Maladies infectieuses

396 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur soumet une partie des souris à une irradiation du corps entier suivie d'une greffe de cellules, et l'ensemble à des injections intrapéritonéales répétées et à des prélèvements sanguins rétro-orbitaux tous les quinze jours pendant trois mois, qu'il reconnaît pouvoir altérer leur vision. Ce travail vise à comprendre le rôle d'une molécule dans une forme agressive de mastocytose, un cancer du sang. Il cite un "dépôt de brevet" et des financements parmi les retombées attendues et affirme le modèle animal "indispensable", la complexité des interactions cellulaires n'étant selon lui pas reproductible in vitro.

Objectifs

Les mastocytoses systémiques (MS) sont des formes incurables de maladies du sang particulièrement difficiles à traiter. Ces maladies très hétérogènes allant de formes indolentes à des leucémies fatales, sont caractérisées par l’accumulation et l’activation incontrôlée des cellules immunitaires appelées mastocytes dans la moelle osseuse. Plus de 30% des patients atteints de MS agressives ne répondent pas aux traitements administrés en clinique. Il est donc essentiel de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le métabolisme des cellules est fortement perturbé dans les cellules cancéreuses afin de répondre à leur besoin en énergie pour proliférer de façon aberrante. Nous avons donc identifié les altérations métaboliques dans les mastocytes de patients afin de tester le potentiel clinique de leur inhibition. Nous avons mesuré une forte concentration de kynurénine (L-Kyn), une petite molécule chimique, dans le plasma des patients atteints de formes agressives comparé aux indolentes et confirmé l’activité de la voie dont elle fait partie dans des mastocytes issus de la moelle osseuse de patients.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément comment la L-Kyn dont la concentration est élevée de façon physiologique dans le plasma des patients atteints de MS agressive, exacerbe les fonctions mastocytaires en régulant directement les fonctions des mastocytes ou leur microenvironnement (adipocytes médullaires). Ces analyses nous permettront d'une part de tester le potentiel de la voie de la kynurénine comme cible thérapeutique dans les MS agressives dans un contexte physiologique mais également d'identifier de nouvelles cibles en aval de la L-Kyn qui pourraient également être pertinentes. Cette étude est la première étape vers le développement de nouveaux médicaments ciblant ces régulations en combinaison ou non avec les traitements utilisés pour cette pathologie en routine clinique. Elle permettra également le dépôt de brevet et de financements indispensables pour la poursuite de ce projet. Ces pathologies agressives sont particulièrement invalidantes ; la médiane de survie des patients au diagnostic est de moins de 3 ans et de moins de 6 mois pour les formes les plus agressives. Cette étude est donc indispensable pour améliorer le devenir des patients et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques afin de prévenir ou freiner le développement de ces pathologies.

Procédures

Les animaux (procédures 1-2) recevront une injection intra-péritonéale sur animaux vigiles 3 fois par semaine pendant une semaine puis 5 fois par semaine pendant deux semaines. Les prélèvements sanguins seront réalisés en rétro-orbital sous anesthésie à l'isoflurane tous les 15 jours pendant 3 mois ou jusqu’à l’atteinte des points limites. Les animaux (procédures 3-5) recevront une irradiation sous-létale sur corps entier sur animaux vigiles. Une greffe intraveineuse en rétro-orbital unique sera réalisée. Une injection intra-péritonéale sur animaux vigiles 5 fois par semaine sera réalisée pendant deux semaines. Les prélèvements sanguins en rétro-orbital seront réalisés sous anesthésie à l'isoflurane tous les 15 jours pendant 3 mois ou jusqu’à atteinte des points limites.

Impact sur les animaux

La manipulation et la pesée pourraient entraîner du stress chez les animaux. Une mauvaise tolérance à l’irradiation sous-létale pourrait entraîner une inactivité et une mobilité réduite pendant quelques heures après l’irradiation (rare). Le même phénotype pourrait être observé après une greffe partielle des cellules injectées quelques jours après la transplantation. Une perte de poids pourra être observée et sera monitorée. Les prises de sang répétées dans le sinus rétro-orbital pourraient causer des problèmes de vision aux souris.

Devenir

La totalité des individus impliqués seront mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

L’utilisation de plusieurs modèles cellulaires in vitro seuls ne permet pas de rendre compte de la complexité des interactions cellulaires impliquées dans la maladie. Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal afin de valider notre hypothèse. A cette étape du projet, il n’existe aucune autre méthode satisfaisante qui pourrait se substituer à l’expérimentation animale.

Réduction

Pour chacune des procédures, nous limiterons au nombre minimum d'animaux permettant de caractériser l'efficacité des molécules testées. Le calcul d’effectif pour chaque groupe dans chaque procédure sera réalisé en utilisant un calcul d'effectif pour chaque groupe dans chaque procédure sera réalisé en utilisant un calcul statistique approprié. Cette approche nous permet de conserver une méthode scientifique rigoureuse tout en réduisant au minimum le nombre d'animaux nécessaires. Nos approches pour évaluer l'efficacité de chaque composé étudié comprendront des groupes contrôles. Afin de réduire à son minimum le nombre d'animaux et dès que cela sera possible, ces groupes contrôles seront commun à plusieurs tests d'efficacité. Enfin, afin de réduire le nombre d'animaux issus de nos propres élevages, des animaux des deux sexes seront utilisés dans nos expériences.

Raffinement

Les expérimentations seront débutées au plus tôt 7 jours après réception des souris au sein de la zone d’expérimentation pour permettre leur acclimatation. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Les expérimentateurs et le personnel qualifié de l'animalerie sont formés pour limiter au maximum le stress des animaux lors de leur manipulation. Les animaux utilisés dans ces expériences seront soumis à une surveillance quotidienne. Les objectifs de toute procédure étant de donner à l’animal la meilleure qualité de vie possible et de garantir que toute souffrance due aux procédures soit détectée et réduite. Pour ce faire, le suivi de la maladie se fera par des mesures cinétiques utilisant des procédés non invasifs. Dès l’apparition des points limites, que nous avons choisis le plus précoce possible pour que l’animal reste asymptomatique, l’animal sera mis à mort. Par conséquent, cette mise à mort intervient avant l’apparition de symptômes et de nuisances dues à la pathologie. Nous optimiserons les conditions d'hébergement des animaux par la présence d'enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactes et/ou coton) et par leur maintien en groupes de 4 ou 5 afin d'éviter le stress de l'isolement. Pour limiter au maximum la souffrance des animaux, les prélèvements seront effectués sous anesthésie, et une analgésie sera mise en place si nécessaire (voir points limites).

Choix des espèces

Le projet nécessite l'utilisation d'une espèce de la classe des mammifères proche de l'homme pour sa physiologie (ici l'hématopoïèse). Sur cette base, en adéquation avec nos objectifs, le modèle murin apparaît le plus pertinent. En effet, bien que des formes ancestrales de systèmes hématopoïétiques aient été identifiées chez les Urochordés (Ciona Intestinalis), l’hématopoïèse donnant naissance à un système immunitaire adaptatif n’est présente que chez les vertébrés. Ceci restreint l’étude des mécanismes moléculaires de l’hématopoïèse à ces derniers parmi lesquels, le poisson zèbre et la souris, sont les modèles génétiques les mieux caractérisés. L’apport historique des modèles souris dans l’étude du système hématopoïétique, les outils développés chez cette espèce et l’absence d’expertise sur le poisson zèbre au sein de l’institut satisfait aux exigences d’utilisation de la souris comme espèce la moins susceptible de ressentir de la souffrance ou de la douleur pour les expérimentations proposées. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ces types de modèle de MS et ce type d'injection de cellules néoplasiques mastocytaires en intraveineux, c'est à dire des souris "jeunes adultes" âgées de 6 à 10 semaines au moment de la transplantation et/ou des injections intra-péritonéale prévues.

108 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, une cavité est creusée dans leurs molaires puis laissée ouverte 24 heures pour déclencher une inflammation de la pulpe dentaire, avant l'application d'un hydrogel expérimental. Le porteur reconnaît une douleur buccale et une gêne pour s'alimenter, et prévoit l'euthanasie de groupes de six animaux à 24 et 72 heures pour récupérer les molaires. Il affirme que les expériences in vitro ne reproduisent pas les interactions cellulaires complexes de l'inflammation et que le recours au rongeur reste "nécessaire" pour valider le biomatériau.

Objectifs

La carie dentaire touche environ 98% de la population en Europe. La dent représente un environnement spécialisé où la pulpe dentaire est un tissu conjonctif mou entouré d'une barrière minérale dure faite de dentine et d'émail. Lors d’une carie, les micro-organismes pénètrent l’émail et la dentine et déclenchent ensuite une réponse inflammatoire/immunitaire dans la pulpe dentaire (pulpite). Cette pulpite peut entraîner des douleurs dentaires très aiguës (la forme la plus répandue de douleur orofaciales). Le traitement des dents en pulpite est encore controversé. Le traitement « classique » canalaire radiculaire présente un bon taux de succès (85%) : il consiste après mise en forme et désinfection à l’aide d’une solution d’hypochlorite de sodium 2,5% à obturer de manière tridimensionnelle l’intégralité de l’endodonte avec un ciment et de la gutta percha (polymère naturel). Cependant, les dents traitées sont plus cassantes que les dents non traitées ; il y a une perte des capacités de cicatrisation, et un risque de dissémination bactérienne dans l'organisme subsiste toujours après traitement radiculaire. Une approche alternative consiste à retirer uniquement la partie enflammée de la pulpe pour maintenir et préserver son potentiel de guérison. Les avantages de ces thérapeutiques sont : le maintien des mécanismes de défense, la perception de la douleur comme système d'alerte, la cicatrisation et la régénération des tissus, l'achèvement de la formation des racines chez les jeunes patients. Malgré ces avantages évidents, cette approche alternative est encore peu pratiquée notamment parce que le résultat est difficilement prévisible en raison de l'état inflammatoire du tissu pulpaire restant. En effet, l'inflammation pulpaire est souvent trop importante et entraîne une nécrose pulpaire. L'originalité de ce projet est de contrôler la réponse immunitaire qui est le principal facteur de succès.

Bénéfices attendus

Ce modèle nous permettra d’induire une inflammation dans un système global ce qui n’est malheureusement pas possible avec les expérimentations in vitro. Nous pourrons alors évaluer l’effet anti-inflammatoire de ces nouveaux hydrogels d'acide hyaluronique à base de nanoémulsion chargée en lipoxine A4 (LXA4). Les nouvelles stratégies thérapeutiques utilisant des LXA4, qui améliorent la résolution de l’inflammation pourraient avoir un meilleur rapport bénéfice/risque. A court terme ce protocole nous permettra de répondre à plusieurs questions. Tout d’abord, nous pourrons choisir une formulation d’hydrogel, la plus efficace pour favoriser la résolution de l’inflammation. Nous pourrons également valider l’effet de la LXA4 in vivo dans un système complexe et non seulement in vitro sur les macrophages. Notre proposition peut également être avantageuse par rapport à d'autres systèmes d'administration de médicaments qui ont des effets immunotoxiques indésirables potentiels. A plus long terme, ce protocole marquera une avancée dans l’élaboration d’un système complexe permettant de relarguer des molécules anti-inflammatoires telles que la LXA4 de manière contrôlée dans le temps. En clinique, l’objectif final sera d’apporter une alternative supérieure en termes de cicatrisation et de régénération des tissus concernés dans le cadre des pulpites (maintien des mécanismes de défense, perception de la douleur comme système d'alerte, cicatrisation et la régénération des tissus, l'achèvement de la formation des racines chez les jeunes patients). Bien que notre perspective se concentre sur le domaine de la dentisterie, l'utilisation de notre proposition thérapeutique pourrait être déployée afin de traiter de multiples maladies inflammatoires et/ou des défauts osseux.

Procédures

Le jour de la procédure, les rats seront anesthésiés. L’ouverture buccale sera maintenue par instrument dentaire. Pour induire l’inflammation, nous formerons une cavité à l'aide d'instruments dentaires sur les molaires, la cavité formée sera rincée au sérum physiologique avant d’être laissée à l’air libre durant 24h. Après 24h d’exposition, la cavité sera de nouveau rincée au sérum physiologique pour éliminer tous débris éventuels puis nous viendrons injecter dans la cavité la proposition thérapeutique (ou bien les solutions contrôles) à l’aide d’une seringue, le volume sera adapté à chaque cavité de manière à la remplir. La cavité sera ensuite refermée avec un biomatériau utilisé en dentisterie. Pour chaque groupe, 6 rats seront euthanasiés à 24h et 6 autres à 72h. Nous récupérerons les maxillaires de manière aseptique afin de procéder aux différentes analyses.

Impact sur les animaux

Ce modèle entraine une inflammation « contrôlée » et limitée du tissu pulpaire. Ce protocole de classe modérée pourrait conduire à : - Une douleur au niveau buccal après avoir exposé le tissu pulpaire à l’environnement oral - Une gêne pour s’alimenter (normalement pendant 24h) liée aux dents laissées ouvertes. Le design de l’étude permet de conserver un coté sans atteinte dentaire permettant une alimentation normale. Nous resterons bien évidemment très attentifs sur tout comportement anormal des animaux de manière à soulager leur douleur si celle-ci venait à apparaître.

Devenir

Les animaux doivent être mis à mort afin de pouvoir récupérer les molaires traitées et controlatérales (qui serviront de témoins).

Remplacement

Cette étude prend en compte la règle des 3R. Les expériences in vitro ne permettent malheureusement pas de mimer les interactions complexes intervenant entre les différents acteurs cellulaires (macrophages, neutrophiles, monocytes…) et les différents systèmes (immunitaires, vasculaires…). Il est donc nécessaire de travailler sur des systèmes biologiques complexes représentés par les animaux afin de mieux étudier les mécanismes mis en jeu lors de la réponse inflammatoire. L’utilisation de rongeurs reste nécessaire afin de valider les propriétés des biomatériaux chargés en termes de biocompatibilité, et bioactivité. Il n’existe malheureusement pas de solution de remplacement complet ou par des invertébrés.

Réduction

Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les formulations d’hydrogels ont été testées et sélectionnées en amont pour leur biocompatibilité et leur caractère anti-inflammatoire in vitro. Le nombre de 6 animaux par groupe est calculé à partir d’un test de puissance statistique pour une différence significative de 20%, un écart-type de 10% et un risque consenti de 5%.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse, les animaux seront manipulés plusieurs jours avant l’expérimentation dans un but d’habituation et leur environnement sera enrichi par alpha dri. Les rats seront hébergés à raison de 3 rats par cage. Nous raffinerons également en réduisant les douleurs via : - 1. Une anesthésie réalisée localement avant toute procédure sur la dent. - 2. Des antalgiques en post opératoire. Les rats seront observés et pesées quotidiennement jusqu’à la fin de l’expérimentation. Par ailleurs, des points limites ont été identifiés et les procédures de raffinement à mettre en oeuvre lors de l’atteinte de ces points limites ont été décrites. De plus, pour faciliter la prise alimentaire, l’alimentation des rats sera posée sur le sol de manière à être plus accessible. Enfin, les analyses menées sur chaque animal seront complètes. Les molaires traitées et les molaires controlatérales seront prélevées pour effectuer des analyses complètes afin d'exploiter le tissu extrait dans sa totalité.

Choix des espèces

Notre choix se base donc sur l’étude de la bibliographie. Notre projet fondé sur une approche translationnelle est un préalable nécessaire à un développement préclinique sur d'autres espèces plus proches de l'Homme. Ce modèle est bien maitrisé dans notre laboratoire. Le modèle de carie induite sur la molaire de rat est couramment utilisé dans la littérature pour l’étude des biomatériaux et/ou la réponse immunitaire de la pulpe dentaire tout particulièrement pour l’approche moléculaire, histologique et imagerie 3D. Nous avons choisi d’utiliser uniquement des mâles. Il existe des différences liées au sexe dans la prévalence des lésions carieuses chez l’Homme. Ces différences sont dépendantes d’un grand nombre de variables (milieu socio-économique, accès à l’éducation, accès aux soins). En revanche ces différences n’ont jamais été démontré dans des modèles animaux de caries dentaires. La réponse immunitaire est capitale dans la cicatrisation et il peut y avoir des différences de réponse entre mâles et femelles. Nous prévoyons d’utiliser que des mâles pour justement éliminer ce biais et cela correspond de plus à des publications qui nous ont servi de références pour l’élaboration du protocole. Les animaux reçus auront 7 semaines, ils auront une semaine d’acclimatation dans l’animalerie avant le début du protocole. Les rats auront donc 8 semaines au début du protocole et presque 9 semaines à la fin du protocole. Ce choix correspond à notre volonté de travailler sur de jeunes adultes afin d’éviter les effets liés à la sénescence, de plus cela correspond aux protocoles standards retrouvés dans la littérature concernant ce modèle d’inflammation de la pulpe dentaire.

108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante sous la peau un dispositif puis on y dépose la bactérie Staphylococcus aureus, avant un prélèvement du cœur et une dislocation cervicale, pour tester un implant recouvert d'une molécule antibactérienne contre le biofilm. Le porteur écarte tout anti-inflammatoire, qui risquerait d'aggraver l'infection, et n'attend surtout que des atteintes locales. Il répond à la "demande de l'industriel" et présente l'essai in vivo comme un "besoin incontestable".

Objectifs

L’objectif de ce projet d’évaluer l’efficacité d’un implant coaté d’une molécule antibactérienne sur la réduction du biofilm microbien dans un modèle d’infection d’implant sous-cutané à Staphylococcus aureus chez la souris.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de pouvoir développer un matériel innovant permettant de réduire ou même d’inhiber l’apparition d’un biofilm bactérien sur un matériel étranger chez l’homme. Les biofilms bactériens sont généralement définis comme des agrégats de cellules bactériennes attachés à une surface et enrobés d’une matrice visqueuse. La formation d’un biofilm se fait selon un modèle bien établi et suit différentes étapes (adhésion, croissance, maturation et dispersion). On estime que 80 % de la biomasse microbienne de notre planète réside sous forme d’un biofilm. Le biofilm protège les bactéries et leur permet de survivre dans des conditions environnementales hostiles. Les bactéries du biofilm peuvent résister à la réponse immunitaire de l’hôte et sont beaucoup plus résistantes aux antibiotiques et aux désinfectants que les cellules bactériennes planctoniques (non adhérentes). Ainsi, la présence de biofilm dans les infections est particulièrement redoutée en clinique (ex : prothèse orthopédiques, sondes de ventilation mécanique, cathéters veineux…). Parmi les espèces bactériennes largement retrouvées dans les biofilms figurent les espèces du genre Staphylococcus sp.

Procédures

La mise en place de l’implant coaté ou non en position sous-cutanée chez la souris sera réalisée sous anesthésie fixe en intra-péritonéal (kétamine 50mg/kg + xylazine 10 mg/kg). Les flancs seront rasés puis désinfectés par un cycle Bétadiné. Une incision cutanée de 0.5cm sera réalisée stérilement et l’implant sera inséré dans la poche ainsi constituée. L’infection bactérienne sera effectuée dans un même temps en déposant 50µL de l’inoculum au contact de l’implant dans la poche sous-cutanée. Deux points de suture seront appliqués à l’issue. Les souris concernées par la phase 1 du projet seront soumis à un prélèvement intracardiaque sous anesthésie fixe (kétamine 50mg/kg + xylzaine 10 mg/kg) avant la mise à mort par dislocation cervicale. Toutes les autres souris seront mises à mort comme précédemment cité sans prélèvement intracardiaque.

Impact sur les animaux

S’agissant d’un matériel étranger non connu les effets indésirables attendus pourraient principalement être de nature tissulaires (nécrose au site d’implantation, œdème, hématome, altération de la morphologie tissulaire. Aucune atteinte systémique liée à l’infection n’est attendue (vérifié dans d’autres études réalisées par le laboratoire).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude afin de récupérer l’implant et le tissu environnant pour une quantification bactérienne.

Remplacement

Lors du développement de nouvelles stratégies anti-infectieuses, les molécules ou matériaux sont tout d’abord testées par des méthodes traditionnelles in vitro. Ces études in vitro sont indispensables à l’avancée des travaux de recherche et développement mais ne suffisent pas à déterminer l’efficacité en conditions réelles des traitements en développement. En effet, de nombreux échecs thérapeutiques ont été décrits malgré une bonne sensibilité in vitro du pathogène à la molécule d’intérêt. Ainsi, la mise en place de méthodes d’évaluation préclinique in vivo des agents anti-infectieux dans des systèmes plus complexes constitue un besoin incontestable et est devenue l’une des exigences des sociétés savantes telles que l’EMEA (European Medicines Agency).

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude a été réduit au maximum (5 souris pour la phase pilote et 10 souris pour la troisième partie du projet) qui permettront de répondre aux hypothèses énoncées et permettre une analyse statistique fiable (estimation de la diminution de la charge bactérienne sur l’implant et dans le broyat du tissu environnant par une analyse Anova (test post hoc Bonferroni)). Pour la première partie (étude de la toxicité, le nombre d’animaux a été réduit à 5 par groupe).

Raffinement

D’une façon générale pour l’ensemble de l’étude, la prise d’anti-inflammatoires est contre indiquée du fait de l’interaction reconnue avec les modulateurs de l’inflammation, et risquerait même de faire flamber l’infection. Lors de la mise en place de l’implant, les souris seront anesthésiées par un mélange de kétamine (50 mg/kg) + xylazine (10 mg/kg). L’incision cutanée réalisée ne dépassant pas 5mm, deux points de suture seront appliqués à l’issue. Les souris reprennent une activité normale dès leur réveil et ne présentent pas de signes de souffrance particuliers. Par ailleurs, il s’agit d’une infection très localisée et en aucun cas une infection systémique n’est anticipée. Enfin, un enrichissement du milieu (jouets en plastique, igloos en carton) sera utilisé et une surveillance bi quotidienne sera réalisée tout au long de l’étude.

Choix des espèces

Les modèles de biofilm sur implant utilisent le plus souvent le cochon d’Inde ou la souris. Dans notre cas, la demande de l’industriel a porté sur l’utilisation de la souris. Des souris Balb/cByJ de 8 semaines de façon à avoir un poids corporel de 26-27g

112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de la mutation de la mucoviscidose, elles reçoivent dans la trachée des fragments de la bactérie Pseudomonas aeruginosa pour déclencher une inflammation pulmonaire, plus une injection d'un candidat anti-inflammatoire, avant une ponction cardiaque, un lavage des poumons et la mise à mort. Le porteur indique que l'exposition peut provoquer une gêne respiratoire sur une durée courte de 24 heures. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ou informatique ne reproduit cette réponse inflammatoire complexe entre le poumon et la rate.

Objectifs

La mucoviscidose est une maladie génétique incurable qui touche 1 enfant sur 4500 naissances en France. Elle atteint le système digestif et l’appareil respiratoire mais l’atteinte pulmonaire est responsable du décès dans 90% des cas. La faible espérance de vie de ces enfants résulte majoritairement de leurs prédispositions génétiques et des infections chroniques pulmonaires contractées qui aggrave leur pathologie pulmonaire. Afin de comprendre les mécanismes physiopathologiques de ces infection chroniques, nous avons établi un modèle murin permettant de mimer l’inflammation présente chez les patients. Pour mener notre étude, nous allons valider notre modèle d’inflammation. La mutation génétique la plus fréquemment rencontrée chez les patients atteints de mucoviscidose est la mutation F508del du gène CFTR. Nous avons donc utilisé le modèle murin portant la même mutation F508del. Les poumons de ces souris seront exposés à des extraits de bactéries mortes Pseudomonas aeruginosa. Cette bactérie est celle qui contamine majoritairement les patients atteints de mucoviscidose. Nous travaillons sur le composé CIGB-552, un peptide synthétique qui a montré son efficacité contre l’inflammation liée au cancer et aux infections généralisées. Notre objectif est de mesurer les paramètres de l’inflammation par des méthodes scientifiques robustes, afin de montrer l’effet anti-inflammatoire du CIGB-552 sur les infections pulmonaires dans le contexte de la mucoviscidose. Cela permettra de proposer un nouveau médicament pour les patients.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont : 1) D’obtenir un modèle murin de la mucoviscidose qui se rapproche des patients. La mesure des différents paramètres de l’inflammation pulmonaire permettra de mieux identifier les phénomènes inflammatoires sur lesquels agis le CIGB-552. 2) Que ce modèle murin d’inflammation soit suffisamment caractérisé, validé et reproductible. Cela permettra d’utiliser ce modèle pour mieux caractériser les futures molécules anti-inflammatoires développées par notre équipe ou par la communauté scientifique. 3) D’évaluer l’efficacité anti-inflammatoire du CIGB-552 sur plusieurs paramètres de l’inflammation qui sont observable seulement à l’échelle d’un individu.

Procédures

Pesée des souris : les souris vigiles seront pesées sur une balance conçue pour les petits animaux. Sera réalisée sur les 112 animaux, 4 fois par animal, pendant la durée de l’expérimentation (25h). Injection intra-péritonéale de CIGB-552/véhicule : les souris vigiles seront maintenues par contention par l’expérimentateur dans un environnement conçu pour l’expérimentation animale. Il sera injecté un volume de 100µl à une dose de 1,4 mg/kg avec une seringue. Sera réalisée sur les 112 animaux, 1 fois par animal au début de la procédure. Instillation oro-pharyngée de LPS de p.a. : les souris sont anesthésiées (Buprénorphine (0.05mg/Kg), Zoletil (40mg/Kg) et Xylazine (4.2mg/Kg) (150 μL par voie IP)). Injection dans la trachée à l’aide d’un cathéter, d’un volume de 20µl de LPS de pseudomonas aeruginosa 4mg/kg et 2mg/kg (ou du véhicule). Après ce geste, l’instillation d’un petit volume d’air via le cathéter permet de dégager les voies respiratoire en favorisant le dépôt du LPS (ou du vehicule) sur les paroies des voies aériennes. Sera réalisée sur les 112 animaux, 2 fois par animal à 1h et 22h après le démarrage de la procédure. Le geste technique par animal ne dure que quelques minutes et est réalisée dans un environnement conçu pour l’expérimentation animale.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent subir une gène respiratoire causée par l’exposition de leurs poumons aux bactéries mortes de Pseudomonas aeruginosa (P.a). Les morceaux de bactérie vont induir la réponse immunitaire des souris, et développer l’inflammatoire pulmonaire comparable à l’observation chez les patients atteints de mucoviscidose. Notre maitrise des gestes techniques montre que la méthode d’exposition des poumons des souris (instillation oro-pharyngée) n’est pas un geste invasif, ce qui garranti que le déclencheur de l’inflammation sont les morceaux de bactérie P.a. Dans l’état de nos connaissances, nous ne pouvons prédire l’effet de l’inflammation sur la perte de poids des souris. Du moins, nous n’anticipons pas de perte de poids sur une exposition aussi courte à la bactérie P.a (24h). Nous peserons les animaux au cours de la procédure. Si une nuisance de l’animal est observée, elle sera déclenchée seulement après l’exposition au LPS jusqu’à la fin de la procédure, soit un temps maximal de 24h.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l’issu de notre seule procédure par injection d’Euthasol 40 (140mg/kg). Nous récupèrerons le sang par ponction intra-cardiaque, le lavage broncho-alvéolaire et les lobes des poumons pour étudier la signature moléculaire et cellulaire liée à l’inflammation. Ces paramètres seront évalués par la méthode d’ELISA, d’histochimie, de RT-qPCR et de cytométrie de flux.

Remplacement

Notre étude porte sur l’évaluation de l’inflammation pulmonaire. Ce phénomène se prépare à l’échelle d’un individu par des échanges de messagers chimiques et cellulaire entre le poumon et la rate. Les modèles disponibles en laboratoire (cellule et prédiction bio-informatique) ne permettent pas à ce jour d’étudier cette réponse complexe de l’inflammation. C’est pourquoi l’utilisation d’animaux est nécessaire afin de comprendre et la réponse anti-inflammatoire, et d’évaluer la part bénéfique du CIGB-552 dans la modulation et la résolution de la réponse inflammatoire locale pulmonaire. En revanche nous limiterons cette étude préliminaire à un seul modèle de souris qui est le modèle F508del, le plus pertinent de la communauté scientifique pour étudier le processus complexe de l’inflammation.

Réduction

Précédemment au laboratoire nous avons optimisé les procédures afin d’observer sur un même animal, les paramètres clés de la mesure de l’inflammation. Les deux expositions aux morceaux de bactérie P.a. à deux temps différents de la procédure sur un même animal, permettent d’étudier deux moments de la réponse inflammatoire dans un même individu : les messagers chimiques ainsi que les messagers cellulaires qui permettent de répondre à l’infection. De ce fait, nous divisons par deux le nombre d’animaux nécessaires pour observer l’effet du CIGB-552 sur ces deux phénomènes de l’inflammation distincts dans le temps. D’après les expérimentations animales antérieures de l’équipe, nous estimons que 14 souris (7 mâles et 7 femelles) par groupe sont nécessaires pour révéler statistiquement l’effet bénéfique du CIGB-552.

Raffinement

Les souris seront élevées dans des cages ventillées de 5 animaux maximum, pour favoriser leur vie sociale. Un enrichissement de l’habitat sous forme de maisonnettes, de briquettes de bois et de morceaux de cotons permettra de réduire le stress des animaux et de favoriser leur bien-être. Les souris F508del possèdent une alimentation en croquettes Teklade plus riches en protéines pour éviter la perte de poids liée à la mucoviscidose. Les souris sont abreuvées avec une eau contenant de faibles doses de laxatifs (movicol) pour favoriser l’évacuation des selles. Les zootechniciens ainsi que les expérimentateurs sont tous formés et familiers aux soins particuliers à donner à notre modèle d’étude. Au cours de l’expérimentation, toutes les étapes de la procédure seront réalisées en limitant au maximum le caractère invasif. L’ensemble des geste technique est maitrisé au sein de notre équipe. Les souris seront placées dans un caisson de réveil à 25°C après anesthésie, et nous contrôlerons particulièrement les paramètres température, respiration et battement cardiaques pour mener au réveil et à la reprise d’activité normale des animaux. Les souris d’une même cage appartiendront au même groupe expérimental, afin d’homogénéiser le comportement social des animaux lié aux injections et instillations. Par ailleurs, les souris recevant les morceaux de bactéries P.a. seront dans la même cage afin d’éviter la contamination croisée lors du toilettage des souris. Nous raffinons cette partie de l’expérimentation pour atteindre efficacement nos objectifs. Notre étude se concentre sur un phénomène inflammatoire court, ce qui limite la durée d’exposition et la douleur liée à des phénomènes d’exposition répétée et long. Nous pourrons modéliser l’effet de l’inflammation par des méthodes de prédiction mathématique lorsque nous aurons les conclusions de notre étude. L’évaluation permanente de la souffrance des souris permettra de respecter le bien-être animal et d’appliquer la mise à mort à l’atteinte d’un point limite. Enfin, nous raffinons notre étude en observant deux phénomènes inflammatoire distincts dans le temps, sur un même individu sans en affecter la qualité des résultats. Nous étudions les effets du CIGB-552 sur la réponse inflammatoire en évaluant plusieurs paramètres sur un même individu, ce qui nous permet de comprendre les phénomènes inflammatoires et leurs liens.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour des raisons multiples. 1) Le modèle murin F508del est le plus utilisé dans la recherche sur la mucoviscidose et est très bien caractérisé. Ces souris sont fournies et recommandées aux chercheurs français par l’association de patients Vaincre la Mucoviscidose. 2) Les modèles murins peuvent facilement être exposées aux morceaux de bactéries de Pseudomonas aeruginosa. Cela permet le développement d’un modèle plus affiné pour répondre à notre objectif qui est d’évaluer les propriétés anti-inflammatoire du CIGB-552 dans un contexte d’inflammation pulmonaire proche de celui des patients mucoviscidose. Il est donc pertinent d’utiliser ce modèle. 3) La génétique de la souris compte parmi les meilleures connaissances de la communauté scientifique. Les souris utilisées pour notre procédure seront âgées d’au moins 8 semaines (adultes). Nous choisissons cet âge pour deux raisons expérimentales : 1) La trachée des souris adultes est plus grande. 2) les souris F508del ont une anomalie de la trachée. Le choix de l’âge adulte facilite la procédure d’exposition des poumons aux morceaux de bactéries (instillation oro-pharyngée).

Onze macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardés en vie en vue d'une réutilisation. Pendant un an à un an et demi, chaque animal est colonisé par la bactérie Klebsiella pneumoniae par gavage sous anesthésie, puis subit des prélèvements de sang et des écouvillonnages rectaux répétés, avec radiographie et lavage broncho-alvéolaire en cas de pneumopathie. Le porteur indique que l'infection peut provoquer fièvre, perte d'appétit et gêne respiratoire, traitées par antibiotiques, les animaux étant hébergés seuls au début. Il affirme que le macaque est l'un des seuls modèles permettant de caractériser la réponse immunitaire et qu'aucune alternative n'existe pour cette étude au long cours.

Objectifs

Klebsiella pneumoniae est une bactérie pathogène dont les souches sont souvent résistantes aux antibiotiques, ce qui complique la prise en charge des patients. A ce titre, cette bactérie fait partie de la liste des agents pathogènes prioritaires, émise par l’OMS en 2017, pour lesquels il est nécessaire de mieux caractériser la pathogenèse (processus par lequel la bactérie déclenche la maladie), et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et vaccinales. K. pneumoniae colonise fréquemment le tube digestif de l’homme, avant d’être à l’origine de différents types d’infections, comme des bactériémies (présence de bactéries dans le sang) ou des pneumopathies (infections des poumons). Le clone ST258 de K. pneumoniae, apparu récemment en Amérique du Nord et en Europe, s’est propagé rapidement, et est responsable de maladies infectieuses chez les patients atteints de déséquilibres de la flore intestinale. La mise en place d’un modèle pertinent de colonisation intestinale, chez un animal proche de l’homme, est une étape indispensable pour comprendre les mécanismes de colonisation et de pathogenèse de cette souche. Dans ce contexte, nous souhaitons mettre en place un modèle de colonisation du tube digestif par le clone ST258 de K. pneumoniae chez le macaque cynomolgus pour étudier sa capacité à coloniser le microbiote intestinal, pour suivre la durée de portage intestinal et examiner les évolutions génétiques de la souche sur le long terme. Les pathologies infectieuses (bactériémie, pneumopathie) éventuelles, faisant suite à la colonisation intestinale, seront également surveillées. Dans cette étude, la souche ST258 sera comparée à une souche de référence de K. pneumoniae ne possédant pas les mêmes capacités épidémiques.

Bénéfices attendus

Le suivi de l’évolution génétique au sein du microbiote intestinal d’un représentant du clone de K. pneumoniae ST258 permettra de comprendre si les raisons de la diffusion mondiale de ce clone résident dans sa capacité à coloniser le tube digestif sur le long terme et à s’adapter à cet environnement particulier. Cette étude permettra de développer des stratégies thérapeutiques mieux ciblées.

Procédures

Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie : gavage (1, 15-20 min), prélèvements sanguins et écouvillonnages rectaux (J-6, J-1, J1, J3, J5, J7, J9, J15 puis 1/semaine, réalisés en même temps en 15-30 min). Si un animal développe des signes indicateurs de pneumopathie, des procédures supplémentaires seront réalisées pour pouvoir la diagnostiquer et la traiter : écouvillonnages nasopharyngés et trachéaux (1 tous les 2 jours pendant l’infection, 15-30 min), radiographie pulmonaire et lavage broncho-alvéolaire (1, réalisés en même temps en 45-55 min). Le projet est prévu pour une durée comprise entre 1 et 1,5 an.

Impact sur les animaux

La colonisation digestive par K. pneumoniae ne s’accompagne d’aucun signe clinique particulier. Cependant, en cas de passage des bactéries dans le sang ou de pneumopathie d’inhalation, des signes cliniques de l’infection bactérienne peuvent apparaitre : fièvre, perte d’appétit, gêne respiratoire. Ces infections seront traitées immédiatement par antibiothérapie et ne devraient pas durer au-delà de quelques jours. Des critères d’arrêt sont prévus dans le projet en cas de progression de la maladie. Le traitement antibiotique peut causer des diarrhées et entérites (inflammations de l’intestin grêle). L’état des animaux sera observé tous les 2 jours pendant 10 jours après l’antibiothérapie. En cas de symptômes digestifs, les vétérinaires de l’installation seront alertés et mettront en œuvre des traitements en adéquation avec l’expérience.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie

Remplacement

Aucune méthode alternative n’est possible pour étudier les phénomènes de colonisation et d’infection bactériennes, avec l’intervention notamment du système immunitaire. Cette étude sur le long terme ne peut être réalisée que sur des animaux vivants.

Réduction

Dans ce projet, au maximum 4 doses de la souche ST258 seront testées successivement, chaque fois sur un seul singe, afin de déterminer la charge optimale permettant la colonisation. La dose suivante sera ajustée en fonction du résultat précédent. Pour les deux doses les plus optimales, nous rajouterons 2 singes pour chaque dose de ST258, ce qui permettra de choisir la meilleure dose en ayant des groupes de 3 animaux. Cette stratégie permet de limiter le nombre de singes utilisés. Un groupe de trois autres singes sera infecté avec une souche de référence de K. pneumoniae avec la dose déterminée pour la souche ST258. Les six (2 groupes de 3) singes étudiés sur le long terme représentent le minimum requis pour évaluer et permettre une interprétation statistique fiable des résultats obtenus concernant le portage des bactéries et la comparaison des deux souches.

Raffinement

Le gavage sera effectué sous anesthésie et ne devrait pas provoquer de douleur particulière. Les prélèvements sanguins et les écouvillonnages rectaux seront également pratiqués sous anesthésie. En cas de pneumonie, une radiographie pulmonaire et un lavage broncho-alvéolaire unique pourront être pratiqués sous anesthésie. Hébergement des animaux infectés par K. pneumoniae en individuel conformément à l’agrément (animalerie A2) : - conservation du contact sensoriel par la mise en place de plaques translucides entre les cages latérales, et cages face à face séparées par environ 2 mètres de distance, - distribution 2 fois par semaine d’enrichissements destructibles de type peebletoy ou sachet surprise au lieu d’1 pour les hébergements en groupe. Cet hébergement individuel est nécessaire au début de l'expérience, pour éviter les biais lors de l’évaluation de certains paramètres biologiques tels que la mesure continue de la température (diurne et nocturne) et pour limiter la surexposition bactérienne. Les animaux seront remis en groupe à J21. En cas d’infection, les animaux seront traités par des antibiotiques auxquels les souches bactériennes utilisées sont sensibles.

Choix des espèces

Pour cette étude sur le long terme, le choix s’est porté sur le macaque pour plusieurs raisons : 1/ les PNH sont physiologiquement plus proches de l’homme 2/ les PNH représentent l’un des seuls modèles permettant la caractérisation de la réponse immune au pathogène: les réponses immunitaires sont similaires à l’homme, et les techniques et outils d’exploration de la réponse immunitaire sont disponibles et maitrisés. 3/ Les souris, l’autre modèle permettant une exploration de la réponse immunitaire, sont coprophages (se nourrissant de leurs excréments) et transmettent donc ce pathogène de façon épidémique. Nous utiliserons des singes adultes car ce sont les adultes qui sont colonisés par K. pneumoniae chez l’homme.

1340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la tuberculose par instillation dans le nez sous anesthésie, pour identifier les gènes permettant au bacille de persister et de se transmettre. Le porteur indique que l'infection pulmonaire peut provoquer des signes cliniques aux stades avancés, des points limites précoces déclenchant l'élimination des animaux en souffrance. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne rend compte des phases tardives de la maladie et que le modèle souris est "incontournable".

Objectifs

Etudier les interactions entre l’hôte et les mycobactéries pathogènes est une étape clé dans l’optique d’identifier des cibles thérapeutiques et/ou des stratégies vaccinales nouvelles pour la lutte contre la tuberculose. Notre équipe s’attache, au travers de la manipulation de l’agent pathogène lui-même, à identifier les adaptations et facteurs permettant aux bacilles de la tuberculose de persister chez l’hôte et à se transmettre d’un hôte à l’autre et à comprendre le mécanisme moléculaire de fonctionnement de ces déterminants.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus doivent apporter des connaissances sur les mécanismes de la pathogénie mycobactérienne mais aussi sur l’importance de certains composés pour la survie de la bactérie chez l’hôte, et l’induction de la pathologie. Ces dernières informations sont essentielles pour valider certaines enzymes ou certaines voies de biosynthèse comme cibles thérapeutiques. Nos travaux se focalisent sur les adaptations et facteurs permettant aux bacilles de la tuberculose de persister chez l’hôte et à se transmettre d’un hôte à l’autre. Les informations sur ces étapes du cycle infectieux sont extrêmement limitées et il n’existe pas de modèle cellulaire pouvant se substituer au modèle animal.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 interventions: 1) une injection d'anesthésique par voie intrapéritonéale qui conduira à une sédation de 15 min environ; 2) une instillation intranasale de la solution infectante réalisée sur les animaux anesthésiés.

Impact sur les animaux

Les protocoles consistent à inoculer un agent infectieux, une mycobactérie pathogène. Une infection principalement pulmonaire va donc en résulter. Dans les premières semaines de l’infection, les animaux ne présentent aucun signe de souffrance. Dans les stades avancés, les animaux infectés peuvent présenter des signes cliniques.

Devenir

Mise à mort. Les animaux seront infectés par des agents pathogènes, les bacilles de la tuberculose, et seront sacrifiés avant prélèvement d'organe.

Remplacement

Différents modèles cellulaires ou animaux sont utilisés par les équipes travaillant sur la tuberculose. Malheureusement les modèles cellulaires ne permettent pas à l’heure actuelle de rendre compte de la totalité des étapes de l’infection d’un hôte par les mycobactéries pathogènes. Ainsi il n’existe aucun modèle cellulaire pertinent pour l’étude des phases tardives de la tuberculose telles que la persistance ou la transmission. Le modèle animal est donc incontournable à l’heure actuelle. Dans ce contexte, le modèle animal le plus couramment utilisé est le modèle souris. Ce modèle reproduit notamment au niveau immunologique bon nombre des observations faites chez l’homme.

Réduction

Les différentes phases des projets (clairement identifiées dans les procédures détaillées) seront suivies de décisions de poursuite ou d’arrêt de l’étude en fonction des résultats. Nos expériences antérieures nous ont fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir en première intention des résultats statistiquement significatifs. Toutes les expériences impliquant des animaux font l’objet d’un protocole expérimental écrit et validé par le responsable de l’animalerie. Nous utilisons des lots d’animaux homogènes pour réduire la variabilité. Enfin, nous essayons d’analyser plusieurs paramètres sur un même lot d’animaux (par exemple : préparation d’ARN, cytométrie de flux et charges bactériennes).

Raffinement

Dans toutes les expériences, les souches de souris ont été choisies en fonction de l’objectif de l’expérimentation (détaillé dans le descriptif de la procédure expérimentale). L’état sanitaire et le bien-être des animaux sont évalués tout le long de l’expérience par des personnels formés et des points limites ont été définis. La souffrance et/ou le stress animal sont présents à deux niveaux dans nos expériences : i) lors de l’anesthésie et de l’infection des animaux,et ii) lors de l’inflammation pulmonaire chronique et des dommages tissulaires induits par l’infection mais où nous mettons en place des points limites précoces pour suivre les animaux et intervenir rapidement. Ces deux niveaux de douleurs font l’objet d’une prise en charge spécifique indiquée dans les procédures respectives et déjà appliquées dans nos projets antérieurs. Lors de l'infection des animaux, ceux-ci sont au préalable anesthésiés. Le second niveau de stress/douleur est lié à l'induction de la tuberculose expérimentale. Les expériences que nous réalisons sont limitées à une période de temps et à des doses infectieuses qui ne doivent pas générer de signes cliniques de la maladie. Cependant, nos expériences antérieures ont montré que parfois, et pour des raisons encore inconnues, les animaux peuvent développer des signes cliniques plus précocement qu’attendu. Ces évènements sont rares. Cependant, dès le premier jour d’infection et tout au long de l’expérience, la surveillance des douleurs chroniques est réalisée par observation directe et journalière des animaux par du personnel formé. Les signes de douleur ou de stress sont guettés et conduisent à l’élimination immédiate des animaux en souffrance. Une grille de scoring a été mise en place pour un suivi adapté.

Choix des espèces

Il existe plusieurs modèles animaux (souris, cobaye, lapin, porc, bovin, primate non humain) pour la tuberculose chacun présentant des avantages et des inconvénients. Pour notre projet visant à explorer les interactions hôte/pathogène par le biais de l'étude de souches bactériennes mutantes, la souris constitue le modèle de choix en raison i) de l'existence et de l'excellente caractérisation des fonds génétiques de résistance variable à la pathologie, ii) du fort degré de convergence avec les paramètres de l'immunité protectrice chez l'homme, iii) de la prédominance des outils d'analyse (souris transgéniques, réactifs immunologiques disponibles) par rapport aux autres espèces envisageables. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes et, si possible, par soucis d’homogénéité, âgées entre 6 et 10 semaines.

1000 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont inoculés avec des trypanosomes, prélevés chaque jour d'une goutte de sang à la queue puis exsanguinés sous anesthésie, une partie des souris étant exposée aux piqûres de mouches tsé-tsé pour étudier la transmission. Le porteur indique que l'infection peut rendre les animaux moribonds ou prostrés, le poil hérissé, et décrit des points limites déclenchant une euthanasie précoce. Il affirme que ces souches parasitaires ne peuvent pas être maintenues in vitro et que l'hôte vivant reste nécessaire pour tester molécules et vaccins.

Objectifs

L’objectif de ce projet est donc d’amplifier des souches sanguicoles de trypanosomes (Trypanosoma brucei gambiense, Trypanosoma evansi, Trypanosoma brucei brucei, Trypanosoma congolense, Trypanosoma vivax) conservées en azote liquide, par passage sur souris et rats afin de a) produire des souches en quantité massive pour production d’antigènes parasitaires nécessaires aux tests de dépistage type ELISA et pour des études de caractérisation du protéome, du transcriptome et du secrétome des trypanosomes dans l’objectif de développer de nouvelles molécules afin de proposer des tests diagnostiques plus sensibles et spécifiques, b) réaliser des stabilats cryoconservés de trypanosomes pour entretien de notre cryothèque, c) réaliser des repas sanguins infectants de glossines (sur souris balb/c et génétiquement modifiées) pour étudier les modalités de la transmission vectorielle des trypanosomoses africaines humaine et animale, d) tester des molécules candidates afin de mettre au point un traitement contre les trypanosomes humaine et animale et d’étudier l’efficacité de certaines d’entre elles pour développer un vaccin anti-maladie. e) évaluer l’importance de la localisation des parasites dans le derme au cours de l’infection en fonction de l’espèce de trypanosome et valider sa valeur diagnostique.

Bénéfices attendus

Notre unité de recherche développe des approches multidisciplinaires visant à améliorer la compréhension des mécanismes infectieux dans les maladies induites par des protozoaires parasites de la famille des trypanosomatidae (les trypanosomes). Ces maladies transmises par des vecteurs (glossines essentiellement) sévissent dans des zones rurales pauvres des pays africains et constituent un obstacle majeur à l’installation humaine et au développement de l’élevage et de l’agriculture avec un fort impact socio-économique pour des populations déjà fortement appauvries. Des moyens de lutte existent, basés sur la lutte anti-vectorielle et l’utilisation d’outils diagnostiques et de traitements curatifs, mais bien qu’utilisés de façon raisonnée et intégrée, ils montrent de plus en plus leurs limites (chimiorésistances développées par les populations d’insectes et les parasites par exemple). Nos travaux s’inscrivent dans un souci d’amélioration des outils diagnostiques existants (amélioration et développement de tests de dépistages), d’identification de molécules ayant une action curative ou préventive, de mise au point d’un vaccin efficace pour protéger les populations humaines et animales et enfin, d’amélioration des outils de la lutte anti-vectorielle.

Procédures

Injections et prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés. 40 rats et 300 souris seront inoculés une fois avec des souches de trypanosomes (dans certains cas une immunosuppression sera, au préalable, réalisée par injection), un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement sur 2 à 10 jours maximum et une exsanguination sous anesthésie profonde sera ensuite réalisée. 210 souris seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes, un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement sur 2 à 10 jours maximum, une anesthésie par injection d’un mélange anesthésique sera ensuite réalisée suivi d’un repas de glossines de 10 minutes. 240 souris seront immunisées trois fois à deux semaines d’intervalle, puis seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes, un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement sur 2 mois maximum et une exsanguination sous anesthésie profonde sera ensuite réalisée. 30 souris seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes, 90 souris seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes et une fois avec la molécule à tester et 30 souris seront inoculées une fois avec la molécule à tester. Sur ces 150 souris un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement pendant 10 jours. 60 rats seront inoculés une fois avec des souches de trypanosomes un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé avant l’inoculation et quotidiennement pendant 10 jours, un prélèvement de peau à 2 endroits différents sera réalisé deux fois à J4 et J10 après l’inoculation.

Impact sur les animaux

Les animaux infectés voient une parasitémie se développer dans leur sang, les nuisances vont de l'asymptomatisme à un changement d’apparence physique tel que le poil hérissé pendant plus de 3 jours, avec un aspect général moribond ou un état de prostration. Les inoculations peuvent provoquer du stress chez les animaux.

Devenir

L'ensemble des souris et rats seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de récolter les parasites ou le sérum des animaux.

Remplacement

Les souches parasitaires que nous utilisons ne peuvent pas être maintenues in vitro, elles sont extracellulaires et se développent dans le sang de leur hôte, voire dans le derme. Ils entretiennent avec l’organisme hôte des relations étroites de nature cellulaires et chimiques nécessaires à leur développement et il nous est impossible de les reconstituer en utilisant des milieux artificiels même complémentés. De même, les mécanismes de transmission à la glossine nécessitent également l’utilisation du modèle animal. Les « tests de molécules à visées thérapeutiques et vaccinales », bien que nous mettions en place des tests in vitro et ex vivo visant à étudier leurs effets sur les cellules de l’hôte, nécessitent l’hôte pour avoir une vue d’ensemble des mécanismes complexes mis en jeu lors d’une infection. La mise en évidence de parasites dans le derme ne peut se vérifier que par le mode in vivo.

Réduction

Les animaux utilisés sont reduits au strict minimum.

Raffinement

L'espériencce des utilisateurs a permis la définition de points limites qui permettent grâce au suivi quotidien des animaux et de leur parasitémie, de procéder à l'euthanasie précoce d'un animal qui commence à présenter des signes de malêtre.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont des espèces classiquement utilisées pour la multiplication des souches de trypanosomes africains. Elles développent une infection comprise entre 3 et 10 jours post-infection en moyenne en fonction de la souche parasitaire utilisée. Le cas échéant, des souris génétiquement modifiées pourront être utilisées pour l’étude des interactions hôtes/pathogènes/vecteur. Les rats sont utilisés lorsque la quantité de parasites à produire est plus importante (cas de la production d’antigènes parasitaires). Des souris et des rats adultes seront utilisés afin d’optimiser la quantité de parasites à produire ou de sérum à récolter.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une instillation dans la trachée ou une exposition d'une heure en chambre d'aérosolisation pour reproduire une pneumonie à Tropheryma whipplei, l'agent de la maladie de Whipple. Le porteur indique que tout animal saignant ou respirant anormalement après l'instillation sera tué, et prévoit un analgésique en cas de signes de douleur. Les souris sont tuées pour prélever les organes et mesurer l'atteinte pulmonaire.

Objectifs

Tropheryma whipplei est l’agent de la maladie de Whipple, une maladie chronique systémique caractérisée par un syndrome de malabsoprtion, de la fièvre et des douleurs abdominales. Un certain nombre de données suggèrent que chez l’homme, l’infection résulte d’une transmission oro-fecale ou oro-orale. Les avancées en épidémiologique et techniques diagnostiques ont montré que T. whipplei étaient en fait responsable d’un large spectre d’infections et qu’à côté des infections chroniques, systémiques ou localisées, il existait des infections aigues et même un portage asymptomatique. Ainsi, il a été rapporté que chez l’homme, T. whipplei était un agent de gastroentérite, probablement au cours de la primo-infection. Des travaux de notre équipe avait alors montré qu’en infectant des souris par voie orale, on retrouvait T. whipplei dans les selles de manière transitoire et qu’elle induit une diarrhee passagere. Par ailleurs, nous avions également pu montrer qu’une lesion intestinale epitheliale prolongeait le portage de T. whipplei, aggravait de manière non significative la gastroenterite et permettait la colonisation de la muqueuse intestinale et une séro-conversion.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre la mise en place et la physiopathologie des pneumonies à T. whipplei. Il permettra également de développer des outils diagnostiques et éventuellement pronostiques de telles infections.

Procédures

Dans la procédure 1, les animaux seront soumis à une instillation intra-trachéale. Le tube flexible relié à une seringue à insuline sera inséré à 0.5-1 cm dans la trachée et la solution sera injectée (volume inférieur à 50 microlitres). Afin d'éviter que l'instillat ne s'échappe de la trachée, le tube sera maintenu en place 5 sec. Il sera retiré et la souris sera maintenue en position pendant au moins 30 secondes. Pour la procédure 2, les animaux seront exposés dans la chambre d'aérolisation pendant une heure.

Impact sur les animaux

En cas de signes de douleur, de souffrance ou d’angoisse suite à l’instillation intra-trachéale, un analgésique (buprénorphine) sera injecté en sous-cutané, à raison de 0.2 mg/kg de poids corporel en sous cutané. Les effets indésirables directs de la procédure 1 seraient une mauvaise instillation intratrachéale. Ainsi, tout animal qui saigne, qui présente une respiration anormale après récupération de l'anesthésie sera euthanasié.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. En effet, les organes seront prélevés pour être analysés et évaluer l'impact de la pneumonie.

Remplacement

Il est nécessaire de tester nos observations dans un modèle de souris afin de se rapprocher des conditions physiopathologiques de la pneumonie induite par T. whipplei et de comprendre les mécanismes sous-jacents dans le but de fournir des pistes diagnostiques et thérapeutiques dans la prise en charge des patients.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit grâce à la mutualisation des techniques et analyses sur un même animal. De plus, de par notre expérience (effets modérés de l’infection à T. whipplei), nous avons déterminer le nombre de souris nécessaires à notre étude pour observer une différence statistique significative entre les groupes (p < 0.05) avec une puissance au moins supérieure à 80%.

Raffinement

La mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel ainsi que le suivi quotidien de l’état de santé des animaux permettront le raffinement de ce projet. Ainsi, tout au long de l’étude, les animaux seront surveillés quotidiennement, ce qui nous permettra d’intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en envisageant l’utilisation d’antalgiques. Dès lors qu’un animal aura atteint un point limite, la souris sera euthanasiée dans le but de réduire toute douleur, souffrance et angoisse. Les animaux seront hébergés en groupe de cinq maximum, dans des cages équipées afin d’offrir un environnement enrichi et approprié.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de choix pour l’étude du système immunitaire. Afin de limiter les variations dues à des différences d’âge, des souris adultes de 6 à 8 semaines seront utilisées.