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Programme d’immunisation de lapins pour la génération d’anticorps polyclonaux
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3 615 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections d'antigènes combinés à un adjuvant, dont l'adjuvant complet de Freund qui peut provoquer ulcérations et fièvre, puis des prises de sang répétées, à raison de deux lapins par protocole pour 1 590 protocoles. Il s'agit d'une production commerciale d'anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche publiques et privées, non d'une étude scientifique. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace pour cette production et écarte les banques d'anticorps existantes au nom du temps et du budget.
Objectifs
Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire.
Bénéfices attendus
Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation de substances médicamenteuses. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe. Afin de répondre aux besoins exprimés par différentes équipes de recherche, 1590 protocoles sont envisagés.
Procédures
Injections en intradermique, en sous-cutanée ou en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) Prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).
Impact sur les animaux
Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en sous-cutanée couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang et les injections avec de l’adjuvant incomplet de Freund, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur). Le volume de sang étant en effet adapté au poids de l’animal et correspondra au maximum à 10% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.
Devenir
Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.
Remplacement
La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.
Réduction
Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.
Raffinement
Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'acépromazine, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.
Choix des espèces
L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.
Régulation du développement de l’épithélium intestinal par l’interaction entre la colonisation du microbiote et la signalisation des cytokines.
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16 430 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère. Élevés au stade larvaire dans un milieu antibiotique pour supprimer leur microbiote, ils sont collectés à différents jours, anesthésiés et enrobés dans une matrice de cellulose pour observation au microscope, puis mis à mort pour prélèvement de l'intestin ou séquençage. Le porteur indique que la privation de microbiote entraîne un sous-développement de l'intestin et que la collecte peut être une source de stress. Il justifie le choix de l'espèce par la transparence des larves et leur développement hors de l'utérus, et affirme que la culture in vitro d'un intestin colonisé est impossible à l'heure actuelle.
Objectifs
Les cytokines sont des agents essentiels du système immunitaire et constituent une partie des molécules indispensables à la communication intercellulaire. L'activité d'une cytokine est assurée par la présence à la surface de la cellule cible, de récepteurs spécifiques : ceux-ci permettront de transmettre le message. Elles sont donc des médiateurs, et leur production a lieu en réponse, principalement, à la présence d'un agent infectieux tels qu'un virus ou une bactérie, ou de l'un de leurs constituants. La colonisation de l'intestin par les micro-organismes commensaux (hôte habituel d'un organisme sans lui causer de dommage) commence avec l'ingestion de nourriture, et augmente massivement en nombre et en complexité avec les changements alimentaires tels que l'inclusion d'aliments secs dans le repas des poissons. La génération d'animaux sans germes par l'élimination de la flore commensale en début de vie entraîne un sous-développement des cellules épithéliales et immunitaires intestinales, ce qui conduit à un dysfonctionnement durable de l'organe. Les poissons zèbres dépourvus de microbiote intestinal (ensembles des micro-organismes présents dans l’intestin) présentent une prolifération épithéliale intestinale et une différenciation cellulaire défectueuses au cours du développement. Par exemple, les maladies inflammatoires intestinales peuvent résulter d’un problème d’échange entre la lumière intestinale (espace intérieur de l’intestin) et les cellules épithéliales qui la composent. En fait, la perturbation du dialogue entre le microbiote, le système immunitaire et les cellules épithéliales via les cytokines peut avoir des effets délétères sur l’état d’équilibre de l'intestin, compromettre l'absorption des nutriments et avoir un impact au-delà de l'intestin. Plusieurs études ont révélé des mécanismes par lesquels le microbiote contrôle la maturation du système immunitaire intestinal. Cependant, la manière dont le microbiote régule le développement de l'épithélium intestinal reste largement inconnue. Nous voulons donc comprendre comment les bactéries présentes dans notre intestin et l’interaction qu’elles ont avec les cytokines d’intérêt, peuvent réguler le développement de l’épithélium intestinal.
Bénéfices attendus
Le système immunitaire est bien connu pour son rôle important lors d'infections par des bactéries, des virus et d'autres agents pathogènes. Cependant, au-delà de l'immunité et de la défense, le rôle des signaux du système immunitaire, tels que les cytokines, dans le développement et la maturation des organes n'est pas bien compris. En outre, on ne sait pas comment les cytokines interagissent avec l’ensemble des micro-organismes colonisateurs, qui favorise la maturation des organes. Ces questions peuvent être facilement étudiées dans le modèle du poisson zèbre puisqu'il se développe en pleine eau et qu'il est transparent, ce qui permet d'observer directement les organes en développement dans le contexte de l'organisme complet. En outre, la manipulation de l'environnement est également très facile avec ce modèle animal. Ces avantages expérimentaux nous permettent de comprendre en détail comment les cytokines et leur interaction avec le microbiote modulent le développement et la maturation des organes intestinaux. En outre, ce projet nous permettra de révéler comment le dysfonctionnement du système immunitaire, au-delà de l'altération de la défense et de l'immunité, peut entraîner une altération de la maturation correcte de l'intestin. Ces résultats peuvent potentiellement ouvrir la voie à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies intestinales, y compris celles liées à l'inflammation intestinale, ainsi que pour les pathologies dans lesquelles le bon fonctionnement physiologique de l'intestin est compromis.
Procédures
Les différentes interventions sur les larves dépourvues de toute flore seront les suivantes : - Observation rapide sans ouverture de boite tous les jours ou presque - Changement du milieu antibiotique, tous les jours ou tous les 2 jours - Aux temps J5, J8, J12, J15, 25 larves seront collectées, anesthésiées et incluent délicatement dans une matrice de cellulose le temps de l’observation au microscope. L’observation avec prise de photo de chaque larve pourrait prendre jusqu’à deux heures. Les larves seront mises à mort pour analyse post-mortem. - Aux temps à J12 et J15, 30 larves seront collectées et mises à mort avant de prélever l’intestin pour analyse. - Collecte de 225 larves pour séquençage. Les larves seront mises à mort pour analyses. - 15 larves seront collectées, anesthésiées et incluent délicatement dans une matrice de cellulose le temps de l’observation au microscope et seront mises à mort pour analyse post-mortem.
Impact sur les animaux
Nous allons étudier des larves de 5 jours post-fertilisation (dpf) jusqu’à 15dpf, avec prise alimentaire sans germe à partir de 7 dpf. La formule de cette nourriture contient tous les nutriments nécessaires à leur croissance en dehors des germes. Les concentrations d’antibiotiques dans lesquels les larves vont se développer sont adaptées pour leur développement. L’effet indésirable qui pourrait apparaitre serait une mortalité des larves au cours du processus. Un risque de stress lors de la collecte des larves pour analyse au microscope est possible.
Devenir
Toutes les larves seront mises à mort pour analyse post-mortem
Remplacement
L'étude de cellules souches en culture extraite de l'organisme vivant n'est pas suffisante pour comprendre les processus de l'embryogénèse (processus de formation d'un organisme pluricellulaire, de la cellule initiale issue de la rencontre des cellules reproductrices parentales à un être vivant autonome). La culture in vitro d’intestin et sa colonisation avec un microbiote est impossible à l’heure actuelle. Il n’existe aucune donnée sur d’autre modèle de Vertébré. Néanmoins, il existe des données de séquençage de l’ARN (technique pour identifier et quantifier le matériel génétique à un moment donné) issues du modèle poisson sur lesquelles nous nous sommes basés.
Réduction
Nous combinons, autant que possible, des méthodes d’analyse multiples à partir des mêmes animaux (les animaux observés en microscopie seront mis à mort pour utiliser leur intestin pour extraire l’ARN.) de manière à réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. De plus, nous aurons souvent recours à des méthodes d’analyse non-invasives grâce à des marqueurs fluorescents pouvant être suivis facilement du vivant de l’animal. Les tailles des lots ont été déterminés en fonction de notre expérience passée ou celle de collaborateurs proches. Les prélèvements seront réalisés de manière à pouvoir mettre en œuvre le maximum d’analyses pour une larve donnée (études génomiques, cellulaires, histologiques). Cette optimisation des échantillons permet de réduire le nombre total d’animaux utilisés dans le projet
Raffinement
Les espacements des observations ont été déterminés en fonction de notre expérience passée ou celle de collaborateurs proches. D’une façon générale, les expériences sont de courte durée. Les larves seront lors de la manipulation pilote surveillées quotidiennement puis la fréquence du suivi sera ajustée. Les larves mortes seront enlevées et le milieu avec antibiotique sera changé pour garder les larves dans un environnement optimal. Pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l'angoisse de l'animal, ce dernier sera anesthésié durant toute la procédure expérimentale d’analyse au micrsocope par le biais de la tricaïne diluée dans l’eau.
Choix des espèces
Notre compréhension de la manière dont cellules, gènes de l'hôte et microbiote contrôlent le développement des organes des vertébrés est limitée dans les modèles mammifères. Il n'est pas pratique d’y réaliser des manipulations précises dans l'environnement, dans l’animal, et en même temps, de suivre en image l'intestin en développement. Pour surmonter ces limites, notre nouvelle approche consiste à combiner les avantages du modèle du poisson zèbre avec les nouvelles technologies. Le poisson zèbre est un modèle animal idéal pour étudier le développement des vertébrés en raison de sa facilité de manipulation génétique, de sa grande descendance, de sa transparence et de son développement ex utero rapide. Il est également un système modèle puissant pour étudier le microbiome (environnement spécifique d’un microbiote) des vertébrés. Enfin, la plupart des lignées et des voies immunitaires sont conservées entre poissons et mammifères. Cette étude s’effectuera sur des larves de 5dpf jusqu’à 15 dpf. Nous avons choisi cet espace du stade de développement car nous souhaitons caractériser l’expression de ces cytokines au cours des stades du développement précoces sous deux conditions environnementales différentes (présence de germes conventionnels et sans germe).
Evaluation pharmacologique de composés naturels ou de synthèse pour le traitement des maladies infectieuses
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
8 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 7 300 dans des procédures classées sévères. Elles sont infectées par diverses voies, nasale, intrapéritonéale, urétrale, intradermique et intramusculaire, puis traitées avec des composés candidats, la plupart des études se terminant par un prélèvement d'organes après mise à mort. Le porteur indique que les animaux peuvent perdre du poids et présenter posture voûtée, difficultés respiratoires et prostration, une perte de plus de 20 pour cent du poids servant de point limite. Il affirme qu'il n'existe aucun modèle in vitro reproduisant les interactions entre agent pathogène et système immunitaire, et revendique un besoin de santé publique majeur.
Objectifs
Nous avons pour objectif le développement de thérapies innovantes dans le domaine de l'infectiologie afin de répondre à un problème majeur qu’est la résistance aux antibiotiques.
Bénéfices attendus
Le nombre croissant d’antibiorésistances et d’infections nosocomiales sont clairement identifiés comme un besoin de santé public majeur. Il est indispensable de combattre la résistance aux antimicrobiens et de préserver la capacité de prévenir et traiter les maladies infectieuses à l’aide de nouveaux médicaments sûrs et efficaces
Procédures
Voie d’administration (traitement) : - Per os : 5 secondes, Sous cutané : 5 secondes , Intrapéritonéal : 5 secondes, Intramusculaire : 5 secondes, Intraveineuse : 5 secondes Voie d’administration (infection): - Intra-nasale: 5 secondes, Intra-peritoneale : 5 secondes, Intra-urétrale: 30 secondes, Intra-peritoneale : 5 secondes, Intra-dermique: 5 secondes, Intramusculaire: 5 secondes. Le nombre d'interventions est spécifique de chaque étude et est dépendant du régime de traitement qui lui même est corrélé à la pharmacocinétique de chaque molécule en développement. Néanmoins les fréquences d'intervention (traitement uniquement) peuvent etre uid ou bid.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont une potentielle perte de poids (qui sera considérée comme un point limite si excédant 20%). D'autres effets potentiels sont une apparition de signes cliniques : posture courbée, pelage en piloérection, respiration difficile, prostration ou perte d’activité, perte de réponse à un stimulus.
Devenir
Le sort prévu de tous les animaux à l'issue de chaque procédure est la mise à mort. En effet les études se finissent pour la plupart par des prélèvements d'organes qui sont réalisés après mise à mort des animaux. Les animaux survivants ne peuvent resservir à d'autres expérimentations en raison du développement de défenses immunitaires au cours de l'établissement des pathologies infectieuses.
Remplacement
L’apparition de résistance aux traitements antibiotiques de référence rend urgente la découverte de nouvelles solutions thérapeutiques innovantes. Le recours à l’animal de laboratoire s’inscrit dans le cadre de la résistance de certains agents pathogènes aux antibiotiques. En effet l’efficacité in vivo d’un composé sur une infection résulte non seulement de l’effet de ce dernier sur les micro-organismes mais également de la réponse du système immunitaire de l’hôte sur ces agents pathogènes. Il n’existe aucun modèle in vitro mimant de façon précise ces interactions complexes. Afin d’évaluer l’activité thérapeutique de nouvelles substances, des modèles pharmacologiques in vivo mimant les pathologies telles que la septicémie, les infections pulmonaires, les infections urinaires etc… sont utilisés. De plus les mécanismes de réaction de l’hôte peuvent être mis en évidence en utilisant ces modèles sur animaux immunocompétents versus immunodéprimés. Une veille scientifique est mise en oeuvre pour étudier toute méthode scientifique alternative à l’expérimentation animale dans le domaine.
Réduction
Le nombre estimé est entre 1000 et 1600 animaux / an sur 5 ans. 12 procédures expérimentales sont prévues dans ce projet et le nombre d'étude varie en fonction de la demande client. Le nombre d’animaux inclus dans chaque étude peut varier de 20 à 100, en fonction du nombre de groupes différents à générer dans chaque étude (nombre de souches bactériennes différentes à tester, nombre de molécules antibactériennes à tester, doses différentes de la molécule antibactérienne). Cet écart dans le nombre d’animaux par étude justifie la fourchette d’évaluation du nombre à l’année. . Des études in vitro sont réalisées si possible en amont afin de ne pas avoir à tester des produits potentiellement dangereux ou non efficaces sur des animaux. Des analyses statistiques visant à déterminer le nombre d’animaux optimal pour produire des résultats robustes sont effectués. Des études pilotes sont conduites afin de s'assurer de la fiabilité du modèle.
Raffinement
Le bien-être de l’animal sera en permanence au centre de nos préoccupations. Les souris sont hébergées dans des cages à 22 ± 2 °C et 50 ± 10% d’hygrométrie, en portoirs ventilés ou isolateurs, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé chaque semaine. Les animaux ont une semaine d’acclimatation avant que les procédures ne débutent. Les conditions d’expérimentation font l’objet d’un suivi attentif du bien-être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement par la structure en charge du bien-être animal Pour les protocoles où la douleur ne peut pas être prise en charge par des analgésiques, une observation accrue et des critères d’arrêt stricts sont mis en place. Les points limites utilisés sont: Le suivi du poids (le critère d'arret est une perte de plus de 20%), L'accumulation de signes cliniques : posture courbée, pelage en piloérection, respiration laborieuse, prostration ou perte d’activité, perte de réponse à un stimulus. Pour le confort de l'animal la prévention du stress est intégrée au protocole expérimental par l'utilisation d'une anesthésie gazeuse (isoflurane) au préalable des gestes douleureux (injection intraveineuse, injection intra-uretrale, injection intra-musculaire,...).
Choix des espèces
L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus). Les modèles souris sont largement utilisés par les équipes de Recherche publique et privée dans le traitement des maladies infectieuses Les souris se prêtent aux analyses immunologiques en raison d'un large panel d'outils d'analyses permettant de disséquer les mécanismes du développement de la physiopathologie
Évaluation de l’efficacité de candidats vaccins recombinants contre le COVID-19, la grippe et la rage, basés sur le vaccin vivant contre la rougeole
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
3 930 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales, intramusculaires, intranasales ou intracérébrales de candidats vaccins ou de virus d'épreuve, dont la grippe et la rage qui peuvent provoquer une pneumonie et une perte de poids jusqu'à 25 %, voire la mort. Le projet évalue chez la souris des vaccins recombinants contre le COVID-19, la grippe et la rage, dérivés du vaccin contre la rougeole. Le porteur indique qu'aucun animal ne peut être réutilisé ou sorti de l'animalerie confinée, et affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit l'interaction hôte-pathogène.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de réaliser l’évaluation préclinique chez la souris de candidats vaccins élaborés dans notre laboratoire. Ces candidats vaccins sont dérivés du vaccin vivant atténué contre la rougeole, qui est l’un des vaccins humains les plus sûrs et efficaces. Pour bénéficier des grands avantages de ce vaccin, nous développons des nouveaux vaccins recombinants ou chimériques construits à partir du génome de la souche Schwarz du virus vaccinal de la rougeole (MV) qui est modifiée pour exprimer un ou plusieurs antigènes des agents pathogènes ciblés. Ces antigènes sont exprimés à partir d’unités additionnelles de transcription (stratégie vaccin recombinant) ou à la place d’antigènes du vaccin contre la rougeole (stratégie vaccin chimère). Ces stratégies ont déjà fait l’objet de nombreuses publications scientifiques par notre équipe et par d’autres. Plusieurs programmes sont poursuivis en parallèle dans le laboratoire. Dans ce projet, nous développons des vaccins recombinants ou chimériques MV-COVID, MV-grippe et MV-rage. Pour chacun des agents pathogènes ciblées, une série de plusieurs candidats vaccins sont construits, produits et caractérisés en faisant varier le choix et la forme des antigènes vaccinaux, la conception du/des transgènes et leur insertion dans le génome de la souche Schwarz avant l’étude in vivo. Les candidats vaccins sont évalués pour leurs capacités immunogènes et protectrice chez des souris de laboratoire ou des souris génétiquement modifiées qui présentent une meilleure susceptibilité aux faibles doses à l’infection par les souches atténuées du virus de la rougeole. En fonction des résultats obtenus chez la souris, des séries successives de candidats vaccins sont produites afin d’aboutir à la sélection d’un ou deux candidats par pathogène ciblé. Cette sélection réduite fera l’objet d’une validation préclinique complémentaire chez le primate non humain puis d’études cliniques chez l’homme.
Bénéfices attendus
Le but ultime de ce projet est la mise à disposition de vaccins prophylactiques efficaces et améliorés contre plusieurs pathologies infectieuses graves.
Procédures
Une identification par marquage à l’oreille (quelques secondes) en début d’expérimentation. Une à trois administrations de substance par injection intrapéritonéale / intramusculaire sur animaux vigiles (20 secondes) ou instillation intranasale (60 secondes) sur animaux préalablement anesthésiés par injection intrapéritonéale (20 secondes), avec des intervalles de 1 mois. Alternativement, une à deux administrations de substance par injection intrapéritonéale / intramusculaire sur animaux vigiles (20 secondes) puis une seule injection intracérébrale (20 secondes) sur animaux préalablement anesthésiés par injection intrapéritonéale (20 secondes), avec des intervalles de 1 mois. Une à trois prises de sang (10 secondes), avec des intervalles de 1 mois.
Impact sur les animaux
Selon notre expérience antérieure, l'injection de vecteurs dérivés du vaccin vivant atténué contre la rougeole n’induit aucun signe clinique chez les souris. Il en est de même pour l’inoculation par voie intranasale du vecteur Ad5-hACE2 suivie de celle du SARS-CoV-2. A l’opposé, l’inoculation de virus grippaux H1N1/H3N2 adaptés à la souris, du virus H1N1 pandémique (2009) ou du virus de la rage (souche CVS) peuvent provoquer une maladie symptomatique, entraînant potentiellement la souffrance. Les virus grippaux induisent une pneumonie virale primaire de symptômes modérés à sévères selon la souche et la dose d’épreuve utilisée, dont les manifestations cliniques vont d’une gêne respiratoire / mobilité réduite / perte de poids transitoire à la mort. La perte de poids peut être importante, jusqu’à 25% du poids d’une souris mâle adulte, tout en restant transitoire et en l’absence de toute autre manifestation clinique chez des souris vaccinées. Le virus de la rage est fortement neurotrope et induit une encéphalite létale après inoculation intracérébrale à la souris, dont les premières manifestations cliniques peuvent être la perte de poids, l’ataxie, un comportement agité et rotatoire, un manque de coordination des pattes et la paralysie. L’inoculation intramusculaire périphérique (membre inférieur) peut provoquer une neuropathie et/ou une paralysie progressive à mesure que le virus progresse vers le système nerveux central (SNC), puis une encéphalite ultimement létale. Pour éviter que les animaux souffrent, des points limites seront établis préalablement à la réalisation des expériences et les animaux seront mis à mort immédiatement après avoir atteint ces points.
Devenir
Une grande partie des animaux seront mis à mort afin d’être prélevés de multiples organes nécessaires pour l’évaluation de l’efficacité des candidats vaccins. Tous les autres animaux survivants seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils auront été immunisés par des vaccins vivants recombinants ou infectés par des virus d’épreuve pathogènes pour l’homme dans une animalerie confinée (A3) : il n’est donc pas possible de les réutiliser dans d’autres projets ou de les transférer en dehors de l’animalerie.
Remplacement
Ce programme préclinique est au centre de l’activité de notre équipe. Il est primordial car il produit les premières preuves de concept de l’immunogénicité et de l’efficacité des candidats vaccins qui déterminent les phases ultérieures du développement, susceptibles de produire des nouveaux vaccins humains. Aucun système in vitro ne permet à ce jour d'englober tous les aspects de l'interaction hôte-pathogène qui aboutissent à l’induction d’une réponse immunitaire par les candidats vaccins vivants puis à la protection contre l’infection pulmonaire par les coronavirus ou les virus grippaux ou contre l’infection du système nerveux central par le virus rabique. En particulier, l'évaluation de l'impact vaccinal sur le contrôle de la charge virale et l’appréciation de l’histopathologie des organes cibles ne peuvent se réaliser que dans des modèles in vivo pertinents qu’il n’est à l’heure actuelle pas possible de remplacer par des essais in vitro. Par ailleurs, avant d’entreprendre des études cliniques de phase 1 permettant de cerner l’éventuelle toxicité d’un produit vaccinal administré à l’homme ou de phase 2 permettant d’évaluer son efficacité, c’est une obligation des agences règlementaires de procéder à des études précliniques chez l’animal. Dans ce contexte et en premier choix, nous avons opté pour un modèle non-primate, mais présentant une organisation tissulaire et du système immunitaire proche de l’homme.
Réduction
Sur la base de discussion avec un biostatisticien, et des tests statistiques appropriés, nous avons planifié d’inclure le nombre minimal d’individus par groupe expérimental qui permette une analyse statistique pertinente et concluante. Pour calculer la taille des groupes de souris injectées par les candidats vaccins, nous avons utilisé les moyennes et écart-types géométriques d’expériences antérieures obtenues dans un projet précédent. Les tests considérés sont un test de comparaison de deux moyennes indépendantes pour comparer 2 groupes et un test Anova à un facteur suivis de tests multi-comparaisons pour comparer plusieurs groupes. Grâce à ces données, un logiciel statistique a déterminé la taille optimale des groupes pour un risque alpha de 5% et une puissance de 80-90% : le nombre d’animaux sera ainsi réduit à 6 pour les études d’immunogénicité et 7 pour les études de protection. Par ailleurs, nous utiliserons un modèle d’épreuve par le SARS-CoV-2 déjà mis au point qui ne nécessitera pas de mise au point supplémentaire pour le choix des doses.
Raffinement
Les opérations de vaccination, d’infection, de prélèvement de sang, ainsi que la mise à mort et le prélèvement d’organes seront réalisés par des expérimentateurs formés. La cage des animaux comportera, comme élément d’enrichissement, du coton dentaire, pour que les animaux puissent construire un nid et, dans le cas des animaux infectés, du Diet Gel pour faciliter la prise de nourriture et l’hydratation. La température dans la cage d’animaux infectés sera améliorée au début des symptômes cliniques. Une évaluation clinique sera mise en place à raison de 2 fois par semaine dans le cas des animaux immunisés avec les vaccins rougeole recombinants et une évaluation quotidienne dans le cas des animaux infectés. Si les animaux deviennent cliniquement malades, leur souffrance sera abrégée par leur mise à mort. Selon notre expérience antérieure, l'injection de vecteurs dérivés du vaccin vivant atténué contre la rougeole n’induit aucun signe clinique chez les souris. Il en est de même pour l’inoculation par voie intranasale du SARS-CoV-2 jusqu’au 4ème jour après l’épreuve où les animaux seront mis à mort pour le prélèvement des organes. Pour les procédures d’épreuve de classe sévère (virus grippaux, virus de la rage), nous prendrons soin de réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux : tout en respectant les conditions qui permettent au projet de recherche d’atteindre ses objectifs, nous définirons à l’avance des points limites spécifiques de chaque agent infectieux et les animaux seront mis à mort dès que les points limites seront atteints.
Choix des espèces
Le virus de la rougeole (sauvage ou vaccinal) n’infecte efficacement que les primates. Un modèle rongeur pertinent a donc été développé. Les souris déficientes pour le gène du récepteur d’un médiateur de l’inflammation, les interférons de type I (IFNAR) sont susceptibles à l’infection par les souches vaccinales du virus de la rougeole. Elles peuvent également exprimer le récepteur humain de ce virus, améliorant encore leur susceptibilité aux faibles doses. Nous pensons que certains candidats vaccins basés sur le vaccin contre la rougeole seront capables de se multiplier chez la souris non génétiquement modifiée . Dans ce cas, nous aurons principalement recours à plusieurs lignées de souris de laboratoires qui sont des modèles reconnus pour le SARS-CoV-2, les virus grippaux et le virus rabique. Des souris de 5-7 semaines d’âge seront commandées. Après une semaine de stabulation, les souris seront immunisées pour l’étude de l’immunogénicité des vecteurs vaccinaux ou immunisées et infectées pour l’évaluation de l’efficacité vaccinale. Il est admis qu’à partir de l’âge de 6 à 7 semaines, le système immunitaire de ces petits rongeurs est considéré comme mature et que les réponses immunitaires induites peuvent être considérées comme comparables à celles induites pendant leur vie d’adulte.
SIGNAL: INFECTION AU SARS-COV-2 DES NEURONES A GNRH, NEUROINFLAMMATION,VEILLISSEMENT ET CONSEQUENCES A LONG-TERME
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
348 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Génétiquement modifiées pour exprimer un récepteur humain, elles sont infectées par le SARS-CoV-2 par voie nasale, avec implantation de mini-pompes et prélèvements sanguins répétés, certaines lignées n'ayant qu'une espérance de vie de sept à douze jours après infection. Le projet étudie l'infection des neurones à GnRH et ses effets à long terme sur la reproduction et la cognition, y compris chez des femelles gestantes et leur descendance. Le porteur affirme que cette étude requiert "l'organisme entier" et juge ces souris "indispensables".
Objectifs
Depuis le début de la pandémie de COVID-19, les efforts collaboratifs des 5 équipes de recherche ont montré que le SARS-CoV-2 infecte et tue les neurones produisant l'hormone de libération des gonadotrophines (GnRH) dans le cerveau des patients adultes atteints de COVID-19. Ce phénomène entraîne une réduction spectaculaire de l'expression de la GnRH dans l'hypothalamus chez une proportion significative de patients. Ces neurones, connus pour être les maîtres régulateurs de la fonction de reproduction, pourraient également jouer des rôles clés dans le développement des fonctions cognitives et sensorielles, du métabolisme et du vieillissement cérébral et systémique. En outre, les neurones à GnRH foetaux, qui proviennent du nez, expriment plusieurs protéines qui leur confèrent une sensibilité à l'infection par le SARS-CoV-2. Ceci suggère qu'ils pourraient être vulnérables en cas de transmission materno-foetale/néonatale, et fait planer le risque d'une double pandémie d'infertilité et de déclin cognitif prématuré. Nous émettons l'hypothèse que l'infection des neurones à GnRH et d'autres populations de cellules cérébrales par le SARS-CoV-2 module l'expression des gènes de l'hôte, perturbe le neurodéveloppement et aggrave les changements liés à l'âge par des altérations inflammatoires et épigénétiques persistantes dans les cellules survivantes. Le projet utilise des tissus humains de patients COVID-19 et de sujets non-infectés, ainsi que des modèles cellulaires, et nécessite également l’utilisation de modèles animaux transgéniques afin de déterminer si et comment l'infection et la perte des neurones à GnRH conduit à des altérations pathologiques à long terme. Nous poursuivrons trois objectifs: 1) Déterminer si et comment l'infection par le SARS-CoV-2 module de manière différentielle le paysage de l'expression génétique des neurones à GnRH et d'autres cellules cérébrales infectées pour accélérer l'inflammation hypothalamique, le dysfonctionnement cognitif ou métabolique et la sénescence cérébrale 2) Explorer si l'infection des neurones à GnRH ou la perte d'expression de la GnRH dans le cerveau adulte ou foetal/néonatal a des effets à long terme sur l'axe reproducteur dans des modèles animaux 3) Vérifier si le remplacement de la GnRH de façon physiologique ou l'inversion des voies pathologiques compensera l'expression génique à long terme et les altérations fonctionnelles induites par l'infection du cerveau par le SARS-CoV-2.
Bénéfices attendus
Le projet apportera une meilleure compréhension des répercussions à long terme, jusqu'ici sous-estimées, de la neuroinvasion par le SARS-CoV-2 en termes d'intégrité et de fonction des cellules cérébrales. Il pourrait permettre d’identifier les mécanismes cérébraux qui sous-tendent les symptômes neurologiques de la COVID longue, et proposer des stratégies thérapeutiques viables et fondées sur les preuves pour inverser ou compenser ces mécanismes pathologiques. Les résultats du projet devraient contribuer à réduire le fardeau social, financier et sanitaire imposé par la COVID-19.
Procédures
LES INTERVENTIONS SERONT EFFECTUEES SUR ANIMAL ANESTHESIE ET CHAQUE INTERVENTION EST REALISEE 1 FOIS DANS LA VIE DE L'ANIMAL: - IMPLANTATION DE MINIPOMPE SOUS-CUTANEES AU NIVEAU DE LA PARTIE SUPERIEURE DU DOS, - INFECTION DES SOURIS PAR VOIE NASALE (SOURIS ADULTES GESTANTES OU NON). SEULS LES PRELEVEMENTS SANGUINS SERONT EFFECTUES SUR ANIMAL VIGILE. LES PRELEVEMENTS UNIQUES SERONT EFFECTUES AU NIVEAU DE LA VEINE MANDIBULAIRE 1 FOIS PAR MOIS PENDANT 6 MOIS (SUR L'ANIMAL ADULTE) OU A P12, P23 ET P30 (SUR SOURIS POST-NATALES); LES PRELEVEMENTS FREQUENTS SERONT EFFECTUES DANS LA VEINE LATERALE DE LA QUEUE 1 SEULE FOIS DANS LA VIE DE L'ANIMAL (3µL DE SANG TOUTES LES 6 MINUTES PENDANT 2H).
Impact sur les animaux
TOUTE MANIPULATION DES ANIMAUX PEUT PROVOQUER DU STRESS, DE LA FATIGUE ET DE L'INCONFORT ET DES MESURES DE RAFFINEMENT SERONT MISES EN PLACE POUR LES LIMITER AU MAXIMUM. EN PARTICULIER LES EXPERIENCES DE CHIRURGIE OU DE PRELEVEMENTS DE SANG PEUVENT PROVOQUER DES DOULEURS A COURT-TERME QUI SERONT LIMITEES PAR L'UTILISATION D'UN ANALGESIQUE (GEL DE CHLORHYDRATE DE PRAMOCAÏNE OU TRONOTHANE 1%). SEULS LES ANIMAUX INFECTES PAR LE VIRUS SARS-COV-2 DANS LA PROCEDURE 2 SUBIRONT UNE PERTE DE POIDS CONSEQUENTES ET SERONT SUIVIS DE TRES PRES; ILS SERONT SACRIFIES A 4 JOURS POST-INFECTION POUR LIMITER LA DUREE DE CET ETAT.
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés pour chaque procédure sera EUTHANASIE à terme même ceux qui servent de contrôles afin de récupérer le sang et les organes.
Remplacement
Les expériences prévues ont été planifiées en tenant compte de la règle des 3 R. L’étude des effets physiopathologiques de l’infection par SARS-CoV-2 et de l’efficacité des médicaments nécessitent l’utilisation d’organisme entier, et ne laissent pas la possibilité de remplacer les animaux utilisés par des systèmes cellulaires. En effet, suite à l’infection respiratoire, le système immunitaire s’active et conduit à une inflammation. Celle-ci se traduit par le recrutement et l’activation de nombreux types cellulaires et par la production de facteurs solubles (cytokines, chimiokines etc). Cette réaction est sous la dépendance d'un réseau complexe de cellules et de facteurs solubles qui ne peut pas être reproduite in vitro. Par ailleurs, les effets potentiellement bénéfiques du donneur de NO au cours de l’infection ne peuvent être réellement évalués qu’in vivo. Le modèle souris est pertinent pour ce type d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et homogène d’animaux par groupe sera utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique. LE NOMBRE D’ANIMAUX EST BASE SUR UN CALCUL STATISTIQUE QUI PREND EN COMPTE LE PARAMETRE ETUDIE ET DES EXPERIENCES PILOTES. POUR CELA, LA TAILLE MINIMALE DES GROUPES EXPERIMENTAUX A UTILISER A ETE DEFINI ; PUIS LA POSSIBILITE DE COLLECTER PLUSIEURS ECHANTILLONS/TISSUS CHEZ LES MEMES ANIMAUX CHAQUE FOIS QUE POSSIBLE A ETE PRISE EN COMPTE. CETTE UTILISATION MAXIMISE LES DONNEES OBTENUES A PARTIR DE CHAQUE ANIMAL, AFIN DE LIMITER OU D'EVITER L'UTILISATION SUBSEQUENTE D'ANIMAUX SUPPLEMENTAIRES, ET CE, SANS POUR AUTANT COMPROMETTRE LE BIEN-ETRE ANIMAL.
Raffinement
Le raffinement est obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, le recours à des procédures non invasives et non douloureuses, le suivi des signes cliniques et des points limites, le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, le suivi post anesthésie de l’état de santé des animaux ainsi que des soins adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux. Les personnes impliquées bénéficient d’une autorisation pour travailler sur des agents pathogènes de groupe 3. Différentes mesures sont prises pour réduire le stress, l’inconfort et la douleur. EN PARTICULIER, LES ANIMAUX SONT MANIPULES INDIVIDUELLEMENT, ET DANS LE CALME, AFIN DE LIMITER TOUT STRESS DES ANIMAUX NON MANIPULES. LES MANIPULATIONS S'EFFECTUENT A DISTANCE DES AUTRES ANIMAUX. UNE SURVEILLANCE QUOTIDIENNE EST EFFECTUEE AFIN DE S’ASSURER DE L’ETAT DES ANIMAUX.
Choix des espèces
La souris exprimant l’ACE2 humain génétiquement modifiée représente un modèle pertinent pour l’étude des réponses immunes et inflammatoires liées à l’infection par le SARS-CoV-2. AFIN D’ETUDIER LES CONSEQUENCES PATHOPHYSIOLOGIQUES DE LA PERTE DE CES NEURONES LORS DE LA COVID-19, NOUS UTILISERONS UN MODELE DE SOURIS TRANSGENIQUES DANS LESQUELLES L’ACE2 HUMAIN S’EXPRIMERA UNIQUEMENT DANS LES NEURONES A GNRH. L’ETUDE DU ROLE SPECIFIQUE DU CO-RECEPTEUR A LA NEUROPILIN-1 (NRP1) SPECIFIQUEMENT DANS LES NEURONES A GNRH REQUIERT L’UTILISATION DE SOURIS TRANSGENIQUES INFECTEES DE MANIERE GLOBALE PAR LE SARS-COV-2 ET QUI N’ONT PAS LE RECEPTEUR NRP1 DANS LES NEURONES A GNRH. CES SOURIS ONT UNE ESPERANCE DE VIE COURTE (7 A 12 JOURS POST-INFECTION) MAIS SONT INDISPENSABLES POUR DETERMINER LE ROLE DU CO-RECEPTEUR NRP1 DANS LA PERTE DE L’EXPRESSION DE LA GNRH. NOTRE TROISIEME OBJECTIF ETANT D’ETABLIR L’IMPACT DE L’INFECTION IN UTERO OU NEONATALE SUR LA MINIPUBERTE ET A LONG TERME SUR L’AXE REPRODUCTEUR, IL NECESSITE L’UTILISATION DE SOURIS FEMELLES GESTANTES INFECTEES PAR LE SARS-COV-2 ET D’ETUDIER LES EFFETS SUR LA DESCENDANCE A PLUS OU MOINS LONG-TERME.
Production de souris humanisées pour le système immunitaire : modèle d’étude pour l’immunobiologie, les pathologies humaines et l’évaluation de traitements.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
3 260 souris vont être utilisé·es, dont 2 960 réutilisées dans d'autres procédures, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent des cellules souches humaines après irradiation, puis des injections, gavages et prélèvements sanguins répétés jusqu'à huit fois, avec un suivi par imagerie. Il s'agit d'une plateforme produisant à la demande des souris "humanisées" pour le système immunitaire, fournies à des laboratoires pour tester vaccins et traitements. Le porteur présente ce modèle comme une alternative au primate non-humain et affirme qu'il est le "seul modèle d'hématopoïèse humaine expérimentale".
Objectifs
L’étude in vivo de la physiopathologie de nombreux pathogènes humains ainsi que l’analyse de l’activité et de l’innocuité des traitements et vaccins contre ces pathogènes ne peut être réalisé chez l’Homme pour des raisons éthiques. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces pathogènes dans un modèle expérimental, des modèles de souris humanisées pour le système immunitaire (souris HIS) ont été développés au cours des deux dernières décennies. Ces souris HIS sont des modèles in vivo précliniques qui permettent d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…). Dans ce projet, nous proposons de produire des souris HIS qui seront par la suite soit utilisées par des laboratoires de recherche dans le cadre de leurs projets de recherche sur les pathologies humaines et/ou de développement de nouveaux vaccins ou traitements. Dans ce projet, nous testerons l’activité de nouvelles immuno-modulateurs thérapeutiques ou de nouveaux vaccins afin de tester leur activité et/ou leur impact sur le système immunitaire humain.
Bénéfices attendus
Ces souris HIS générées dans ce projet permettront d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène de pathogènes humains mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…).
Procédures
irradiation (1 par animal, durée : quelques minutes) - prélèvement sanguin (1 à 8 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 2 à 4 semaines) - injection hydrodynamique (1 par animal, durée 7-8 secondes) - injection intra-péritonéale (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1jour à 1 mois) ) - injection intra-veineuse (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - injection intra-musculaire (1 à 3 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1semaine à 1 mois) - injection sous-cutanée (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) -administration dans eau de boisson (1 à 8 par animal, durée 24h à 1 mois, intervalle 1 jour à 1 mois) - administration par gavage (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - imagerie IVIS (2 à 10 par animal, durée 5min, intervalle entre 3 jours et 1 mois)
Impact sur les animaux
Immunodéficience : du fait de leur degré d’immunodéficience, ces animaux sont très sensibles aux infections. TSLP : Après irradiation les souris transgéniques pour TSLP peuvent développer avec l’âge des tumeurs d’origine murine. Après humanisation, ces souris peuvent développer des dermatites. L’apparition des signes cliniques est suivie régulièrement et des soins seront apportés en cas d’apparition de symptômes. Irradiation : de potentiels effets néfastes à long terme de l’irradiation, tels que le développement de tumeurs, pourraient apparaitre. Cependant, cette procédure est appliquée depuis de nombreuses années dans le laboratoire et il n’a été constaté des signes cliniques de ces effets néfastes que dans une minorité (5 mois). Injection Hydrodynamique : un risque de dyspnée peut arriver dans les 5-10 minutes après injection. Si une dyspnée est observée la souris sera mise à mort.
Devenir
Les animaux portant un système immunitaire humain générés dans une procédure pourront être inclus d'autres procédures du même projet (par exemple pour booster certaines cellules humaines, augmenter le nombre de cellules myeloides humaines, valider l’activité d’immuno-modulateurs) ou d'autres projets à la demande des utilisateurs de la plateforme). Les autres souris utilisées pour valider l’activité d’immuno-modulateurs seront mises à mort pour analyse des différents organes post-mortem.
Remplacement
Les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier la réponse du système immunitaire humain dans son ensemble, contre des tumeurs ou des pathogènes à tropisme exclusivement humain ni de prédire l’efficacité et l’innocuité de nouveaux vaccins ou traitements immunomodulateurs contre ces tumeurs ou pathogènes. Historiquement, le modèle de choix pour ces études est le primate non humain, le modèle de souris HIS est un modèle alternatif qui peut permettre de limiter le nombre d’études sur le primate non humain.
Réduction
Nous évaluons notre niveau de production de souris HIS à 380 souris la première année, 570 la deuxième année, 770 chaque année pour les 3 années suivantes, soit un total de 3260 souris sur 5 ans. Ces chiffres ont été calculés en tenant compte 1. du nombre d’opérateurs de la plateforme (facteur limitant la production la première année et qui passera de 2 à 4 FTE entre les années 1 et 3), 2. du nombre d’utilisateurs intéressés par les modèles développés par notre plateforme qui est estimé à 4 la première année, 6 la deuxième année et devrait se stabiliser à 8 par an à partir de la 3ème année. 3. du fait qu’environ 80% des animaux présenteront un niveau d’humanisation >10%, 4. du fait que la plateforme fournira en moyenne 75 souris humanisées par utilisateur et par an (15 pour étude pilote et 30 pour expérience principale, en comptant 1 étude pilote et 2 expériences principales /utilisateur/an).
Raffinement
La planification des expériences en amont et la concertation entre le personnel de la plateforme et les utilisateurs sont des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux. Par ailleurs, lorsque cela sera nécessaire, des études pilotes seront réalisées en amont des études principales. Enfin, l’état clinique (pelage, mouvement, activité, pâleur, signes de bagarres, apparition de tumeurs) des animaux sera suivi deux fois par semaine pour permettre la détection de signes de souffrance. En cas d’apparition de signes de souffrance, un analgésique pourra être administré aux souris. Si les signes de souffrance persistent, une mise à mort sera effectuée pour prévenir toute souffrance inutile.
Choix des espèces
La souris humanisée présentant un système immunitaire humain (HIS) est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale. Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. Les souris HIS sont générées par injection de cellules souches isolées dans des souriceaux nouveau-nés de moins de 9 jours car les nouveaux nés sont plus permissifs à la greffe dans les premiers jours de vie. Le contrôle qualité par vérification du niveau d’humanisation dans le sang sera réalisé à l’âge adulte entre 8 et 12 semaines. Ce nombre de semaines correspond au temps minimum nécessaire au développement du système immunitaire humain dans une souris à partir de cellules souches hématopoïétiques. Les souris HIS seront ensuite utilisées entre 12 et 25 semaines de vie. Cet intervalle d’âge correspond à la période pendant laquelle le système immunitaire humain est le plus stable chez la souris.
Evaluation de l’efficacité thérapeutique de nouveaux traitements pour le syndrome de détresse respiratoire aigüe à l’aide de modèles de sepsis chez le rongeur (souris et rats)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
Rats : 3900
5 070 souris et 3 900 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les expérimentateurs déclenchent un sepsis par injection de toxine LPS ou par ligature du caecum, provoquant septicémie, inflammation, perte de poids, atteintes pulmonaires et choc septique, pour tester de nouveaux traitements du syndrome de détresse respiratoire aiguë. Le porteur n'attend pas de nuisance liée aux traitements eux-mêmes, qu'il présente comme non toxiques. Il affirme que le rat et la souris reproduisent au mieux la maladie humaine et que les essais in vitro ne suffisent pas.
Objectifs
Le Syndrome de Détresse Respiratoire Aigüe (SDRA) est un syndrome clinique d'inflammation et d'œdème pulmonaire diffus qui provoque généralement une insuffisance respiratoire aiguë. Le SDRA peut être causé par des déclencheurs infectieux ou non infectieux qui impliquent l'activation et la dérégulation de multiples voies de lésion, d'inflammation et de coagulation qui se chevauchent et interagissent dans les poumons et dans le système. Le plus souvent, le SDRA peut se développer dans le cadre d'une pneumonie, d'une septicémie (39% des cas), d'une aspiration du contenu gastrique ou d'un traumatisme grave. Le SDRA représente 10 % de tous les patients dans les unités de soins intensifs dans le monde entier, avec un taux de mortalité élevé (30-40 %). Le SDRA se caractérise par une mauvaise oxygénation et des poumons non conformes ou "rigides", c'est pourquoi la ventilation mécanique et les thérapies de soutien sont les piliers du traitement de la maladie. Cependant, le taux de mortalité est toujours très élevé, il est donc nécessaire de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques visant à découvrir ou repositionner des molécules et comprendre les mécanismes qui jouent un rôle dans la survenue et l’évolution de la pathologie. Dans le cadre de nos programmes de maturation, nous développons au stade pré-clinique des nouvelles molécules pharmaceutiques ou des molécules en repositionnement. Pour chaque nouvelle molécule intégrée dans notre pipeline, des études de toxicologie (in vitro et/ou in vivo), de pharmacocinétique et d’efficacité seront entreprises. Cette demande d’éthique concerne les études d’efficacité dans le contexte du SDRA avec la mise en place de modèle animaux reproduisant ces pathologies chez la souris ou le rat. L’objectif est de trouver des molécules pouvant retarder la progression de la maladie et améliorer la qualité de vie des patients atteints par cette pathologie.
Bénéfices attendus
Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet dans la septicémie et le SDRA. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, nos études permettront de trouver potentiellement des médicaments dont les effets seraient supérieurs aux molécules de référence déjà existantes, qui ralentiraient la progression de la maladie évaluée par des analyses sanguines (marqueurs inflammatoires, de toxicité, de NEToses (formation de pièges extracellulaires des neutrophiles) et de fibrose) ou par analyse histologique (recrutement des fibrocytes, fibrose, NEToses, toxicité).
Procédures
Tous les animaux des groupes 2 à 7 subiront soit une injection unique en intra-péritonéale de LPS, soit une administration unique en intra-nasale de LPS, soit une administration unique en intra-trachéale de LPS, soit une ligation du caecum par méthode chirurgicale pour induire la pathologie. L’injection intra-péritonéale se fera sur animaux vigiles tandis que pour l’administration intranasale et intratrachéale ainsi que pour la méthode chirurgicale, l’induction se fera sur animaux anesthésiés. Les animaux du groupe 1 quant à eux recevront du sérum physiologique, du PBS ou seront opérés à blanc. Les injections intra-péritonéales dureront moins d’une minute par animal. Les administrations intra-nasales et intra-trachéales dureront environ 5 minutes par animal et la méthode chirurgicale durera environ 20 minutes par animal. Les traitements pourront être administrés en préventif (jusqu'à 1 mois avant l'induction du modèle) et/ou en curatif (jusqu'à 4 semaines après l'induction du modèle). Selon la molécule, la voie d'administration pourra être par voie intra-veineuse, intra- péritonéale, sous-cutanée, par voie orale, par voie topique sur animal vigile ou par système de mini-pompe osmotique qui sera la voie préférentielle. Tous les animaux recevront un véhicule, un traitement à tester ou une molécule de référence. Le nombre d'administration dépendra de la molécule et de la voie d'administration considérée. Cela pourra être une fois par semaine jusqu'à une à deux fois par jour. En amont des études in vivo, la toxicité potentielle des molécules testées et du véhicule aura été testée in vitro. Dans le cas où les molécules d’intérêt ne sont pas des molécules déjà sur le marché pour d’autres indications, des études de toxicologie in vivo pourront être entreprises afin de travailler avec des doses non toxiques. Les animaux seront pris en contention pour être anesthésiés avec un mélange de kétamine /xylazine, qui sera administré par injection intra-péritonéale ou par inhalation d’isoflurane. Lors des prélèvements de sang intermédiaires par voie rétro-orbitale ou lorsque qu’un animal présentera un score total compris entre 5 et 7, toutes catégories confondues dans le tableau des points limites, les souris et les rats seront traités avec de la buprénorphine. Le prélèvement sanguin durera environ 5 minutes par animal. A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort selon les méthodes réglementaires.
Impact sur les animaux
Du fait de l'induction des modèles, les animaux vont développer une septicémie associée à une élévation des marqueurs inflammatoires, une perte de poids et des complications aux longs termes telle que des dommages dans les poumons et un choc septique. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques).
Devenir
Euthanasie : le poumon sera prélevé pour analyse histologique et prélèvement de sang.
Remplacement
L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules pouvant agir sur l’inflammation, le recrutement des neutrophiles et la fibrose implique de disposer de modèles animaux adéquats mimant au mieux la pathologie humaine. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce rat ou souris à travers nos différents modèles reproduisent au mieux la pathophysiologie du sepsis et du SDRA. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Pour vérifier et déterminer l’effet d’un traitement sur l’inflammation et les dommages pulmonaires pouvant mener à la fibrose, il est essentiel d’examiner l’animal entier. Il est indispensable car ne peut être reproduit en modèle cellulaire.
Réduction
Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux grâce à une approche statistique, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Le traitement des données entrainera la comparaison de 7 groupes de 6-12 animaux pour chaque étude donc une analyse statistique appropriée sera réalisée.
Raffinement
Toutes les procédures induisant une douleur seront réalisées sous anesthésie (chirurgie, prélèvement de sang) durant toute la procédure expérimentale afin de maitriser et limiter la douleur et la souffrance des animaux. L’anesthésie sera induite par induction à l’isoflurane (et maintien au masque) ou par injection de kétamine/xylazine en intra-péritonéale. Les procédures de chirurgie seront effectuées par une personne habilitée et formée. Pour les modèles d’induction par la chirurgie, les animaux recevront un analgésique qui sera administré en phase pré- et post-opératoire ainsi qu’un analgésique local appliqué lors de la procédure chirurgicale. En dehors de la phase de chirurgie, l’utilisation d’antibiotiques peut être nécessaire afin de retarder le choc septique. Toutefois, en cas de douleur ou de souffrance importante, un analgésique pourra être employé. Nos études étant basées sur des modèles inflammatoires, les anti-inflammatoires ne sont pas applicables. Les animaux seront également sous surveillance rapprochée. Les animaux seront suivis quotidiennement pendant les 5 premiers jours qui suivent l’induction puis trois fois par semaine pour pouvoir identifier les signes de souffrance caractérisés par le comportement du rat ou de la souris : les changements physiques (pelage, peau, yeux…), la mobilité, l’alimentation, l’agressivité, le poids du corps (mesuré 2 fois par semaine) limité à une perte de 20% maximum par rapport au poids initial, la consistance des fèces. Nous avons mis en place un tableau de suivi qui permet de définir les points limites adaptés. Si le score total d’un animal, toutes catégories confondues, au cours de l’étude est compris entre 5 et 7, l’animal recevra une injection de buprénorphine ou de meloxicam. Si le score total d’un animal, toutes catégories confondues, au cours de l’étude est >7 ou bien si le score dans une seule catégorie est 3, l’animal est euthanasié pour raisons éthiques.
Choix des espèces
La souris et le rat sont des modèles d’étude très développés et caractérisés, étant donné leurs tailles et leurs spécificités. Ce sont des espèces communément utilisées pour ces modèles en accord avec les recommandations internationales et la littérature. Notamment la souche de rat Sprague Dawley (SD) est un modèle de laboratoire bien connu avec suffisamment de données historiques. Chez la souris, les souches C57Bl/6 et Balb/c représentent les souches de choix. Le choix de l’espèce utilisée dépendra en particulier du modèle utilisé, des objectifs et des besoins de l’étude. Si une molécule s’avère efficace dans une espèce, celle-ci pourra être éventuellement testée dans l’autre espèce afin de montrer une efficacité espèces indépendante. Les rats ou souris seront âgés d’au moins 8 semaines au début de l’étude, en accord avec la littérature existante pour effectuer ces différents modèles. De plus, à cet âge, le système immunitaire de ces animaux est totalement développé.
Cytokines inflammatoires et cardiopathie septique
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les expérimentateurs percent leur tube digestif sous anesthésie pour déverser les selles dans l'abdomen et provoquer une péritonite, puis suivent la défaillance cardiaque par échographie avant de prélever le cœur. Le porteur indique que l'infection peut provoquer stress, perte de poids et baisse de mobilité, et estime que garder ces souris en vie ne serait pas éthique vu la sévérité des procédures. Sur le remplacement, il affirme qu'étudier le tissu cardiaque lui-même est "indispensable" et que ni les essais en tube à essai ni la modélisation informatique ne peuvent mimer l'infection de façon fiable, ce qui rendrait "nécessaire" le recours à la souris.
Objectifs
Les infections sont des maladies extrêmement fréquentes et potentiellement graves. Dans leur forme la plus sévère (sepsis), l’inflammation provoquée par l’infection touche le corps entier et peut nuire au fonctionnement des différents organes, dont le cœur. Ce mauvais fonctionnement du cœur ne répond pas toujours au traitement par antibiotique. Il n’existe pas de traitement à ce jour qui traite spécifiquement l’inflammation responsable de la dysfonction du cœur au cours d’une infection sévère. Notre premier objectif est d’étudier cette dysfonction cardiaque induite par le sepsis. Pour cela, nous utiliserons un modèle d’infection sévère chez la souris. Les souris seront opérées sous anesthésie générale (elles seront endormies) afin de créer un petit trou dans leur tube digestif qui permettra aux selles de se déverser dans l’abdomen provoquant ainsi une infection appelée péritonite. Les souris ainsi infectées recoivent des anti-douleurs, et du liquide pour maintenir leur pression arterielle. Ce modèle a déjà été utilisé par plusieurs équipes et l’inflammation qu’il engendre provoque une dysfonction cardiaque similaire à celle observée chez l’homme. Nous pourrons ensuite caractériser le fonctionnement du cœur par échographie. Notre second objectif est d’étudier les paramètres de l’inflammation responsables de la dysfonction du cœur. Pour cela, les cœurs des souris infectées comme précédemment décrit seront prélevés et analysés après le décès de la souris et nous déterminerons quelles sont les protéines de l’inflammation qui sont exprimées à l’intérieur du cœur au cours de l’infection. Enfin, notre troisième objectif est de tester des traitements ciblant les protéines de l’inflammation qui auront été trouvées dans les cœurs des souris infectées. Nous injecterons aux souris infectées ces traitements par une piqure sous la peau et comparerons à des souris infectées traitées par placébo. Les points de comparaison reposeront sur l’analyse par échographie de la fonction du cœur et sur la survie des souris à l’infection.
Bénéfices attendus
Les infections sont très fréquentes en santé humaine et potentiellement graves avec un taux de décès élevé. Le décès peut être en lien avec des organes qui ne fonctionnent plus, dont le cœur, à cause de l’inflammation qui s’est propagée dans tout le corps et ce malgré un traitement antibiotique. A ce jour, aucun traitement spécifique n’existe pour soigner ce mauvais fonctionnement du cœur dû à l’infection. Notre travail permettra de mieux décrire cette dysfonction du cœur au cours de l’infection, de comprendre à quoi elle est due précisément et d’évaluer finement l’efficacité sur cette atteinte du coeur de traitements contre l’inflammation. En cas de résultats encourageants, notre étude ouvrira la porte à des études de ces traitements chez l’Homme
Procédures
Les souris sont opérées sous anesthésie générale. Elles sont endormies grâce à un gaz anesthésiant. La durée de la chirurgie est d’une dizaine de minutes. Une injection dans le ventre (intra-péritonéale) de médicament contre la douleur est réalisée avant la chirurgie et répétée toutes les 12 heures après pour les souris encore en vie. Dans la procédure qui teste les traitements, les souris les reçoivent soit par une injection dans le ventre soit par une prise orale, selon le mode de fonctionnement du médicament.
Impact sur les animaux
Les souris pourront ressentir une douleur après la chirurgie liée à l’ouverture du ventre. Celle-ci est prévenue par des médicaments contre la douleur qui sont systématiquement donnés. L’infection peut provoquer un stress, une perte de poids, une diminution ou augmentation de la température corporelle, une diminution de la mobilité des souris ou un défaut de leur toilettage. Les traitements seront administrés par injection dans le ventre ou sous la peau ou par la bouche. Les souris pourront ressentir un stress lié à la contention et une douleur liée à la piqûre.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure. En effet, il s’agit de procédures sévères, il ne serait donc pas éthique pour le bien être animal de les garder en vie.
Remplacement
L’étude de la fonction du cœur chez l’Homme au cours des infections sévères a été déjà réalisée de manière aussi complète que possible avec des analyses non-invasives. Cependant, pour aller plus loin dans la compréhension de ce phénomène, il est indispensable d’étudier le tissu du cœur en lui-même, or cela n’est pas possible chez l’Homme. Il n’existe pas à ce jour d’expérience dans les tubes à essais ou de modélisations sur l’ordinateur qui pourraient mimer l’infection de manière fiable car celle-ci a plusieurs causes et se propage dans tous le corps mettant donc en jeu des mécanismes complexes. De plus, il n’est pas éthique de tester des médicaments directement chez l’Homme. Ces raisons rendent nécessaire le recours à des modèles animaux.
Réduction
L’ensemble des études déjà réalisées sur le sujet dans le monde sera étudié avant de débuter les expérimentations animales. Ainsi, tous les traitements déjà essayés et non-efficaces ne le seront pas à nouveau ce qui permettra de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Nous n’étudierons que les animaux mâles car il a été montré que la mauvaise fonction du cœur au cours de l’infection était plus fréquente chez eux. Ainsi, cela permettra de ne pas inclure des femelles qui pourraient ne pas présenter de dysfonction du cœur et donc ne pas être analysées dans la suite du travail. L’étude de la fonction du cœur se fait par échographie ce qui est non-invasif pour la souris. Ainsi, les échographies peuvent être répétées chez une même souris au cours du temps sans avoir besoin de la mise à mort ce qui permet également de réduire le nombre d’animaux. L’analyse de l’expression des protéines de l’inflammation dans le cœur lui-même est une technique performante qui détecte un grand nombre de protéines en utilisant un nombre très faible d’animaux. L’analyse préalable de ces protéines guidera les traitements qui seront ensuite testés : seuls les traitements dirigés contre les protéines exprimées dans le cœur des souris au cours de l’infection seront testés. Grâce à une analyse statistique, nous réduisons au minimum le nombre de souris utilisées tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs c'est à dire qui nous permettent de conclure de manière fiable sur le plan mathématique. Nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d’analyses possibles à partir d’un même animal. Tous les organes prélevés sont congelés pour pouvoir les réanalyser au besoin ultérieurement.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi c'est à dire avec des cotons pour jouer par exemple, avec une semaine d’adaptation avant l’expérimentation. Un suivi quotidien sera réalisé avant le début de l’expérimentation puis toutes les six heures dès que celle-ci aura commencé. La chirurgie est réalisée sur une souris anesthésiée.. La douleur post opératoire est systématiquement prévenue par l’administration d’un médicament contre la douleur avant la chirurgie et au bout de 12 heures. Les souris seront mises à mort si leur état se dégrade brusquement ou si elles présentent un état de souffrance. Une grille de score est prévue à cet effet qui sera également remplie toutes les heures dès le début de l’expérimentation.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme espèce animale pour réaliser les expériences de ce projet est pertinent car l’infection sévère chez la souris est très proche de celle chez l’Homme. Ce modèle est utilisé depuis de nombreuses années dans la littérature scientifique. Les souris utilisées seront des souris mâles car le mauvais fonctionnement du cœur au cours de l’infection sévère est plus fréquent chez les souris mâles. Ces souris seront des souris adultes de 8 à 12 semaines car nous nous intéressons à l’infection sévère chez les humains adultes
Efficacité du céfépime seul ou associé à l’enmétazobactam dans un modèle d’infection pulmonaire à Klebsiella pneumoniae chez la souris.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues neutropéniques par un immunosuppresseur, elles sont infectées par la bactérie Klebsiella pneumoniae par voie intranasale sous anesthésie, puis reçoivent des antibiotiques toutes les deux heures, avant une mise à mort vingt-six heures après l'infection pour dénombrer les bactéries dans les poumons et la rate. Le porteur indique qu'un animal atteignant un score de souffrance extrême est mis à mort par anticipation. Il décrit de nouvelles options thérapeutiques comme "indispensables" et présente le recours aux souris comme une étape "obligatoire et réglementaire" du développement des médicaments.
Objectifs
Ce projet vise à tester l’efficacité in vivo du céfépime (antibiotique), couplé à l’enmétazobactam (inhibiteur de β-Lactamases à Spectre Etendu - BLSE) dans un modèle d’infection pulmonaire à Klebsiella pneumoniae productrice d’OXA-48 (mécanisme de résistance aux bêta-lactamines) chez la souris neutropénique. Ce projet fait suite à une autre étude qui a donné des résultats satisfaisant mais nécessitant de nouvelles investigations.
Bénéfices attendus
Les pneumonies bactériennes dues à des espèces multi résistantes comme K. pneumoniae constituent un challenge pour les professionnels de santé. En effet, ces pathogènes bactériens deviennent de plus en plus difficiles à traiter en raison de leur capacité à produire des β-lactamases, en particulier les carbapénèmases telles que l’OXA-48. Les entérobactéries productrices d’ OXA-48 sont de plus en plus communes dans les systèmes de santé nord-américains et européens et de nouvelles options thérapeutiques sont indispensables pour traiter ces infections. L’évaluation de l’efficacité du céfépime couplé à l’enmétazobactam pourrait représenter une nouvelle ligne thérapeutique pour lutter contre ces infections.
Procédures
Les souris recevront deux injections intrapéritonéales d’immunosuppresseur à J-4 et J-1 avant infection afin d’obtenir une neutropénie significative mais non létale. L’infection se fera par voie intranasale à l’aide d’une pipette et sous une courte anesthésie volatile. L’administration des antibiotiques se fera par voie sous cutanée ou intrapéritonéale.
Impact sur les animaux
Avant l’infection, les souris seront immunodéprimées avec un protocole bien défini. Les injections intra-nasales seront réalisées par du personnel compétent et expérimenté et les animaux seront placés sous anesthésie volatile. Les concentrations d’antibiotiques utilisées seront en accord avec les données de la littérature sur ce sujet. Aucune toxicité n’est rapportée. Du fait des temps d’administration des antibiotiques (toutes les 2h pendant 24h), la surveillance de l’évolution de l’infection sera quasi continue sur la totalité de l’étude (26h) et si un animal présente des signes de souffrances extrêmes, correspondant à un score de 8 (cf tableau des scores cliniques), alors une mise à mort prématurée sera mise en place. Tableau score clinique en annexe
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort 26h post infection afin de dénombrer la charge bactérienne présente dans les poumons et dans la rate.
Remplacement
Le céfépime est un antibiotique de la famille des bêta-lactamines, du groupe des céphalosporines de 4e génération. Cependant, le céfépime peut être hydrolysé par des β-lactamases à spectre étendu (BLSE) et des carbapénémases telle que l’OXA-48. La principale stratégie pour restaurer l'efficacité des β-lactamines est l'utilisation d'inhibiteurs de β-lactamase. Le but est de trouver la meilleure combinaison capable d’avoir une activité antibactérienne efficace contre ces BLSE. Dernièrement, des études in vitro et in vivo ont démontré une activité intéressante chez des Entérobactéries multi résistantes. La mesure de l’efficacité de cette combinaison (céfépime + enmétazobactam) ne peut se faire sans avoir recours au modèle animal ce d’autant que certains échecs de traitement ne peuvent être anticipés autrement et que les aspects liés à la pharmacocinétique de ces nouvelles molécules ne peuvent être évalués autrement. Pour l’heure, le recours à des animaux est une étape obligatoire et règlementaire dans le développement de molécules à visée thérapeutique.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude a été réduit au maximum (7 animaux pour la phase d’efficacité), ce qui permettra de répondre aux hypothèses énoncées et d’effectuer une analyse statistique fiable (estimation de la diminution de la charge bactérienne dans les poumons)
Raffinement
D’une façon générale pour l’ensemble de l’étude, la prise d’anti-inflammatoires est contre indiquée du fait de l’interaction reconnue avec les modulateurs de l’inflammation, ce qui risquerait même de faire flamber l’infection. Les injections intra-nasales seront réalisées par du personnel compétent et expérimenté et sous anesthésie volatile. Un programme d’enrichissement de l’environnement sera mis en place pour prévenir les comportements anormaux et problèmes de santé lié au stress de l’animal. Les animaux seront hébergés à 7 par cage. La principale nuisance sera liée à l’installation et à la progression de l’infection pulmonaire. Pour cela, une surveillance quasi continue sur 26h du fait du rythme d’administration des antibiotiques (toutes les 2h) sera réalisée tout au long de l’étude et si un animal présente des signes de souffrances extrêmes correspondant à un score de 8 (cf tableau des scores cliniques), alors une mise à mort prématurée sera mise en place.
Choix des espèces
Les souris CD1 représentent classiquement un des modèles de choix pour l’évaluation de la charge bactérienne. D’autre part, il s’agit de l’espèce utilisée dans d’autres modèles d’infection pulmonaire développés au laboratoire. Souris de 8 semaines de façon à avoir un poids corporel d’environ 28-32g (même poids que pour les précédentes études).
Babesia microti: infection expérimentale et production de matériel parasitaire
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
150 gerbilles de Mongolie vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles sont infectées par le parasite Babesia microti, subissent des prélèvements de sang à la queue tous les trois jours, puis sont tuées par exsanguination une fois la parasitémie cible atteinte, jusqu'à 50 % des globules rouges parasités. L'objet du projet est de produire du sang parasité servant de contrôle positif pour un test de diagnostic. Le porteur affirme que le parasite n'est pas cultivable in vitro et que l'infection expérimentale reste le "seul moyen" d'en produire.
Objectifs
Afin d'obtenir des molécules parasitaire (protéines, antigènes, ADN...) il est nécessaire de recourir à l'infection expérimentale d'animaux tels que la gerbille de Mongolie, le parasite B. microti n'étant pas cultivable in vitro. L'objectif est d'obtenir la quantité nécessaire et suffisante de matériel, essentiellement sous forme de sang parasité pour extraction d'ADN, pour disposer d'un contrôle positif utilisable sur 1 année complète.
Bénéfices attendus
Le diagnostic des babésioses, humaines ou vétérinaire, repose sur la technique de la PCR (amplification spécifique de l'ADN). Un contrôle positif est nécessaire à la validation des résultats, ce contrôle positif consiste à l'utilisation de sang de gerbille parasité par B. microti.
Procédures
Deux injections intra péritonéales (200 µl) seront réalisées (inoculation du parasite à partir de sang parasité à J1), et surdose d'anesthésique lorsque la parasitémie atteint sa valeur cible. Environ 5 prélèvements de sang (1 goutte, soit 50 µl) au niveau de l'extrémité de la queue seront réalisés pour la réalisation d'un frottis sanguin et une mesure d'hématocrite (1 prélèvement tous les 3j). Un prélèvement de sang à la queue, réalisé sans contention particulière, dure environ 20 s, est quasiment indolore et ne provoque pas de stress ni de réactions particulières.
Impact sur les animaux
Les animaux reçoivent deux injections intrapéritonéales au cours de la procédure: une première injection pour l'inoculation des parasites, la deuxième lors de l'euthanasie. Ces deux injections peuvent entraîner une légère inflammation au point d'injection. Les prélèvements réalisés à la queue peuvent également causer une irritation modérée, leurs réalisations ne nécessitent pas la mise en place d'une contention particulière. Le saignement à la queue est stoppé très rapidement et l'application d'un désinfectant au niveau de la queue limite l'inflammation potentielle. Le développement du parasite dans le sang, au moins jusqu'à une parasitémie de 50%, n'induit pas d'effets notables sur le comportement des animaux.
Devenir
Le prélèvement de sang parasité par exsanguination implique l'euthanasie des animaux à la fin de la procèdure.
Remplacement
Il n'y a actuellement pas de méthodes alternatives à l'infection expérimentale pour propager les parasites B. microti. De plus, l'infection expérimentale reste une méthode de réference pour l'isolement de souches parasitaires issues de prélèvement cliniques. Contrairement à d'autres espèces de Babesia telles que B. divergens (cultivable en hématies humaines venant de l'EFS) ou de B. canis (cultivable en hématies canines venant d'une société d'élevage privée), B. microti ne peut pas être cultivées à long terme sur hématies in vitro (quelle que soit l'espèce de mammifère considérée). La production de matériel biologique ne peut être réalisée par des molécules de synthèse ni simulation informatique, ce qui contraint à l'infection expérimentale.
Réduction
Le nombre d'animaux est déterminé par le volume de sang parasité nécessaire pour l'utilisation du matériel mais aussi pour assurer le renouvellement des stocks congelés, permettant un maintien à long terme de nos capacités de production. Ainsi, nous avons besoin de 30 ml de sang parasité/an. A raison de 2 ml de sang total prélevable par animal, nous avons besoin de 30 gerbilles/an (soit 150 animaux sur 5 ans). L'objectif étant la production de sang parasité, l'approche statistique est sans objet.
Raffinement
Le prélèvement rétro-orbital, utilisé pour la mesure d'hématocrite (sur tube capillaire hépariné) est désormais remplacé par l'utilisation d'un lecteur d'hématocrite avec bandelettes. Ce lecteur utilise 2 µl de sang, qui sera prélevé à la queue dans le même prélèvement que celui nécessaire à la détermination de la parasitémie. Ceci permet donc d'éliminer totalement le prélèvement rétro-orbital de la procédure, ce qui permet de réduire fortement la perte sanguine des animaux, la douleur éventuellement générée et les risques d'infection. A noter que le parasite ne peut survivre ou se développer en dehors de la circulation sanguine de l'animal, et ne peut etre transmis que lors d'une injection expérimentale ou une morsure de tique infectée, ce qui empêche toute contamination de la zone d'hébergement. L'extrémité de la queue, à la suite du prélèvemnet, est désinfectée et le saignement stoppé par une légère pression avec un papier absorbant, ce qui empêche l'écoulement de sang parasité en dehors de la zone d'expérimentation et contribue à la non-contamination de la zone d'hébergement. Le point limite principal est l'hématocrite, et la mise en évidence de signes de souffrances. Lorsque l'hématocrite mesuré est inférieur ou égal à 20% (ou lorsque l'animal présente des signes de souffrance tels que déterminés sur la grille d'évaluation), l'euthanasie de l'animal est décidée et le sang parasité récupéré.
Choix des espèces
Babesia microti est un parasite transmis lors du repas sanguin de tiques infectées sur un hôte sensible. Les gerbilles de Mongolie sont sensible à l'infection par B. microti, et en l'absence de système de culture in vitro du parasite, l'infection expérimentale reste le seul moyen de produire du matériel parasitaire (ADN, protéines...).
Détermination de l’activité anti-biofilm ex vivo de trois bactériophages anti-staphylococciques sur du biofilm formé in vivo chez le lapin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
12 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, déclarés aptes puis proposés à l'adoption via une association. Chaque animal subit l'implantation chirurgicale de cages sous-cutanées sur les flancs, puis leur retrait, et deux à trois prélèvements sanguins, pour tester l'action de bactériophages contre le biofilm staphylococcique. Le porteur présente ce modèle comme une réduction du nombre d'animaux, chaque lapin permettant d'évaluer jusqu'à 36 conditions ex vivo. Il décrit ces premiers résultats comme un préalable à de futurs essais thérapeutiques, dont l'application clinique reste hypothétique.
Objectifs
La recherche d’alternatives thérapeutiques dans le domaine des antibactériens constitue un enjeu majeur de santé publique et a été identifiée comme une priorité, aussi bien au niveau national, qu’international. Les bactériophages sont des virus ciblant spécifiquement les bactéries. S’ils peuvent représenter un support de transfert de matériel génétique (résistance, virulence) via leur cycle lysogénique, leur cycle lytique permet d’envisager leur utilisation en thérapeutique. La phagothérapie représente ainsi une alternative innovante à l’antibiothérapie dans le traitement des infections bactériennes, à l’ère de la diffusion de l’antibiorésistance.
Bénéfices attendus
La description de l’activité anti-biofilm des bactériophages est un prérequis important pour leur utilisation en thérapeutique humaine. Les modèles in vitro actuellement utilisés pour l’évaluation de l’activité anti-biofilm sont soumis à de nombreuses variations liées aux conditions de culture utilisées, justifiant l’utilisation d’un modèle animal. De plus, le modèle proposé permet, à l’inverse des autres modèles animaux développés pour l’évaluation de l’activité anti-biofilm des antibiotiques, d’évaluer un grand nombre de conditions à partir d’un nombre limité d’animaux. Ce projet représentera la première description de l’activité anti-biofilm des bactériophages sur du biofilm formé in vivo, et son caractère concentration et temps dépendant. Ces résultats serviront de base aux choix à des modélisation pharmacocinétiques qui permettront de choisir les posologies et rythmes d’administration à adopter en thérapeutique locale ou systémique. Ces dernières seront validées secondairement dans ce même modèle par injection locale ou systémique de phages, seuls ou en association à des antibiotiques, dans un futur projet. Ces premières données serviront de rationnel et permettront de designer les futurs essais thérapeutiques prévus dans un projet plus global.
Procédures
Chaque animal aura 2 (minimum) ou 3 (maximum) prélèvement de sang. Le prélèvement est effectué après application d’un anesthésique local et dure moins d’une minute. Le temps chirurgical n’excédera pas 30 minutes par animal (5 minutes pour l’abord, 5 minutes pour la mise en place des cages, 5 minutes pour les fixer et 5 minutes pour la fermeture des incisions) et conciste en l'implantation, puis plus tard le retrait d'implants (cages) insérés sur chaque flanc par le biais de 3 incisions cutanées de 1 cm de long réalisées en zone dorsale médiane.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables potentiels sont : - i) locaux : troubles cicatriciels, formation d’abcès ; et - ii) généraux : généralisation de l’infection, avec bactériémie. A noter que le modèle est basé sur l’inoculum minimal efficace pour lequel les résultats préliminaires soulignent l’absence d’effets secondaires locaux et gébéraux. Les tensions cicatricielles potentiellement occasionnées par les implants seront réduites par le recours à un nouveau design plus adapté de section ovalaire. La gêne occasionnée devrait être réduite. Selon notre expérience, aucune infection systémique n’a été constatée lors de la validation du modèle tant sur le plan clinique que microbiologiques (hémocultures régulièrement prélevées).
Devenir
Les animaux qui seront déclarés aptes par le vétérinaire seront mis à l’adoption à l’aide d’une association.
Remplacement
Si les méthodes statiques et dynamiques d’évaluation de la formation, la structure et la composition du biofilm développées in vitro ont permis des avancées considérables dans la compréhension de la physiologie du biofilm, leur analyse comparative montre une importante hétérogénéité dans les résultats obtenus dépendant de la phase de croissance bactérienne, des milieux de culture utilisés et de leurs éventuelles supplémentations en glucose et/ou plasma, du type de matériel, des durées d’incubation, des étapes de lavage et de coloration, etc. Au-delà de ces considérations techniques, le rôle de l’environnement lié à l’hôte est maintenant bien reconnu (insuline, hormones stéroïdes, vitamines, etc.). En conséquence, les évaluations in vitro de l’activité anti-biofilm des antimicrobiens donnent souvent des résultats contradictoires. Des modèles animaux ont été implémentés pour palier à cette variabilité, tous basés sur l’implantation et l’infection de divers matériaux, le traitement des animaux avec les molécules testées avant l’ablation du matériel pour évaluation du biofilm résiduel. Toutefois, ces techniques longues et coûteuses ne permettent l’évaluation que d’un nombre limité de conditions (molécules, concentrations) et dans des conditions parfois éloignées de la pathologie étudiée. Nous proposons ici d’évaluer l’efficacité des bactériophages sélectionnés sur un modèle lapin d’implantation de cages sous-cutanées permettant, avec un nombre limité d’animaux, le screening ex vivo nombreuses conditions (phages, concentrations) sur du biofilm formé in vivo.
Réduction
L’ensemble des techniques utilisées ont été validées in vitro au préalable. Par ailleurs, le modèle utilisé représente en soit un modèle de réduction du nombre d’animaux nécessaire à l’étude du biofilm par rapports aux méthodes existantes in vitro ou in vivo, le système d’implantation de cages/billes permettant d’évaluer, à partir d’un seul animal, 36 conditions ex vivo : - limitation du nombre de conditions : l’évaluation des CMEB (Concentration Minimal Eradicatrice du Biofilm) nécessite l’utilisation de l’ensemble des phages seuls ou en combinaisons, puisqu’il s’agit de l’objectif principal. En revanche, l’évaluation de l’impact du temps de contact entre phages et billes ne sera réalisée que sur 3 conditions selon les résultats des CMEB, et avec seulement 3 concentrations afin de limiter le nombre total d’animaux nécessaires Le nombre d’animaux choisi correspond au minimum nécessaire pour atteindre les standards scientifiques nécessaires à l’interprétation des résultats, incluant 6 réplicas pour les comptes bactériens. Ce nombre de réplicas est le nombre habituellement nécessaire dans les modèles expérimentaux en microbiologie pour assurer la fiabilité et reproductibilité des résultats observés.
Raffinement
L’animal sera placé 3 semaines en acclimatation. Après une semaine et demie d’acclimatation, une puce d’identification électronique permettant de mesurer sa température corporelle tout au long du projet sera implantée sous la peau. L’animal sera habitué au passage du lecteur mais aussi au pyjama pour protéger les cages et les cicatrices afin de faciliter le suivi post-opératoire. Après 3 semaines d’acclimatation et reparti en lot homogène avec d’autres congénères, l’animal sera injecté avec un analgésique pour anticiper la sensation de la douleur la veille de la chirurgie. Le jour de la chirurgie, l’animal sera anesthésié à l’aide d’un anesthésique couplé à un analgésique (anti-douleur) pour réduire toutes sensations à la douleur. Un cathéter sera mis en place sur la veine de l’oreille pour permettre l’hydratation de l’animal tout au long de la chirurgie. L’animal est placé sous masque avec un anesthésie gazeux pour le maintien de l’anesthésie. L’animal est placé sur une table chauffante afin de maintenir la température corporelle. Un renfort de protection avec une compresse et une couche de coton cardé réduira les frottements des fils des points sur le pyjama et donnera une protection supplémentaire à un grignotage du pyjama par l’animal. L’animal sera placé dans des couvertures polaire et sous-surveillance jusqu’à son réveil. L’animal avec les couvertures polaire seront remis dans la cage. L’animal recevra le soir de la chirurgie un analgésique pour la nuit et le maintien de l’analgésie au lendemain de la chirurgie pendant 3 à 5 jours se fera selon les besoins de chaque individu. Le soir de la chirurgie, il sera déposé dans la cage des légumes frais, plus appétent, pour stimuler l’appétit de l’animal et réduire la perte de poids en post-opératoire. Les légumes frais seront maintenus pendant 72 h post-opératoire. Le poids de l’animal est suivi quotidiennement jusqu’à la reprise de poids. La cicatrice sera surveillée toutes les 48 h jusqu’au retrait des points à 15 jours minimum post-chirurgie. Suite au précédent projet, une nouvelle forme de cage imprimées en 3D de section ovalaire pour limiter les tractions cicatricielles sera utilisée par rapport au modèle princeps.
Choix des espèces
Le choix du lapin repose sur un rationnel technique et biologique, en comparaison aux alternatives possiblement envisageables : - le modèle lapin est utilisé depuis le début du 20ème siècle pour l’étude des infections staphylococciques du fait de sa sensibilité à ces infections et à la reproduction d’infections proches de celles observées chez l’homme ; - la taille d’une souris ne permettant l’implantation que d’une seule cage par animal, le modèle perdrait l’intérêt de pouvoir évaluer un large panel de conditions à partir d’un nombre limité d’animaux ; - le rat présente une sensibilité 100 fois moindre aux infections staphylococciques, nécessitant l’utilisation d’inoculum très élevés (et donc non pertinents cliniquement) sous peine d’une clairance spontanée de l’infection par la plupart des animaux Les animaux arriveront à 2,5 kg environ pour atteindre 3-3,5 kg (âge adulte). L’utilisation d’animaux adulte permet de bénéficier d’un système immunitaire mature, et d’une taille permettant l’implantation de 6 cages par animal.
Production d’anticorps anti-Klebsiella pneumoniae chez la lapine
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
11 lapines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une puce sous-cutanée puis deux à trois injections d'un candidat vaccin, subissent plusieurs prélèvements de sang à l'oreille en cage de contention, et terminent par une ponction intracardiaque sous anesthésie pour recueillir un maximum de sérum. L'objectif est de mesurer la production d'anticorps selon le protocole d'administration, ces anticorps étant ensuite injectés à des souris. Le porteur affirme qu'il n'est pas encore possible de se passer de l'animal pour produire des anticorps, et présente la lapine comme un modèle de choix pour son volume sanguin.
Objectifs
S’appuyant sur les données communiquées par 87 pays en 2020, un nouveau rapport de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) met en évidence des niveaux élevés de résistance des bactéries aux antibiotiques (supérieurs à 50 %), en particulier chez des bactéries fréquemment retrouvées en milieu hospitalier, comme Klebsiella pneumoniae et Acinetobacter baumannii, responsables de septicémie. Le traitement de ces infections requiert obligatoirement l’utilisation d’antibiotiques de dernière ligne, tels que les carbapénèmes. Cependant, 8% (jusqu’à 50% dans certains pays) des souches de Klebsiella pneumoniae responsables d’infections sanguines sont résistantes à ces mêmes carbapénèmes, ce qui augmente notoirement le risque de décès imputables à ces infections. D’autres alternatives, en particulier vaccinales, sont actuellement à l’étude. Un candidat vaccin, basé sur des cellules d’Acinetobacter baumannii inactivées et génétiquement modifiées pour exprimer des protéines de surface de Klebsiella pneumoniae (OMPs), a déjà montré une protection significative dans un modèle d’infection à Klebsiella pneumoniae chez la souris. Une précédente étude a également testé la production d’anticorps chez le lapin en réponse à l’administration de ce candidat vaccin. L’objectif du présent projet est de poursuivre l’étude de ce vaccin chez le lapin afin d’analyser la variabilité de réponse à son administration chez cette espèce animale et de tester des protocoles d’administration différents.
Bénéfices attendus
Après la mise en évidence de l’efficacité du candidat vaccin chez la souris, et de sa capacité à entrainer la production d’anticorps chez la lapine ce projet vise à déterminer le meilleur protocole d’administration et à évaluer la variabilité de réponse à son administration. Les anticorps collectés à la fin de l’expérience seront ensuite administrés chez la souris pour réaliser une vaccination dite passive. L’efficacité de cette vaccination permettra d’en apprendre davantage sur les mécanismes immunitaires déclenchés par l’administration de ces bactéries atténuées chez la lapine et sur leur potentiel en tant que vaccin. A terme, l’idée est de pouvoir favoriser la vaccination de populations à risque, en l’absence de traitement antibiotiques efficaces.
Procédures
Les animaux vont être soumis à différentes interventions : - Mise en place d’une puce de température en sous cutanée à J-1 sur animal vigile - 3 secondes par puce - 3 Injections intramusculaires du candidat vaccin à J0, J28 +/- J56 (en alternant la cuisse droite et la cuisse gauche) sur animal vigile - 3 secondes par injection - 3 à 5 prélèvements sanguins à l’oreille à J0, J14 et J28 +/- J42 et J56 (en alternant l’oreille droite et l’oreille gauche) sur animal vigile en cage de contention - 5 minutes de maintien en cage de contention par prélèvement - 1 anesthésie générale (3 secondes) suivie d’une ponction intracardiaque (2 minutes).
Impact sur les animaux
Les animaux vont être soumis à différents actes pouvant induire un stress ou une douleur légère : - Mise en place d’une puce de température en sous-cutané à J-1 - La mise en place de la puce est réalisée à l’aide d’une seringue prévue à cet effet et ne dure pas plus de 3 secondes. Aucune contention particulière n’est requise et d’après notre expérience aucune gêne n’est ressentie par l’animal lors de la pose ni après la mise en place de la puce. - 2 à 3 injections intramusculaire à J0, J28 +/- J56 (en alternant la cuisse droite et la cuisse gauche) - Le candidat vaccin ainsi que l’adjuvant ont déjà été testés chez la souris et le lapin et n’ont montré aucun signe de toxicité. - 3 à 5 prélèvements sanguins à l’oreille à J0, J14, J28 +/- J42 et J56 (en alternant l’oreille droite et l’oreille gauche) sur animal vigile en cage de contention - Les animaux seront familiarisés à la cage de contention au cours de 3 séances d’habituation réalisées avant le début de l’expérience. - 1 anesthésie générale par injection intramusculaire suivi d’une ponction intracardiaque. - La ponction intracardiaque étant réalisée sous anesthésie générale, elle ne sera associée à aucune douleur particulière.
Devenir
Les 11 animaux du projet seront mis à mort à l’issue des 42 ou 70 jours d’expérience ou plus précocement s’ils montrent des signes de souffrance. Avant la mise à mort, une ponction intracardiaque sera réalisée sur l’ensemble des animaux afin de récupérer un maximum de sang (ainsi de sérum) final afin de doser la quantité d’anticorps produit tout au long de l’étude.
Remplacement
La production d’anticorps polyclonaux est un mécanisme complexe basé sur l’interaction entre plusieurs types de cellules immunitaires. La première étape indispensable à cette production est l’immunisation chez l’animal. Il n’est pas encore possible aujourd’hui de se passer du modèle animal pour la production d’anticorps.
Réduction
Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé. Seuls 3 groupes seront comparés et ces groupes contiendront au maximum 5 animaux. Le groupe control (sans vaccin) sera composé de seulement 3 animaux tout comme le groupe recevant 2 administrations de vaccin qui servira à déterminer si seulement 2 administrations peuvent être suffisantes à la production d’anticorps. Le groupe recevant 3 administrations de vaccin nécessitera 5 animaux afin d’évaluer la variabilité de la réponse au vaccin. Ce nombre d’animaux (11 au total) permettra également de récupérer suffisamment d’anticorps pour de futures expériences d’immunisation.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Ils seront suivis 2 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude. Un suivi accru sera réalisé durant les 6h suivant les administrations du candidat vaccin et la fréquence de surveillance sera augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux. Le suivi de la température sera effectué grâce à une puce placée en sous cutané ce qui évitera l’utilisation d’un thermomètre rectal souvent stressante pour l’animal. L’administration du candidat vaccin n’est pas censée entrainer d’effet indésirable. Cependant des critères d’interruption de l’étude, supportés par une grille de score de douleur, ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance.
Choix des espèces
La lapine est un modèle de choix pour la production d’anticorps polyclonaux. En effet sa taille moyenne implique un volume sanguin important et donc un plus grand potentiel de récupération d’anticorps que pour la souris par exemple. Les lapines de cette étude seront âgées de 3 mois de façon à avoir une maturité immunitaire suffisante.