Maladies infectieuses

150 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Répartis en cinquante protocoles de trois animaux, ils reçoivent une injection sous-cutanée d'antigène couplé à l'adjuvant complet de Freund puis trois prélèvements de sang, avant mise à mort à dix jours, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur reconnaît que l'injection peut provoquer des ulcérations au point d'injection, de la fièvre et un inconfort. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est aussi efficace et présente la production sur animal vivant comme "indispensable", au service d'une activité commerciale répondant aux "besoins" des laboratoires.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole envisagé est particulier, car il vise à récupérer uniquement les anticorps générés lors d'une réponse primaire. Par conséquent, la procédure expérimentale est plus courte que des protocoles classiques d'obtention d'anticorps polyclonaux et ne nécessitera qu'une seule injection. Les anticorps seront récupérés à l'aide de prélèvement d'échantillons de sang, dont les volumes seront adaptés au poids de l'animal en suivant des recommandations. Le protocole durera 10 jours, ce qui est plus court que les protocoles classiques de 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation d’une subtsance médicamenteuse. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe. Afin de répondre aux besoins exprimés par différentes équipes de recherche, 50 protocoles sont envisagés.

Procédures

1 injection en sous cutanée de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) 3 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en sous-cutanée couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 2% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J10.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (3 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'acépromazine, qui possède un effet tranquilisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Infectées par un paludisme murin, elles subissent des prélèvements sanguins à la queue tous les deux jours pendant un mois, une injection de bleu Evans puis une dislocation cervicale sous anesthésie, pour tester comme antipaludiques des molécules déjà employées contre d'autres maladies. Le porteur indique qu'une parasitémie élevée peut entraîner une anémie, une perte de mobilité et une perte de poids, la souche étant retenue justement parce que ces souris resistent bien à ces parasitémies. Il affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit la complexité de l'infection et conclut à l'absence de "solution viable de remplacement".

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans un repositionnement médicamenteux. Il vise à déterminer l'efficacité de molécules initialement utilisées pour traiter la tuberculose, des fascioloses ou bien encore des helminthiases, en tant qu'antipaludiques. Lesdites molécules ont préalablement été testées in vitro et sont issues des dernières générations de molécules produites pour les infections précédemment mentionnées. Elles présentent un intérêt chimique car elles n'appartiennent à aucune des familles chimiques antipaludiques déjà utilisées. L’injection au niveau abdominale de bleu evans permet, 1H avant la mort des souris, de marquer les tissus ayant subi des dommages et de les quantifier. Ces tissus sont récupérés après l’euthanasie et soigneusement conservés dans du formamide.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus résident dans la confirmation des résultats in vitro. Une évaluation de la quantité de molécules candidates restantes dans le sang après injection totale est un point important de l'évaluation in vivo pour savoir si ces molécules sont plus ou moins éliminées pendant l'infection. Ce projet permettra de mettre en évidence l'efficacité de nouvelles molécules dans la thérapeutique antipaludique

Procédures

Un premier lot de 2 souris subit un prélèvement veineux à la queue - tous les 3 jours pendant 10 jours et à partir de 7% de parasitémie, une anesthésie et un prélèvement rétro orbitaire seront réalisés - la totalité du sang sera prélevé. Les souris seront euthanasiées (durée 30 minutes) et décapitées pour récupérer les cerveaux intacts. Un autre lot de 40 souris subiront des prélèvements veineux à la queue - tous les 2 jours à compter de J2 (post infection) pendant 30 jours accompagnés de pesée tous les 2 jours à compter de J1 (post infection) pendant 30 jours - Jour de l'euthanasie injection de bleu Evans en ip 50 µL à 50mg/kg, incubation 1h maximum puis anesthésie et dislocation cervicale permettant de collecter le cerveau, le sang et les autres organes. Cocktail kétamine xylasine pour des souris de 18g ; tel que : 100 mg/kg de Kétamine et 10 mg/kg de xylazine.

Impact sur les animaux

Les molécules évaluées sont des molécules qui ont déjà été testées sur des rongeurs ou lagomorphes pour la cytotoxicité et la reprotoxicité et ayant conduit à leur autorisation de mise sur le marché dans le cadre de traitement humain (sutézolide) et vétérinaire (triclabendazole). Les doses utilisées sont en dessous du seuil de toxicité décrits dans la littérature. L'infection par Plasmodium berghei conduit à la mort chez les BALB/c pour des parasitémies supérieures à 80% néanmoins le choix de ce modèle réside également sur le fait que ces souris résistent très bien à des parasitémies élevées en affichant un tableau clinique facile à suivre. Les nuisances correspondent à des contentions, des piqures au niveau de la queue pour prélèvement, des injections intrapéritonéales et l’injection de médicaments candidats pour l’expérience. Dans le modèle de paludisme murin, les souris auront des parasitémies qui à taux elevé (>75%) peuvent entrainer une anémie donc une perte de mobilité et une perte de poids transitoire

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées. L’euthanasie se justifie par le prélèvement de la totalité du sang infecté pour le premier lot de 2 souris - il est également justifié pour le second lot de 40 souris ce qui permet de récupérer rapidement les organes vitaux des souris et le sang pour dosage médicamenteux. Les souris ne peuvent plus être infectée en raison des restes de médicaments et de la prise de poids

Remplacement

Pour ce projet, il n’existe pas de solution viable de remplacement pour le moment. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques est justifiée par la complexité de la pathologie étudiée, le paludisme. Cette infection parasitaire touche les hématies et l’augmentation de la parasitémie entraine un tableau clinique complexe au niveau des différents organes en raison de l’anémie progressive et l’inflammation croissante liées à l’infection. Ces mécanismes ne peuvent pas être d’étudié dans des systèmes in vitro, ou des bioréacteurs élaborés.

Réduction

La réduction fait partie de notre stratégie d'étude. Elle repose sur une étude bibliographique pour connaitre les dernières études pharmacologiques et antipaludiques en paludisme simple. Le calcul du nombre de sujets dans des groupes de même effectif est donné par une formule mathématique, pour mettre en évidence une différence statistiquement significative entre les deux groupes avec un risque de première espèce alpha égal à 5% et une puissance de 80% Nous prenons 8 souris, tq 4 mâles + 4 femelles par groupe afin de prévenir toute perte d'effectif qui rendrait statistiquement nulle l'expérience.

Raffinement

Le bien-être des animaux est un point important dans notre projet puisqu’ il est évalué dans notre grille de score. Des abris, des éléments à ronger seront fournis (enrichissement), et la présence de nids réalisés par les souris est vérifiée tout comme leur capacité de fouissement (expression du caractère naturel de l’animal). Les animaux seront hébergés en conditions standard d’animalerie, avec de l’eau et de la nourriture ad libitum. Ils bénéficieront d’une période de stabulation de 5 jours post livraison dans l’animalerie de l’Etablissement utilisateur, puis d’une période de 7 jours pendant laquelle les animaux seront familiarisés quotidiennement à la manipulation par les expérimentateurs. Entre la livraison et l’expérience, les animaux seront placés dans des cages garantissant la surface réglementaire pour chaque souris. Les éventuels signes de souffrance seront systématiquement recherchés et évalués. La Kétamine (100 mg/Kg) et la Xylazine (10 mg/Kg) avec une injection de 100µL pour 20 grammes de masse corporelle seront utilisés afin de limiter la douleur, notamment pour le retro orbitaire (procédure 1) et les anesthésies avant dislocations cérébrales en fin de procédure 2. De façon générale, Des aiguilles plus fines 29 gauge pourront être utilisées en complément d’une pommade (lidocaine) si les sites d’injection en intrapéritonéal deviennent sensibles pour les souris. En cas de difficulté d'alimentation des croquettes imbibées et des biberons aux tétines plus faciles d'accès peuvent etre également mis en place.

Choix des espèces

Le modèle murin (Mus muculus) est choisi car il est un support idéal pour l'infection par Plasmodium berghei. Il permet l'étude d'un paludisme proche de celui de l'Homme. Il est d'autant plus pertinent car la souche de paludisme murine a un cycle plus rapide que celle infectant l'Homme. Cette caractéristique est très utile dans une étude d'efficacité antipaludique ou pharmacologique pour confronter l'activité antipaludique d'un candidat face un parasite se multipliant rapidement. Nous retenons les souris BALB/C pour cette étude en raison de leur capacité à résister à des parasitémies élevées (entre 60 à 70%) et afficher un tableau clinique facile à suivre. la simplicité et l'efficacité du modèle {BALB/c+Plasmodium berghei} en font un support pertinent pour notre étude d'efficacité antipaludique.

6 000 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'antigènes, parfois avec adjuvant, et des prélèvements de sang pouvant aller jusqu'à quatre par jour, pour produire des anticorps destinés à des tests de diagnostic et des médicaments. Hébergés seuls alors que l'espèce est sociale, ils sont tués en fin de protocole, un prélèvement de sang final important rendant leur maintien en vie impossible selon le porteur. Celui-ci reconnaît que la production d'anticorps in vitro existe mais affirme qu'une immunisation in vivo reste "nécessaire" dans certains cas.

Objectifs

L’objectif des protocoles d’immunisations sont utilisés à des fins scientifiques et médicales. Les applications pour leur utilisation peuvent être diverses comme par exemple : Fabrication de tests de diagnostic permettant la détection de maladies en médecine humaine, Préparation de médicaments pour usage en médecine humaine (médicaments biologiques), Applications diverses en recherche et développement.

Bénéfices attendus

Ces études d’immunisation sont utilisées à des fins scientifiques et médicales. Ces études sont bénéfiques pour les patients à court terme (e.g. fabrication de tests de diagnostic de type ELISA) et à moyen/long terme (eg. Phase de recherche et développement pour la mise à disposition de médicaments biologiques).

Procédures

Tous les animaux rentrant dans une étude d’immunisation peuvent être soumis à des injections d’antigène et des prélèvements sanguins répétés. Concernant les injections, les volumes maximum sont de 2 mL répartis sur 4 à 8 sites maximum pour la voie sous-cutanée, 0.5 mL sur 4 sites maximum pour la voie intra-musculaire, 5 mL/kg pour la voie intraveineuse, 2mL sur 40 sites maximum pour la voie intra dermique. La durée d’injection est d’une dizaine de secondes à 5 minutes selon la voie. Le nombre d’injections dépend de la voie d’injection et du protocole du scientifique mais seront au maximum espacés d’un à deux jours sur une durée totale d’un mois. En cas de durée supérieure à un mois, la structure en charge du bien-être animal sera contactée pour évaluer le bénéfice / risque. Concernant les prélèvements, les animaux peuvent être soumis à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale de 5 minutes. Tous les animaux rentrant dans une étude d’immunisation peuvent être soumis à une anesthésie générale par injection d’un anesthésique par voie intraveineuse ou à une anesthésie locale répétée par application d’une pommade anesthésiante. Une pesée hebdomadaire d’une durée inférieure à 5 minutes est réalisée jusqu’à une fois par jour selon le protocole et l’état clinique de l’animal.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour les animaux utilisés dans le cadre de ces études sont : douleur, stress, perte de poids et inflammation localisée au site d’injection liés à des injections répétées d’antigènes (+/- adjuvés), douleur, stress, perte de poids et saignements et/ou inflammations localisés aux sites de prélèvements liés aux prélèvements sanguins répétés, la contention de l’animal d’une manière générale qui peut amener à du stress chez l’animal.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Il est en effet impossible de : réutiliser ces lapins dans le cadre d’un autre protocole d’immunisation, réutiliser ces lapins dans le cadre d’un autre projet effectué par l’établissement utilisateur. Lors du prélèvement final de la procédure, un volume significatif de sang est récupéré et cela rend incompatible la réutilisation de l’animal.

Remplacement

La production d’anticorps par méthode in-vitro exclusive comporte des avantages mais dans certains cas (exemples :besoin de concentration en anticorps élevée, glucosylation appropriée, affinité des anticorps spécifique…), une immunisation de type in-vivo reste encore nécessaire de nos jours. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Réduction

Également, à travers les années d’expertises gagnées par l’établissement utilisateur, il n’est pas nécessaire de commander plus d’animaux que demandés par le scientifique pour réaliser le projet. Si une exception à cela devait avoir lieu, une revue par les membres de la SBEA serait nécessaire avant d’initier le projet. Avec l’expérience acquise, le nombre d’animaux prévu dans ce projet est diminué de l’ordre de 20% par rapport au projet précédant. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Raffinement

Les lapins sont hébergés individuellement en gardant un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. De l’enrichissement est mis à leur disposition (balles de cellulose et/ou foin, anneau en plastique, mousqueton…) Un cycle jour nuit est présent en zone d’expérimentation (12h/12h). Les animaux sont observés de manière quotidienne par du personnel formé et compétent et pesés toutes les semaines. Durant cette pesée, un examen approfondi de l’état clinique des lapins est effectué par le technicien (e.g. : vérification des points d’injection, maux de patte éventuels, dentition…). Également, durant ce processus, des caresses aux animaux sont prodiguées. Des points limites intermédiaires associés à des actions spécifiques et des points limites terminaux sont en place. Par exemple, en cas de perte de poids ≥ 20% sur une semaine, une nourriture appétante est proposée à l’animal. Également, en cas d’apparition de certains signes cliniques (exemples : masses sans douleur pour l’animal, abcès sans lésion, fécalome) des protocoles de soins validés par un vétérinaire sont prodigués aux animaux. Certains gestes douloureux (injections intra-dermique) sont réalisés sous anesthésie générale et les injections répétées sont effectuées après application d’un anesthésiant local (lidocaïne). En cas de prélèvements sanguins, les volumes prélevés ainsi que les périodes de récupération suivront la réglementation, les recommandations de la «Federation of European Laboratory Animal Science Associations » (FELASA) ainsi que les raffinements et bonnes pratiques internes. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisées que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. A chaque abord d’une voie vasculaire, un point de compression sera effectué le temps suffisant pour assurer l’arrêt du saignement. Une observation de l'animal sera réalisée au retour dans sa cage pour s’assurer de sa récupération immédiate. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Choix des espèces

Le lapin est l'animal le plus utilisé pour la production d’anticorps étant l’espèce animale la plus adaptée pour cela, de par la production de volumes suffisants d'antisérum qualitatif et à titre élevé. Cela permet donc d’utiliser moins d’animaux pour l’objectif scientifique requis. Age minimum des lapins : 10 semaines. A cet âge, les lapins ont un système immunitaire permettant la réalisation des études de type immunisation.

96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le parasite de la leishmaniose est injecté dans l'oreille, puis les lésions sont suivies pendant plusieurs mois, le porteur indiquant que des ulcérations peuvent se développer et durer jusqu'à douze semaines. Il étudie le rôle d'un récepteur immunitaire dans cette maladie et situe le bénéfice, une thérapie, à long terme. Il affirme que les mécanismes inflammatoires ne peuvent être étudiés de façon intégrée que dans un organisme entier.

Objectifs

Les leishmanioses sont des pathologies causées par le parasite leishmania qui font de plus en plus de ravages autour du monde. Aujourd’hui plus d’un milliard de personnes vivent dans des zones endémiques et peuvent donc contracter le parasite et développer la maladie. Les manifestations cliniques des leishmanioses cutanées chez l’homme peuvent varier de nodules, pustules, ulcères, jusqu’à atteindre des défigurations au niveau du visage et parties externes du corps. La nature de la réponse immunitaire dans la physiopathologie des leishmanioses cutanées joue un grand rôle dans la résolution ou la persistance de la maladie. La reconnaissance du pathogène par le système immunitaire se fait grâce à des recepteurs présents sur les cellules immunitaires. L’objectif principal de notre projet est d’étudier l’interaction du parasite avec un récepteur immunitaire pour comprendre le rôle que joue ce dernier dans cette pathologie et suivre la réponse immunitaire qui peut en résulter.

Bénéfices attendus

Les leishmanioses cutanées peuvent être contractées par l’homme de tout âge, comme par l’animale. Plusieurs tentatives ont été faites pour développer des traitements efficaces mais à ce jour il n’existe pas de traitement effectif pour cette pathologie. Il devient donc de plus en plus urgent de se pencher sur cette pathologie car cette dernière risquerait de se propager rapidement dans les prochaines années. Cela serait dû à plusieurs facteurs dont le réchauffement climatique. L’objectif à long terme est de développer une thérapie efficace en ciblant des récepteurs présents sur des cellules immunitaires afin de réduire et limiter ainsi l’invasion parasitaire.

Procédures

-1 Injection dans l'oreille pendant 15 secondes -Suivi hebdomadaire de l'évolution des lésions pendant 15 mois

Impact sur les animaux

Suite à l’injection de parasites, les souris peuvent présenter une douleur modérée, une inflammation localisée au site de l’injection. Par la suite, des ulcérations peuvent se développer à partir de la semaine 2-3 et peuvent durer jusqu’à 12 semaines. La manipulation de souris pour le suivie s’effectuera à partir du moment de l’injection jusqu’à la semaine 20 post injection.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocol expérimental afin de réaliser diverses prélèvements (tissus, sang, organes...)

Remplacement

Ce projet s’intéresse à la compréhension du rôle du récepteur CD32a dans la réponse inflammatoire dans le cas des leishmanioses cutanées. La pathologie étant cutanée, le développement de lésion est le symptôme dominant observé dans cette pathologie. Ainsi, les mécanismes physiologiques et immunologiques complexes aboutissant à cette inflammation ne peuvent être étudiés de façon intégrée que dans un contexte d’organisme entier, dans des modèles in vivo.

Réduction

Un total de 96 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet permettant de réaliser 3 études de 6 groupes (groupes contrôles et groupes infectés) avec 6 animaux par groupe (pour les groupes infectés) et 4animaus (pour les groupes contrôles) sur une durée de 2 ans. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus.

Raffinement

Les souris seront hébergées en cages ventilées, par groupe social stable de 5. La nourriture, et l’eau de boisson seront fournies. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être ainsi que de l'enrichissement (batonnet de bois, coton, maison en cellulose). Au moment de leur entrée, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation (une semaine) et seront habituées à la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière-obscurité (12h – 12h), d’une température (20 - 24°C). Les souris seront surveillées tous les jours pour vérifier l’absence de souffrance. Toutes les injections sont réalisées sur animaux sous anesthésie gazeuse général et avec un analgésique. Les injections sous la peau seront réalisées avec grand soin pour éviter d’atteindre le muscle. On a mis en place une fiche de scoring comme point limite fafin de prendre en charge l’animal au cas où il y a atteinte à son bien-être et pour éviter la souffrance animal.

Choix des espèces

Deux modèles murins sont choisis pour étudier le rôle du récepteur, des souris sauvages qui n’expriment pas le récepteur et une lignée transgénique de souris exprimant ce récepteur. La souris adulte, agée entre 6 et 8 semaines, est le modèle le plus utilisé dans l'étude de la leishmaniose cutanée puisque c'est un mammifère et qu'il est aussi bien connu. En plus de cela, le comportement de la souris est bien étudié ce qui nous permet de lui administrer les soins nécessaires pour limiter et réduire sa douleur.

2 530 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une septicémie provoquée par ligature et perforation du caecum, un modèle que le porteur reconnaît induire une mortalité élevée, avant injection de cellules stromales dans la cavité péritonéale. Les souris sont réparties par âge, jusqu'à deux ans, pour évaluer l'effet du traitement au cours du vieillissement. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de confirmer in vivo des effets déjà montrés in vitro et qu'une étude chez la souris est "nécessaire".

Objectifs

L'objectif du projet est de mettre en évidence l'effet de différentes populations de cellules stromales sur la résolution d'une septicémie induit après une péritonite au cours du vieillissement et de comprendre les mécanismes d'action des différentes populations cellulaires.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mettre en évidence l’effet des cellules stromales mésenchymateuses "naives" ou primées sur l’inflammation et la résolution d'une septicémie induite après une péritonite et d’étudier l’intérêt de ce traitement au cours du vieillissement. En effet, nous espérons que les cellules stromales mesenchymateuses diminueront l’inflammation induite par la péritonite augmentant ainsi la survie des animaux. De plus, notre étude nous permettra de mieux comprendre le mode d'action des différentes populations de cellules stromales mesenchymateuses et de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de péritonite.

Procédures

La péritonite est induite chez certains animaux par ligature et ponction du caecum. Les souris sont endormies par inhalation d’un gaz et maintenues endormies sous masque sur une table chauffante pendant l’intervention et jusqu’à leur réveil. La profondeur de l’anesthésie est évaluée par l’absence de réponse à la stimulation des extrémités. Une incision cutanée au niveau de l’abdomen est réalisée puis l’ouverture de la cavité péritonéale est réalisée au ciseau. Le caecum est ligaturé et perforé à l’aide d’une aiguille. Après injection de différentes populations de cellules stromales mésenchymateuses dans la cavité péritonéale encore ouverte, la fermeture du péritoine en deux plans est réalisée. Réalisée par une personne entrainée, la chirurgie dure entre 7 et 10 min. Avant l'intervention, un analgésique est injecté sur animaux endormis Pour les animaux chez qui la péritonite sera induite par injection de composés protéiques, les animaux auront 2 injections intrapéritonéales l’une contenant le composés protéiques l’autres les cellules thérapeutiques. Avant l'intervention, une injection sous cutané d’analgésique est réalisée sur animaux vigiles. L'injection d'analgésique sera répétée toutes les 12 heures pendant 3 jours

Impact sur les animaux

Le modèle de péritonite induit par ligature et ponction ceacale est un modèle qui induit une mortalité assez élevée chez les animaux opérés. La douleur induite par la chirurgie et par l'induction de la péritonite est gérée par administration d'analgésiques.

Devenir

Tous les animaux suivant ces différents protocoles seront mis à mort afin de permettre l'analyse de l'effet des différents traitements sur la réponse immunitaire, l'inflammation générale et les lésions des différents organes de la cavité péritonéale.

Remplacement

L'effet immunomodulateur des différentes populations de cellules stromales mesenchymateuses a été démontré in vitro mais il est indispensable de confirmer ces résultats in vivo, en ayant une vraie situation d’inflammation mettant en jeu l’ensemble des partenaires cellulaires qui interviennent lors de l’inflammation. Une étude chez la souris s’avère donc nécessaire.

Réduction

Notre expérience nous permet de déterminer que le nombre de 5 souris par groupe et la réalisation en triplicat de l'expérience nous permettra d'évaluer l'effet de nos différentes populations cellulaires et de diminuer ainsi le nombre d'animaux utilisés. Nous inclurons suffisamment de souris par groupe et effectuerons trois expériences indépendantes pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. L’expérience de notre laboratoire nous permet de déterminer le nombre optimal de souris à utiliser par lot.

Raffinement

Les animaux sont anesthésiés sous gaz et maintenues endormies sous masque sur une table chauffante pendant l’intervention et jusqu’à leur réveil. Un antalgique est placé dans l'eau de boisson des animaux 24h avant l'intervention puis de manière continue après la chirurgie. Vu la stabilité de la molécule, le biberon sera changé tous les jours. De plus, une injection d’un analgésique sera effectuée au moment de la chirurgie sur animaux endormis afin de diminuer la douleur. Cette injection sera répétée toutes les 12 heures pendant 3 jours. Les animaux seront élevés à 5 animaux par cage) afin de limiter le stress lié à la chirurgie et à l'isolement. Du papier type kleenex ainsi que des cabanes type "igloo" seront ajoutés dans la cage afin de respectivement permettre la formation du nid et d’enrichir l’environnement de vie des animaux. Des croquettes imbibées d'eau contenant un analgésique seront placées directement dans la cage afin de limiter au maximum l'extension des animaux opérés. De plus, une grille de score et l’utilisation de point limite adaptés permettront de définir les critères d’arrêt de souffrance et d'entraîner la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

La souris est un modèle complexe qui nous permettra d'évaluer l'effet de nos cellules d'intérêt sur la réponse inflammatoire locale mais également en systèmique. De plus, le modèle de sepsis chez la souris est très bien décrit nous donnant des informations essentielles au bon déroulement de notre procédure. Enfin, les outils techniques et biochimiques nécessaires à l'analyse des données obtenues sont développées chez cette espèce. Les personnes âgées présentent un risque accru de mortalité lors d’une évolution négative d’une péritonite. L'utilisation d'animaux à différents âges (8 semaines, 1 an, 2 ans) nous permettra d'évaluer l'intérêt d'utiliser les différentes populations de cellules stromales mesenchymateuses comme traitement d'un sepsis induit après péritonite au cours du vieillissement.