Maladies infectieuses

103 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une infection pulmonaire à Pseudomonas aeruginosa par instillation intranasale sous anesthésie, avec une surmortalité d'environ 20 % attendue, avant euthanasie pour mesurer la charge bactérienne et la réaction immunitaire. Le porteur cherche à savoir si une enzyme bactérienne peut servir de cible thérapeutique face à l'antibiorésistance. Le développement d'inhibiteurs et de nouvelles thérapies est renvoyé au long terme.

Objectifs

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie de l’environnement induisant des infections respiratoires chez les sujets fragilisés comme ceux se trouvant en réanimation, ceux atteints de broncho-pneumopathie chronique obstructive ou encore ceux atteints de mucoviscidose. L’émergence de souches de P. aeruginosa de plus en plus résistantes aux antibiotiques est observée partout dans le monde. La resistance aux antibiotiques est un problème car cela risque d’entraîner des impasses thérapeutiques pour les patients. L’objectif est d’étudier si une enzyme protégeant P. aeruginosa contre la défense de l’hôte peut servir de cible thérapeutique alternative ou adjuvante aux antibiotiques pour traiter les infections à P. aeruginosa résistant aux antibiotiques : ce projet scientifique a pour objectif (i) de déterminant les charges bactériennes dans les poumons infectés par les bactéries hyperexprimant ou non la proteine, (ii) d’étudier l’impact de l’infection sur la destruction de l’architecture du poumon et sur la réaction immunitaire.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet nous permettra de caractériser plus précisement la virulence accrue au niveau pulmonaire induite par l’enzyme d’intérêt chez la bactérie P. aeruginosa résistante aux antibiotiques utilisés couramment en médecine humaine. Cette caractérisation est indispensable pour affirmer l’implication de cette enzyme dans la différence de survie observée chez les souris dans nos travaux précédents et elle est nécessaire pour expliquer le mécanisme global de la virulence augmentée de ces souches. Cette enzyme participe à la virulence à la bactérie. Elle constitue donc une cible potentielle pour le développement à plus long terme de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les infections pulmonaires à P. aeruginosa résistants à de nombreux antibiotiques. Le développement d’inhibiteurs de cette enzyme peut être envisagé pour constituer une thérapeutique alternative et adjuvante aux antibiotiques en médecine humaine. Son inhibition pendant l’infection respiratoire permettrait de limiter la prolifération de P. aeruginosa en le rendant sensible à la réponse de l’hôte.

Procédures

Pour chaque animal, il sera réalisé : - Une infection respiratoire par instillation intra-nasale : geste réalisé sous anesthésie générale. - Une administration d’un antidouleur par injection intrapéritonéale à 6h post infection puis 1 fois par jour pendant 5 jours. - L’euthanasie post infection pour prélévement et analyse des poumons (étude charge bactérienne et réaction immunitaire).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sont ceux résultants de l’infection pulmonaire bactérienne. Il pourra être observé des signes d’infections respiratoires : dyspnée, mobilité réduite, dos vouté et poil hirissé. Une possible sur-mortalité d’environ 20% lors de l’instillation intranasale est également attendue.

Devenir

Les animaux seront mis à mort au cours ou à la fin de la procédure afin de réaliser le dénombrement de la charge bactérienne pulmonaire, les analyses d’histologie et cytologiques sur les prélèvements pulmonaires.

Remplacement

Ce projet requérant un modèle murin a été considéré après une étude in vitro préalable. En effet, la première partie de notre projet, qui a permis la mise en évidence de la virulence augmentée de la souche résistante aux antibiotique et le rôle d’une enzyme d’intérêt, a été réalisée sur un modèle in vitro d’épithélium respiratoire humain. Cependant, malgré son utilité, ce modèle reste très limité car il ne permet pas d’étudier la virulence bactérienne à l’échelle du poumon dans son ensemble et il ne prend pas en compte la réponse immunitaire globale de l’hôte vis-à-vis de P. aeruginosa. Au contraire, dans le modèle murin de pneumonie aiguë, la réponse globale de l’hôte au niveau pulmonaire est assurée et cette étape in vivo est essentielle à la validation du rôle la protéine d’intérêt dans l’infection à P. aeruginosa résistant aux antibiotiques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été déterminé pour répondre à l’objectif scientifique selon le nombre d’expériences prévues, les besoins en données selon les analyses statistiques envisagées et les données de la littérature. Une réflexion biostastistique a été réalisée afin d’éviter qu’une réduction trop drastique ne nuise à la fiabilité des résultats du projet. Les groupes ont donc été réduits à la taille minimum nécessaire à l’interprétation des résultats. Pour essayer de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous allons effectuer les expériences de manière séquentielle dont certaines ne seront réalisées qu’en fonction des résultats obtenus avec les premières.

Raffinement

Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien être de l’animal, plusieurs mesures seront réalisées : - l’anesthésie générale lors de l’instillation intra-nasale de l’inoculum bacterien, avec l’utilisation d’un dispositif chauffant lors de l’anesthésie des souris pour éviter l’hypothermie - une surveillance rapprochée pendant toute la durée de la procédure. Cette surveillance permet le suivi des animaux et la vérification des points limites, requérant l’euthanasie - l’administration d’un antidouleur à 6h post-infection puis 1 fois par jour jusqu’à la fin de la procédure pour limiter la douleur et la dyspnée chez l’animal - un enrichissement des cages et le regroupement des souris dans les cages pour préserver les interactions sociales.

Choix des espèces

La souris est une espèce pour laquelle de nombreux protocoles de pneumonie aiguë d’étiologie bactérienne ont été optimisés et validés. Le modèle murin utilise des souris adultes et permet d’étudier la pathogénicité bactérienne lors de l’infection pulmonaire aiguë (i) en établissant les courbes de survie (se basant sur l’atteinte des points limites), (ii) en réalisant des coupes histologiques pulmonaires et (iii) en déterminant la charge bactérienne infectante dans les poumons.

80 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent une injection de virus Ebola ou Nipah et des injections quotidiennes de molécules candidates, sous une douzaine d'anesthésies, pour évaluer l'efficacité antivirale de ces molécules. Le porteur indique que les hamsters témoins doivent développer les signes de l'infection, dont une perte de poids, des troubles respiratoires ou neurologiques et une possible mort. Il reconnaît l'existence de méthodes in vitro qu'il juge prometteuses mais trop localisées, et conclut à la nécessité du modèle animal.

Objectifs

Les virus Ebola (EBOV) et Nipah (NiV) sont des agents pathogènes viraux. Il n’existe pas, à l’heure actuelle, de contre-mesure efficace (vaccin, antiviraux, …) pour lutter contre les virus, à l’exception de quelques candidats vaccins dirigés contre le virus EBOV, utilisés en situation d’épidémies en Afrique. Ces virus peuvent être transmis par contamination interhumaine directe, et sont responsables de fièvres hémorragiques (EBOV) ou d’encéphalites sévères et/ou de syndromes respiratoires (NiV) chez l’humain, avec un taux de mortalité relativement élevé (jusqu’à 90% pour EBOV et 75% pour NiV, selon les souches et épidémies). Ces pathogènes constituent un problème de santé publique majeur, dont les maladies induites figurent sur la liste de l’Organisation Mondiale de la Santé des maladies prioritaires en matière de recherche et développement. L’émergence d’épidémies comme celle à virus Soudan ebolavirus actuellement observée en Ouganda souligne la nécéssité de disposer de moyens efficaces pour lutter contre ces virus. Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité antivirale de molécules préalablement sélectionnées in vitro, contre les virus EBOV et NiV.

Bénéfices attendus

Dans le contexte d’absence de traitement contre les virus Ebola et Nipah, le développement et l’évaluation de molécules antivirales permettraient d’identifier un ou plusieurs molécules à visée thérapeutique. Cette/ces molécule(s) pourront ensuite être potentiellement utilisées chez l’Homme en contexte de traitement chez les personnels de santé, les manipulateurs du virus ou la population à risque.

Procédures

La procédure expérimentale soumettra chacun des animaux, de la réception jusqu’à la fin du protocole à : des anesthésies gazeuses (au nombre de 12 prévues au protocole et d'une durée maximale de 10 minutes chacune), des administrations de molécules (10 injections, une par jour) et du virus (une injection unique) par voie intra-péritonéale (sur animal anesthésié), et enfin à mise à mort (animal anesthésié) pour réaliser les prélèvements de sang et des organes d’intérêt.

Impact sur les animaux

Les animaux contrôles devraient développer les signes cliniques caractéristiques d’une infection par le virus Nipah ou par le virus Ebola, tels qu’une perte de poids, une diminution de la locomotion et du toilettage, une perte de tonus ainsi que des troubles respiratoires et de potentiels signes neurologiques. Ces signes peuvent être accompagnés d’une mortalité avec peu de signes précurseurs : l’observation d'oreilles redressées, de troubles neurologiques et/ou respiratoires. Les animaux traités par une des molécules candidates devraient présenter moins ou pas de signes contrairement aux animaux non traités.

Devenir

L'étude implique que les organes puissent être prélevés sur l'ensemble des animaux (n=80) puis analysés, ceux-ci étant répartis en 4 groupes expérimentaux pour chacun des deux virus. Par conséquent, seule la mise à mort des 80 individus de l'étude permettra d'obtenir des données virologiques suffisantes permettant de comparer l'efficacité des molécules comme possible stratégie thérapeutique antivirale.

Remplacement

Il existe désormais plusieurs méthodes alternatives in vitro et ex vivo, dérivées de la culture cellulaire (classiquement utilisée depuis des décennies) ou de l’animal. Ces nouvelles technologies tendent à recréer artificiellement ou à maintenir les interactions inter cellulaires que nous pouvons retrouver dans un organisme. En revanche, ces cultures in vitro ou ex vivo permettent de se focaliser sur un organe mais pas sur un organisme vivant (système immunitaire circulant, flux sanguin, circulation lymphatique). Bien que très prometteuses, ces techniques restent très localisées et répondent à des problématiques assez ciblées. Afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de ces molécules, et suite aux divers tests in vitro, elles doivent désormais être testées dans un modèle plus complexe mimant l’infection par les virus Ebola et Nipah. Ces tests in vitro ne permettent pas actuellement de répondre à des questions globales telles que la mise en place de la malade et de ses symptômes, ou la mise en place des réactions immunitaires suite à une réponse à un traitement et à une épreuve virale.

Réduction

Concernant l’évaluation de thérapeutiques antivirales, en étudiant également l’effet de genre, nous avons déterminé l’effectif nécessaire comme étant de 10 hamsters par groupe expérimental, comportant chacun 5 mâles et 5 femelles. Nous nous sommes également basés sur les précédents projets réalisés par l’équipe et des collaborations de recherche à l’origine de ce projet. Les animaux inclus dans cette étude seront infectés par un stock déjà caractérisé à une dose permettant une observation de symptômes chez la totalité des individus.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par 2 ou 3 dans des cages adaptées au système d’hébergement. Chaque cage est équipée de litière (copeaux et rafle de maïs) et de matériel permettant la nidification (coton, mouchoirs, ...), ainsi que d’une maison/d’un abris en carton et d’une roue d’exercice. L’alimentation et la boisson sont en accès libre dans chaque cage. Les observations journalières seront réalisées afin d’évaluer l’état de chacun des animaux selon une matrice de score établie pour ce modèle, et selon le virus utilisé et les signes cliniques attendus. Un système de vidéosurveillance permettra de visualiser les animaux pendant les périodes où les membres de l’équipe ne seront pas présents en laboratoire.

Choix des espèces

Le hamster doré est le modèle de référence pour l’étude du virus Nipah. Il a été développé il y a quasiment 20 ans au laboratoire puis utilisé dans le cadre de divers projets collaboratifs. L’étude de ce modèle dans le contexte d’une infection par le virus Ebola sera réalisée par utilisation d’une souche de virus adaptée au hamster, développée par une des équipes collaboratrice lors de précédents projets de recherche (travaux non publiés). Les animaux seront âgés de 8 à 10 semaines selon la disponibilité. Ces âges correspondent aux stades de développement des hamsters utilisés par la communauté scientifique pour les études pré-cliniques portant sur les virus d’intérêt de ce projet.

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par le virus de l'encéphalite à tiques, par voie alimentaire ou sous-cutanée, l'infection pouvant provoquer des troubles neurologiques, une perte de poids et la mort. Le porteur cherche à mettre au point un modèle d'infection alimentaire, en lien avec des cas humains liés à des fromages au lait cru, et double l'effectif "afin de répliquer l'expérience si nécessaire". Il affirme que l'étude "ne peut se faire que sur un modèle animal" et qu'il n'existe pas d'alternative.

Objectifs

Le virus de l’encéphalite à tiques (TBEV) est un virus transmis principalement par la tique. TBEV est retrouvé en Europe et en Asie. Il existe une autre voie de contamination par TBEV : ingestion de produits laitiers non pasteurisés. Il est responsable, chez l’Homme, de l’encéphalite à tiques (TBE), une infection du système nerveux grave dont le taux de mortalité est d'environ 1 % et qui entraîne des séquelles graves chez 10 à 30 % des patients. Le nombre de cas de TBE en France est en constante augmentation depuis quelques années, avec notamment les premiers foyers dus à des fromages frais de chèvre contaminés survenus en 2020 (44 cas) et 2021(2 cas). L’infection par la piqûre de tique a été très étudiée et des modèles animaux d’infection sont déjà bien établis. Cependant, un manque de connaissances est observé sur l’ensemble des facteurs conduisant à l’apparition d’encéphalites suite à la consommation de produits laitiers crus contaminés. L’objectif global de notre projet est de mettre en place un modèle animal d’infection pour TBEV par la voie alimentaire dans le but d’identifier les facteurs pouvant influencer le pouvoir infectieux de TBEV lors d’une infection à la suite d’une ingestion de produits laitiers contaminés. Pour la mise en place de ce modèle d’infection, il est d’abord nécéssaire d’identifier la souche de souris qui répondra au mieux à nos interrogations (reproduire la maladie observée chez l’Homme). Pour aller plus loin, nous suivrons ensuite la progression au sein des tissus du virus à la suite d’une ingestion et nous comparerons cette progression avec celle observée à la suite d’une piqûre de tique. En effet, il a été observé que les symptômes neurologiques apparaissaient plus tôt lors d’une infection par la voie alimentaire et nous tenterons d’expliquer la raison en testant différentes hypothèses. Parmis les différentes hypothèses, l’implication de la flore intestinale de l’hôte et des composants chimiques et biochimiques des produits laitiers dans la virulence de TBEV est à investiguer.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de combler un manque de connaissances sur les facteurs impliqués dans l’apparition plus précoce d’encéphalites suite à l’ingestion de produits laitiers crus contaminés. Il permettra la mise en place d’un modèle animal d’infection pour TBEV par la voie alimentaire et d’investiguer le rôle de la flore intestinale et des composants chimiques et biologiques des produits laitiers dans la virulence de TBEV. Ce projet apportera des données permettant une prise de décision et l’instauration de mesures de prévention dans le cadre de la réglementation alimentaire sanitaire.

Procédures

Les souris seront infectées soit par la voie sous-cutanée soit par la voie alimentaire. Pour cela une contention de quelques secondes sera nécessaire (environ 30 secondes). Des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris vigiles par des personnes formées à cette pratique. Le prélèvement sanguin ne dure que quelques secondes – manipulation de 30 secondes à 1 minute).

Impact sur les animaux

Les souris « contrôles positifs d’infection » peuvent ressentir de la douleur lors de l’injection du virus par la voie sous-cutanée. Un stress peut être induit lors de l’administration per os (contention). Les souris sont sensibles à l’infection par TBEV. Les signes cliniques décrits sont l’apparition de signes neurologiques (troubles de l’équilibre, motricité…), la perte de poids, l’inactivité et la mort. Les animaux seront contrôlés tous les jours.

Devenir

Dans le cadre de nos interrogations (multiplication et progression de TBEV dans les tissus,…), nous avons besoin, pour nos analyses, des organes des souris nécessitant la mise à mort de tous les animaux.

Remplacement

L’étude de l’infection de TBEV à la suite d’une contamination par la voie alimentaire ne peut se faire que sur un modèle animal. Il n’existe pas de modèle alternatif.

Réduction

Un total de 640 souris sera utilisé pour cette étude. L’infection expérimentale de souris par la voie alimentaire avec TBEV a très peu été étudiée (2 études jusqu’à ce jour), le nombre de souris a été doublé afin de nous permettre de répliquer l’expérience si nécessaire et de pouvoir faire face à tout aléa. Le nombre de souris par groupe est un compromis pour utiliser le moins de souris possible tout en ayant assez pour avoir des résultats robustes statistiquement.

Raffinement

Les souris seront plusieurs par cage (5/cage) avec un enrichissement de leur milieu (petite cabane, papier,..). Au cours de l’expérimentation, une surveillance quotidienne des souris sera mise en place. Un point limite adapté pour l’infection expérimentale de souris par TBEV a été défini.

Choix des espèces

Les souris (comparativement à d’autres modèles animaux) sont sensibles à l’infection par le virus de l’encéphalite à tiques (TBEV). Les rongeurs sont notamment impliqués dans le cycle de transmission naturel de TBEV. Les souris représentent donc le modèle idéal en laboratoire. Les souris auront entre 8 et 12 semaines afin d’avoir un système immunitaire mature et d’être assez grosses pour permettre des prélèvements sanguins sans altération de leur état de santé.

36 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent un implant de télémétrie par chirurgie, une dizaine d'anesthésies et des injections vaccinales, puis une infection par des arénavirus responsables de fièvres hémorragiques, les animaux non vaccinés devant développer perte de poids, fièvre et signes hémorragiques avant la mort ou la mise à mort. Le projet teste un candidat vaccin multivalent, avec des points limites déclarés comme l'hypothermie, le coma ou une perte de poids excessive. Le porteur affirme que ces études précliniques sont "indispensables" et "nécessitent obligatoirement des organismes entiers", le modèle macaque reproduisant selon lui le tableau clinique humain.

Objectifs

Les arénavirus du Nouveau Monde sont nombreux mais plusieurs d’entre eux sont à l’origine de fièvres hémorragiques comme les virus Guanarito, Machupo, Sabia, Chapare et Junin. Un vaccin existe seulement pour ce dernier alors que les autres virus sont aussi responsables d’émergences avec un taux de mortalité élevé (jusqu’à 30%). Le vaccin a déjà prouvé son efficacité en protégeant des macaques cynomolgus contre les virus Machupo et Guanarito. Il reste à prouver son efficacité contre les autres arénavirus du Nouveau Monde pour valider la protection contre tous les arénavirus très pathogènes d’Amérique du Sud ainsi que contre un arénavirus non-inclus dans la composition du vaccin (virus Whitewater Arroyo) pour étudier la capacité de protection croisée. L’objectif de ce projet est de démontrer chez le primate non-humain le potentiel de protection contre les cinq arénavirus pathogènes circulant en Amérique du Sud ainsi que sa capacité à protéger contre un nouvel arénavirus du Nouveau Monde non inclus dans sa formulation. Pour cela, nous allons injecter des doses vaccinales à des macaques cynomolgus. Le projet vise donc à : - Montrer la protection acquise grâce au vaccin contre tous les arénavirus pathogènes d’Amérique du Sud - Etudier le niveau et les mécanismes de protection - Tester la protection à court et à long terme du vaccin.

Bénéfices attendus

Un tel vaccin multivalent pourrait permettre de proposer une stratégie vaccinale contre tous les arénavirus du Nouveau Monde et ainsi être préparé pour lutter contre l’émergence possible de l’un de ces virus à fort potentiel épidémique. En effet, étant donné la faible fréquence des épidémies occasionnées par chacun de ces virus et le faible nombre de cas impliqués, il n’est pas raisonnable de développer des vaccins individuels contre chacun d’entre eux. La seule méthode rationnelle et pragmatique qui permet d’envisager le développement industriel d’un tel vaccin est de proposer un candidat qui permettrait de protéger contre l’ensemble des fièvres hémorragiques causées par les arénavirus en Amérique du Sud. De plus, le large spectre de ce vaccin pourrait conférer une protection contre d’éventuels arénavirus émergents, étant donné les protections croisées attendues. Si l’efficacité de ce vaccin est prouvée contre les virus d’intérêt chez le macaque cynomolgus, les études réglementaires pour la mise sur le marché de ce candidat vaccin pourront être réalisées.

Procédures

La procédure expérimentale soumettra les animaux à des anesthésies (au nombre de 10 prévues dans la procédure expérimentale, du jour de la réception jusqu’au jour de la mise à mort, et d'une durée de 1h à 2h selon les individus), à des injections (une unique injection par voie sous-cutanée le jour du challenge et une injection par voie intra-musculaire le jour de la vaccination pour les groupes concernés) et à des prélèvements salivaires, nasaux et sanguins sur animaux anesthésiés (9 sessions de prélèvements prévues dans cette procédure expérimentale, sessions d'une durée d'environ 15 minutes par animal). Lors de l'atteinte de point limite ou de la fin du protocole, les animaux seront anesthésiés, puis des prélèvements (sang, moelle osseuse) ainsi que la mise à mort puis des prélèvements autres (liquide céphalo-rachidien, humeur vitrée, organes) seront réalisés. Pour les animaux ne présentant pas de point limite ni de score limite atteint, la procédure s'achèvera donc entre 28 et 30 jours post-infection. La durée de la procédure pour les survivants sera donc de 10 jours d’acclimatation puis de 30 jours au maximum de protocole.

Impact sur les animaux

Tous les animaux du projet auront subi une chirurgie d’implantation des dispositifs de télémétrie avant les étapes d’injection du vaccin. Un suivi de la cicatrisation sera réalisé par un contrôle journalier et des soins seront administrés si nécessaire. Dans chacune des expérimentations suivant ces deux procédures, les animaux seront impliqués dont des animaux vaccinés et des animaux non vaccinés. Aucun effet n’est attendu pour les animaux vaccinés hormis les possibles signes cliniques que peut induire un vaccin à court terme (fièvre). En effet, nous avons précédemment montré la protection du vaccin contre les virus Machupo et Guanarito. Nous attendons le même niveau de protection contre les virus Chapare, Sabia et Junin qui sont aussi inclus dans la composition du vaccin. Pour le virus Whitewater Arroyo, nous testons une protection croisée, donc la protection totale est moins certaine. Les animaux contrôles non-vaccinés devraient présenter les symptômes décrits chez les humains suite à l’infection par ces virus. Nous nous attendons donc à observer des symptômes une perte de tonus, une perte de poids, une fièvre et l’observation de signes hémorragiques éventuels. Les procédures incluent des prélèvements répétés, réalisés (sous anesthésie) selon des volumes et une fréquence conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Cela pourrait entraîner un inconfort, une diminution de l’alimentation et une fatigue temporaire lors du réveil.

Devenir

L'étude implique que les organes et les tissus puissent être prélevés sur l'ensemble des animaux de l'étude (n=36), ceux-ci étant répartis en divers groupes infectés et vaccinés. Par conséquent, seule la mise à mort des 36 animaux de l'étude permettra d'obtenir des données statistiquement robustes.

Remplacement

Il existe désormais plusieurs méthodes alternatives in vitro, dérivées de la culture cellulaire (classiquement utilisée depuis des décennies). Ces nouvelles technologies tendent à recréer artificiellement les interactions inter cellulaires que nous pouvons retrouver dans un organisme. Bien que très prometteuses, ces techniques restent très localisées et répondent à des problématiques assez ciblées. Le vaccin utilisé ici a d’abord fait l’objet de caractérisation in vitro. La réponse immune induite a été testée et une forte réponse a été observée. Dans le cas des fièvres hémorragiques virales dont font partie les fièvres hémorragiques induites par les arenavirus, il est impossible de remplacer les modèles animaux afin de réaliser des études sur la physiopathogénèse et les réponses immunitaires dans leur ensemble. Ce projet vise donc à démontrer l’efficacité d’un candidat vaccin contre l’infection, ce qui nécessite obligatoirement des organismes entiers. De plus, cela s’inscrit dans des études précliniques, indispensables au développement d’un candidat vaccin.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit autant que possible pour obtenir des résultats interprétables et statistiquement pertinents. En effet, un effectif de trois animaux par groupe représente le minimum absolu permettant des résultats statistiquement significatifs. Au-delà de la survie, les groupes seront comparés en fonction des valeurs de score au cours de la maladie, des valeurs des paramètres biochimiques, virologiques et autres paramètres physiologiques. Les tests statistiques ne pourront pas être tous hautement significatifs, cependant, la multiplicité des paramètres évalués permet de démontrer de manière fiable les résultats obtenus. Les précédentes études basées sur des expérimentations utilisant des groupes expérimentaux de 3 animaux ont permis d’obtenir des données et résultats significatifs montrant que la présence ou absence de virémie est un critère essentiel.

Raffinement

Malgré les conditions de confinement, les conditions réglementaires d’hébergement sont appliquées. Afin d’assurer au mieux le bien-être des animaux, ils seront hébergés en volière par groupes de 3 dans un milieu enrichi avec des dispositifs permettant aux animaux de mettre en avant le plus possible un comportement naturel (perchoir, jeu, diversification alimentaire…). Un scoring quotidien sera réalisé dès le jour de l’infection, et des points limites ont été définis à l’avance (hypothermie, coma post anesthésie, perte de poids excessive). Cela permettra de mettre fin à la procédure expérimentale pour les animaux qui atteindraient l’un des points limites fixés ou un score limite. Par ailleurs, l’enregistrement permanent de la température grâce à des systèmes implantés permet une meilleure analyse de la maladie induite. Malgré une chirurgie pour la mise en place de cet implant, le fait d’équiper les animaux avec un tel dispositif représente un raffinement en tant que mesure non invasive et paramètre de surveillance dans le cadre des points limites. Les animaux sont également visibles de l’extérieur du laboratoire grâce aux caméras permettant ainsi un contrôle visuel en dehors des horaires de présence du personnel dans le laboratoire. En cas de doute sur l’état d’un ou plusieurs animaux, une entrée en laboratoire sera programmée immédiatement pour procéder à une observation en zone et à une possible décision.

Choix des espèces

Il n'existe pas de bon modèle rongeur pour la fièvre de Lassa, l’arénavirus responsable de fièvre hémorragique le plus étudié à ce jour. Les cobayes et des souris génétiquement modifiées peuvent présenter une susceptibilité plus ou moins prononcée mais ces modèles ne reproduisent qu'en partie la maladie et les réponses immunitaires qui ont lieu chez l'Homme. Nos précédentes expérimentations réalisées avec les virus Machupo et Guanarito ont abouti à une infection létale pour tous les cynomolgus infectés par Machupo et les 3 animaux contrôles infectés par Guanarito ont présenté une pathologie sévère bien qu’un seul d’entre eux n’ait atteint le point limite d’expérimentation en cours de protocole. Les symptômes observés reproduisent bien le tableau clinique décrit chez l’Homme, le modèle cynomolgus est donc le plus adapté pour étudier la maladie et la protection par le vaccin. Ce projet ne nécessite pas d'exigences particulières concernant le stade de développement des animaux utilisés hormis le fait de former des groupes homogènes en âge et poids pour pouvoir analyser les résultats sans biais. Les animaux utilisés seront des juvéniles sevrés d’au moins 12 mois et de moins de 3 ans.