Maladies infectieuses

6 lapines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une puce sous-cutanée, trois injections intramusculaires d'un candidat vaccin et cinq prélèvements sanguins à l'oreille en cage de contention, avant une ponction cardiaque terminale de 30 mL de sang sous anesthésie. Le porteur indique que leur mise à mort est justifiée par la "nécessité" de récupérer une grande quantité de sang pour analyser les anticorps. Il affirme qu'il n'est "pas encore possible" de se passer de l'animal pour la production d'anticorps polyclonaux et prévoit un seul groupe de six lapines, sans témoin.

Objectifs

S’appuyant sur les données communiquées par 87 pays en 2020, un nouveau rapport de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) met en évidence des niveaux élevés de résistance des bactéries aux antibiotiques (supérieurs à 50 %), en particulier chez des bactéries fréquemment retrouvées en milieu hospitalier, comme Klebsiella pneumoniae et Acinetobacter baumannii, responsables de septicémie. Le traitement de ces infections requiert obligatoirement l’utilisation d’antibiotiques de dernière ligne, cependant, 8% (jusqu’à 50% dans certains pays) des souches de Klebsiella pneumoniae responsables d’infections sanguines sont également résistantes à ces antibiotiques de dernière ligne. Des alternative aux antibiotiques, en particulier vaccinales, sont actuellement à l’étude. Un candidat vaccin, basé sur des cellules d’Acinetobacter baumannii inactivées (bactéries inoffensives dont tous les facteurs de virulence ont été retirés) et génétiquement modifiées pour exprimer des protéines de surface de Klebsiella pneumoniae, a déjà montré une protection significative dans un modèle d’infection à Klebsiella pneumoniae chez la souris. Une précédente étude a également testé la production d’anticorps chez le lapin en réponse à différente fréquences d’administration de ce candidat vaccin associé à un adjuvant (produit utilisé pour améliorer l’efficacité des vaccins). L’objectif est de poursuivre l’étude de ce vaccin chez le lapin afin d’analyser la variabilité de réponse à son administration chez cette espèce animale et ainsi obtenir une quantité suffisante d’anticorps avec la fréquence d’administration choisie. Ce projet en particulier, vient compléter les différents groupes déjà testés en étudiant cette fois l’administration du vaccin seul, sans aucun adjuvant. La quantité d’anticorps produite par les animaux et collectée en fin d’expérience reflètera l’efficacité de la vaccination.

Bénéfices attendus

Après la mise en évidence de l’efficacité du candidat vaccin chez la souris, et de sa capacité à entrainer la production d’anticorps chez la lapine ce projet vise à déterminer à évaluer la variabilité de réponse à son administration et à compléter les données obtenues avec le bon protocole d’administration. Les anticorps collectés à la fin de l’expérience seront ensuite administrés chez la souris pour réaliser une vaccination dite passive. L’efficacité de cette vaccination permettra d’en apprendre davantage sur les mécanismes immunitaires déclenchés par l’administration de ces bactéries atténuées chez la lapine et sur leur potentiel en tant que vaccin. A terme, l’idée est de pouvoir favoriser la vaccination de populations à risque, en l’absence de traitement antibiotiques efficaces.

Procédures

Les animaux vont être soumis à différentes interventions : - Mise en place d’une puce de température en sous-cutané à J-1 sur animal vigile - 3 secondes - 3 injections du candidat vaccin (1mL) par voie intramusculaire à J0, J28, J56 (en alternant la cuisse droite et la cuisse gauche) sur animal vigile - 3 secondes par injection - 5 prélèvements sanguins à l’oreille à J0, J14 et J28,J42 et J56 (en alternant l’oreille droite et l’oreille gauche) sur animal vigile en cage de contention - 5 minutes de maintien en cage de contention par prélèvement - 1 anesthésie générale par injection intramusculaire (3 secondes) directement suivie d’une ponction intracardiaque de 30mL de sang (2 minutes) qui se terminera par une injection intracardiaque d’un euthanasiant (3 secondes) pour assurer la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux vont être soumis à différents actes pouvant induire un stress ou une douleur légère : - Mise en place d’une puce de température en sous-cutané à J-1 - La mise en place de la puce est réalisée à l’aide d’une seringue prévue à cet effet et ne dure pas plus de 3 secondes. Aucune contention particulière n’est requise et d’après notre expérience aucune gêne n’est ressentie par l’animal lors de la pose ni après la mise en place de la puce. - 2 à 3 injections intramusculaire à J0, J28, J56 (en alternant la cuisse droite et la cuisse gauche) -Le candidat vaccin a déjà été testés chez la souris et le lapin et n’ont montré aucun signe de toxicité. - 5 prélèvements sanguins à l’oreille à J0, J14, J28, J42 et J56 (en alternant l’oreille droite et l’oreille gauche) sur animal vigile en cage de contention - Les animaux seront familiarisés à la cage de contention au cours de 3 séances d’habituation réalisées avant le début de l’expérience. - 1 anesthésie générale par injection intramusculaire directement suivi d’une ponction intracardiaque de 30mL de sang qui se terminera par une injection intracardiaque d’un euthanasiant pour assurer la mise à mort. - La ponction intracardiaque étant réalisée sous anesthésie générale, elle ne sera associée à aucune douleur particulière.

Devenir

Les 6 animaux du projet seront mis à mort à l’issue des 70 jours d’expérience ou plus précocement s’ils montrent des signes de souffrance. Leur mise à mort est justifiée par la nécessité de récupérer suffisamment d’anticorps pour les analyses complémentaires ce qui implique le prélèvement d’une grande quantité de sang.

Remplacement

La production d’anticorps polyclonaux est un mécanisme complexe basé sur l’interaction entre plusieurs types de cellules immunitaires. La première étape indispensable à cette production est l’immunisation chez l’animal. Il n’est pas encore possible aujourd’hui de se passer du modèle animal pour la production d’anticorps.

Réduction

Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé. Seul 1 groupe de 6 lapins sera administré par le candidat vaccin (protocole de 3 immunisations) afin de compléter des données (pas de groupe control). Comme ce projet ne comporte qu’un groupe, aucun test statistique de comparaison ne sera utilisé.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Ils seront suivis 2 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude. Un suivi accru sera réalisé durant les 6h suivant les administrations du candidat vaccin et la fréquence de surveillance sera augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux. Le suivi de la température sera effectué grâce à une puce placée en sous cutané ce qui évitera l’utilisation d’un thermomètre rectal souvent stressante pour l’animal. L’administration du candidat vaccin n’est pas censée entrainer d’effet indésirable. Cependant des critères d’interruption de l’étude, supportés par une grille de score de douleur, ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance.

Choix des espèces

La lapine est un modèle de choix pour la production d’anticorps polyclonaux. En effet sa taille moyenne implique un volume sanguin important et donc un plus grand potentiel de récupération d’anticorps que pour la souris par exemple. Les lapines de cette étude seront âgées de 3 mois de façon à avoir une maturité immunitaire suffisante.

1 620 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Fortement immunodéprimées, elles sont greffées avec des cellules leucémiques humaines puis reçoivent des molécules candidates, avec des prises de sang hebdomadaires, pour mettre au point un modèle de leucémie liée au virus HTLV-1 et tester des traitements. Le porteur décrit les effets attendus de la greffe, amaigrissement, perte d'équilibre, difficultés motrices, gonflement du ventre et poils hérissés, suivis par une grille bi-hebdomadaire. Il juge de nouvelles approches thérapeutiques "indispensables" et affirme qu'il n'existe "pas de modèle cellulaire satisfaisant" pour cette maladie.

Objectifs

La leucémie/ lymphome T liée au virus HTLV-1 (ATLL) est une maladie du sang agressive qui est rapidement mortelle dans la majorité des cas malgré des protocoles de traitement intensifs. Ceci est principalement lié à une résistance des cellules leucémiques à la chimiothérapie chez environ 50% des patients. Il est donc indispensable de proposer aux patients de nouvelles approches thérapeutiques. Hormis les lignées dérivées historiques de cellules d’ATLL dont on sait que le comportement est éloigné de celui des cellules d’ATLL de patients, il n’existe pas de modèle cellulaire satisfaisant pour l’étude de la maladie induite. Par conséquent, il est nécessaire de tester l’efficacité de nouveaux traitements sur d’autres modèles, qui de plus représentent la diversité des mutations cancéreuses observées chez les cellules leucémiques des patients. Ce projet fait suite au précèdent projet dont l’objectif initial était l’établissement de lignées à partir de cellules primaires de patients atteints de lymphome/leucémie lié au virus HTLV-1 ou de cellules sur le même modèle de qui est réalisé dans d’autres maladies du sang. Depuis 2019, une vingtaine de cellules primaires d’ATLL ont été injectées à des souris fortement immunodéprimées. Il a été possible d’obtenir 4 lignées stables (après plusieurs réinjections). De manière intéressante, il a été possible de cultiver in vitro pendant quelques jours (2-3 semaines environ) 3 de ces lignées. Ce projet a un double objectif : 1. Mise au point d’un nouveau modèle de leucémie/lymphome T liée à HTLV pour permettre une meilleure compréhension de la maladie induite (poursuite de l’étude débutée en 2019). 2. Evaluer in vitro et in vivo l’efficacité de nouvelles thérapeutiques potentielles qui seront testées seules ou en association pour contrecarrer la résistance primaire des cellules d’ATLL à la chimiothérapie.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est l’identification d’une ou plusieurs molécules d’intérêt qui a (ont) un effet potentiel anti-tumoral sur les cellules d’ATLL. Cette (ces) molécule(s) fera (feront) l’objet d’études approfondies sur son (leur) mécanisme d’action. Enfin à terme, l’objectif est de proposer une étude clinique étant entendu que l’ATLL est une maladie orpheline qui concerne moins de 50 nouveaux patients par an en France mais environ 1000 cas par an au Japon et que l’ATLL est un modèle pour d’autres maladies du sang.

Procédures

Les souris seront greffées avec des cellules leucémiques d’origine humaine par voie intrapéritonéale, intraveineuse (queue) ou sous-cutanée (durée du geste : quelques secondes). Ce geste ne sera réalisé qu’une seule fois. Des prises de sang (50 microlitres maximum) seront réalisées de façon hebdomadaire pour évaluer la prise de greffe (durée du geste : quelques secondes). Des candidats molécules thérapeutiques seront administrées aux souris selon un schéma propre déjà décrit dans la littérature dans le cadre d’autres études sur d’autres cancers ; les doses injectées et les fréquences décrites n’engendrent pas d’effets secondaires néfastes. Différents modes d’injections seront utilisés (en respectant les volumes maximaux associés à chaque voie) : - Intrapéritonéal (quelques secondes) - Intraveineux : sous anesthésie gazeuse ou médicamenteuse (durée quelques minutes entre l’anesthésie et l’injection) - Gavage (quelques secondes)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables liés à la greffe de cellules tumorales humaines ont été observés et mesurés au cours du projet précédent et ont conduit au développement d’une grille de suivi spécifique bi-hebdomadaire : amaigrissement, ataxie (perte d’équilibre), des difficultés motrices, le gonflement du ventre, perte de poils ou poils hérissés. L’apparition d’un dos voussé ou d’un faciès douloureux est également noté. Les molécules candidates ont toutes déjà été utilisées dans des modèles murins et la quasi-totalité ont fait l’objet de publications scientifiques. Pour la majorité de ces molécules, il n’est pas rapporté d’événement indésirable notable en lien avec leur administration. Quelques-unes ont conduit à une dégradation de l’état des souris imputé à l’apparition d’un syndrome de lyse tumorale en cas d’administration à un stade de prise de greffe avancé ; pour ces molécules, nous privilégierons leur utilisation dans le cadre d’un traitement avant la prise de greffe afin de limiter ce risque et monitorerons de manière plus rapprochée les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car immunodéficients, infectés par le virus HTLV-1 et développant une tumeur.

Remplacement

Hormis les lignées dérivées historiques de cellules d’ATL (lignées TLOMI et MT1) dont on sait que le comportement est éloigné de celui des cellules d’ATL primaires, il n’existe pas de modèle cellulaire satisfaisant pour l’étude de la maladie liée au virus HTLV-1 (conclusion tirée après concertation entre laboratoires travaillant sur cette pathologie et analyse de la littérature). Les molécules que nous utiliserons auront toutes été préalablement testées et validées in vitro sur des cultures de cellules avant leur administration chez la souris. Cependant, cette étude in vitro, qui permettra de fortement limiter le nombre de molécules candidates à tester, ne peut remplacer une étude préclinique sur modèle animal pour tester leur efficacité in vivo.

Réduction

Nous utiliserons une double stratégie de réduction du nombre d’animaux utilisés dans le cadre de cette expérimentation. Dans un premier temps, toutes les molécules candidates seront testées in vitro sur des cultures de cellules, et seules les molécules ayant démontré une efficacité sur la viabilité des cellules tumorales in vitro seront utilisés dans le cadre de cette expérimentation. Dans un deuxième temps, nous évaluerons l’efficacité des molécules les plus efficaces dans le cadre d’un traitement avant greffe de tumeurs sur souris. Seules les molécules efficaces dans la procédure 2 seront ensuite éventuellement testées dans le cadre d’un traitement curatif (après la greffe), seules ou en association avec une chimiothérapie. Au niveau statistique, le nombre d’animaux prévu pour les procédures 2 et 3 est compatible avec la mise en évidence d’effets expérimentaux forts, ce qui est l’objectif recherché. Une hétérogénéité est attendue entre les différentes lignées (hétérogénéité génétique selon les patients), donc l’analyse des données devrait faire appel à des modèles statistiques spécifiques.

Raffinement

Une grille d’évaluation spécifique ainsi que des points limites spécifiques ont été développés au cours du projet précédent de génération des cellules, et seront utilisés afin de suivre de manière rapprochée et la plus précise possible la pris de greffe chez les animaux, et d’intervenir précocément en cas de signe de souffrance. Les points suivis sont : l’amaigrissement (grâce à l’aspect de la colonne vertébrale, le poids n’ayant aucune signification lors d’une prise de greffe), l’ataxie (perte d’équilibre), des difficultés motrices, le gonflement du ventre, l’aspect du pelage (perte de poils ou poils hérissés). L’apparition d’un dos voussé ou d’un faciès douloureux est également noté. En lien avec les animaliers chargés du suivi, nous avons développé une grille d’intensité (+, ++ ou +++) de ces symptômes conduisant aux points limites des expériences. Toute observation inhabituelle est également répertoriée et évaluée. En cas d’injection de la tumeur par voie sous-cutanée dans dugel, le volume tumoral sera évalué par mesure au pied à coulisse deux fois par semaine.

Choix des espèces

Le projet précédent a permis d’établir qu’un modèle ce cellule était réalisable dans le cadre de l’ATLL sur des souris femelles immunodéficientes, en conservant la plupart des caractéristiques de la tumeur initiale, ce qui en fait un modèle très pertinent pour étudier la maladie HTLV-1 induite et rechercher de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous ne disposons pas à ce jour de modèle d’étude plus proche de la maladie initiale et représentatif de l’hétérogénéité clinique et moléculaire de la maladie. Les souris seront âgées de 7 à 15 semaines au moment de l’injection de cellules de patients ATLL (même stade de développement que dans le projet précédent de développement des lignées, et que dans d’autres projets d’études de leucémies/lymphomes). En l’absence d’apparition de signes de souffrance ou d’atteinte d’une prolifération suffisante de cellules cancéreuses dans le sang des souris, les animaux seront mis à mort au plus tard un an après injection.

688 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit la pose chirurgicale d'une chambre implantable et d'un cathéter, une injection sous-cutanée quotidienne jusqu'à vingt jours, une infection bactérienne et jusqu'à quatre prélèvements sanguins, pour évaluer des traitements contre les biofilms qui colonisent les cathéters. Le porteur décrit les nuisances attendues comme la chirurgie et une possible infection avec perte de poids et douleur. Il écarte le remplacement in vitro au motif qu'il ne reproduirait pas la complexité d'un "organisme entier" et sa réponse immunitaire.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le travail de notre laboratoire visant à mieux comprendre la physiologie distincte des bactéries grandissant au sein d’une communauté de biofilm, et ce afin de mettre au point des méthodes efficaces pour contrôler les infections dues aux biofilms. Les communautés bactériennes en biofilms sont particulièrement difficiles à éradiquer car elles sont à la fois protégées de l’action du système immunitaire par la structure physique du biofilm (présence de matrice extracellulaire) ainsi que de l’action des antibiotiques par la présence, au sein du biofilm, de sous-populations de bactéries particulièrement tolérantes aux antibiotiques, les bactéries « persistantes ». Ce projet vise donc à identifier chez certaines bactéries pathogènes les fonctions responsables de la colonisation de cathéters centraux, d’évaluer des traitements de type préventifs ou curatifs pour éviter la formation de biofilms ou éradiquer des biofilms existants, et enfin de déterminer si le traitement de ces biofilms par des antibiotiques peut entraîner la sélection de résistance à ces antibiotiques. Les connaissances qui seront acquises au cours de ce projet permettront de fournir de nouvelles pistes sur les traitements à utiliser pour lutter contre les infections liées aux biofilms tout en prenant en compte le facteur sélection de résistance aux antibiotiques.

Bénéfices attendus

Les avantages escomptés sont la compréhension des mécanismes mis en jeu lors de la formation de biofilms sur des cathéters centraux par certaines bactéries pathogènes et de la réaction de ces bactéries à certains traitements. Nous pourrions mieux appréhender si certaines bactéries peuvent développer des mécanismes de résistance, ou bien si les traitements préventifs ou curatifs appliqués sont efficaces pour éviter la formation de biofilms, ou traiter les biofilms dans le cas où ceux-ci sont déjà formés. Grâce à ces études qu’on peut estimer être pré-cliniques, on peut envisager dans le futur d’adapter certains traitements contre ces infections dues à la colonisation de matériel médical et ainsi réduire le taux de morbidité et mortalité des patients malheureusement infectés.

Procédures

Toutes les interventions en dehors de la contention seront faites sur animaux anesthésiés par anesthésie gazeuse. Chaque rat subira une injection sous-cutanée quotidienne rapide (quelques secondes) sur l’ensemble de la durée des procédures employée (au maximum sur 20 jours). Chaque rat subira une pose de chambre implantable dans le dos et une cathéterisation. L’intervention chirurgicale durera 45 min. Chaque animal subira au maximum 4 prélèvements de sang au niveau caudal chacun à plus de deux jours d’intervalle. Ceux-ci dureront moins de 3 min.

Impact sur les animaux

Les nuisances causées aux animaux seront liées à la chirurgie nécessaire pour la pose du cathéter central et au possible développement d’une infection bactérienne (perte de poids et douleur dans le respect des points limites).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront tous subis une intervention chirurgicale avec pose d’un implant et été infectés par une bactérie pathogène. Cela implique que 1) leur défense immunitaire sera différente d’autres animaux non exposés à ce même pathogène et 2) ils sont potentiellement devenus porteurs asymptomatiques de cette bactérie pathogène et seraient donc susceptible de la transmettre s’ils étaient réutilisés. De plus, tous ces animaux seront sacrifiés pour analyser des organes vitaux.

Remplacement

Ce projet ne peut malheureusement pas s’envisager dans des systèmes in vitro, qui sont inappropriés pour reproduire la complexité d’un organisme entier et sa réponse à l’infection (système immunitaire). La complexité des facteurs de l’hôte qui peuvent influencer le processus de colonisation des matériels médicaux est notamment trop importante pour être reproduite à ce jour in vitro.

Réduction

D’une part, en amont des expériences conduites chez l’animal nous effectuons de nombreuses expériences in vitro afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires. Pour ce qui est des traitements innovateurs qui seront testés, aucun d’entre eux ne sera évalué in vivo si celui-ci n’a pas d’abord démontré son efficacité in vitro. Les protocoles in vivo sont rédigés en amont pour éliminer le risque de réaliser une expérience non indispensable (rejet d’investigations discutables). Un maximum de 4 souris par groupe sera utilisé afin d’assurer une représentativité statistique minimale. Au maximum 2 répétitions seront réalisées de façon indépendante pour valider les résultats expérimentaux et augmenter la puissance des analyses statistiques. L’outil de bioluminescence sera utilisé pour évaluer l’évolution de l’infection in situ au niveau du cathéter central et en dehors de celui-ci, pour suivre le même animal au cours du temps, limiter les variations inter-individuelles et ainsi diminuer le nombre d’animaux requis.

Raffinement

Les Rats hébergés à 4 maximum par cage. Le fait d'avoir un hébergement de 4 animaux par cage au lieu d'un seul conduit à un meilleur confort pour les rats, moins d’anxiété et moins d’agitation lors des manipulations. Cette cohabitation n’est pas associée à un plus grand risque de difficultés de cicatrisation ni d’ablation intempestive des chambres implantables. Nous ferons une visite quotidienne durant la phase d’acclimatation, même en l’absence de manipulation, puis au moins une fois par 24h durant les jours suivant. Une attention particulière sera donnée après la phase de chirurgie et d’inoculation des cathéters par les bactéries.

Choix des espèces

Le choix de cette espèce s’est naturellement faite par le type de matériel implantable à utiliser dans nos expériences. Le cathéter intraveineux à chambre implantable de type pédiatrique est directement pertinent pour le traitement d’infections chez les patients dû au diamètre interne du cathéter ainsi qu’au type de matériau qui ont un impact majeur sur la formation du biofilm. Les dimensions d’un cathéter de type pédiatrique ne permettent pas une adaptation à des animaux plus petits comme la souris. Tous les animaux fournis seront des rats mâles de 8 semaines et d’environ 275-300 g. À ce stade, les veines ont atteint une taille suffisante pour faciliter la pose du cathéter, et le système immunitaire pleinement développé pour participer au contrôle des contaminations du matériel implanté.

2 432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une souche de Mycobacterium avium leur est instillée dans le nez, puis elles reçoivent des composés par voie orale, sous-cutanée ou intrapéritonéale jusqu'à deux fois par jour pendant douze semaines, pour tester des candidats antibiotiques. Le porteur décrit les atteintes attendues d'une infection pulmonaire, perte de poids, respiration difficile, écoulements et baisse d'activité, et reconnaît que les traitements peuvent créer inconfort ou toxicité. Il qualifie de nouvelles options thérapeutiques d'"indispensables" et affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit à ce jour la dynamique bactérienne dans un organisme vivant.

Objectifs

Les mycobactéries non tuberculeuses (MNT) ou mycobactéries atypiques sont des bactéries opportunistes dont le réservoir réside dans l’environnement (sol et eaux). Ce sont des bactéries non pathogènes intrinsèquement pour l’homme, elles sont dites opportunistes car elles vont devenir infectieuses sur un terrain affaibli. Elles vont être responsables d’infections pulmonaires chez des sujets fragilisés, atteints de mucoviscidose, de bronchopneumopathie chronique obstructive ou immunodéprimés. Ces sujets vont alors développer une infection pulmonaire progressive entrainant une insuffisance respiratoire sévère voire la mort si elle n'est pas traitée. Ces maladies pulmonaires dues aux MNT sont en augmentation dans le monde et dans plusieurs pays, dont les États-Unis et le Canada, le taux d'incidence de ces maladies est supérieur à celui de la tuberculose. Avec une moindre incidence, ces bactéries peuvent être responsables d’infections cutanées, toujours sur des sujets affaiblis. Parmi les MNT, le groupe Mycobacterium avium complex (MAC) qui regroupe les espèces avium et intracellulare, est le groupe le plus prévalent lors des infections induites par des MNT. Les traitements existants sont sous forme de bi ou tri thérapie, sur de longues durées avec un risque croissant d’émergence de mutant résistant. De nouvelles options thérapeutiques s’avèrent donc indispensables. L’objectif du projet est d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés dans des modèles d’infection pulmonaire chez la souris induite par des bactéries appartenant au groupe Mycobacterium avium complex. Ces composés auront par ailleurs montré leur efficacité in vitro sur ces mêmes bactéries.

Bénéfices attendus

Les maladies pulmonaires dûes à Mycobacterium avium complex sont en nette progression, les traitements sont majoritairement des cocktails d’antibiotiques sur de longues durées avec un risque certains d’émergence de mutants résistants. Le bénéfice de ce projet est donc de répondre à un besoin thérapeutique non comblé par l’identification d’une ou plusieurs molécules capables de diminuer significativement, voire d’éradiquer la charge de Mycobacterium avium complex lors d’une infection pulmonaire chez la souris et permettant la progression de (s) molécules aux stades ultérieurs de recherche pré-clinique et clinique.

Procédures

1/ Administration des composés à tester ou de leur solvant, par voie orale ou sous-cutanée ou intra-péritonéale, une à deux fois par jour pendant un maximum de 12 semaines, durée quelques secondes à chaque administration. 2/ Instillation en intranasale d’une souche infectieuse, une fois pendant l’étude, durée environ 15 à 30 secondes 3/ Prélèvement sanguin après anesthésie gazeuse, une fois pendant l’étude, durée quelques secondes

Impact sur les animaux

Les nuisances principales et effets indésirables sont ceux d’une infection pulmonaire : Une perte de poids, une respiration difficile et/ou bruyante, des yeux et museau qui coulent, une diminution de l’activité. Les animaux recevront également les différents traitements par gavage oral ou par injection en sous cutané ou en intrapéritonéal, traitements susceptibles de créer de l’inconfort voir de la toxicité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale, des analyses sur les organes étant nécessaires pour mesurer l’efficacité des molécules testées.

Remplacement

A ce jour, aucun modèle cellulaire ne récapitule complètement, la dynamique bactérienne dans un organisme, la complexité cellulaire impliquée et la cinétique d’absorption et d’élimination d’une molécule. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour évaluer l’efficacité de potentiels candidats médicaments.

Réduction

Nous utiliserons des modèles bien établis dans la littérature afin de limiter la phase de mise au point et ainsi de limiter le nombre d’animaux. Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude. Le nombre de souris utilisées par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique. Dans la littérature, le nombre d’animaux par groupe est compris entre 6 à 10. Une analyse statistique rétrospective permettra de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe. Tous les composés qui seront testés dans ce modèle seront sélectionnés sur la base de leurs efficacité in vitro et leur bonne distribution pharmacocinétique. Un grand nombre de composés synthétisés par notre recherche sont éliminés sur la base de ces résultats et ne sont pas évalués in vivo.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance journalière avec administration d’analgésique en cas de besoin. Si les points-limites préalablement établis sont atteints, l’animal sera mis à mort de façon anticipée afin d’éviter toute souffrance. Lors de la mise à mort, les animaux seront placés sous anesthésie profonde. Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 4 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. Pour éviter tout risque de surinfection, les animaux seront hébergés en portoir ventilé. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. L’environnement des animaux sera adapté et enrichi à leur arrivée et pendant toute la durée de l’expérimentation.

Choix des espèces

L’espèce choisie sera la souris, espèce majoritairement utilisée dans la littérature dans les modèles d’infection pulmonaire. Les animaux seront utilisés à un stade adulte afin d’avoir une maturité pulmonaire

114 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la mycobactérie M. avium au moyen d'un aérosol, puis une partie reçoit des antibiotiques par gavage cinq jours sur sept pendant un à trois mois, pour mettre au point un modèle d'infection pulmonaire proche de celui de l'humain. Le porteur indique n'attendre ni perte de poids ni douleur d'après les données disponibles, et décrit le gavage comme "inconfortable" surtout les premiers jours. Il écarte le remplacement au motif que l'infection touche plusieurs organes et types de cellules, et conclut à la nécessité de l'in vivo.

Objectifs

Les infections à M. avium (MAC) ont une prise en charge complexe, basée actuellement sur une association d’au moins trois antibiotiques pour une durée de 12 mois à 24 mois, avec un taux de succès limité (52 à 70% selon les séries). Ces infections surviennent chez des patients ayant des comorbidités respiratoires :mucoviscidose, bronchectasies… Pour améliorer la prise en charge de ces patients, il faut pouvoir tester, sur un modèle adapté, de nouvelles molécules, mais aussi mieux comprendre la mauvaise réponse au traitement antibiotique, alors que les souches sont sensibles. L’objectif de cette étude est d’évaluer le meilleur modèle d’infection à M. avium en vue d’évaluer de nouvelles associations de traitement antibiotiques ou de nouvelles molécules mais aussi de mieux comprendre les échecs de traitement chez l'homme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont d’obtenir un modèle d’infection à mycobactérie proche de ce qui se passe sur l’homme afin de pouvoir l’utiliser pour tester de nouveaux antibiotiques (qui pourraient être plus efficace et/ou avec moins d’effets indésirables que les traitements actuellement utilisés). L'amélioration du modèle permettra aussi de réduire l'utilisation des animaux dans le cadre de ces études.

Procédures

Six souris de chaque espèce n'auront aucune procédure spécifique. Chacune des 102 autres souris subira une infection unique par voie aérienne (geste non invasif, durée 30 minutes de l'aérosol, avec une durée totale dans le nébuliseur de 1h30) de mycobactéries. 36 souris (18 souris de chaque espèce) sur les 102 infectées auront une administration par voie orale d'antibiotiques de 5 à 10 secondes par jour (5 jours sur 7) pendant 1 mois pour 12 d’entre elles (6 de chaque groupe), pendant 2 mois pour 12 d'entre elles (6 de chaque groupe), et pendant 3 mois pour les 12 dernières (6 de chaque groupe). Les animaux seront hébergés jusque 4 mois après l'infection.

Impact sur les animaux

La nébulisation de mycobactérie pourra induire un stress le temps de l’aérosol (durée totale de 1h30 de cette partie de la procédure). Aucune douleur n’est attendue. Sur l’ensemble des données disponibles sur le modèle murin d’infection à mycobactéries non tuberculeuses, il n’y a pas de perte de poids ou de mobilité après infection. Par précaution, les souris seront pesées de manière bi-hebdomadaire au minimum. Le gavage peut être inconfortable, surtout les premiers jours. Le nombre d'expérimentateur sera limité pour habituer les souris. Les souris seront surveillées de manière systématique après chaque gavage. A la fin de l’étude les animaux seront mis à mort sans sédation préalable (souris donc moins de 150g, et pour éviter de fausser les résultats. Le geste est réalisé par du personnel formé et sera immédiat et sans douleur pour l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélèvements et analyses

Remplacement

Le remplacement du modèle animal par un autre modèle n'est pas possible du fait que l'infection à myobactérie touche différents organes et différents types de cellules. Des premiers travaux peuvent être faits sur cellule, mais néanmoins pour évaluer complètement un nouvel antibiotique il faut ensuite vérifier son efficacité sur les différents organes, ce qui ne peut être reproduit in vitro.

Réduction

Ce modèle permet de mimer mieux l’infection telle qu’elle est chez l’homme et elle a l’avantage de produire une infection homogène au sein des souris, permettant ainsi de limiter le nombre de souris par groupe pour obtenir des résultats scientifiquement solides. Le nombre de souris a donc été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l'analyse statistique

Raffinement

Les souris seront dans des hébergements en groupe. Il sera utilisé un enrichissement dans les cages pour permettre le jeu des souris. Le projet commencera au minimum 15 jours après leur arrivée dans l’animalerie pour permettre aux souris de s’habituer aux nouveaux locaux. Deux personnes seulement pratiqueront l'apport des antibiotiques par voie orale afin de permettre l’habituation des souris. Les souris seront surveillées tous les jours sur différents aspect (poids, comportement, allure) pour vérifier leur bien être

Choix des espèces

Les souris possédent un système respiratoire proche de l'homme. Elles entreront dans l'étude au stade de jeunes adultes, soit 6 semaines (infection à mycobactéries principalement chez les adultes chez l'homme)

150 poules vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections intramusculaires d'un antigène couplé à un adjuvant sur soixante-trois jours, puis sont tuées, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur indique que les injections avec adjuvant complet de Freund peuvent provoquer ulcérations, fièvre et baisse de mobilité, et présente le prélèvement des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace et que l'immunité de l'animal vivant est "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.

Procédures

5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (perchoir, miroir, bloc à picorer ou type coquilles d'huîtres...).

Choix des espèces

La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.

430 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées de parasites et de protéines, sont exposées 45 minutes à des piqûres de moustiques sous anesthésie et subissent des prélèvements de sang tous les un à deux jours, pour tester des protéines de Plasmodium comme cibles vaccinales contre le paludisme. Le porteur indique que l'infection provoque affaiblissement, anémie et symptômes neurologiques, et que les animaux sont tués avant d'atteindre les points limites. Il écarte le remplacement au motif qu'aucune culture in vitro continue du parasite n'existe et qu'il faut un "organisme muni d'un système immunitaire", tandis que la preuve de concept vaccinale annoncée reste au conditionnel.

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans la recherche de nouvelles cibles vaccinales ou thérapeutiques ciblant la phase hépatique du paludisme, qui constitue la première étape d'infection chez l'homme après la transmission de Plasmodium, le parasite responsable du paludisme, par un moustique. Plusieurs protéines de Plasmodium ont été identifiées comme jouant un rôle essentiel au cours de l'infection et constituent des cibles vaccinales potentielles. Dans ce projet, nous utiliserons un modèle murin d’infection par Plasmodium berghei pour caractériser la fonction de ces protéines et tester si elles sont des cibles potentielles pour des anticorps neutralisants.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait d'une part améliorer notre compréhension des mécanismes d'infection du foie par Plasmodium au cours du paludisme, d'autre part apporter la preuve de concept que de nouveaux antigènes de Plasmodium peuvent être ciblés par des anticorps neutralisants. La validation pré-clinique de nouvelles cibles vaccinales pourrait ouvrir de nouvelles perspective pour lutter contre le paludisme.

Procédures

Administrations sur animaux vigiles: injection intrapéritonéale d'anesthésiants (1 injection, durée 10 secondes), injection sous-cutanée de protéines (3 injections espacées de 2 semaines, durée du geste 10-15 secondes), injection intrapéritonéale de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes), injection intraveineuse de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes), administration orale de médicament (prise unique, durée du geste 10 secondes), administration de médicament dans l'eau de boisson (durée 7 à 10 jours). Prélèvements sur animaux vigiles: prélèvement d'une goutte de sang ( tous les 1 à 2 jours pendant 3 à 21 jours, durée du geste 10 secondes). Prélèvements sur animaux anesthésiés: prélèvement de sang (acte unique, durée 10 minutes). Exposition d'animaux anesthésiés à des piqûres de moustiques (pendant 45 minutes). Imagerie en bioluminescence sur animaux anesthésiés (pendant moins de 5 minutes).

Impact sur les animaux

Stress lié à la contention, douleur de courte durée lors des injections intrapéritonéales, intraveineuses ou sous-cutanées sur animaux vigiles, stress ou douleur de courte durée lors de l'administration orale de médicament sur animaux vigiles, douleur de courte durée lors des prélèvements sur animaux vigiles, douleur au site des injections sous-cutanées, risques associés à l'anesthésie (hypothermie, détresse respiratoire), contraintes liées à l'infection elle-même (affaiblissement, anémie, symptômes neurologiques).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures par des méthodes réglementaires, soit parce que des prélèvements sont nécessaires pour des analyses post-mortem, soit pour éviter d'atteindre des points limites chez les animaux infectés.

Remplacement

Le projet vise à caractériser dans un modèle murin la fonction de protéines essentielles du parasite Plasmodium, l'agent du paludisme, et à évaluer l'efficacité d'une vaccination contre ces protéines. Il n'existe pas à l'heure actuelle de système de culture continue de Plasmodium berghei in vitro permettant le remplacement du modèle murin pour les études fonctionnelles. D'autre part, l'analyse de l'effet protecteur d'une immunisation nécessite le recours à un organisme muni d'un système immunitaire (en l'occurence la souris) pour pouvoir étudier les réponses anticorps.

Réduction

Au total ce projet utilisera 430 souris. Ce nombre a été réduit au minimum pour permettre de réaliser les prélèvements nécessaires aux études fonctionnelles. Pour les immunisations, la taille des effectifs a été établie à l'aide d'un calcul de puissance pour permettre de détecter un effet significatif par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Afin de contribuer au raffinement des procédures, les animaux sont hébergés avec leurs congénères (2 à 5 par cage) dans un milieu enrichi (lanières de papier Kraft ou équivalent). Les conditions environnementales des locaux d’hébergement sont réglementaires. Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée avant le début des expérimentations. Une période d'habituation sera également respectée dans l'appareil de contention avant les injections intraveineuses sur animaux vigiles, afin de réduire le stress. Certaines procédures sont réalisées sous anesthésie et analgésie pour prévenir la douleur. La mesure de la charge parasitaire par bioluminescence est une méthode peu invasive, contribuant au raffinement des procédures. La présence de points limites définis permettra d'éviter la souffrance liée aux complications de l'infection par Plasmodium berghei. Afin de faciliter l’alimentation et l'hydratation chez les animaux infectés par Plasmodium, la nourriture pourra être donnée sous forme de bouillie ou de gel directement dans la cage. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent, pour vérifier l’apparence et l’état clinique des animaux, la prise alimentaire et hydrique ainsi que leur comportement, afin de détecter toute modification suggérant une douleur, une souffrance ou une détresse.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal permettant des études fonctionnelles chez Plasmodium berghei, un parasite qui reproduit de multiples aspects de l'infection par les parasites infectant l'homme. Ce modèle est en particulier pertinent pour étudier la fonction de protéines essentielles du parasites, dans le but d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. La souris est également un hôte doté d'un système immunitaire permettant d'évaluer l'efficacité de stratégies de vaccination contre le paludisme. Dans ce projet, nous utiliserons des souris adultes, âgées de 6 à 10 semaines au début des procédures, conformément aux protocoles classiques utilisés dans ce type d'étude.

672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, deux plaies dorsales leur sont créées au biopsy punch avec pose d'une attelle et de sutures, puis infectées par la bactérie Staphylococcus aureus, avant l'application d'un plasma froid ou d'un antibiotique et quatre prises de sang. Le porteur signale une douleur et une gêne au réveil, ainsi qu'un risque de blessures si les souris se grattent ou se mordent, l'objet étant de tester le plasma froid contre les bactéries résistantes des plaies. Il affirme qu'aucune alternative non animale n'existe pour cette phase et présente le porc, dont la peau est plus proche de la nôtre, comme écarté pour des raisons logistiques.

Objectifs

L’objectif est à la fois d’optimiser les technologies plasmas existantes et de développer de nouvelles technologies pour éliminer les bactéries résistantes responsables d’infections nosocomiales. Ceci est accompli dans un consortium interdisciplinaire et international qui met en synergie ses expertises démontrées. Les sources de plasma sont testées dans différents contextes pour leur efficacité antimicrobienne in vitro et in vivo en utilisant un modèle murin de plaie infectée. Des études mécanistiques sur la destruction bactérienne médiée par le plasma froid sont effectuées tandis que des échantillons de plaies provenant de patients facilement disponibles sont utilisés pour fournir du matériel réaliste pour étudier l’efficacité de cette nouvelle approche. Enfin, le traitement de plaies colonisées par des bactéries résistantes aux antibiotiques fournira les données d’une preuve de concept. Les résultats ne serviront pas uniquement à rendre prometteur l’utilisation du plasma froid contre les plaies infectées, mais également à améliorer la cicatrisation de plaies afin de lutter contre le développement de l’antibiorésistance en médecine humaine et vétérinaire. Le projet se déroule en trois étapes et feront l’objet de plusieurs demandes d’autorisation de projet. Première étape : Le premier objectif a été de mettre au point un modèle murin de plaie pseudo-chronique et de montrer l'efficacité des plasmas à froid sur la cicatrisation. Cette étape est donc validée et a permis de mettre en place le modèle de chirurgie, les soins à la douleur et le traitement à plasma froid.

Bénéfices attendus

Au sein du projet global, il est attendu que l’utilisation de plasma froid avec différents gazs soit efficace pour lutter contre l’infection par des bactéries résistantes aux antibiotiques ou pas et pour améliorer la cicatrisation des plaies présentant un déficit cicatriciel. Cela se traduirait notamment par une baisse significative de la colonisation bactérienne de la plaie, et une éventuelle accélération de la cicatrisation des plaies. Un nouveau dispositif à plasma sera également utilisé et ses effets seront comparés à ceux du plasma de référence, déjà utilisé dans des cas cliniques en Allemagne. Il est attendu que ce nouvel outil soit aussi efficace, sinon plus, que le plasma de référence quant à la désinfection et la cicatrisation des plaies, car il permettrait de traiter une surface de plaie plus importante plus rapidement et d’augmenter l’efficacité de la réponse immunitaire. A plus long terme, cela pourrait permettre de généraliser l’utilisation de divers dispositifs à plasma à l'être humain, chez des patients souffrant de troubles de la cicatrisation (diabète, immunodépression, etc.) ; mais aussi de lutter contre l’antibiorésistance s’installant notamment sur ces plaies dans le cas d’infections nosocomiales. Cela pourrait également offrir des opportunités de traitement dans divers domaines (chirurgie, ophtalmologie, oncologie, etc.). La généralisation de l’utilisation de cette technologie pour entièrement décontaminer du matériel médical en milieu hospitalier pourrait être envisagée.

Procédures

Des puces d’identification dorsales seront injectées en sous-cutané à tous les animaux, sous anesthésie (5 minutes par animal). Les animaux seront soumis à une anesthésie générale et à la chirurgie visant à créer les plaies chroniques (biopsy punch et pose de l’attelle avec points de suture, 20 minutes par animal). 4 prises de sang à la veine submandibulaire seront effectuées sur chaque animal tout au long de l’expérience à l’aide d’une aiguille. Tous les animaux seront vigiles (2 minutes par animal). Pendant 3 jours après la chirurgie, tous les animaux recevront des injections d’analgésiques en sous-cutané pour gérer la douleur au maximum (2 minutes par animal). Les plaies des animaux seront infectées par Staphylococcus aureus (dépôt de solution non invasif, 5 minutes par animal). Des prélèvements seront effectués à la surface des plaies de chaque animal à l’aide d’un coton-tige (10 secondes par animal). Les traitements plasma à froid ou avec antibiotique seront appliqués sur les plaies (5 min par animal vigile).

Impact sur les animaux

Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après l’injection de la puce d’identification pourrait être observés. Suite à la création des deux plaies dorsales, une douleur et une gêne possible dans les déplacements sont attendues au reveil de l’animal sans analgésie. Si les souris se grattent ou se mordent, des blessures pourraient apparaitre sur le dos ou les flancs. La contention lors des prises de sang peut engendrer du stress pour l’animal. Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après la prise de sang pourrait être observés. Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après la prise de sang pourrait être observés. Des symptômes de l’infection pourraient être observés après l’inoculation de S. aureus.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort soit les 672 souris. Des prélèvements de tissus seront effectués post-mortem pour la partie histologie (zone de biospsie et rate) pour l'analyse biologique de la reconstruction de l'épiderme cutané, ainsi que des prélèvements de la surface de la plaie pour analyses bactériologiques. La décision est prise par les responsables scientifiques et concepteurs.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative non animale pour cette partie du projet, puisque l’objectif est d’évaluer l’efficacité des plasmas à gaz sur l'infection et la cicatrisation d’une plaie en vue d’une standardisation de son utilisation chez l’être humain. Ainsi, il n’est pas possible de remplacer les animaux par un modèle in vitro. Les premières expériences du projet global sont des expériences in vitro qui ont confirmé la nécessité d’une phase in vivo pour obtenir des résultats supplémentaires et plus précis quant à l’objectif final : la phase clinique.

Réduction

Les volumes de sang à prélever par animal et leur fréquence étant contraints, les volumes prélevés à chaque prise de sang seront « poolés » par 2 (même couple d'animaux pour chaque prise de sang). Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques et en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base d’un test non paramétrique pour l’étude de la réponse immunitaire et de l’effet de l’infection sur les dérivés oxygénés produits notamment. Deux plaies dorsales seront réalisées sur chaque animal. Cela permet de réduire le nombre d'animaux car le nombre d’échantillons par animal est multiplié par deux, plutôt que de n’avoir qu’une seule plaie plus étendue par animal.

Raffinement

Dès l'arrivée des animaux à l’animalerie, une semaine d’acclimatation est prévue pour permettre l'adaptation des animaux à leur nouvel environnement. Les animaux seront surveillés 2 fois par jour à partir du jour de la chirurgie (J0) : relevé télémétrique de la température de J0 à J10, signes cliniques tels que le poids, l’aspect du faciès et le comportement général. En cas de mal-être suspecté, de la nourriture sera déposée sur le sol de la cage pour limiter les efforts nécessaires aux animaux. Pour éviter toute souffrance, les animaux seront euthanasiés par inhlalation contrôlée de CO2 dès que leur état état clinique se dégradera en dépit du traitement analgésique mis en place. En particulier, l’expression de trois des signes cliniques suivants sur une période de 24h entrainera leur mise à mort : hypothermie, de J0 à J2, hyperthermie de J2 à J10, comportement anormal, prostration, amaigrissement (>15%), poil hérissé, isolement, diarrhée. Les souris bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid et objet à ronger). Les souris sont hébergées 4 par cage dans une animalerie A2 en portoirs ventilés. Afin de diminuer la douleur de l'injection de la puce, les animaux seront sous anesthésie générale et un léger massage au niveau de la zone d’injection est effectué. Pour la partie chirurgie et le suivi post-opératoire : Période préopératoire : injection pré-opératoire 'un analsgésique (0,1 mg/kg, SC), au moins 20 minutes avant le début de la chirurgie, maintien au chaud sous lampe chauffante Période opératoire : anesthésie gazeuse : 4% pour l’induction, 1-2% pour le maintien, sur tapis chauffant Période postopératoire : injection post-opératoire immédiate d'un anti-inflammatoires non stéroïdiens (10 mg/kg, SC), maintien au chaud sous lampe chauffante. Injection d'un anti-inflammatoires non stéroïdiens (même dose) le soir. Injection d'un anti-inflammatoires non stéroïdiens (10 mg/kg SC, 1 fois/jour, à J1 et J2). Injection d'un analsgésique (même dose) (2 fois/jour, à J1 et J2), voire J3 en fonction du résultat de l'évaluation de la douleur, si elle n'est pas contrôlée par le méloxicam. Visite animalier matin et soir de J0 à J10. En cas d’hypothermie, les souris seront placées sous une lampe chauffante n’émettant pas de lumière. Après chaque prise de sang, une récompense positive alimentaire de type bouchés fruitées ou des rondelles de bananes sèches ou popcorn sera réalisée.

Choix des espèces

La souris est l’animal le plus utilisé en expérimentation animale, en particulier quand il s’agit d’expériences impliquant un dispositif médical. Puisque l’objectif est de généraliser l’utilisation du plasma à froid à l’être humain, le porc aurait pu être choisi car la structure de l’épiderme est plus proche de la nôtre. Cependant, il est tout de même préférable de commencer par des expérimentations sur souris d’un point de vue logistique et statistique. Age des souris = 6-7 semaines pour la lignée de référence (déjà validée pour la chirurgie et l'infection à S. aureus). Les souris doivent être de jeunes adultes pour avoir la place de faire les biopsies (décrits dans les modèles publiés) et avoir un système immunitaire mature. Age des souris = 12-13 semaines pour la lignée diabétique Les souris doivent présenter un diabèté confirmé au moment de la réalisation des plaies pour mimer au mieux ce qui se déroule chez le patient.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées de protéines puis de parasites du paludisme, un traitement, des prélèvements sanguins tous les un à deux jours et, sous anesthésie, une exposition de 45 minutes à des piqûres de moustiques. Le porteur signale un affaiblissement, une anémie et de possibles symptômes neurologiques liés à l'infection, l'objet étant de tester une immunothérapie redirigeant des anticorps existants vers les globules rouges infectés. Il indique qu'aucune culture continue de ce parasite ne permet de remplacer la souris pour produire et sélectionner les parasites transgéniques.

Objectifs

Le paludisme est dû à l’infection par le parasite Plasmodium, qui se multiplie dans les globules rouges. L’émergence de parasites résistants aux médicaments antipaludiques actuels impose de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce projet a pour objectif d’évaluer dans un modèle murin une nouvelle stratégie d’immunothérapie contre le paludisme, visant à rediriger une réponse anticorps pré-existante vers les globules rouges infectés pour entraîner leur destruction par le système immunitaire. Une preuve de concept de cette stratégie a déjà été établie contre des cellules cancéreuses.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à apporter la preuve de concept de l'efficacité d'une stratégie d'immunothérapie contre le paludisme dans un modèle pré-clinique murin. Le développement de thérapies basées cette méthode, interférant avec la pathogénicité et/ou la transmission du parasite, pourrait offrir de nouvelles alternatives de contrôle du paludisme.

Procédures

Administrations sur animaux vigiles: injection intrapéritonéale d'anesthésiants (1 injection, durée 10 secondes), injection sous-cutanée de protéines (3 injections espacées de 2 semaines, durée du geste 10-15 secondes), injection intrapéritonéale de protéines (2 injections espacés de 2 jours, durée du geste 10-15 secondes), injection intrapéritonéale de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes), injection intraveineuse de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes), injection intrapéritonéale de médicament (3 injections espacées d'1 jour, durée du geste 10 secondes), administration de médicament dans l'eau de boisson (durée 7 à 10 jours). Prélèvements sur animaux vigiles: prélèvement d'une goutte de sang ( tous les 1 à 2 jours pendant 3 à 21 jours, durée du geste 10 secondes). Prélèvements sur animaux anesthésiés: prélèvement de sang (acte unique, durée 10 minutes, suivi immédiatement par une euthanasie par une méthode réglementaire). Exposition d'animaux anesthésiés à des piqûres de moustiques (pendant 45 minutes).

Impact sur les animaux

Stress lié à la contention, douleur de courte durée lors des injections intrapéritonéales, intraveineuses ou sous- cutanées sur animaux vigiles, douleur de courte durée lors des prélèvements sur animaux vigiles, douleur au site des injections sous-cutanées, risques associés à l'anesthésie (hypothermie, détresse respiratoire), contraintes liées à l'infection elle-même (affaiblissement, anémie, symptômes neurologiques).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures par des méthodes réglementaires, soit parce que des prélèvements sont nécessaires pour des analyses post-mortem, soit pour éviter d'atteindre des points limites chez les animaux infectés.

Remplacement

Le projet vise à évaluer dans un modèle murin une nouvelle stratégie d'immunothérapie contre le paludisme, notamment à l'aide de parasites génétiquement modifiés. Le projet nécessite l'utilisation d'un organisme immuno-compétent, en l'occurrence la souris. De plus, il n'existe pas à l'heure actuelle de système de culture continue des Plasmodium berghei in vitro permettant le remplacement du modèle murin pour la production et la sélection de parasites transgéniques.

Réduction

Au total ce projet utilisera 320 souris. Le nombre d'animaux a été réduit au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs des procédures. La taille des effectifs a été établie à l'aide d'un calcul de puissance pour permettre de détecter un effet significatif par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Afin de contribuer au raffinement des procédures, les animaux sont hébergés avec leurs congénères (2 à 5 par cage) dans un milieu enrichi (lanières de papier Kraft ou équivalent). Les conditions environnementales des locaux d’hébergement sont réglementaires. Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée avant le début des expérimentations. Une période d'habituation sera également respectée dans l'appareil de contention avant les injections intraveineuses sur animaux vigiles, afin de réduire le stress. Certaines procédures sont réalisées sous anesthésie et analgésie pour prévenir la douleur. La présence de points limites définis permettra d'éviter la souffrance liée aux complications de l'infection par Plasmodium berghei. Afin de faciliter l’alimentation et l'hydratation chez les animaux infectés par Plasmodium, la nourriture pourra être donnée sous forme de bouillie ou de gel directement dans la cage. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent, pour vérifier l’apparence et l’état clinique des animaux, la prise alimentaire et hydrique ainsi que leur comportement, afin de détecter toute modification suggérant une douleur, une souffrance ou une détresse.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal permettant des études fonctionnelles chez Plasmodium berghei, un parasite qui reproduit de multiples aspects du paludisme causé par les parasites infectant l'homme. La souris est un hôte doté d'un système immunitaire permettant d'évaluer l'efficacité de stratégies d'immunothérapie contre le paludisme. Dans ce projet, nous utiliserons des souris adultes, âgées de 6 à 10 semaines au début des procédures, conformément aux protocoles classiques utilisés dans ce type d'étude.