Maladies infectieuses

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un ou deux gavages et au maximum une injection intrapéritonéale pour être infectées par la bactérie Clostridioides difficile, afin de tester des anticorps censés bloquer la colonisation intestinale. Le porteur qualifie le gavage d'"acte réflexe sans douleur" et affirme un "niveau de sévérité quasi nul", alors que la gravité déclarée reste modérée. Les souris sont tuées par dislocation cervicale à J4, J7 et J15 pour dénombrer les bactéries.

Objectifs

Clostridioides difficile, bactérie Gram positif anaérobie et sporulée, appartient au microbiote intestinal humain et représente la première cause de diarrhées infectieuses nosocomiales de l'adulte au décours d’un traitement antibiotique. Le succès d’une infection à C. difficile va dépendre pour une grande part de la capacité de ce pathogène à se multiplier et à coloniser le tractus intestinal de l’hôte. L’environnement du contenu intestinal qui fait suite à une dysbiose est complexe et ne peut être mimé in vitro que très partiellement. De plus, il a été montré que l’expression de certains facteurs de virulence comme les toxines ou certaines protéines de surface dépendait de la présence de métabolites connus pour varier au cours de la dysbiose. Le but de ce projet est d’étudier in vivo les potentialités prophylactiques et thérapeutiques d’anticorps ciblant des protéines de surface du C. difficile, démontrés par la littérature comme ayant un rôle majeur dans le processus de colonisation. Le pouvoir de colonisation de différentes souches de C. difficile sera évalué, en présence et en l’absence des anticorps monoclonaux.

Bénéfices attendus

Il est attendu une protection des anticorps monoclonaux anti-protéines de surface dans l’infection à C. difficile (ICD). Cette protection peut se traduire sous forme d’une baisse de la colonisation, d’une capacité des souris à éliminer plus rapidement la bactérie et/ou à développer de moindres symptômes de cette infection. Le modèle murin d’ICD est un modèle récapitulant l’infection chez l’homme et permettra ainsi –si les résultats sont concluants- de préparer les essais cliniques chez l’Homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à un gavage (1 à 2 fois) ainsi qu’à au maximum 1 injection IP.

Impact sur les animaux

Le niveau de sévérité est quasi nul car les souris ne sont pas sensibles aux infections à C. difficile. Il faut noter qu’il peut apparaître une légère diarrhée après 2 jours d’infection mais généralement les souris se rétablissent vite. Par ailleurs le gavage est un acte reflexe qui est sans douleur pour la souris et sera pratiqué par des personnes expérimentées avec des sondes flexibles. La dose unique d’injection est de 100 µl et l’inoculation sera réalisée par les techniciens animaliers qui ont une haute pratique de cette procédure. Par ailleurs nous avons observés lors de nos précédentes expériences que deux gavages successifs n’ont pas d’incidence sur le bien-être des animaux. Les embouts utilisés pour ces injections ne sont pas pointus, ils n’entraînent aucun dommage au tractus digestif de l’animal et le gavage se fait par un mécanisme réflexe de l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale selon la procédure approuvée par le CEEA sous la référence n°10.

Remplacement

Nous avons déjà commencé à évaluer nos anticorps sur des modèles in vitro. Plusieurs tests ont et sont développés tels qu’un test d’inhibition d’adhérence sur des cellules en plaques où nous incubons dans un premier temps les anticorps avec les bactéries avant de les mettre sur des tapis cellulaires de cellules Caco-2. Après lavage, nous évaluons le nombre de C. difficile ayant adhérés par dénombrement sur gélose ou quantification par qPCR- et dans une puce microfluidique, ainsi qu’un test permettant de regarder la formation de biofilm en présence des anticorps. Le premier test a montré une inhibition d’adhérence aux cellules par les anticorps. Le second test est encore en cours de développement. Enfin, la formation de biofilm est inhibée en présence des anticorps. Le biofilm formé par C. difficile étant un facteur de colonisation et de résistance, nous devrions voir une moindre colonisation in vivo et/ou une élimination plus rapide des bactéries par les souris. Nous avons également mis en évidence une activation des neutrophiles en présence de bactéries recouvertes de nos anticorps et une phagocytose augmentée lorsque les anticorps sont présents. Ces premiers résultats sont encourageants mais ces modèles ne sont pas toujours adaptés pour évaluer le potentiel des anticorps et restent trop simples (lignées cellulaires, absence de microbiote). N’existant à ce jour pas de modèle in vitro ou in silico capable de reproduire la complexité du processus infectieux, des modèles in vivo sont nécessaires pour en conclure sur une activité prophylactique ou thérapeutique des anticorps et ce avant d’amorcer une nouvelle phase de développement clinique.

Réduction

Chaque essai nécessitera 12 animaux soit 36 animaux par expérience. Lors d’un essai, plusieurs anticorps seront testés afin de diminuer le nombre de groupes contrôles. C’est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Un nombre inférieur d’animaux pourrait conduire à une expérience non interprétable en cas de décès accidentel d’un individu au cours de l’expérience. Ce nombre d'animaux est calculé au plus juste en fonction de notre expérience antérieure pour garantir la qualité statistique des données et minimiser le nombre de répétitions. À la suite de la quantification des bactéries présentes dans les fèces comme dans le ceacum dans les différents groupes expérimentaux, un test statistique approprié de type ANOVA nous permettra d’évaluer les différences entre les groupes.

Raffinement

Les animaux ne sont jamais privés de nourriture et de boisson et du coton est toujours présent dans les cages. Pendant la durée de l’expérience, ils restent dans leur environnement habituel. Les animaux ne sont pas isolés afin de maintenir une certaine sociabilité. Le gavage sera pratiqué par des personnes expérimentées avec des sondes flexibles. Les embouts utilisés pour ces injections ne sont pas pointus, ils n’entraînent aucun dommage au tractus digestif de l’animal et le gavage se fait par un mécanisme réflexe de l’animal. A J4, J7 et J15 jours après le gavage, les souris seront mises à mort par dislocation cervicale. Les animaux seront observés plusieurs fois par jour après inoculation de l’agent pathogène. Afin de suivre l’état général des souris, nous appliquerons les critères indiqués par la grille de « Body Condition Scoring » (Guidelines for Assessing the Health and Condition of Mice. Charmaine J. Foltz and Mollie Ullman-Cullere. Lab Animal. April 1999. Vol 28, No. 4, pps. 28-32.) ainsi qu’une échelle de scoring: a) Changement de poids corporel : 0=Normal, 1=Perte de poids 20%, b) Apparence physique: 0= Normale, 1=Manque de toilettage, 2=Poil ébouriffé, yeux plissés ou bridés, 3=Poil très ébouriffé, posture anormale, c) Comportement : 0=Normal, 1=Changement mineurs, 2= Anormal : mobilité réduite, inactif, 3=Très agité ou immobile, automutilation. Au score maximum de 3 atteint dans un sous-groupe ou un score final de 6 atteint dans la somme des sous-groupes, les animaux seront euthanasiés. Lors d’une infection des souris par C. difficile, il apparaît parfois une légère diarrhée après 2 jours d’infection mais les souris se rétablissent le jour d’après. Afin d’éviter toute déshydratation, des Dietgel seront mis dans les cages dès l’administration de la bactérie. Dans le cas bien improbable où une déshydratation serait observée, une réhydratation avec du sérum physiologique par voie sous-cutanée pourra être pratiquée. Dans l’éventualité où des animaux seraient durablement malades (score décrit ci-dessus), ils seront mis à mort pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Le modèle souris est le modèle de colonisation de C. difficile largement utilisé dans de nombreux travaux in vivo (à l’inverse du modèle hamster utilisé comme modèle de virulence). Nous privilégions cette espèce et ce d’autant plus que des souris axéniques sont disponibles dans notre animalerie. De plus, l’épithélium intestinal murin est anatomiquement proche de celui de l’homme, avec la présence de villosités au niveau de l’intestin grêle et de cryptes dans le colon. Aucun autre modèle animal inférieur ne possède une structure aussi similaire, qui semble intervenir dans les interactions entre C. difficile et l’hôte lors de la phase d’implantation et de colonisation. Les animaux seront des adultes âgés de 7 semaines afin d’obtenir des résultats homogènes, ce qui pourrait ne pas être le cas avec des animaux à un stade de développement plus précoce, ou bien avec des animaux plus âgés, le microbiote n’étant pas stable pour de jeunes individus, et la diversité restreintes pour des individus âgés. De plus, et pour pouvoir comparer nos résultats avec d’autres travaux, nous conserverons cet age.

3 singes vervets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardés vivants pour un projet ultérieur. Chaque singe subit sous anesthésie une chirurgie abdominale pour la pose d'un implant de télémétrie et une cathétérisation de l'artère fémorale, avec des risques d'infection, d'hémorragie et de complications vasculaires. Le porteur présente l'ensemble comme une opération "de raffinement" destinée à équiper les animaux avant une recherche à venir. Il indique que la nécessité scientifique de cette recherche relève de l'utilisateur final et a été validée en amont, sans la détailler ici.

Objectifs

Le projet consiste en la pose d’implant de télémétrie sur 3 Chlorocebus sabaeus. Ce projet est une phase de pré-etude afin de préparer les animaux à un projet de recherche ultérieur dans un but de raffinement. La pose d’implant de télémétrie permet le suivi en temps réel et en continu des paramètres vitaux des animaux (température corporelle, fréquence respiratoire, fréquence cardiaque, pression artérielle). Cela permet d’obtenir des données physiologiques continues sans stresser les animaux (pas de contention); de plus, cela permet des mesures en temps réel à distance, afin d’être le plus prédictif possible d’un changement d’état physiologique de l’animal et une intervention rapide du personnel si nécessaire (atteinte de point-limite….)

Bénéfices attendus

La pose d’implant de télémétrie permet le suivi en temps réel et en continu des paramètres vitaux des animaux (température corporelle, fréquence respiratoire, fréquence cardiaque, pression artérielle). Ce projet est réalisé en amont d’un projet de recherche pour lequel il est important de pouvoir monitorer les animaux en continu. Dans le cadre des 3Rs, cela permet de raffiner la procédure avec l’obtention de données physiologiques continues sans stresser les animaux, et en étant plus prédictif « en direct » sur toute modification de l’état de l’animal pour une intervention plus rapide en cas d’atteinte de points-limites (monitoring avec système d’alerte possible).

Procédures

Le projet consiste en la réalisation, sous anesthésie générale et analgésie, d’une chirurgie abdominale pour la pose d’un implant intra-abdominal et une cathérisation vasculaire de l’artère fémorale sur 3 animaux.

Impact sur les animaux

Les animaux devant subir une chirurgie, les effets probables sur les animaux seront ceux inhérents à une telle intervention : - de la douleur per et post-opératoire. Cela peut entrainer secondairement une baisse de l’activité et une diminution de l’appétit transitoire pendant quelques jours après la chirurgie. De plus, inhérent à toute intervention de ce type, les risques possibles sont : - risque anésthésique, - risque d’infection, - risque hémorragique per-opératoire, - risque vasculaire sur le membre postérieur cathétérisé.

Devenir

Ce projet ne contient qu’une procédure. Tous les animaux sont gardés en vie en fin de procédure. Projet s’inscrivant comme phase de préparation des animaux en vue d’un projet ultérieur.

Remplacement

Ce projet se déroule dans le cadre de la préparation d’animaux pour fournir des animaux équipés en télémétrie comme phase de pré-étude pour la réalisation d’étude ultérieure. La nécessité scientifique de l’utilisation d’animaux est faite en amont par les utilisateurs des animaux ; leur projet de recherche est déclaré et agréé par les autorités compétentes selon la règlementation en vigueur.

Réduction

Ce projet a lieu dans le cadre d’une mise au point de technique de raffinement, elle est réalisée sur seulement 3 animaux afin d’évaluer / confirmer son intérêt scientifique et de raffinement pour cette étude. Les conclusions pourront en plus servir pour appliquer les principes de Réduction et de Raffinement à d’autres projets futurs.

Raffinement

La réalisation de ce projet s’inscrit pleinement dans un objectif de raffinement puisqu’elle a pour objectif de permettre un meilleur monitoring d’animaux per-étude (acquisition de mesures physiologiques sans intervention sur les animaux) et de pouvoir intervenir le plus tôt possible en anticipant les modifications physiologiques et notamment l’atteinte de points-limites précoces (système d’alerte lors d’atteinte de paramètres limites). Considérant la procédure elle-même, dans le but de limiter les nuisances aux animaux: - La douleur liée à l'intervention chirurgicale sera gérée par une anesthésie et une analgésie per et post-opératoire adaptées. - le risque infectieux sera limité par une asepsie rigoureuse et une antibiothérapie prophylactique per et post-opératoire. - Le risque anesthésique sera limité par le fait que le protocle a été bien adapté en amont et que le monitoring sera fait par un vétérinaire formé. - Les risques hémorragiques et vasculaires seront limités par le fait que la chirurgie est réalisée par un.e chirurgien.ne expérimenté.e dans la technique.

Choix des espèces

Ce projet est une phase « pré-étude » en vue de fournir des animaux équipés en télémétrie pour un projet de recherche ultérieur. Le Singe vert est une espèce phylogéniquement proche de l’homme et particulièrement sensible au virus considéré dans ce projet. La pertinence de l’utilisation du C.aethiops et du stade juvénile pour le projet de recherche a été établie en amont par l’utilisateur final lors de son agrément du projet lui-même.

30 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par le SARS-CoV-2 par voie orale ou intranasale, pesés chaque jour, puis tués par prélèvement sanguin intracardiaque sous anesthésie pour autopsie, afin de valider la voie orale d'infection en vue d'un futur essai de probiotiques contre le Covid-19. Le porteur annonce une perte de poids limitée à 5-8 % et une absence de signes cliniques, en s'appuyant sur ses expériences antérieures. Ce projet est présenté comme une étape préliminaire de calage du modèle avant l'étude principale.

Objectifs

Le présent projet vise à valider la voie orale comme voie d'infection par le SARS-CoV2 chez le hamster. Ce projet représente un travail préliminaire à un autre projet dont l'objectif sera de caractériser l'efficacité de bifidobactéries (groupe de bactéries vivant à l'état naturel dans les intestins) dans la lutte contre les infections au SARS-CoV2, grâce à leur potentiel pouvoir d'inhibition de la fixation du virus SARS-CoV2 sur ses cellules cibles. Des expérimentations in-vitro sont actuellement en cours pour valider cette hypothèse. En cas de succès, et pour valider cette approche in-vivo, il sera nécessaire que les bifidobactéries testées se retrouvent sur le site d’infection virale. N’étant pas administrables par voie intra-nasale, il sera donc nécessaire d’administrer les bifidobacteries et le virus SARS-CoV2 par voie orale. En préalable, il est donc nécessaire de valider cette voie d’infection du SARS-CoV2 sur le modèle hamster qui sera utilisé.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser la voie orale d'infection chez le hamster syrien et de valider la dose infectante choisie. Différents paramètres seront étudiés : - courbe de poids - quantification du virus dans une sélection d'organes d'intérêt (Appareil respiratoire supérieur, rate, poumons) par culture cellulaire et quantification de matériel génétique - lésions pulmonaires par immunohistologie - séroconversion. Ces paramètres serviront de référence lors des expérimentations visant à évaluer le pouvoir des souches probiotiques à prévenir le Covid-19.

Procédures

Groupe témoin + groupe infecté par voie orale : les 18 animaux seront infectés à J0, par voie orale sans anesthésie, avec 200µl de virus à la dose de 10^5 TCID50. Groupe témoin infection i.n: Les 12 hamsters seront soumis à une légère anesthésie gazeuse (isoflurane 5%) afin de leur admnistrer à J0 (à l'aide d'une micropipette) par voie intranasale 40µL de virus à la dose de 10^5 TCID50 (soit 20µl par narine). Les animaux seront manipulés quotidiennement pour une pesée. L'ensemble des animaux seront anesthésiés (J+4 ou J+7) à l'isoflurane puis par injection de kétamine/xylazine afin de réaliser une prise de sang intracardiaque terminale avant autopsie.

Impact sur les animaux

Hormis une perte de poids des hamsters limitée à 5-8% (données issues de nos précédentes expériences), et dont le pic est attendu à J+6, les hamsters ne développent pas de signes cliniques lorsqu'ils sont infectés. A partir de J+6, les hamsters regagnent du poids

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort afin de réaliser une autopsie et une collecte d'organes/sang pour étudier la pathogénie du SARS-CoV2.

Remplacement

Des experimentations préliminaires in-vitro sont encours pour démontrer l'activité anti-protéase in-vitro sur des cellules caco2. Néanmoins, l'évaluation de la pathogénocité d'un virus (multiplication virale, distribution, lésions associées) ne peut se faire in-vitro et nécessite de passer par le modèle animal.

Réduction

le nombre d'animaux par groupe a été fixé à 12 afin d'avoir 6 animaux par point de mise à mort (J+4 et J+7) qui est le minimum généralement requis pour obtenir des résultats d'infection virale statistiquement significatifs . Seul Le groupe témoin ne comporte que 6 animaux, tous mis à mort à J+7 (pas de sacrifice à J+4).

Raffinement

Ces hamsters seront hébergés en cage de 2 à 3 individus avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette), cellulose, et de bâtonnets de bois à ronger. Un contrôle de leur état de santé sera assuré tous les jours. Des points limites précis et suffisamment précoces pour leur éviter toute souffrance prolongée et inutile ont par ailleurs été définis.

Choix des espèces

Les études scientifiques menées sur le SARS-CoV-2 ont maintenant largement démontré que le hamster doré était un modèle expérimental qui présentait une forte sensibilité au virus (atteintes respiratoires, perte de poids) ainsi qu'une forte réceptivité (multiplication du virus dans les poumons). Le hamster est donc le modèle de choix pour l'évaluation de l'efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de nouveaux vaccins. Nos précédentes expérimentations nous ont permis de caractériser la réceptivité et la sensibilité des hamsters adultes vis à vis des souches SARS-CoV2 utilisées au laboratoire. Nous utiliserons donc des hamsters adultes de 8 à 10 semaines à réception.

152 poulets de chair vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont vaccinés par voie intramusculaire ou orale puis infectés par la bactérie Campylobacter, avant mise à mort et prélèvement d'organes, pour optimiser un vaccin destiné à réduire la contamination humaine par la volaille. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable, décrivant Campylobacter comme une bactérie commensale asymptomatique du poulet, et présente ce dernier comme la "seule espèce adaptée" faute d'organoïdes reproduisant l'immunité aviaire. Les poussins sont élevés jusqu'à 42 jours, âge d'abattage des poulets de chair, puis tués pour l'étude.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le développement d’une stratégie de lutte vis-à-vis de la bactérie Campylobacter jejuni dans la filière avicole par la vaccination. Lors d’essais précédents, nous avions montré qu’un vaccin candidat basé sur la protéine appelée « YP437 » donnait des résultats prometteurs en terme d’induction d’anticorps sériques ou de protection vis-à-vis de l’infection bactérienne. Cependant, le protocole vaccinal doit maintenant être amélioré pour être plus efficace. Les objectifs visés par ce projet sont d’évaluer des pistes d’amélioration de la stratégie vaccinale : (1) Evaluer l’efficacité vaccinale du candidat vaccin sous sa forme protéique (vaccination et rappel vaccinal sous forme de protéines). En effet, cette combinaison n’avait pas été évaluée lors des essais précédents qui utilisait une primo-vaccination sous forme d’ADN et un rappel vaccinal sous forme protéique. Or, d’après notre expérience avec d’autres antigènes vaccinaux, la valence vaccin protéique est impliquée dans l’induction d’une réponse immunitaire sérique. (2) Evaluer l’impact de la fréquence (répétitions) des doses administrées du candidat vaccin. L’administration de plusieurs rappels vaccinaux pourrait augmenter l’amplitude des réponses immunitaires protectrices. (3) Evaluer l’impact de la voie d’inoculation en administrant le vaccin candidat par la voie orale (administration mucosale). En effet, lors des essais précédents, seule la voie intramusculaire a été testée. Or, d’après certains résultats précédents, l’induction de réponse immunitaire mucosale a été retrouvée chez des poulets partiellement protégés. La voie orale pourrait donc être intéressante pour stimuler la voie mucosale qui pourrait avoir un rôle sur la réduction de la charge caecale en Campylobacter. (4) Suivre tout un panel de réponses immunitaires dont les anticorps spécifiques circulants et mucosaux (anti-YP437), la réponse cellulaire et la composition du microbiote intestinal en réponse au vaccin en présence de Campylobacter. En effet, lors des essais précédents, seuls les paramètres de l’immunité systémique et mucosale ont été mesurés. Toutefois, il est possible que les efficacités vaccinales soient liées aux réponses humorales spécifiques, à l’immunité mucosale intestinale, à l’immunité cellulaire et/ou à la composition du microbiote intestinal qui pourrait interagir avec Campylobacter, et/ou le vaccin et/ou le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Ce suivi devrait nous donner des indications sur ce qui est important selon différents paramètres testés (fréquence et voie d’inoculation, nature du vaccin) pour induire une réponse immunitaire protectrice contre Campylobacter chez le poulet en étudiant les interactions système immunitaire/microbiote et de Campylobacter au sein des intestins du poulet suite à la vaccination. L’étude de la voie orale permettra d’apporter des réponses sur la stimulation de la voie mucosale et d’être plus adapté à la vaccination de terrain dans les élevages. Le concept est innovant car l’adjuvant utilisé pour la voie orale n’a encore jamais été testé chez des poulets de chair.

Procédures

Plusieurs lots seront vaccinés par voie intramusculaire ou orale et infectés par Campylobacter par voie orale. Les prélèvements d’organes (caecum, rate et bourse de Fabricius) et de fluides (sang et bile) auront lieu après mises à mort des animaux. Au total, 7 lots de poulets de chair (souche Ross 308) seront utilisés. Lot 1: Vaccinés par la protéine YP 437 deux fois aux jours 5 et 12 par voie intramusculaire et infecté par Campylobacter au jour 19. Lot 2: Témoin placebo du lot 1 Lot 3: Vaccinés par la protéine YP 437 quatre fois au jours 5, 12, 19 et 28 en intramusculaire et infecté par Campylobacter au jour 19. Lot 4: Témoin placebo du lot 3 Lot 5: Vaccinés par la protéine YP 437 deux fois au jours 5 et 12 par voie orale et infecté par Campylobacter au jour 19. Lot 6: Témoin placebo du lot 5 Lot 7: Témoin challenge (non vacciné mais infecté par Campylobacter). Les poulets des lots 1 à 4 seront inoculés par voie intramusculaire. Les lots 1 et 3 seront inoculés avec le vaccin contenant la protéine YP 437 émulsionnée dans un adjuvant alors que les lots 2 et 4 seront inoculés avec un placebo (PBS + adjuvant). Les poulets du lot 5 seront inoculés avec le vaccin contenant la protéine YP 437 émulsionnée dans un adjuvant par voie orale alors que les poulets du lot 6 seront inoculés également par voie orale mais avec un placebo (PBS + adjuvant). Les lots 5 et 6 seront au total vaccinés 4 fois alors que les lots 1 à 4 seront au total vaccinés 2 fois. Le lot 7 ne sera pas vacciné. Tous les poulets seront infectés par voie orale par Campylobacter au jour 19. L’essai se déroulera comme suit: J1 : Naissance et mise en place des poussins au sein des animaleries et mise à mort de 5 poussins pour prélèvements de vésicules vittelines afin de vérifier le statut indemne en Campylobacter. J5 : Première vaccination pour tous les lots sauf le 7. J12 : Deuxième vaccination pour tous les lots sauf le 7. J19 : Infection avec Campylobacter par voie orale sur tous les animaux et mise à mort de 5 animaux par lot pour prélèvements de fluides et d’organes. Troisième vaccination pour les lots 5 et 6. J22 : Récolte de fientes à même le sol afin de vérifier la colonisation en Campylobacter suite à l’infection des poulets 3 jours avant. J28 : Quatrième vaccination pour les lots 5 et 6. J42 : Fin de l’essai, mise à mort de 16 animaux par lot pour prélèvements de fluides et d’organes. Au total, 152 animaux seront utilisés pour cette procédure.

Impact sur les animaux

Le vaccin protéique a déjà été utilisé lors d’expérimentations précédentes chez les poulets de chair, et aucune réaction indésirable n’a été décelée suite à la vaccination. L’adjuvant utilisé par voie intramusculaire a déjà été utilisé et n’a pas provoqué d’effets indésirables. L’adjuvant utilisé par voie orale n’a jamais été inoculé chez le poulet mais il a déjà été testé chez d’autres modèles animaux (bovin, porcin, poisson, murin) sans effets indésirables. Par ailleurs, Campylobacter est considérée comme une bactérie commensale des poulets, et à ce titre est asymptomatique. En outre, la souche utilisée a déjà fait l’objet de plusieurs essais in vivo et aucun effet indésirable n’a été observé. Il n’est donc attendu à ce qu’aucun effet indésirable ne survienne tout au long de l’essai.

Devenir

Les prélèvements d’organes et fluides seront réalisés après la mise à mort de l’animal. Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale.

Remplacement

La volaille et notamment le poulet de chair représente la source majeure de campylobactériose pour l’homme. Campylobacter fait partie de la flore naturelle des poulets qui le portent de manière asymptomatique. La colonisation intervient entre la seconde et troisième semaine après l’éclosion. Le but de cette étude ici est de contribuer au développement de vaccins contre cette bactérie chez le poulet afin de réduire in fine le risque d’infection humaine par Campylobacter. La mise en place de la protection vaccinale contre Campylobacter fait intervenir à la fois le système immunitaire composé de différentes cellules et le microbiote intestinal. En l’absence de lignée cellulaire (population de cellules ayant une capacité de se diviser et donc de se multiplier) ou d’organoïdes (modèle d'un organe) pouvant mimer le système immunitaire aviaire et les interactions Campylobacter-microbiote-système immunitaire, aucune stratégie alternative visant à évaluer l’immunogénicité d’un vaccin inoculé aux poulets ou l’impact de la vaccination sur le microbiote n’est disponible. Le poulet est donc la seule espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de notre procédure.

Réduction

Les animaux seront utilisés au seuil de la pertinence scientifique et statistique. Au jour 19 (avant infection par Campylobacter per os), 5 poulets par lot seront mis à mort pour avoir un nombre d’animaux par lot minimal pour appliquer les tests statistiques fiables pour les paramètres étudiés. Au jour 42, en raison de la variabilité interindividuelle importante du dénombrement de Campylobacter, il est nécessaire d’avoir à minima 15 animaux par lot afin de comparer les charges caecales en Campylobacter, reflétant l’efficacité vaccinale. Des tests de comparaison de moyennes seront effectués pour analyser les résultats des différents lots à chaque date de prélèvement. Des tests paramétriques (Student ou Anova) seront utilisés lorsque les critères de normalité et d’homogénéité des variances seront réunis. Sinon des tests non paramétriques (Kolgomorov-Smirnov ou Kruskall Wallis) seront utilisés.

Raffinement

Dans nos expériences précédentes, avec le vaccin à base des protéines YP437, aucun symptôme ou effet indésirable n’a été détecté chez les animaux étudiés (avec deux injections de vaccin). Le protocole a été établi pour limiter au maximum le nombre de manipulation par animal. Néanmoins, afin de pouvoir bien évaluer l’immunogénicité du vaccin et la preuve du concept, il apparait opportun, dans deux groupes, de réaliser 3 rappels vaccinaux au lieu d’un seul. Pour ces animaux, comme pour l’ensemble des animaux par ailleurs, le personnel expérimenté apportera la même attention à chaque injection pour éviter/limiter les inconforts au moment de l’injection. D’après notre expérience, les vaccins se diffusent très bien en intramusculaire et une garde au niveau de l’aiguille rattachée à la seringue peut être ajoutée pour que l’aiguille soit bien positionnée et bien adaptée à la dimension de la cuisse du poulet. L’adjuvant utilisé par voie intramusculaire a déjà été utilisé et n’a pas provoqué d’effets indésirables. L’adjuvant utilisé par voie orale n’a jamais été inoculé chez le poulet mais il a déjà été testé chez d’autres modèles animaux (bovin, porcin, poisson, murin) sans effets indésirables. Afin de limiter les gestes invasifs et le stress chez les animaux, les prélèvements de sang auront lieu lors de la saignée à la veine jugulaire après mise à mort des animaux. Par ailleurs, Campylobacter est considérée comme une bactérie commensale des poulets, et, à ce titre, l’infection est asymptomatique. En outre, la souche utilisée a déjà fait l’objet de plusieurs essais in vivo et aucun effet indésirable n’a été observé. Aucun effet indésirable n’est donc attendu au cours de cet essai. Néanmoins, les animaux seront observés quotidiennement. Si toutefois, une altération de l’état de santé était observée quelle que soit la raison, les animaux concernés seront mis à mort en cas d’atteinte des points limites suivants : blessure grave, prostration, absence de réaction après sollicitation (absence de réponse à des stimuli tactiles et visuels), anorexie ou impossibilité de s’abreuver ou de s’alimenter.

Choix des espèces

Campylobacter fait partie de la flore naturelle des poulets qui le porte de manière asymptomatique. La colonisation de cette flore intervient entre la seconde et troisième semaine après l’éclosion. Le but des études ici est de contribuer au développement de vaccins contre cette bactérie chez le poulet afin de réduire in fine le risque d’infection humaine par Campylobacter. Le poulet est donc la seule espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de notre procédure. Des poussins de 1 jour seront utilisés et élevés jusqu’à 42 jours. Le but est de suivre les réponses immunitaires et l’influence du microbiote avant au jour 19 et suite à l’infection par Campylobacter au jour 42, âge moyen testé lors des précédents essais et cohérent avec l’âge d’abattage des poulets de chairs pour la consommation.

1 975 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux de deux jours sont infectés par la bactérie Bacillus cereus puis traités par injection, et sont tués au bout de 48 heures avec les mères, susceptibles d'avoir été contaminées. Le porteur indique que l'infection provoque une baisse d'activité, une pâleur, puis le rejet par la mère et l'absence d'alimentation, la survie des animaux étant le critère suivi. Il affirme avoir déjà testé les composés in vitro mais conclut à la nécessité de vérifier l'effet dans un modèle d'infection vivant.

Objectifs

L’identification d’un nombre croissant de cas d’infections dues aux bactéries du groupe Bacillus cereus sensu lato, pathogène opportuniste (ne causant en général pas de maladie chez les personnes en bonne santé) présent dans l’environnement, représente un problème majeur en santé publique. Il s’agit de la 3ème cause d’intoxications alimentaires dans le monde (Autorité Européenne de Sécurité des Aliments : EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ). EFSA J, 2016), et de plus en plus de travaux font aussi état d’infections fatales chez le nouveau-né prématuré. Le traitement antibiotique de référence contre ces infections à Bacillus cereus consiste en une association vancomycin/aminoglycoside. Cependant, la recherche d’un traitement plus simple et moins lourd à mettre en place serait un plus dans la prise en charge de ce type d’infections. Ce projet devrait permettre de répondre à la question de l’EFSA et de l’ANSES (Agence Nationale de Sécurité Sanitaire de l'Alimentation de l'Environnement et du Travail) sur les risques en santé publique, des bactéries du groupe Bacillus cereus et permettre la mise au point de nouveaux traitements contre ce type d’infection.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est la recherche de nouveaux traitements contre les infections à Bacillus cereus. S’il existe un traitement antibiotique de référence contre ce type d’infection chez le nouveau-né prématuré, la découverte d’un traitement plus simple et moins lourd à mettre en place constituerait une avancée significative dans le traitement de ces infections.

Procédures

Aucune intervention ne sera effectuée sur les femelles gestantes avant, pendant ou après mise bas. Les souriceaux de 2 jours seront infectés par voie intrapéritonéale, puis, une heure plus tard, traités par injection par voie intrapéritonéale. Le temps nécessaire à l'infection ou au traitement, par voie intrapéritonéale, n'excéde pas 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux seront ceux liés à l'infection en général, à savoir principalement chez les souriceaux, baisse de l'activité, pâleur, pouvant aboutir au rejet par la mère et à l'absence d'alimentation, visualisée par l'absence de lait dans l'estomac. Nous utiliserons des doses infectantes déterminées dans un précédent projet. Les animaux infectés seront traités avec les composés chimiques sélectionnés et la survie des animaux sera suivie au cours du temps et comparée avec des animaux traités avec une solution saline.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort au bout des 48 heures de la procédure, les souriceaux ayant été infectés et/ou traités avec différents composés chimiques et les femelles gestantes après mise bas ayant pu être contaminées par les souriceaux infectés.

Remplacement

Les différents composés étudiés ont été testés in vitro sur des cultures de Bacillus cereus et les concentrations minimales inhibitrices déterminées pour chaque composé actif contre cette bactérie. Nous devons maintenant vérifier que cet effet observé sur des bactéries en culture se retrouve dans un modèle d’infection in vivo. Dans un souci de remplacement et de raffinement, des tests de toxicité sur cellules nous ont permis de déterminer les doses de chaque composé n'entrainant pas de mort cellulaire. Ce sont ces doses qui seront utilisées dans ce projet.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d'animaux le plus restreint possible nous permettant d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ce nombre sera calculé en tenant compte de nos résultats d'un précédent projet. Il pourra être réduit encore en fonction des résultats obtenus.

Raffinement

En termes de raffinement, afin de garantir le bien-être des souris, celles-ci seront hébergées dans un environnement enrichi (igloo et baguette en papier). Également, ce projet fait suite à un précédent projet au cours duquel les doses infectantes ont été déterminées. Après infection et après traitement avec les composés, les animaux seront surveillés quotidiennement (aux temps 2 heures post infection et 1, 2, 4, 6, 8, 24 et 48h post traitement) par les responsables du projet et par le personnel animalier, permettant de détecter toute apparition de signes de souffrance durables non reliés à l’infection et pouvant être dus à une mauvaise injection. Le cas échéant, les animaux concernés seraient immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement décrit dans la littérature comme modèle de l'infection in vivo. De plus, les systèmes de défense contre les bactéries pathogènes sont très conservés de la Drosophile aux Mammifères, et en particulier, les réponses cellulaires de l'hôte vis-à-vis du pathogène sont très similaires entre la souris et l'homme. Ce modèle est celui que nous avons utilisé dans nos études précédentes dans un modèle de bactériémie à Escherichia coli chez la souris, dans un modèle murin de bactériémie induite au cours d'une pneumonie à Staphylococcus aureus et dans un modèle d’infection à Pseudomonas aeruginosa. Plus précisément, ce modèle d'infection chez la souris C57Bl/6JRj nouveau-née est celui que nous avons utilisé par ailleurs dans l'étude de l'infection à Bacillus cereus chez le nouveau-né prématuré. Les animaux utilisés seront des souriceaux nouveau-nés de 2 jours, afin de coller au plus prés aux cas d'infections fatales observées en clinique chez le nouveau-né prématuré.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux à trois injections d'un candidat vaccin contre Klebsiella pneumoniae, deux à trois prélèvements de sang par section d'une partie de la queue au scalpel sous anesthésie, puis une ponction cardiaque terminale. Le porteur indique tester différents protocoles d'immunisation pour comparer leur efficacité, les retombées pour des patients étant renvoyées au conditionnel et au long terme. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'est pas encore possible de se passer du modèle animal pour produire des anticorps.

Objectifs

S’appuyant sur les données communiquées par 87 pays en 2020, un nouveau rapport de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) met en évidence des niveaux élevés de résistance des bactéries aux antibiotiques (supérieurs à 50 %), en particulier chez des bactéries fréquemment retrouvées en milieu hospitalier, comme Klebsiella pneumoniae et Acinetobacter baumannii, responsables de septicémie (infection généralisée). Le traitement de ces infections requiert obligatoirement l’utilisation d’antibiotiques de dernière ligne, tels que les carbapénèmes. Cependant, 8% (jusqu’à 50% dans certains pays) des souches de Klebsiella pneumoniae responsables d’infections sanguines sont résistantes à ces mêmes carbapénèmes, ce qui augmente notoirement le risque de décès imputables à ces infections. D’autres alternatives, en particulier vaccinales, sont actuellement à l’étude. Un candidat vaccin a déjà montré une protection significative dans un modèle de septicémie à Klebsiella pneumoniae chez la souris. Une précédente étude a également testé la production d’anticorps chez le lapin en réponse à l’administration de ce candidat vaccin. L’objectif du présent projet est de poursuivre l’étude de ce vaccin chez la souris en testant différents protocoles d’immunisation et en comparant leur efficacité et également d’analyser la spécificité du vaccin.

Bénéfices attendus

Après la mise en évidence de l’efficacité du candidat vaccin chez la souris, et de sa capacité à entrainer la production d’anticorps chez la lapine ce projet vise à déterminer le meilleur protocole d’administration et à évaluer la variabilité de réponse à son administration ainsi que sa spécificité. A terme, l’idée est de pouvoir favoriser la vaccination de populations à risque, en l’absence de traitement antibiotiques efficaces.

Procédures

Les animaux vont être soumis à différentes interventions : - 2 à 3 administrations du candidat vaccin par voie intramusculaire à J0, J21 +/- J42 (une administration correspond à une injection par cuisse) sur animal vigile _ 3 secondes par injection - 2 à 3 prélèvements sanguins à la queue à J0, J7 +/- J28 par section d’une partie de la queue au scalpel après anesthésie gazeuse _ 5 minutes dans la cage à induction pour l’anesthésie puis 10 secondes pour le prélèvement - 1 anesthésie générale par injection intrapéritonéale (3 secondes) directement suivie d’une ponction intracardiaque de sang (30 secondes) qui se terminera par une dislocation cervicale (3 secondes) pour assurer la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux vont être soumis à différents actes pouvant induire un stress ou une douleur légère : - Jusqu’à 3 administrations intramusculaires à J0, J21 +/- J42 (chaque administration correspond à 2 injections : cuisse droite + cuisse gauche) _ Le candidat vaccin ainsi que l’adjuvant ont déjà été testés chez la souris et le lapin et n’ont montré aucun signe de toxicité. - 2 à 3 prélèvements sanguins par section d’une petite portion de la queue à J0, J7 +/- J28 réalisés sous anesthésie gazeuse _ Prélèvements réalisés sous anesthésie et uniquement sur 10 souris par groupe. - 1 anesthésie générale par injection intra péritonéale (IP) directement suivi d’une ponction intracardiaque de sang qui se terminera par une dislocation cervicale pour assurer la mise à mort. _ La ponction intracardiaque étant réalisée sous anesthésie générale, elle ne sera associée à aucune douleur particulière.

Devenir

Les 100 animaux du projet seront mis à mort à l’issue des 28 ou 49 jours d’expérience ou plus précocement s’ils montrent des signes de souffrance.

Remplacement

La production d’anticorps est un mécanisme complexe basé sur l’interaction entre plusieurs types de cellules immunitaires. La première étape indispensable à cette production est l’immunisation chez l’animal. Il n’est pas encore possible aujourd’hui de se passer du modèle animal pour la production d’anticorps.

Réduction

Le nombre d’animaux de cette étude a été déterminé en fonction de la quantité de sérum souhaité en fin d’expérience. Un volume correspondant au prélèvement de 20 souris sera nécessaire afin de réaliser des expériences in vitro de l’activité bactéricide sur plusieurs souche de K.pneumoniae. L’efficacité de l’immunisation sera analysée après 2 et 3 administrations ce qui impose un nombre de 40 animaux pour les groupes recevant le vaccin ou les cellules porteuses. En revanche, pour le groupe témoin (adjuvant) pour qui aucune production d’anticorps spécifique à K.pneumoniae n’est attendue, l’analyse du sérum après 3 injections uniquement sera suffisante et permettra de réduire l’effectif de ce groupe à 20 animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Ils seront suivis 2 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude. Un suivi accru sera réalisé durant les 6h suivant les administrations du candidat vaccin et la fréquence de surveillance sera augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux. L’administration du candidat vaccin n’est pas censée entrainer d’effet indésirable. Cependant des critères d’interruption de l’étude, supportés par une grille de score de douleur, ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance. Également, les prélèvements sanguins à la queue ont été limités à seulement une partie des animaux de chaque groupe.

Choix des espèces

Le système immunitaire de la souris, proche de celui de l’homme, en fait un modèle de choix pour les études d’immunisation. Également, la suite du projet impliquera de tester ce vaccin dans un contexte d’infection pulmonaire à K.pneumoniae qui est un modèle infectieux que notre laboratoire a déjà développé chez la souris. Souris de 6 à 8 semaine de façon à avoir une maturité immunitaire suffisante, capable de produire une réponse IgG.