et son potentiel anti-biofilm in vivo. Notre objectif est de démontrer que l’application directe de PF sur une brûlure du troisième degré infectée par S. aureus permettrait d’empêcher la formation de biofilms ou de les éliminer, ainsi que d’en comprendre le mécanisme.

Bénéfices attendus

Ce projet, mené sur un modèle de plaie cutanée par brûlure au troisième degré traitée par une greffe de peau humaine et infectée par des bactéries, permettra de révéler le mécanisme d’un traitement direct par plasma sur la désinfection de ce type de plaie et la prévention de formation de biofilms, une nouvelle piste thérapeutique.

Procédures

Type d'intervention sur animaux vivants : - Anesthésie générale (durée 20 min) - Intervention chirurgicale (durée 20 min) - Injection (durée 1 min, 3 fois par jour pendant les 72 premières heures après la chirurgie) - Infection sur la peau (durée 1-2 min) - Analyse du signal bioluminescent (10 min) Nuisances attendues : - Stress physique d’origine thermique - Lésions et infection cutanée

Impact sur les animaux

La brûlure cutanée sera un dommage inhérent au projet. Un stress physique d’origine thermique est donc attendu. De même, des lésions et une maladie sont attendues suite à l’infection des greffons. D'autres dommages pourraient se produire suite à la diffusion par voie sanguine des bactéries à partir du foyer initial cutané (endocardite, ostéomyélite, choc septique) bien qu'ils n'aient pas été observés dans notre étude précédente.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de la procédure qui permettra d‘étudier la formation des biofilms et leur traitement par le plasma froid. Au cours de l'expérimentation, des animaux seront infectés par Staphylococcus aureus. À la fin de l'expérience, des tissus comprenant de la peau infectée et du sang seront prélevés. Le prélèvement de tissus biologiques nécessite l'euthanasie.

Remplacement

Il n'existe pas d'alternative à l’expérimentation animale pour cette étude. En effet, le plasma, en distribuant des espèces actives, agit non seulement sur les cellules cibles mais aussi sur l’équilibre moléculaire in vivo à la fois localement mais aussi de manière plus diffuse autour de la zone traitée. Afin de réduire le nombre d’animaux en expérimentation, la précision et la reproductibilité de la technique ont été validés précédemment sur des cellules cutanées isolées in vitro. Des modèles de peau bio-imprimés en 3D et ex vivo sont également utilisés au laboratoire. Mais ceux-ci ne permettent pas de reconstituer la véritable inflammation et ne contiennent que 3 types de cellules différentes. Il est donc indispensable de tester cette technique in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour mener à bien ce projet est réduit au strict minimum pour pouvoir conclure de façon statistiquement significative, à savoir 6 animaux par condition, à raison de 7 conditions, en 3 réplicas et 42 animaux donneurs, soit un total de 168 souris. Une précédente expérimentation avait permis de montrer que ce nombre d’animaux par groupe était suffisant pour conclure de manière significative.

Raffinement

Avant et après la brûlure et la chirurgie une analgésie sera maintenue. Les souris anesthésiées seront réchauffées pour prévenir l'hypothermie. Pendant 48 heures après la brûlure, une réhydratation des animaux par injection de solution de réhydratation sera réalisée. Des gels hydriques seront disposés dans les cages. Les animaux sortis de l'anesthésie générale seront surveillés pendant 30 min. La mise à mort sera anticipée si l'état de l'animal se détériorait progressivement sans retour à la normale jusqu'à conduire à la prostration, l'immobilité, l'apathie, le hérissement des poils, le tremblement et la cyanose. La pose de la greffe de peau sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Les souris anesthésiées seront réchauffées. L’injection d’analgésie sera administrée 30 min avant la pose d'une greffe de peau, puis toutes les 8 heures 3 fois par jours après la greffe. Une solution de réhydratation sera injectée pour éviter la déshydratation. Les animaux sortis de l'anesthésie générale seront surveillés pendant 30 min. La mise à mort sera anticipée si l'état de l'animal se détériorait progressivement sans retour à la normale jusqu'à conduire à la prostration, l'immobilité, l'apathie, le hérissement des poils, le tremblement et la cyanose. L’analgésique sera injecté 3 fois par jour. Toutes les souris seront pesées quotidiennement. Les souris seront surveillées une fois par jour pour les activités naturelles telles que l'exploration, le repos, l'escalade, le toilettage, la recherche de nourriture, la nidification et le comportement social. Les points limites généraux seront : une perte de poids significative, des changements de comportement, tels que l'agressivité, l'isolement dans le groupe, l'agitation et l'automutilation, ainsi que des réactions autonomes telles que des pupilles dilatées, une respiration rapide et la piloérection persistante. Un autre point limite spécifique sera la surinfection non liée à la procédure.

Choix des espèces

La souris est l'espèce de choix pour l'étude de l'infection par Staphyloccus (S.) aureus : espèce naturellement colonisée par S. aureus comme l'homme, pathogenèse infectieuse proche de celle de l'homme, espèce permissive à l'infection par S. aureus. Il y a une abondante littérature et des modèles expérimentaux bien établis chez la souris de laboratoire. De plus, nous avons l'expérience de l'expérimentation animale sur cette espèce au laboratoire. Cet animal sera bien adapté à notre problématique. En effet, les plaies étudiées sont faiblement étendues limitant la douleur et les dommages : l'utilisation d'une autre espèce mammifère de plus grande taille comme le rat nécessiterait plus de matériel de départ pour un gain nul. Enfin, une précédente étude réalisée chez la souris a donné des résultats très prometteurs. Les souris auront environ 6 semaines à leur livraison. Une phase d’acclimatation d’une semaine minimum sera observée avant que les animaux ne rentrent dans le protocole. Les souris seront utilisées au stade de jeunes adultes (environ 8 semaines). A cet âge, nous limitons les biais liés à l’utilisation de souris vieillissantes. De plus, leur taille est suffisante pour une manipulation et une brûlure aisée de la peau.

3 984 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par une sonde introduite dans l'orifice urinaire sous anesthésie, puis reçoivent des injections répétées d'antibiotiques avant d'être tuées pour prélever vessie et prostate. Le porteur affirme que les souris ne montrent aucun signe extérieur d'infection ni de douleur, tout en reconnaissant un stress lié aux administrations répétées. Il présente l'étude des organes comme "impossible sans modèle animal" et oppose l'"organisme entier" aux analyses en tube à essai jugées "trop simplistes".

Objectifs

Les infections urinaires masculines (IUM) sont fréquentes et difficiles à traiter. Elles sont différentes des infections urinaires survenant chez la femme car chez l’homme, en plus de l’infection des urines et de la vessie il y a également une infection de la prostate. Malgré le traitement par antibiotique, les prostatites (infection de la prostate) récidivent très fréquemment, dans 20% des cas. Il a été montré que dans la grande majorité des cas, ces récidives sont dues à des bactéries qui n’ont pas été tuées par l’antibiotique et qui persistent donc dans la prostate. Ces rechutes vont être à l’origine d’une altération de la qualité de vie des patients et de la prescription de nouveaux antibiotiques qui peuvent provoquer des effets indésirables et sélectionner des bactéries résistantes au traitement antibiotique, rendant ainsi les infections plus difficiles à traiter. Il est donc urgent de comprendre pourquoi ces bactéries persistent dans la prostate, pour en améliorer le traitement. Pour cela, l’étude directe de la prostate est nécessaire, ce qui ne peut être réalisé chez l’humain. L’objectif de notre projet est de comprendre la discordance entre la non-réponse aux antibiotiques (persistance de bactéries dans la prostate) et la supposée sensibilité à l’antibiotique dans les tests habituellement réalisés en laboratoire de ville (examen bactériologique des urines). Pour ce faire, nous utiliserons un modèle d’infection urinaire de souris provoquant une infection de la prostate.

Bénéfices attendus

Notre objectif est d’améliorer le traitement des infections urinaires masculines pour éviter les rechutes.

Procédures

Tous les animaux sont infectés sous anesthésie générale. Les produits anesthésiants sont injectés dans le ventre de la souris à l’aide d’une petite aiguille. Les bactéries sont injectées à l’aide d’une petite sonde rentrée dans l’orifice urinaire. Cette étape d'infection dure environ 3 minutes par animal. -Le traitement antibiotique est réalisé par des injections sous cutanées d’antibiotiques sur un animal vigile (durée du geste d'environ 15 secondes). La fréquence (toutes les 4 à 12 heures) ainsi que la durée du traitement (24 heures à 5 jours) dépendent de l’antibiotique utilisé. -Les urines sont recueillies au cours d’une miction spontanée. -L’animal est mis à mort par surdosage en médicament anesthésiant administré sur animal vigile par une piqûre dans le ventre. -La vessie et la prostate sont ensuite prélevés stérilement après la mort de l’animal. -La durée de l'infection est variable de 48 heures à 21 jours.

Impact sur les animaux

Les souris ne présentent pas de signe extérieur d’infection dans ce modèle. Leur comportement est normal. Elles urinent de manière normale sans signe extérieur évoquant de la douleur au moment de la miction. Les produits administrés ne sont pas douloureux. Les administrations répétées d’antibiotiques pourront avoir un impact sur le bien-être animal et provoquer un stress auquel nous serons particulièrement attentifs.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure afin de prélever stérilement leurs organes (vessie, prostate ) après la mort pour analyser les bactéries qui s'y trouvent.

Remplacement

L’accessibilité aux organes touchés par l’infection urinaire masculine (prostate et vessie) en dehors des urines reste très limitée chez l’homme. Or l’étude simple des urines ne permet pas d’expliquer la récidive de l’infection urinaire. L’analyse des bactéries dans les prostates et les vessies est donc nécessaire et impossible sans modèle animal. L’étude des bactéries et de la réponse à l’antibiotique dans les tubes à essais est trop simpliste et ne rend pas compte des facteurs multiples qui sont impliqués dans un organisme entier.

Réduction

Grâce à une analyse statistique, nous réduisons au minimum le nombre de souris utilisées tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs c'est à dire qui nous permettent de conclure de manière fiable sur le plan mathématique. Les contrôles ayant été infectés par la même souche seront comptabilisés dans les analyses des différentes procédures ce qui pourra permettre de diminuer le nombre de contrôles dans une procédure ultérieure. De nombreuses analyses dans les tubes à essais seront réalisées en amont pour choisir les bactéries, les antibiotiques et les conditions les plus pertinentes afin de réduire les animaux utilisés. Nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d’analyses possibles à partir d’un même animal. Tous les organes prélevés sont congelés pour pouvoir les réanalyser au besoin ultérieurement.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi c'est à dire avec des cotons pour jouer par exemple, avec une semaine d’adaptation avant l’expérimentataion. Un suivi quotidien sera réalisé. L’infection urinaire est réalisée sur une souris anesthésiée. Les souris seront euthanasiées si leur état se dégrade brusquement ou si elles présentent un état de souffrance. Une grille de score est prévue à cet effet qui sera également remplie quotidiennement.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme espèce animale pour réaliser les expériences de ce projet est pertinent car l’infection urinaire chez la souris est très proche de celle chez l’Homme. Ce modèle est utilisé depuis de nombreuses années dans la littérature scientifique. Nous étudierons des souris adultes de 8 à 12 semaines et uniquement de sexe masculin car la prostatite ne survient que chez les hommes adultes.

2304 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont inoculées avec des souches du virus de la fièvre de la vallée du Rift, par injection ou par voie nasale sous anesthésie, puis subissent jusqu'à quatre prélèvements de sang, pour comparer la pathogénicité de souches isolées sur le terrain. Le porteur indique que l'infection est "le plus souvent mortelle" et provoque perte de poids, prostration, signes d'encéphalite et convulsions, les souris étant mises à mort dès les premiers signes cliniques. Il conclut que le recours à la souris est "indispensable" du fait de sa sensibilité au virus.

Objectifs

Ce projet a pour but d'évaluer la pathogénicité de nouvelles souches de virus de la fièvre de la Vallée du Rift isolées sur le terrain (pays africains) lors de foyers infectieux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'obtenir des indications pertinentes et importantes (différences de sévérité clinique et de virémie - niveau et cinétique) sur le niveau de pathogénicité des nouvelles souches virales isolées, dans un contexte expérimental parfaitement contrôlé, par comparaison avec une ou deux souches de référence. Ces données pourront être confrontées avec des observations de terrain lorsqu'elles seront disponibles.

Procédures

Les souris seront soumises : - à l'inoculation d'une suspension virale soit par injection (une fois, 2 secondes), soit par voie intranasale après anesthésie par injection (une fois, 2 secondes, durée d'anesthésie 20 minutes); - au maximum à 4 prélèvements de sang de faible volume (durée 15 secondes) espacées de 3 jours.

Impact sur les animaux

L'infection par inoculation intrapéritonéale n'engendre qu'une sensation légèrement douloureuse très brève. L'inoculation par voie intranasale est réalisée sous anesthésie générale et n'a aucun impact au réveil de la souris. Les prélèvements de sang entraînent une douleur de piqûre au point de prélèvement qui dure moins de 10 secondes. Les volumes prélevés ont été réduits pour n'entraîner aucun risque d'anémie. La réalisation de ces gestes par un opérateur expérimenté contribue à réduire l'effet indésirable ressenti par les souris. L'inoculation du virus de la fièvre de la Vallée du Rift à des souris de laboratoire induit une infection le plus souvent mortelle. Cliniquement, une perte de poids apparaît au bout de 3-4 jours avant que les souris développent des symptômes sévères (prostration, signes d'encéphalite, convulsions) qui précèdent la mort de quelques heures. Néanmoins, les animaux n'attendront jamais ce stade et seront mis à mort dès l'apparition des premiers signes cliniques.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort car elles seront infectées par un agent infectieux dangereux pour la santé humaine.

Remplacement

La caractérisation des nouvelles souches virales impose d'établir leur niveau de pathogénicité par comparaison avec des souches de référence. Ce sera fait in vitro sur des cultures de cellules, qui ne permettent toutefois pas de prédire la pathogénicité in vivo (en particulier la répartition du virus entre les organes, qui peut varier d'une souche à l'autre). Le recours à un modèle animal est indispensable et la souris est le plus adapté en raison de sa sensibilité au virus et de la somme de connaissances accumulées sur ce modèle d'infection.

Réduction

Les nombreuses données que nous avons déjà produites au laboratoire nous permettent d'estimer que des groupes de 7 à 10 souris seront nécessaires et suffisants pour obtenir des informations fiables dans des expériences de suivi clinique. L'effectif sera ajusté en fonction des résultats (sévérité clinique et charge virale). Afin de réduire le nombre d'animaux à utiliser, les expériences seront d'abord réalisées sur des femelles, chez qui l'infection est moins rapide. Seules les doses et souches intéressantes seront ensuite répliquées chez les mâles. De même, une première voie et première dose sera testée en priorité, d'autres doses et voie d'administration ne seront pas systématiquement réalisées

Raffinement

Les souris seront entretenues dans des conditions d'hébergement normales (isolateurs, cages de 5 souris pour les femelles et autant que possible en petits groupes de 2-3 pour les mâles). Les gestes techniques seront réalisés par un opérateur très expérimenté les maîtrisant parfaitement. Les sourisseront suivies chaque jour, puis deux fois par jour après l'apparition des premiers symptômes pour mettre en œuvre des points limites précoces mais qui ne perturbent pas les conclusions des expériences. De l'aliment gélifié sera mis à disposition des souris sur la litière pour les aider à s'alimenter dès observation de difficultés locomotrices.

Choix des espèces

La souris est une espèce adaptée à l'étude du virus de la fièvre de la vallée du Rift en raison de sa sensibilité spontanée et des nombreuses connaissances produites sur ce modèle d'infection. Elle est compatible avec un hébergement en isolateur indispensable compte tenu du niveau de risque associé à ce virus. Nous utiliserons des jeunes adultes (9-12 semaines), âge auquel le modèle d'infection a été validé dans les études antérieures.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent 29 gavages sur 22 semaines, un régime riche en graisse, un produit irritant ajouté à l'eau de boisson pour accentuer une colite et plusieurs prélèvements sanguins, pour tester une association de bactéries, d'extraits de plante et d'activité physique censée réduire l'inflammation intestinale. Les retombées annoncées pour les patients atteints de la maladie de Crohn, une thérapie personnalisée modulant le microbiote, sont renvoyées au long terme. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire" de valider le cocktail à l'échelle d'un "organisme entier" et que l'ajout de l'activité physique impose de recourir à la souris.

Objectifs

Le microbiote intestinal joue un rôle clé dans le développement et l’entretien des pathologies inflammatoires chroniques de l’intestin. En effet, dans de nombreuses pathologies, certaines populations de bactéries ‘bénéfiques’ pour l’hôte sont diminuées au détriment de bactéries ‘agressives’ aux propriétés pro-inflammatoires. Dans la maladie de Crohn, il a été observé une quantité anormale de bactéries aux propriétés adhérentes et invasives au niveau de la muqueuse de l’intestin grêle des patients. Une fois attachées à la muqueuse iléale, ces bactéries adhérentes et invasives peuvent traverser la muqueuse et déclencher ou aggraver l’inflammation intestinale. Chez l’animal, ces bactéries adhérentes et invasives sont capables d’aggraver une inflammation intestinale déjà existante et elles sont également capables de coloniser l’intestin et d’induire une inflammation intestinale. A ce jour, il n’existe pas de traitement pour guérir définitivement la maladie de Crohn, les traitements actuels visent à contrôler les poussées inflammatoires sans cibler les causes de l’inflammation. Ce projet a pour but de tester l’efficacité d’une stratégie ciblant le microbiote, et plus précisément les bactéries adhérentes et invasives, afin de limiter leur présence et ainsi, diminuer une des origines de l’inflammation intestinale. Lors du projet, une combinaison de bactéries dites « bénéfiques » et d’extraits de plante, préalablement sélectionnée in vitro pour leurs propriétés à lutter contre les bactéries adhérentes et invasives, sera administrée à des souris, en plus d’une activité physique. L’efficacité de ce traitement à éliminer les bactéries agressives présentes dans le microbiote digestif des animaux et à restaurer un microbiote « sain » dans le but de diminuer les symptômes inflammatoires sera évaluée.

Bénéfices attendus

Les investigations chez l’animal permettront de compléter les résultats des analyses in vitro obtenus avec la combinaison bactéries/extraits de plante à l’échelle d’un organisme entier, en prenant en considération l’environnement du tractus digestif, le microbiote intestinal et le système immunitaire. A court terme, les bénéfices attendus de ce projet sont d'éliminer spécifiquement les bactéries adhérentes et invasives de l’intestin afin de diminuer les symptômes inflammatoires. Plus largement, le bénéfice attendu est de restaurer un microbiote intestinal global « sain » et ainsi, de protéger et renforcer la muqueuse intestinale. A moyen terme, ce projet permettra de comprendre l’importance de combiner ou non un traitement de type « probiotique » avec une activité physique. A plus long terme, cette investigation permettra de mieux prendre charge les patients atteints de maladie de Crohn en fonction de la composition de leur microbiote intestinal en leur proposant une thérapie personnalisée modulant le microbiote qui inclura une alimentation adaptée, une activité physique, et une prise de probiotiques et d’extraits de plante.

Procédures

-Dans le cadre de ce projet, les animaux recevront par voie orale (gavage) 1/le cocktail de bactéries-extraits de plante (26 administrations réparties sur 6 semaines), les bactéries adhérentes et invasives (1 administration) et le traceur fluorescent pour suivre la perméabilité intestinale (2 administrations), soit 29 gavages/animal sur la totalité du protocole de 22 semaines. -Les animaux auront 2 prélèvements sanguins en cours de protocole (en semaines 18 et 21). Ce prélèvement sera réalisé sur animal endormi sous anesthésie gazeuse. Un dernier prélèvement sera réalisé sur animal anesthésié sans réveil. - Les propriétés contractiles (force maximale isométrique et puissance maximale concentrique) des muscles fléchisseurs plantaires seront évaluées une fois sous anesthésie à l’isoflurane. Les contractions musculaires seront évoquées électriquement à l’aide d’électrodes de surface (technique non invasive).

Impact sur les animaux

L’administration d’un régime alimentaire riche en graisse va induire une prise de poids accompagnée d’une légère inflammation intestinale. En fin de protocole, les animaux vont recevoir dans l’eau de boisson une faible dose d’un produit irritant qui peut accentuer les symptômes de colite. L'activité physique va permettre de diminuer la prise de poids des animaux placés sous régime riche en graisse. Le projet impose que les animaux soient placés un par cage, de réaliser des gestes de gavage et des prélèvements de fèces et de sang, ce qui peut induire un stress chez l’animal.

Devenir

L’ensemble des animaux utilisés lors de la procédures (72 animaux) sera mis à mort à la fin des expérimentations. Il est nécessaire de prélever un ensemble d’échantillons biologiques chez l’animal à l’issu de l’expérience pour compléter les données issues des observations cliniques (signes de colite), des analyses de microbiote fécal, ou des paramètres inflammatoires déterminés suite à des dosages dans les fèces des animaux.

Remplacement

Avant de réaliser l’essai chez l’animal, le cocktail de bactéries/extraits de plante a été finement analysé in vitro, sur des modèles de cellules en culture (cellules épithéliales intestinales humaines et cellules immunitaires) afin de sélectionner la meilleure combinaison pour lutter contre les bactéries adhérentes et invasives retrouvées chez les patients atteints de maladie de Crohn. Cependant, il est nécessaire de valider l’efficacité de ce cocktail à l’échelle d’un organisme entier, afin de prendre en compte l’effet du passage digestif (pH acide de l’estomac, sels biliaires…) et la présence du système immunitaire et du microbiote intestinal. Mais surtout dans ce protocole, nous voulons savoir si l’activité physique peut augmenter l’effet bénéfique du cocktail, ce qui impose de passer chez l’animal.

Réduction

-Le nombre d'animaux a été réduit dans la mesure où cela ne compromet pas les objectifs du projet. Le nombre de 8 animaux/lot devrait permettre de réaliser des tests statistiques adaptés d’après l’ensemble des données animales antérieures. -Le fait de réaliser la procédure en 2 temps permet d’intégrer un ‘go/no go’ dans la procédure : le protocole sera mené sur 24 des 72 animaux avec des lots justement pensés, permettant de juger si le modèle reflète suffisamment les symptômes de la maladie de Crohn (inflammation intestinale de bas grade et déséquilibre du microbiote intestinale). Si celui-ci est le reflet de la maladie, alors l’étude sera poursuivie sur le second groupe d’animaux. -Les études antérieures ont montré que le nombre de bactéries adhérentes et invasives dans les fèces des animaux était le reflet du nombre de bactéries associées à la muqueuse. Cette mesure permet de réaliser un suivi de colonisation en fonction du temps de façon non invasive et sans douleur pour l’animal. La quantification des bactéries dans les fèces en fonction du temps permet donc de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Une période d’acclimatation sera réalisée avant le début de la procédure (une semaine). Les animaux auront libre accès à l'eau et la nourriture. Les animaux seront disposés dans des cages de 1500 cm² en IVC (individually ventilated cages) afin de pouvoir y placer une roue d’activité connectée. L’environnement sera donc enrichi avec plusieurs types d’enrichissements : lamelles de cartons compressées et maisonnettes ou tremplins avec abris. Lors de la phase 2 du projet, les lots sédentaires seront placés sur un portoir à distance des groupes avec activité physique afin de diminuer les potentiels effets délétères du bruit que peuvent produire les roues. Les animaux seront surveillés quotidiennement. Il sera administré aux souris montrant des signes de souffrance un traitement à base de buprénorphine (0,05mg/kg en sous-cutanée) pour réduire leur douleur. Des critères d’arrêt ont été déterminés. Si un animal rempli ces 3 critères lors du protocole (points limites) : 1/perte de poids corporel > à 15% par rapport au début de l’étude 2/modification de l’activité (hypoactivité importante ou prostration ou spasmes abdominaux ou réticence à se déplacer) ou de la posture (dos vouté, décubitus ventral ou latéral) ou de la respiration (pénible ou rapide avec effort) 3/signes cliniques d’inflammation intestinale (arrière train ou anus souillés avec diarrhée et/ou présence de sang dans les fèces ou au niveau de l’anus) -->il sera immédiatement sorti du protocole, anesthésié à l’isoflurane (2,5%) et mis à mort par dislocation cervicale.

Choix des espèces

Le modèle choisi est la souris C57BL/6 qui est un modèle employé régulièrement pour étudier l’activité physique spontanée sur roue. C’est également un modèle de choix pour la réalisation d’un modèle de colite induite par un produit chimique placé dans l’eau de boisson. L’ensemble des souris utilisées lors de ce projet seront utilisées au stade de jeune adulte, (6-8 semaines) reflétant le pic d’incidence de la maladie de Crohn (15-30 ans).