Maladies infectieuses

1 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des immunisations uniques ou répétées par diverses voies, jusqu'à trois sites par jour, avec prélèvements sanguins et anesthésies multiples, avant euthanasie pour prélever leurs organes. L'objet est de vérifier que des candidats vaccins déclenchent une réaction immunitaire avant des essais d'efficacité ultérieurs. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne modélise l'immunogénicité d'un produit dans un organisme entier vivant.

Objectifs

Selon l'OMS, en 2017, les maladies infectieuses sont responsables dans le monde de 17 millions de décès par an, soit un tiers de la mortalité et 43 % des décès dans les pays en voie de développement (contre 1 % dans les pays industrialisés). Les maladies infectieuses recouvrent un large spectre de pathologies bénignes comme le rhume ou l’angine, mais également très graves comme l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine, les hépatites, le paludisme, la tuberculose, etc. Si la recherche a permis l’éradication de certaines d’entre elles grâce à la mise au point de vaccins spécifiques et des antibiotiques, il reste encore beaucoup de chemin à parcourir pour que toutes ces pathologies soient traitées. Dans le cas du développement d'un vaccin anti-infectieux, il convient de s'assurer que le candidat vaccinal permet d'induire une réaction immunitaire spécifique chez l'animal sain après injection, permettant le développement d'anticorps spécifiques contre la pathologie visée, avant la réalisation d'études d'efficacité (challenge vaccinal). Il n’existe pas de méthode alternative à l’heure actuelle permettant de modéliser de manière fiable l'immunogénicité d'un produit injecté dans un organisme vivant. Le recours à l’expérimentation animale est donc nécessaire à l’objectif de ce projet. Ce projet a pour objectif de caractériser l'immunogénicité de candidats vaccins après administration chez la souris. Plusieurs études pourront être réalisées pour répondre à cet objectif.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de sélectionner de nouveaux candidats vaccins à visée anti-infectieuse pour les phases d'efficacité, et à terme, pour la mise sur le marché de nouveaux vaccins.

Procédures

Les animaux seront immunisés par injection unique ou répétée (maximum 1 fois par semaine) du produit à tester par voie per-os (vigiles), sous-cutanée, intramusculaire, intrapéritonéale (vigiles ou anesthésiés) ou intratrachéale (anesthésiés). Sur animaux vigiles, l’immunisation est de l’ordre de la minute, en comptant l’anesthésie la durée est d’environ 5 minutes. Au maximum, 3 sites/souris par jour pourront être utilisés en respectant les volumes d’injections recommandés et un espacement de 7 jours. Les prélèvements sanguins seront réalisés sur animaux anesthésiés au maximum 1 fois par semaine (et avant euthanasie) jusqu’à la fin de l’étude en respectant les volumes éthiques. Un prélèvement s’effectue en moyenne en 1 à 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront présenter des réactions immunitaires différentes selon les produits testés. Il est possible que leur système immunitaire soit affaibli entrainant l’apparition de signes cliniques. Les animaux seront manipulés régulièrement pour différents actes (pesées, administration des produits, prélèvements de sang) et pourront subir plusieurs anesthésies au cours des études susceptibles d’induire un stress supplémentaire.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole afin de prélever les organes pertinents nécessaires aux mesures et analyses menées pour déterminer l’immunogénicité des produits testés.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire afin de pouvoir caractériser l'immunogénicité d’un produit dans un organisme entier vivant (modélisation d’une situation clinique). Actuellement, il n’existe pas de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable la réaction immunitaire induite d’un produit dans un organisme vivant.

Réduction

Afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant de conclure sur un réel pouvoir immunogène du traitement testé, des groupes d’au moins 5 animaux seront constitués.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 6 jours minimum sera respectée. Les animaux seront hébergés en cage de manière collective durant toute la durée de l’étude (sauf exception en cas de bagarre ou blessure), avec des enrichissements appropriés (abris, matériel de nidation, bois à ronger…). En cas d’hébergement individuel (pour cause de bagarre entre congénère par exemple), les cages seront réorganisées de manière à permettre à minima un contact visuel avec les animaux adjacents. Ce type d’hébergement présente l’avantage de mieux vérifier la prise alimentaire et l’abreuvement de chaque animal, et ainsi vérifier leur état général. Les injections pourront se faire sur animaux vigiles ou sous anesthésie (anesthésie systématique pour les voies d’injection intramusculaire et intratrachéale) en fonction de la voie d’injection et du protocole. Une attention particulière pourra être apportée au site d’injection durant les jours post-injection afin de détecter d’éventuels signes locaux ou d’irritation cutanée. Au cours de l’étude, les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout signe clinique anormal et ainsi prendre le plus rapidement possible, les mesures nécessaires : mesure de soutien (désinfection de plaies, isolement, réchauffement, etc…) ou la mise à mort des animaux ayant un état clinique jugé moribond. Des critères d’interruption ou points limites seront appliqués tout au long de ces études (basés sur la perte de poids, l’état de santé général et d’éventuelles lésions au site d’injection de l’animal). Des examens cliniques approfondis pourront également être réalisés. Toute anomalie clinique sera rapportée au vétérinaire responsable du suivi. Les signes cliniques observés seront pris en charge (injection de fluides, analgésiques, antibiotiques, etc…) dans la mesure où les actions n'influent pas sur l'immunogénicité des produits injectés (en fonction des connaissances des produits).

Choix des espèces

Différentes espèces animales sont nécessaires pour tester l'immunogénicité de candidats vaccins car les pathologies infectieuses présentent des tropismes particuliers vis à vis de certaines espèces animales dans lesquelles ces pathologies infectieuses se développent ou non. Dans ce projet, des souris seront utilisées car il s’agit d’une espèce cible judicieuse qui est sensible aux modèles de pathologies comme la grippe, les rotavirus, la coqueluche, le tétanos, etc. (liste non exhaustive) et qui va donc induire une réaction immunitaire spécifique pour ensuite pouvoir réaliser des tests de challenge vaccinaux. La première injection se fera sur des animaux âgés de 7 à 13 semaines (stade jeune adulte). Ce stade de développement est celui habituellement utilisé pour ce type d’étude.

6 lapines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois injections d'un candidat vaccin et trois prélèvements de sang à l'oreille en cage de contention, puis une ponction intracardiaque terminale de 30 mL sous anesthésie qui se termine par leur mise à mort. L'objet est de produire des anticorps anti-Klebsiella destinés à une vaccination testée ensuite chez des souris dans un autre projet. Le porteur indique qu'il faut exsanguiner les animaux pour récupérer assez d'anticorps et qu'on ne peut pas se passer du modèle animal.

Objectifs

S’appuyant sur les données communiquées par 87 pays en 2020, un nouveau rapport de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) met en évidence des niveaux élevés de résistance des bactéries aux antibiotiques (supérieurs à 50 %), en particulier chez des bactéries fréquemment retrouvées en milieu hospitalier, comme Klebsiella pneumoniae et Acinetobacter baumannii, responsables de septicémie. Le traitement de ces infections requiert obligatoirement l’utilisation d’antibiotiques de dernière ligne, tels que les carbapénèmes. Cependant, 8% (jusqu’à 50% dans certains pays) des souches de Klebsiella pneumoniae responsables d’infections sanguines sont résistantes à ces mêmes carbapénèmes, ce qui augmente notoirement le risque de décès imputables à ces infections. D’autres alternatives, en particulier vaccinales, sont actuellement à l’étude. Un candidat vaccin, basé sur des cellules d’Acinetobacter baumannii inactivées et génétiquement modifiées pour exprimer des protéines de surface de Klebsiella pneumoniae (OMPs), a déjà montré une protection significative dans un modèle de septicémie à Klebsiella pneumoniae chez la souris. L’objectif du projet est de déterminer si ce vaccin entraine une production d’anticorps fonctionnels chez une autre espèce. A cette fin, un protocole d’immunisation sera testé chez la lapine dans le but d’obtenir une quantité importante d’anticorps. Ces anticorps seront utilisés par la suite (dans un autre projet) pour réaliser une vaccination passive chez la souris et ainsi évaluer leur efficacité face à une infection à K. pneumoniae.

Bénéfices attendus

Après la mise en évidence de l’efficacité du candidat vaccin chez la souris, ce projet vise à déterminer s’il est capable d’entrainer la production d’anticorps chez la lapine. Si c’est bien le cas, ces anticorps serviront à mettre au point une vaccination passive chez la souris. L’efficacité de cette vaccination passive permettra d’en apprendre davantage sur les mécanismes immunitaires déclenchés par l’administration de ces bactéries atténuées chez la lapine et sur leur potentiel en tant que vaccin.

Procédures

Les animaux vont être soumis à 6 interventions : - Mise en place d’une puce de température en sous-cutané à J-1 sur animal vigile : 3 secondes - 3 injections du candidat vaccin (0.5mL) par voie intramusculaire à J0, J12 et J28 (en alternant la cuisse droite et la cuisse gauche) : 3 secondes par injection - 3 prélèvements sanguins à l’oreille à J0, J7 et J21 (en alternant l’oreille droite et l’oreille gauche) sur animal vigile en cage de contention : 5 minutes de maintien en cage de contention par prélèvement - 1 anesthésie générale par injection intramusculaire d’un mélange de kétamine et xylazine (3 secondes) - directement suivit d’une ponction intracardiaque de 30mL de sang (2 minutes) - qui se terminera par une injection intracardiaque d’euthasol (3 secondes) pour la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux vont être soumis à différents actes pouvant induire un stress ou une douleur légère : - Mise en place d’une puce de température en sous-cutané à J-1 La mise en place de la puce est réalisée à l’aide d’une seringue prévue à cet effet et ne dure pas plus de 3 secondes. Aucune contention particulière n’est requise et d’après notre expérience aucune gêne n’est ressentie par l’animal lors de la pose ni après la mise en de la puce. - 3 injections du candidat vaccin (0.5mL) par voie intramusculaire à J0, J12 et J28 (en alternant la cuisse droite et la cuisse gauche) Le candidat vaccin ainsi que l’adjuvant ont déjà été testé chez la sourie et n’ont montré aucun signe de toxicité. - 3 prélèvements sanguins à l’oreille à J0, J7 et J21 (en alternant l’oreille droite et l’oreille gauche) sur animal vigile en cage de contention : Les animaux seront familiarisés à la cage de contention au cours de 3 séances d’habituation réalisés avant le début de l’expérience. - 1 anesthésie générale par injection intramusculaire d’un mélange de kétamine et xylazine directement suivit d’une ponction intracardiaque de 30mL de sang qui (si elle n’a pas entrainé la mort de l’animal) se terminera par une injection intracardiaque d’euthasol pour la mise à mort. La ponction intracardiaque étant réalisée sous anesthésie générale, elle ne sera associée à aucune douleur particulière

Devenir

Les 6 animaux du projet seront mis à mort à l’issue des 42 jours d’expérience ou plus précocement s’ils montrent des signes de souffrance. Afin de récupérer un quantité suffisante d’anticorps, il est nécessaire d’exsanguiner les animaux et donc de les euthanasier.

Remplacement

La production d’anticorps polyclonaux est un mécanisme complexe basé sur l’interaction entre plusieurs types de cellules immunitaires. La première étape indispensable à cette production est l’immunisation chez l’animal. Il n’est pas encore possible aujourd’hui de se passer du modèle animal pour la production d’anticorps.

Réduction

Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé. Seuls deux groupes seront comparés et ces groupes ne contiendront que 3 animaux chacun. Ces 3 animaux par groupe seront suffisants pour permettre une première évaluation de la différence interindividuelle de réponse au candidat vaccin et permettre également de récupérer suffisamment d’anticorps pour de futures expériences d’immunisation passive.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Ils seront suivis 2 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude. Un suivi accru sera réalisé durant les 6h suivant les administrations du candidat vaccin et la fréquence de surveillance sera augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux. Le suivi de la température sera effectué grâce à une puce placée en sous cutané ce qui évitera l’utilisation d’un thermomètre rectal souvent stressante pour l’animal. L’administration du candidat vaccin n’est pas censée entrainer d’effet indésirable. Cependant des critères d’interruption de l’étude supportés par une grille de score de douleur ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance.

Choix des espèces

La lapine est un modèle de choix pour la production d’anticorps polyclonaux. En effet sa taille moyenne implique un volume sanguin important et donc un plus grand potentiel de récupération d’anticorps que pour la souris par exemple. Les lapines de cette étude seront âgées de 3 mois de façon à avoir une maturité immunitaire suffisante, capable de produire une réponse IgG.

2 556 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par des mycobactéries, Mycobacterium avium ou abscessus, par voie intranasale ou intratrachéale, puis traitées jusqu'à deux mois par de nouveaux antibiotiques, avant d'être tuées à différents temps. Le porteur indique qu'une perte de poids atteignant 20 % déclenche la mise à mort, tout en présentant une perte de poids continue comme "non préjudiciable" en deçà de ce seuil. Il qualifie le modèle murin d'"indispensable" et de préalable à un essai chez l'humain "incluant le moins de patients possible".

Objectifs

Mycobacterium abscessus (Mabs) et Mycobacterium avium (Mavi) sont des mycobactéries pathogènes opportunistes responsables d'infections pulmonaires chroniques. La physiopathologie et le terrain prédisposant ces infections ne sont pas bien connus. Pour mieux comprendre l'impact de l'hôte, des modèles précliniques sont indispensables. Actuellement, une infection par voie intraveinseuse de souris immunodéprimées est la seule méthode permettant d'évaluer de nouveaux traitements antibiotiques car il existe une clairance spontanée de l'infection chez les animaux immunocompétents. Cette clairance, qui est aussi retrouvée dans d'autres modèles murins d'infection bactérienne (par exemple Pseudomonas aeruginosa), a été contournée par l'infection des animaux par des bactéries encapsulées dans des billes d'alginate. Cet artifice va permettre de créer une infection chronique ressemblant à celle observée chez les patients. Le modèle actuel d'infection à Mabs et Mavi étant très éloigné de la physiopathologie de la maladie bronchique humaine, nous souhaitons dans la première partie de notre projet mettre au point un modèle d'infection chronique chez la souris immunocompétente. Pour ce faire nous effectuerons une infection des souris par des Mabs et Mavi encapsulées dans des billes d'alginate via deux voies d'infection différentes: intranasale et intratrachéale.

Bénéfices attendus

Le modèle actuel d'infection à Mabs et Mavi étant très éloigné de la physiopathologie de la maladie bronchique humaine, nous souhaitons dans la première partie de notre projet mettre au point un modèle d'infection chronique chez la souris immunocompétente.

Procédures

Les animaux seront infectées par voie intranasale ou intratrachéale par Mycobacterium avium ou Mycobacterium abscessus (n=2376) puis traités par voie orale ou sous cutanée pendant un maximum de 2 mois par de nouvelles molécules afin d'évaluer l'efficacité des traitements (n=1800). Un prélèvement sanguin à la veine mandibullaire sur 24 animaux par molécule sera réalisé; seules les 4 molécules les plus actives seront testées soit un maximum de 96 animaux prélevés. Les animaux ne seront prélevés qu'une seule fois.

Impact sur les animaux

L'infection chronique par Mabs ou Mavi peut entrainer une perte de poids modérée mais sans mortalité. Le poids sera donc surveillé de manière hebdomadaire. En cas de perte de poids supérieur à 20%, l'animal sera euthanasié par élongation cervicale.La valeur de référence sera le poids initial des souris le jour de l’inoculation. Le point limite est fixé à une perte de poids de 20% ; cette perte n’interviendra pas du jour au lendemain mais pourra effectivement être continue pour les animaux concernés. Si aucun autre signe évoquant la souffrance n’est associé (animal prostré, poil piqué, animal ne se nourrissant plus), une perte de poids continue n’est pas préjudiciable aux animaux dans la limite du point limite fixé.

Devenir

Fin de procédure 1: les 180 animaux utilisés pour la mise au point du modèle seront euthanasiés 1 jour, 2 semaines et 1 mois après infection. Les témoins non traités des expériences d’étude de la dose minimale effective (360 souris) et ceux de l’expérience d’étude de l’activité des molécules en associations (36 souris) seront euthanasiés le jour du début des traitements (J0), 1 mois et 2 mois après le début du traitement. Fin de procédure 2: les 180 animaux utilisés pour la mise au point du modèle seront euthanasiés 1 jour, 2 semaines et 1 mois après infection. Les témoins non traités des expériences d’étude de la dose minimale effective (360 souris) et ceux de l’expérience d’étude de l’activité des molécules en associations (36 souris) seront euthanasiés le jour du début des traitements (J0), 1 mois et 2 mois après le début du traitement. Fin de procédure 3: les 1440 animaux traités lors de la détermination de la dose minimale effective de 10 molécules test seront euthanasiés après 1 et 2 mois de traitement. Les 360 animaux traités lors de l’évaluation de l’activité bactéricide des nouveaux composés en association seront euthanasiés après 1 et 2 mois de traitement. Il s'agit ici du nombre maximum d'animaux pouvant entrer dans la procédure. En effet, en fonction du mode d'administration des molécules, les animaux pourront être répartis entre la procédure 3 et la procédure 4, sans dépasser l'effectif total du projet. Fin de procédure 4: les 1440 animaux traités lors de la détermination de la dose minimale effective de 10 molécules test seront euthanasiés après 1 et 2 mois de traitement. Les 360 animaux traités lors de l’évaluation de l’activité bactéricide des nouveaux composés en association seront euthanasiés après 1 et 2 mois de traitement. Il s'agit ici du nombre maximum d'animaux pouvant entrer dans la procédure. En effet, en fonction du mode d'administration des molécules, les animaux pourront être répartis entre la procédure 3 et la procédure 4, sans dépasser l'effectif total du projet.

Remplacement

Les études dans le modèle murin sont un prérequis indispensable à la compréhension de la maladie humaine. Il s'agit d'une étape indispensable pour pouvoir affiner au mieux les stratégies thérapeutiques qui seront évaluées chez l'homme dans un essai incluant le moins de patients possible. Notre projet s'inscrit en amont des études d'activités d'antibiotiques chez l'homme et le modèle animal ne peut être remplacé.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au minimum afin de nous permettre d'obtenir une puissance statistique suffisante pour que les résultats soient interprétables ; si notre mise au point de modèle n'était pas concluante, la deuxième partie du modèle ne serait pas mise en oeuvre et une partie des souris prévue ne serait pas utilisée.

Raffinement

Il sera assuré par l'utilisation d'anesthésiques adéquates ainsi que par l'enrichissement mis à disposition des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par des personnes compétentes, permettra de détecter un changement de comportement pouvant indiquer une éventuelle souffrance. L’infection par Mycobacterium avium ou abscessus est susceptible d’engendrer une perte de poids chez l’animal. En cas d’atteinte des points limites fixés préalablement (perte de poids supérieur à 20%) l’animal sera euthanasié par une personne compétente. Un enrichissement sous forme de copeaux de cellulose permettant de faire des nids et mis à disposition des animaux.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle utilisé pour l'évaluation des antibiotiques dans les infections à mycobactéries avant évaluation chez l'homme. Il est nécessaire de garder le même modèle pour obtenir des résultats reproductibles. Les animaux auront 4 semaines à leur arrivée et entreront en procédure à 5 semaines après avoir observés une semaine d'acclimatation. Dans la littérature, les animaux utilisés dans d’autres infections mycobactériennes ont habituellement 4 semaines, c’est pourquoi nous utiliserons des animaux de cet âge afin de pouvoir comparer nos résultats à ceux de la littérature et d’être reproductibles.

60 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par le SARS-CoV-2 par voie intranasale sous anesthésie, puis reçoivent des injections intrapéritonéales quotidiennes, avant d'être tués pour prélever leurs organes. Le porteur indique attendre une perte de poids de J+1 à J+6 sans autre symptôme, et présente le hamster doré comme le "modèle de choix" pour évaluer une molécule, AM-001, déjà jugée efficace en culture cellulaire. Le recours à l'animal est qualifié de "nécessaire" pour valider une preuve de concept.

Objectifs

La protéine AM-001, est une molécule qui cible la protéine de l'hôte EPAC1 qui est elle-même une protéine impliquée dans la signalisation cellulaire dans un large éventail de processus biologiques et qui est activée en particulier par l'AMPc. Cette molécule, développée à l'institut I2MC, INSERM de Toulouse a montré qu’elle avait la capacité, en agissant comme un inhibiteur pharmacologique d’EPAC1, de protéger le cœur de pathologies aigues et chroniques (PMID: 32700175 et 30873562). Un précédent inhibiteur d’EPAC1 a été montré comme efficace contre le SARS-CoV-1 et le MERS lors de précédentes études (Blocking of Exchange Proteins Directly Activated by cAMP Leads to Reduced Replication of Middle East Respiratory Syndrome, Tao and al., 2014). Ainsi nous avons décidé de tester AM-001 contre le SARS-CoV-2. Cette molécule s'est révélée efficace en culture cellulaire avec un très bon index thérapeutique et nous avons maintenant le souhait de la tester dans un modèle animal. Des essais chez la souris dans des modèles de maladies cardio-vasculaires ont montré que cette molécule était efficace et très bien tolérée, à la fois en IV et IP.

Bénéfices attendus

Résultats attendus: ce projet nous permettra d'évaluer l'efficacité de la protéine soit en utilisation thérapeutique, soit en utilisation prophylactique vis-à-vis du SARS-CoV2. La réduction de la perte de poids, de la charge virale dans les poumons et appareil respiratoire supérieur, des lésions pulmonaires (histopathologie) seront évalués.

Procédures

Infection intranasale sur animaux anesthésiés à l'isoflurane (J0) Administration quotidienne par voie IP sur animaux vigile (4 ou 8 injections IP selon les groupes)

Impact sur les animaux

Une perte de poids, progressive et s’étalant sur une période allant de J+1 à J+6 post-infection, est attendue chez les hamsters infectés avec du SARS-CoV2. Hormis cette perte de poids, il n’y a pas de symptômes cliniques attendus durant la période d’infection. L’infection n’aboutit jamais à des décès non désirés. A partir de J+7, les animaux commencent à reprendre du poids.

Devenir

Mise à mort afin de procéder à la collecte de divers organes/sang pour caractériser l'infection et la réussite du traitement étudié en prophylactique et thérapeutique.

Remplacement

Le recours à des animaux est nécessaire afin de valider la preuve de concept d'un usage prophylactique et ou thérapeutique de la proteine.

Réduction

le nombre d' animaux par groupe a été fixé à 6 qui est le minimum généralement requis pour obtenir des résultats d'infection virale statistiquement significatifs (p

Raffinement

Les hamsters seront hébergés en cage de 2 à 3 individus avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette), cellulose, et de bâtonnets de bois à ronger. Un contrôle de leur état de santé sera assuré tous les jours. Des points limites précis et suffisamment précoces pour leur éviter toute souffrance prolongée et inutile ont par ailleurs été définis.

Choix des espèces

Les études scientifiques menées sur le SARS-CoV-2 ont maintenant largement démontré que le hamster doré était un modèle expérimental qui présentait une forte sensibilité au virus (atteintes respiratoires, perte de poids) ainsi qu'une forte réceptivité (multiplication du virus dans les poumons). Le hamster est donc le modèle de choix pour l'évaluation de l'efficacité de nouvelles thérapeutiques ou de nouveaux vaccins. Nos précédentes expérimentations nous ont permis de caractériser la réceptivité et la sensibilité des hamsters adultes vis à vis des souches SARS-CoV utilisées au laboratoire. Nous utiliserons donc des hamsters adultes de 8 à 10 semaines à réception.

700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le SRAS-CoV-2 par voie nasale sous anesthésie, reçoivent des injections répétées et des prélèvements sanguins rétro-orbitaux, pour étudier les atteintes cérébrales de la Covid et tester des traitements. Le porteur indique que l'infection peut entraîner une perte de poids allant jusqu'à 20 % et se révéler mortelle en sept jours, avec atteinte du système nerveux central et chute des capacités motrices et respiratoires, les souris M83 développant en plus une paralysie spontanée. Il affirme que l'étude de la physiopathologie ne peut se faire sans inoculer le virus à l'animal vivant, et justifie la mise à mort de toutes les souris par la gestion du risque lié à un agent pathogène de groupe III.

Objectifs

L’émergence de variants de SRAS2 requiert de nouvelles données scientifiques. Des patients continuent à présenter certains symptômes, parfois des mois après leur guérison, et d’autres en développent de nouveaux. Ces symptômes sont regroupés sous le nom de COVID- long. Des signes neurologiques sont observés chez les patients atteints de Covid et pourraient accélérer des pathologies cérébrales à long terme. Par ailleurs, le rôle de la réponse immunitaire innée est questionné dans l’établissement des symptômes de la Covid à court et long terme. Enfin, les mucines, composant du mucus, pourraient avoir un rôle clé dans la diffusion du SRAS2 au sein de la cavité nasale puis vers le tissu pulmonaire. Ce projet a pour objectifs (1) l’étude de la physiopathologie cérébrale des infections à SRAS2, (2) une meilleure compréhension du rôle de la réponse interféron induite par le virus (3) l'exploration du rôle des protéines composant le mucus (mucines) dans l'infection de l'épithélium respiratoire par le SRAS2 et (4) l'évaluation de traitements permettant de diminuer la pathologie cérébrale et l'inflammation à SRAS2. Pour répondre à ces questions, nous utiliserons une souris transgénique qui développe une neuropathologie rappelant la maladie humaine, un modèle de souris qui présente une immunité altérée, et un modèle de souris déficiente pour l'expression de mucines.

Bénéfices attendus

L’étude chez le rongeur des infections à SRAS-CoV-2 et des stratégies de contrôle est déterminante pour l’élaboration de stratégie de lutte contre la COVID-19 et les variants émergents de SRAS-CoV-2. Ce projet s’inscrit dans une démarche de sciences appliquées au domaine médical en lien avec les déclarations d’intérêt, d’urgence ou de priorité nationale du gouvernement et des organismes publics de recherche. Ce projet va permettre d’évaluer le risque de survenue de troubles de type maladie de Parkinson suite à une infection SRAS-CoV-2, de mieux explorer le rôle de la réponse immune innée dans les infections SRAS-CoV-2 ainsi que de tester des pistes de traitement et de caractériser le rôle des protéines du mucus (mucines) dans l’infection SRAS-CoV-2.

Procédures

Les inoculations par voie nasale sont réalisées sous anesthésie générale. Les administrations par voie sous-cutanée ou intrapéritonéale ou intramusculaire sont réalisées sur l’animal vigile. Les prélèvements sanguins seront réalisés au sinus rétro orbital sous anesthésie générale et collyre anesthésique. La durée de chacune des interventions décrites est inférieure à 1 minute.

Impact sur les animaux

Selon les données déjà disponibles de la littérature, il a été observé une chute de poids n’excédant pas 20% du poids initial que ce soit suite à une infection avec une souche adaptée à la souris ou un variant du SRAS-CoV-2. Les souris M83 développent spontanément des symptômes. Pour les souris M83, elles seront gardées jusqu’à un âge maximum de 8 mois, sachant que les premiers signes de paralysie spontanés n'apparaissent pas avant l'âge de 8 mois chez ces animaux. Selon la dose administrée et la souche virale considérée l’infection peut s’avérer létale chez la souris transgénique hACE2 à 7 jours post-infection avec une perte de poids et une infection du système nerveux central conduisant à une chute de l’activité motrice et des capacités respiratoires.

Devenir

La mise à mort des animaux est requise au regard de la gestion du risque d’exposition de l’agent pathogène de groupe III utilisé dans cette procédure

Remplacement

L’étude de la physiopathologie de l’infection ne peut être menée sans avoir recours à l’administration de l’agent pathogène à l’animal vivant. De plus nos projets s’intéressent à des processus biologiques qui reposent sur des évolutions sur le long terme (2 mois) qui ne peuvent être mimés in vitro. En revanche, les stratégies thérapeutiques seront validées préalablement sur des modèles d’infection utilisant des lignées cellulaires appropriées. L’effet du traitement antiviral sur la multiplication du SRAS-CoV-2 sera ainsi entériné par des analyses in vitro. Les essais thérapeutiques seront ensuite réalisés chez l’animal dans les meilleures conditions possibles afin d’évaluer l'innocuité et l’efficacité du traitement.

Réduction

Dans le but de suivre le principe des 3R et de réduire l’utilisation excessive d’animaux, le nombre d’animaux par groupe a été calculé sur la base de notre expérience acquise précédemment et des données bibliographiques (publications scientifiques). Dans notre expérience, des groupes de 6 animaux permettent d’atteindre une significativité statistique. La comparaison des traitements ou entre lignée de souris s’établit à l’aide de tests non paramétriques avec un niveau de confiance de 95%. Les différences entre les groupes seront considérées comme significatives si la valeur P est inférieure à 0,05%. Pour respecter la règle des 3R, les animaux seront utilisés pour plusieurs expériences (études histologiques et moléculaires).

Raffinement

Pour minimiser le stress induit aux animaux, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane avant inoculation intra-nasale du virus. L’endormissement complet sera contrôlé par pincement ferme de la queue. L’anesthésie à l’isoflurane est rapide et permet d’assurer un réveil rapide en minimisant l’hypothermie. Notre expérience du modèle souris a été également mise à profit pour aborder la question du raffinement : enrichissement et habituation de l’animal à la manipulation. La bonne connaissance du modèle infectieux sur lequel repose ce projet permet de limiter les souffrances ressenties par les animaux au cours des procédures expérimentales. Les souris seront hébergées par 6 dans des portoirs ventilés, avec à leur disposition du matériel de nidification (coton), des tunnels et des maisonnettes en carton ainsi que des bûchettes de bois à ronger.

Choix des espèces

La souris exprimant le récepteur murin ACE2 est sensible à l’infection par les souches adaptée à la souris et certains variants du SRAS-CoV-2. Elle présente l’avantage de pouvoir envisager l’emploi de souris génétiquement modifiée pour un gène d’intérêt (surexpression ou suppression) nécessaire à l’exploration des mécanismes biologiques impliqués dans la susceptibilité ou la défense de l’hôte vis-à-vis de l’infection virale. Les modèles de souris transgéniques exprimant le récepteur humain ACE2 au SRAS-CoV-2 permettent le développement clinique et virologique des infections à l’ensemble des souches circulantes et variants de SRAS-CoV-2. Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris de moins de 6 mois au moment de l’infection. Cette tranche d'âge permettra de disposer de lots homogènes des différentes colonies de souris transgéniques. L'âge maximal de 6 mois permet également d'éviter l'apparition de signes sévères associés à l'infection.