Maladies infectieuses

49 lapines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent la pose d'un capteur télémétrique sous anesthésie, un tatouage, trois injections vaccinales et onze prélèvements de sang, deux groupes recevant des doses d'antigène plus élevées pouvant provoquer une réaction inflammatoire ou toxique plus forte. Toutes seront mises à mort au 84e jour pour analyse du site d'injection et récupération d'anticorps. Le porteur teste un vaccin contre Clostridioides difficile et indique que cette étude sur un "non-rongeur" est requise pour le dossier réglementaire de mise sur le marché.

Objectifs

Clostridioides difficile est une bactérie non pathogène, présente dans la flore intestinale. Elle est le principal agent étiologique de la diarrhée nosocomiale chez les patients sous antibiothérapie, des personnes immunodéficientes et les nouveau-nés. C. difficile se développe dans une flore intestinale affaiblie par l’antibiothérapie et secrète deux toxines, A et B. La toxine A est une entérotoxine, elle provoque l’altération de la perméabilité de l’épithélium intestinal. La toxine B est une cytotoxine qui s’attaque directement aux cellules de l’épithélium. L’effet combiné des deux toxines est la diminution du temps de transit intestinal et de l’absorption intestinale, ce qui provoque une diarrhée. Lors d’une étude réalisée en 2021, plusieurs combinaisons de vaccins ont été testées chez la lapine. Ces vaccins étaient composés des 2 toxines détoxifiées et d’adjuvant, de nature et dose différentes. Les résultats ont permis de définir une formulation vaccinale conférant une immunité protectrice contre C. difficile. L'objectif de cette étude est de compléter les résultats dans les même conditions expérimentales (modèle lapine de 8 semaines) en évaluant l’innocuité de cette formulation dans différentes conditions de stockage (durée et température). Après une validation chez la souris, ce projet permettra l'évaluation préclinique formelle de la toxicité chez les non-rongeurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de définir d’une part l’innocuité de la formule vaccinale mais également les conditions de stockage optimales (durée et température). Ce projet réalisé sur un modèle non rongeur est nécessaire pour la constitution du dossier réglementaire de mise sur le marché du candidat vaccin (le dossier requiert des études sur 2 modèles animaux : un rongeur et un non-rongeur). Ce projet permettra également de consolider les données obtenues lors des expérimentations précédentes en modèle murin.

Procédures

Les 49 animaux du projet seront soumis aux 4 gestes techniques suivants : 1) Pose capteur télémétrique 1 seule fois 7 jours avant la première injection du vaccin (J0). Moins de 5 minutes par animal. Il est possible que cette zone soit douloureuse localement dans les 24 à 48 heures. 2) Identification de la zone d’injection par tatouage 1 seule fois 7 jours avant la première injection du vaccin. 5 à 10 minutes par animal. Il est possible que cette zone soit douloureuse localement dans les 24 à 48 heures. 3) Immunisation : 3 injections intramusculaire de vaccin (volume de 0.5 mL) à J0, J14 et J28. Moins de 5 minutes par animal. Le site d’injection (cuisse) est nettoyé avec de la vétédine® savon puis désinfecté avec de la vétédine® solution ou de l’alcool 70° avant injection avec du matériel stérile Il est possible que cette zone soit douloureuse localement dans les 24 à 48 heures due à une réaction inflammatoire. 4) Prélèvements de sang : 11 prélèvements de sang seront réalisés à J-7, J0, J1, J14, J15, J21, J28, J29, J42, J63 et J84. Le volume maximal prélevé est de 6 ml/kg par prélèvement sanguin. Après avoir appliqué une crème anesthésiante et contentionné le lapin grâce à un gilet, une aiguille de 25-26G est insérée parallèlement à la veine. La veine peut être vasodilatée en appliquant un peu d'eau tiède ou sous une lampe (en vérifiant la température avec un thermomètre).

Impact sur les animaux

La formulation vaccinale utilisée dans les groupes 1 à 5 a déjà été testée dans la précédente étude : aucun effet indésirable n’a été notifié. Les animaux n’ont pas présenté de signes d’agressivité inhabituelle, ni de comportement de prostration ou de souffrance. Aucun retour négatif n’a été reporté de la part du personnel animalier qui était en charge des soins et du suivi quotidien des animaux. Les groupes 6 et 7 recevront des vaccins contenant des doses d’antigènes plus élevées. Il est possible que les animaux de ces groupes développent soit une réponse inflammatoire (locale et systémique) plus importante, soit une réaction liée à la toxicité. Des visites seront réalisées 2 fois par jour afin de surveiller l’état de santé des animaux ainsi que les points limites. La toxicité systémique pourra être évaluée en mesurant la température corporelle des animaux. Au moment de la pose des puces télémétriques, une petite douleur locale peut être observée dans les 24 à 48 heures après implantation. Les prises de sang peuvent induire une petite douleur localement et éventuellement un hématome.

Devenir

Tous les animaux (n = 49) seront mis à mort à la fin de l’étude (J84). Le site d’injection est prélevé pour analyses histologiques. Un maximum de sang est prélevé sur certains animaux pour constituer une réserve d’anticorps. Si, au cours du projet, un animal présente des signes de souffrance (anomalie physique, état de santé dégradé), la décision de les mettre à mort avant J84 sera prise en accord avec le responsable scientifique, les concepteurs du projet et la vétérinaire de l'établissement utilisateur. Cette décision sera également prise si 3 points limites sont observés dans un délai de 48h.

Remplacement

Aucun modèle in vitro ou ex vivo ne peut se substituer totalement à ce type d’expérimentation afin de tester l’innocuité et l’immunogénicité d’un vaccin et de son adjuvant. Des vaccins composés de toxines détoxifiées ont déjà été validés chez la souris, une évaluation préclinique formelle de la toxicité chez les non-rongeurs doit être réalisée. Une étude précédente a permis de tester différentes formulations vaccinales. Ce projet a pour objectif de valider l’innocuité de la formulation vaccinale retenue ainsi que les conditions de conservation optimales.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum tout en permettant une étude de faisabilité. Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques en s’appuyant sur les données de la littérature, sur les données expérimentales obtenues chez la souris et également sur celles obtenues lors de l’étude précédente réalisée dans les conditions identiques. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe (enrichissement social, caresses et voix douce zootechnicien) dans des parcs avec enrichissement du milieu de vie (repose-pattes, tunnel, tasseaux de bois à ronger et des nids). Au delà des conditions d'hébergement, plusieurs mesures de raffinement seront mises en place :1) Une période d’acclimation d’une semaine est prévue entre l’arrivée des animaux et les premiers actes (pose de puce télémétrique et prise de sang sous anesthésie générale) 2) De la crème anesthésiante sera appliquée sur la zone à tatouer, sur la zone d'implantation de la puce et avant chaque prise de sang 3) A J-7 (7jours avant la première injection de vaccin) : les animaux seront anesthésiés pour la pose de la puce télémétrique, la 1ère prise de sang et le tatouage. La taille de l’effraction cutanée est de 2-3 mm. Par mesure de précaution, un point de suture pourra être prévu en cas de rejet de la puce ou si la taille d’effraction est supérieure à 3 mm. 4) A l’issue de chaque prélèvement de sang, de petites poches de glace seront appliquées pour réduire l’hématome. Les prises de sang se feront sur l’oreille droite et gauche afin de ne pas aggraver d’éventuelles lésions. En cas d’apparition d’hématome, une crème décongestionnante pourra être appliquée. Une vigilance particulière sera mise en place lorsque les prises de sang sont réalisées de manière rapprochée (J0/J1, J14/J15 et J28/J29). Pour les autres prises de sang, un délai minimum d’une semaine est mis en place entre 2 prélèvements. 5)Pour chaque prise de sang, les animaux seront contentionnés à l’aide de gilets de contention spécifiques pour limiter le stress des animaux. 6) Une récompense alimentaire sera donnée après les prises de sang et les vaccinations.

Choix des espèces

Des études ont déjà été réalisées chez les rongeurs (souris) mais aussi chez le lapin (modèle utilisé pour tester l’innocuité de l’adjuvant) et le porc (modèle proche de l’homme au niveau immunitaire ; étude de l’immunogénicité). L’objectif de ce projet est de compléter les résultats de l’étude réalisée sur le lapin (test d’innocuité et évaluation de l’efficacité suite à différentes conditions de conservation). Les animaux seront âgés de 8 semaines à leur arrivée. Ils auront 10 semaines lors de la première injection. Il est en effet, considéré que les lapins sont immunocompétents à 10 semaines d’âge. L’allotement se fait en fonction des poids des animaux à leur arrivée.

36 macaques crabiers vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'ouverture de l'abdomen pour poser un implant de télémétrie, des injections d'un candidat vaccin et jusqu'à vingt-et-un prélèvements sanguins et écouvillonnages sur treize mois. À l'issue de cette phase ils ne sont pas tués mais transférés vivants vers un second établissement pour une épreuve infectieuse par les virus des fièvres hémorragiques. Le porteur affirme que le macaque est le "seul modèle pertinent" et qu'il est impossible de mener ce projet avec une autre espèce.

Objectifs

Cartains virus spécifiques à l’Amérique Latine sont à l’origine de fièvres hémorragiques comme les virus Guanarito, Machupo, Sabia, Chapare et Junin. Un vaccin existe seulement pour ce dernier alors que les autres virus sont aussi responsables d’émergences sporadiques avec un taux de mortalité élevé (jusqu’à 30%). Un nouveau vaccin a déjà prouvé son efficacité en protégeant des macaques cynomolgus contre les virus Machupo et Guanarito. Il reste à prouver son efficacité contre les autres virus cité ci-dessus pour valider la protection contre tous ces virus spécifiques à l’Amérique du Sud responsable de fièvres hémorragiques. L’objectif de ce projet est de démontrer le potentiel de protection de ce nouveau vaccin contre 4 autres virus non testés à ce jour et vise donc à : - Montrer la protection acquise grâce au vaccin contre tous ces virus spécifiques à l’Amérique du Sud provoquant des fièvres hémorragiques - Etudier le niveau de protection et les mécanismes de protection - Tester la protection à court et à long terme du vaccin Le projet utilisera 36 macaques cynomolgus et se déroulera chronogiquement dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Un tel vaccin pourrait permettre de proposer une protection contre toute cette famille de virus et ainsi être préparé pour lutter contre l’émergence possible de l’un de ces virus à fort potentiel épidémique. En effet, étant donné la faible fréquence des épidémies occasionnées par chacun de ces virus et le faible nombre de cas impliqués, il n’est pas raisonnable de développer des vaccins individuels contre chacun d’entre eux. La seule méthode rationnelle et pragmatique qui permet d’envisager un développement industriel d’un tel vaccin est de proposer un candidat qui permet de protéger contre l’ensemble des fièvres hémorragiques par cette famille de virus. De plus, le large spectre de ce vaccin pourrait conférer une protection contre d’éventuels autres virus émergents. Si l’efficacité de ce vaccin est prouvée contre les virus d’intérêt chez le macaque cynomolgus, les études réglementaires pour la mise sur le marché de ce candidat vaccin pourront être réalisées.

Procédures

Concernant la phase d’immunisation et de vérification de l’innocuité et de l’immunogénicité du candidat vaccin, les animaux seront soumis à une chirurgie d’implantation abdominale d’un dispositif permettant de mesurer la température corporelle en temps réel (environ 30 min), 1 à 2 injections intramusculaire du vaccin, puis 1 à 21 prélèvements sanguins et écouvillons nasaux et buccaux sur 1 à 13 mois (environ 15 min à chaque session de prélèvements).

Impact sur les animaux

Toutes les interventions sont réalisées sous anesthésie générale. L’inocuité du vaccin utilisé ayant déjà été démontré dans ce modèle, il n’est attendu aucun effet secondaire du produit testé. La chirurgie d’implantation du dispositif de télémétrie (ouverture de l’abdomen) peut engendrer des douleurs opératoires prises en charge médicalement jusqu’à cicatrisation. Les anesthésies et prélèvements sanguins répétés peuvent générer de l’inconfort ainsi que des hématomes aux sites de prélèvements.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie à la fin du projet afin de continuer le projet dans l’EU 2/2 pour la phase de challenge infectieux. Ils sont examinés par un vétérinaire pour vérifier leur aptitude au transport avant d’être transférés.

Remplacement

Ce vaccin a déjà été testé et validé in vitro contre certains virus responsables de fièvres hémorragiques. Cependant, seul un test sur primates non-humains sera à même de prouver l’efficacité et l’innocuité de cette vaccination ciblant plusieurs virus. Ce projet est une phase pré-clinique en amont des études réglementaires de mise sur la marché de candidats médicaments.

Réduction

A un stade pré-clinique en amont de la phase réglementaire, l’utilisation de 3 animaux par groupe est suffisante pour répondre aux objectifs du projet. Pour la phase réglementaire, un nombre plus important d’animaux sera nécessaire mais cette phase ne sera pas lancée avant de s’assurer du caractère prometteur du vaccin en question, ceci afin de réduire le nombre d’animaux globaux. Le présent projet utilisera 12 groupes de 3 animaux chacun : 4 virus à tester x 2 conditions (vaccin vs contrôle) + 4 conditions temporelles.

Raffinement

- Hébergement : les animaux seront hébergés au minimum par paire. Pour une question de taille d’hébergement dans l’établissement 2/2 et d’optimisation de l’étude, les groupes seront composés en trio socialement compatibles. Un programme d’enrichissement spécifique à l’espèce et à l’âge des animaux utilisés est mis en place sur tout le site, et supervisé par le responsable du bien-être animal. Les enrichissements sont structurels (perchoirs, balançoire…), alimentaires (graines pour fourragement, fruits, friandises…) ou consistent en l’apport d’objets de manipulation changés régulièrement. - Suivi de la température corporelle : les animaux seront équipés d’un implant de télémétrie permettant de suivre en temps réel la température corporelle considérée comme donnée d’entrée essentielle renseignant sur l’état d’infection des animaux. Malgré une chirurgie pour la mise en place de l’implant, le fait d’équiper les animaux avec un tel dispositif représente un raffinement en tant que mesure non invasive et paramètre de surveillance dans le cadre des points limites. - Procédures : les animaux seront anesthésiés pour chaque intervention et la chirurgie d’implantation est réalisée sous couverture antalgique. Afin de limiter l’impact des prélèvements sanguins répétés, les sites de prélèvements seront alternés. En cas d’hématome, un autre site de prélèvement sera utilisé et de la pommade sera appliquée sur l’hématome. Une grille de points limite est mise en place pour détecter tout problème inattendu

Choix des espèces

Il n'existe pas de modèles rongeurs capables de reproduire les symptômes et les réponses immunitaires retrouvées chez l'Homme au cours des fièvres hémorragiques. Certaines espèces de cobayes et certaines souris génétiquement modifiées reproduisent en partie les symptômes et les réponses immunitaires ayant lieu chez l'Homme. Les macaques cynomolgus représentent le seul modèle pertinent : Ils développent un tableau clinique similaire à celui observé chez l’Homme ainsi que les mêmes issues. Il est impossible de réaliser ce projet en utilisant un autre modèle animal que les macaques cynomolgus. Ce projet ne nécessite pas d'exigences particulières concernant le stade de développement des animaux utilisés hormis le fait de former des groupes homogènes en âge et poids pour pouvoir analyser les résultats sans biais. Les animaux utilisés seront des juvéniles sevrés d’au moins 12 mois et de moins de 3 ans. En effet, en raison de la taille des hébergements de l’établissement 2/2 et afin de pouvoir garder les groupes en trio d’animaux socialement comptabibles, ces derniers doivent être âgés de moins de 3 ans.

840 poulets vont être utilisés, dont 735 tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par voie orale par des coccidies, ce qui provoque diarrhée, plumes ébouriffées et lésions intestinales que le porteur cherche à obtenir à un niveau élevé sur son échelle. Les oiseaux sont tués pour observer les lésions du tube digestif, seuls 105 individus écartés pour leur poids étant réutilisés. Le projet vise à valider un parasite du poulet comme modèle de substitution au toxoplasme pour évaluer des traitements des aliments, le porteur indiquant qu'on ne peut se passer "totalement" de modèle animal.

Objectifs

Parmi les coccidies, Toxoplasma gondii est un parasite zoonotique dont une partie du cycle de développement se déroule chez le chat. Les oocystes (formes de résistance émises dans l'environnement avec les matières fécales, qui sont également les éléments infectieux) produits par le chat sont une source de contamination s'ils sont ingérés par un animal ou l'Homme (avec essentiellement le risque chez la femme enceinte de transmission au foetus, avec des conséquences graves sur le développement de ce dernier, notamment cérébral et oculaire). L'étude des mesures de maîtrise appliquées au cours de la production alimentaire pour éliminer et/ou inactiver ces oocystes est essentielle pour réduire le risque d'infection par voie alimentaire. Néanmoins, il est difficile d'obtenir ces oocystes en quantités suffisantes pour réaliser les tests d'inactivation et ces études sont également contraintes en raison de la pathogénicité de T. gondii pour l'Homme. Des modèles utilisant des oocystes d'autres parasites sont donc à l'étude dans ce projet pour pouvoir répondre à la problématique d'évaluation de l'exposition à T. gondii dans les aliments. Des oocystes d'Eimeria acervulina, parasite du poulet, ont été sélectionnés car ils ont des caractéristiques proches de celles des oocystes de T. gondii. Le but est de comparer les résultats préalablement obtenus avec Toxoplasma et différents produits de traitement avec ceux qui seront générés dans ces essais avec les oocystes d'Eimeria. Si les oocystes d'Eimeria répondent pareillement ou sont plus résistant à ces traitements, le modèle sera validé et nous pourrons envisager d'utiliser Eimeria comme modèle de Toxoplasma pour évaluer des traitements pertinents dans le domaine alimentaire et leur efficacité comme mesure de contrôle. Le projet vise à tester la viabilité des oocystes traités de différentes manières par rapport à des oocystes non traités, en infectant des poulets avec ces oocystes traités et non traités. Afin de valider les oocystes d'Eimeria comme modèle de T. gondii,les résultats seront comparés avec ceux obtenus avec les oocystes de T. gondii.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer l'efficacité de différents traitements sur les oocystes d'Eimeria acervulina, dans le but de valider Eimeria comme modèle d'étude de l'inactivation des oocystes de Toxoplasma gondii afin d'évaluer par la suite les traitements applicables sur les aliments potentiellement souillés par des oocystes de T. gondii afin de réduire le risque d'infection chez l'Homme avec ce parasite. L'intérêt majeur d'un tel modèle est de pouvoir disposer d'oocystes plus facielemnt et en plus grande quantité qu'avec Toxoplasma pour l'évaluation des mesures de maîtrise et de pouvoir utiliser un parasite non pathogène pour l'Homme, ce qui est essentiel si on envisage des essais sur site indiustriel (impossibilité de tester une procédure de traitmeent sur site avec un pathogène). Parallèlement, il fournira des informations sur les procédés envisageables en élevage de volailles pour réduire la pression coccidienne environnementale afin de réduire le risque associé à Eimeria acervulina, la coccidie la plus fréquente et la plus dommageable économiquement chez le poulet.

Procédures

Inoculation d'oocystes de coccidies par voie orale à l'âge de 16 jours : une seule inoculation par animal, avec contention de l'animal par un agent et inoculation par un autre agent. La durée de l'intervention n'excède pas une minute, préhension et contention incluses.

Impact sur les animaux

Signes cliniques et lésions intestinales proportionnels à l'intensité de développement des coccidies. Les doses envisagées doivent permettre d'obtenir des signes cliniques modérés avec les oocystes non traités (diarrhée et plumes ébouriffées pendant trois à quatre jours) et des lésions intestinales d'intensité 3 sur une échelle comportant quatre niveaux d'intensité. Les lésions d'intensité 3 sont caractérisées par des points blancs de nécrose nombreux sur la muqueuse du duodénum et du jéjunum, causés par les cellules détruites par les parasites. Baisse de gain de poids et augmentation de l'indice de consommation pendant cette période.

Devenir

Tous les oiseaux utilisés dans les essais (720) sont mis à mort pour observation des lésions du tube digestif causées par le développement des coccidies. Lors de la mise en place des poussins d'un jour, 5 sujets sont mis à mort pour analyses vétérinaires, ce qui fait que 15 des 840 sujets sont mis à mort dès leur arrivée. Les 105 sujets ne servant pas aux essais, à cause de leurs poids extrêmes, pourront être réutilisés dans d'autres procédures.

Remplacement

Un des buts du projet est de renoncer à l'utilisation de chats et de souris pour produire des oocystes de T. gondii et pour tester l'efficacité des traitements sur ces oocystes respectivement. Le chat n'est pas un bon modèle animal car il n'est pas habitué à vivre en claustration, contrairement aux volailles. La coccidie Eimeria acervulina a des oocystes dont les caractéristiques morphologiques et de composition sont proches de celles des oocystes de T. gondii. Les tests in vitro de mesure de viabilité des oocystes sont très difficiles à maîtriser et ils ne permettent pas de suivre la totalité du développement des parasites, seuls les premiers stades étant possibles. Ils ne permettent donc pas de suivre des effets qui se manifesteraient sur des stades de développement tardifs dans le cycle parasitaire, comme l'étape de reproduction sexuée. On ne peut pas actuellement se passer totalement de modèle animal.

Réduction

Les effectifs ont été réduits à vingt sujets par lot, ce qui permet d'obtenir des différences significatives pour une baisse de gain de poids moyen d'environ 15 à 20% par rapport à des animaux non infectés (ou infectés avec une dose n'entraînant pas de baisse de gain de poids). Un lot de référence sera constitué de 20 sujets subdivisé en cinq sous-lots de quatre sujets recevant des doses croissantes d'oocystes non traités, afin d'établir une échelle indicative des indices lésionnels. L'utilisation de quatre sujets par dose au lieu de vingt est envisageable car les lésions sont dose-dépendantes et même si l'échelle sera moins fiable que les résultats des différents lots expérimentaux, il sera possible d'estimer un pourcentage de destruction ou d'inactivation des oocystes traités. Les tests statistiques pour comparer les gains de seront des analyses de variance suivis d’un test de Newman-Keuls, après vérification de la normalité des distributions des poids au sein de chaque lot (test de Shapiro-Wilk) et égalité des variances (test F ou Bartlett). En cas d’absence d’égalité des variances ou de distributions anormales, des tests non paramétriques (test de Kruskall-Wallis et tests de Wilcoxon) seront utilisés. Tous ces tests seront réalisés avec le logiciel R.

Raffinement

Les poulets seront hébergés dans des cages conformes aux conditions exigées en expérimentation animale, en groupes homogènes, avec un éclairage naturel complété par un éclairage artificiel en période de jours courts, avec maîtrise de la température et de la pression et suivi de l'hygrométrie. Des cordelettes seront suspendues dans les cages ainsi que des CD afin que les oiseaux puissent interagir avec. Le système d'abreuvement est constitué d'une rampe de pipettes qui peut être utilisé comme perchoir. Des points limites ont été définis dans la procédure expérimentale.

Choix des espèces

Le modèle sélectionné pour l'étude sur les oocystes est la coccidie Eimeria acervulina, qui est un parasite strictement inféodé à l'espèce Gallus gallus. Cette coccidie ne se développe que chez le poulet. Les oiseaux seront mis en place à l’âge d’un jour, après éclosion et récupération au couvoir, afin d’éviter toute contamination accidentelle avec des coccidies. Ils seront élevés en animalerie protégée jusqu’à l’âge de 15 jours. Ils seront inoculés le lendemain et le suivi d’infection sera effectué pendant 8 jours. Ces âges correspondent aux périodes d’apparition les plus fréquentes de cette coccidie dans les élevages, et la durée du cycle parasitaire n’excédant pas sept jours, il n’est pas nécessaire de les garder au-delà de ce délai pour pouvoir mesurer les effets des parasites sur les animaux.

80 furets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par le virus de la grippe par voie nasale, puis subissent des lavages nasaux jusqu'à trois fois par semaine et des prélèvements sanguins sous anesthésie, pour tester des produits antiviraux. L'infection provoque fièvre, écoulement nasal et apathie, et les organes sont prélevés après la mise à mort. Le porteur annonce comme bénéfice la "mise sur le marché de nouveaux produits antiviraux" et affirme qu'aucune méthode alternative ne modélise l'efficacité dans un "organisme entier".

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de développer et caractériser des modèles d’infection par le virus de la grippe (virus Influenza) et d’évaluer l’efficacité de différents produits antiviraux. Plusieurs études pourront être réalisées pour répondre à ces objectifs. Lors de celles-ci, des furets (mustela putorius furo) seront infectés avec une suspension virale du virus de la grippe et traités avec les produits à tester.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à la mise sur le marché de nouveaux produits antiviraux.

Procédures

Les animaux seront infectés par une dose unique de virus et recevront une ou plusieurs fois l'administration des produits antiviraux. Des lavages nasaux seront réalisés (jusqu’à 3 fois par semaine à 2 jours d’intervalle) ainsi que des prélèvements sanguins (au maximum 2 fois en 1 semaine + avant euthanasie) sur animaux anesthésiés.

Impact sur les animaux

Les animaux vont être infectés avec le virus de la Grippe, à une dose d’environ 10^5 PFU/mL, entrainant l’apparition de signes cliniques des animaux reflétant la réalité clinique (principalement fièvre, éternuement, écoulement nasal et apathie). Les animaux seront également manipulés régulièrement pour différents actes (administration des vaccins, pesées, scoring clinique, prélèvements, etc.). Ces actes peuvent stresser les animaux, aussi, pour palier à cela, des mesures de raffinement ont été prévues notamment des anesthésies systmétique pour tous actes nécessitant une contention importante des animaux.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de la phase expérimentale afin de prélever les organes pertinents à la mesure d’efficacité des produits antiviraux en vues d’analyses des charges virales.

Remplacement

Afin de répondre aux objectifs de ce projet, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable l’efficacité de produits antiviraux dans un organisme entier vivant. Le furet a été choisi car il s’agit d’un modèle classiquement utilisé dans les études sur la grippe.

Réduction

Cette étude a fait l’objet d’une réflexion afin que les effectifs de chaque groupe soient déterminés de façon à pouvoir analyser les résultats avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 7 jours minimum sera respectée. Les animaux seront hébergés en groupe tout au long du projet avec des enrichissements appropriés à leur besoin (balles et autres jouets avec une alternance des jouets tous les 15 jours, paniers de repos…). L’infection des animaux par administration intranasale sera réalisée sous anesthésie, ainsi que tous les actes techniques nécessitant une contention importante afin d’éviter tout stress aux animaux. Tout au long de l’étude, un suivi clinique quotidien sera réalisé. Le poids des animaux et la température seront mesurés régulièrement et un suivi clinique avec grille de scoring sera réalisé (a minima quotidiennement après l’infection). Tout score total supérieur ou égal à 12, témoignant d’un état de santé considérablement dégradé de l’animal et sans possible rétablissement conduira à une euthanasie étique des animaux concernés. De façon similaire, toute perte de poids supérieure ou égale à 10% du poids initial de l’animal au cours de l’étude ou durant les 15 derniers jours conduira à une euthanasie éthique.

Choix des espèces

Le furet est un modèle animal dont l’infection grippale mime le mieux la physio-pathogénie humaine (signes cliniques et transmission entre animaux) permettant de se rapprocher au plus près de la pathologie humaine. Les animaux sélectionnés pour ce projet seront âgés de 3 à 4 mois (stade de jeune adulte) au moment de l’infection. Ce stage de développement est celui habituellement utilisé pour ce type d’étude (pas de contrainte spécifique lié à l’age).

68 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 4 étant réutilisés et les autres tués. Ils sont infectés par le SIV, l'équivalent simien du VIH, reçoivent un anticorps et un traitement antirétroviral quotidien pendant dix-sept à vingt-trois semaines, avec des prélèvements répétés de sang, de ganglions, de moelle osseuse et des biopsies rectales sous anesthésie. Le porteur indique une phase aiguë avec fièvre et baisse des lymphocytes, et justifie la mise à mort par la mesure de la charge virale dans les tissus profonds. Il affirme que le primate est "le seul modèle" permettant d'étudier cette infection et qu'aucune méthode alternative n'est possible.

Objectifs

A ce jour, il n’y a aucun vaccin efficace contre le Sida, principalement en raison d’un manque de compréhension des mécanismes utilisés par le VIH pour échapper au système immunitaire. La reconnaissance d’un pathogène par une population cellulaire appelée cellules dendritiques, est une étape clé pour initier une réponse immunitaire efficace. Or l’infection par le VIH induit des dysfonctions des cellules dendritiques. Des expériences in vitro montrent qu’un récepteur immunitaire (LILRB2), qui est exprimé à la surface des cellules dendritiques, est responsable de ces dysfonctions. Ce récepteur peut intéragir avec les molécules de présentation et ainsi induire un contrôle de la réponse immune... Le VIH utiliserait les propriétés de ce récepteur pour déréguler les fonctions des cellules dendritiques. Néanmoins la démonstration du rôle de l’interaction de LILRB2 avec ses ligands in vivo au cours de l’infection par le VIH n’a jamais été faite. L’objectif de ce projet vise à caractériser, in vivo, le lien entre le récepteur LILRB2 et les dysfonctions des cellules dendritiques induite par le VIH. Aucun dispositif cellulaire ne pouvant reproduire la complexité d’une réponse immunitaire in vivo, il est nécessaire de recourir à des modèles animaux. Le primate non humain (PNH) a été choisi pour ce projet puisque c’est le seul modèle animal permettant l'étude de la physiopathologie de l'infection par le SIV, virus responsable du SIDA dans le modèle macaque. A cet égard, nous avons développé un anticorps à visée thérapeutique capable de bloquer la fixation du récepteur LILRB2 sur les moléculesde CMH-I. Cet anticorps a été développé pour fonctionner dans le modèle macaque et l’Homme afin de faciliter son transfert vers une application clinique. Différents protocoles seront appliqués. Ceux-ci incluront l’injection de l’anticorps seul ou en combinaison avec des antirétroviraux en phase précoce ou chronique de l’infection. Les résultats de cette étude pourraient ouvrir la voie vers la mise en place de nouveaux protocoles cliniques visant une rémission des patients infectés par le VIH.

Bénéfices attendus

Le suivi de l’évolution de la charge virale SIV, virus responsable du Sida chez le modèle macaque, permettra de comprendre si un anticorps monoclonal dirigé contre un récepteur présent sur les cellules immunitaires (LILRB2) à visée thérapeutique peut améliorer les réponses immunitaires et conduire à un contrôle de du virus.

Procédures

procédures sous anesthésies: - Injection unique d’anticorps. (entre 5 et 10 min) - Infection SIV (une occurrence). - Anesthésie des animaux lors des prélèvements. La durée d’anesthésie pour les prélèvements est inférieure à une heure - Différents Prélèvements sanguins,de ganglions, lavages broncho-alvéolaires, biopsies rectales et moelle osseuse seront effectués à 4 reprise chacun. La durée du prélèvement peut aller de 2 min (LBA) à 20 min (biopsies ganglions). Procédure sans anesthésie : - Traitement anti-rétroviral injecté quotidiennement du début de traitement à l’euthanasie (moins d’une minute par injection). Cette période durera entre 17 et 23 semaines, en fonction de si le traitement commencera en phase précoce ou en chronique

Impact sur les animaux

Dans les premiers jours de l’infection (phase aiguë), des effets cliniques transitoires comme de la fièvre ou une baisse du nombre de lymphocytes T CD4, peuvent apparaitre pendant quelques jours.

Devenir

Nécessité d’euthanasier les animaux exposés au SIV pour l’évaluation de la charge virale tissulaire et des réponses immunitaires dans les tissus profonds.

Remplacement

Aucune méthode alternative n’est possible pour étudier les effets de l’anticorps monoclonal sur les réponses immunitaires contre le SIV in vivo. Cette étude sur le long terme ne peut être réalisée que sur des animaux vivants.

Réduction

Quatre macaques pour l’étude pharmacodynamique et huit macaques par groupe d’animaux infectés par le SIV sont les nombres d’animaux minimum nécessaires pour déterminer si les variations observées sont bien dues aux conditions expérimentales et non à des variations biologiques inter-animal. Comme mentionné précédemment, ce nombre permet d’avoir des résultats statistiques en utilisant des tests non paramétriques adaptés à des petits échantillons.

Raffinement

- Les injections d’anticorps seront réalisées sous anesthésie. De même les prélèvements de sang, de ganglion, de moelle osseuse et les lavages broncho alvéolaires seront également réalisés sous anesthésie. Les animaux recevront 1 à 2 fois par semaine des dispositifs d’alimentation supplémentaire type pebble toy ou minibrik popcorn et une fois par mois des sachets surprises contenant des friandises et des morceaux de fruits. Des jouets à ronger et à manipuler seront mis à disposition. Enfin, un dispositif de renforcement de contact positif est mis en place via la distribution de fruits sec et/ou de graines. Les animaux qui recevront des traitements antirétroviraux journaliers par voie sous cutanée, seront entrainées préalablement (training) à la contention afin de réduire le stress et les mouvements de l’animal lors de l’injection sous cuntanée. Suite à l’injection, du renforcement de contact positif sera réalisé par l’expérimentateur. Une rotation des sites d’injection sera opérée (haut, milieu, basn droite, gauche) permettant ainsi d’avoir 6 sites en rotation quotidienne.

Choix des espèces

Pour cette étude sur le long terme, le choix s’est porté sur le modèle PNH (Primate non humain) macaque pour plusieurs raisons : 1/ les PNH sont physiologiquement plus proches de l’Homme 2/ les PNH sont l’un des seuls modèles animaux permettant la caractérisation de la réponse immune au SIV: les réponses immunitaires sont similaires à celles de l’Homme, et les techniques et outils d’exploration de la réponse immunitaire sont disponibles et maitrisés. 3/ le gène LILRB2 est conservé chez les primates et Il n’existe pas de récepteur immunitaire équivalent chez les rongeurs. 4/ l’étude se fera sur des animaux adultes qui possèdent un système immunitaire mature.

405 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de trypanosomes africains fluorescents, puis un prélèvement sanguin tous les trois jours pendant quatre semaines et des séances d'imagerie sous anesthésie, avant une ponction intracardiaque terminale. Le porteur affirme qu'aucun dommage évident n'est attendu car la procédure s'arrête avant l'installation des symptômes, tout en déclarant la gravité modérée. Sur le remplacement, il décrit un modèle de peau en micropuce en développement mais conclut que le recours à l'animal reste "indispensable" pour l'"organisme entier".

Objectifs

Le comportement des trypanosomes extravasculaires en termes de prolifération, différentiation, migration, métabolisme et perception sensorielle est certainement déterminant pour le développement de l’infection. Nous suivrons donc la progression de l’infection chez la souris par des parasites Trypanosoma brucei brucei fluorescents et bioluminescents, par une combinaison de méthodes d’imagerie intravitale et de cytométrie. Ceci nous permettra de localiser et de quantifier les trypanosomes dans le temps et dans l’espace en distinguant les parasites intra- et extravasculaires. Le tropisme et le comportement extravasculaires de différents trypanosomes mutants seront successivement comparés à des infections par une souche sauvage afin de : 1- Déterminer la capacité des parasites extravasculaires à se différencier en formes transmissible au vecteur : 1 souche ZCH20 KO (incapable de se différencier) et 1 contrôle Add-Back, 1 souche contrôle rapporteur NLS-EGFP PAD1-UTR (noyau vert fluo si différenciée). Ces 3 souches seront injectées par voie intrapéritonéale. 2- Déterminer l’importance de la mobilité active des parasites pour leur tropisme extravasculaire : 1 souche DNAI1RNAi inductible (nage lente et en arrière seulement). Cette souche sera injectée par voies intravasculaire Vs. intradermique pour comparaison. 3- Déterminer l’importance des fonctions sensorielles pour le tropisme et la maintenance extravasculaire du parasite : 3 souches AQP123 KO (dépourvues de canaux membranaires aquaglycéroporines) et leur 3 contrôles Add-Back. Ces souches seront injectées par voies intravasculaire Vs. intradermique pour comparaison. Un traitement suboptimal à la suramine après 2 semaines d’infections nous permettra de confirmer ces observations en ciblant spécifiquement les parasites sanguins afin de n’observer que les parasites extravasculaires possiblement présents. 4- Déterminer l’importance de la glycolyse et de la néoglucogenèse chez les formes extravasculaires. L’importance du glycérol comme source de carbone sera en particulier étudiée : 1 souche GK KO (sans glycérol kinase) et son contrôle Add-back. Ces souches seront injectées par voies intravasculaire Vs. intradermique pour comparaison. Un traitement suboptimal à la suramine après 2 semaines d’infections sera également réalisé.

Bénéfices attendus

La biologie des formes extravasculaires de trypanosomes reste mal connue. Le comportement des parasites extravasculaires (prolifération, différentiation, migration, métabolisme, perception sensorielle…) est certainement déterminant pour le développement de l’infection. Une meilleure connaissance de ces mécanismes permettrait donc d’envisager de nouvelles cibles diagnostiques et / ou thérapeutiques, et d’optimiser la surveillance des cas et des réservoirs asymptomatiques dans le contexte de l’élimination de la maladie.

Procédures

Une injection intrapéritonéale, intraveineuse ou intradermique (quelques secondes) au début de la procédure. Une prise de sang (10ul en quelques secondes) par animal tous les 3 jours pendant 4 semaines. Une observation par imagerie intravitale sur organisme entier (

Impact sur les animaux

D’après la littérature et notre expérience avec ce modèle d’infection chronique : les symptômes de la maladie ne s’installent chez la souris qu’après plus de 4 semaines et la mort ne survient qu’à partir de 6 à 8 semaines. Dans nos conditions d’observation d’une durée maximum de 4 semaines, aucun dommage évident n’est donc attendu. De plus, l’approche d’imagerie intravitale envisagée permet une réduction significative du nombre d’animaux et minimise grandement le nombre et la gravité des gestes techniques réalisés sur ces animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés (les animaux étant infectés).

Remplacement

Nous développons actuellement un modèle organoïde de peau en micropuce qui permettra de répondre à certaines questions à l’échelle tissulaire, et ainsi de réduire de façon substantielle les infections expérimentales de rongeurs. Toutefois, pour comprendre certains mécanismes à l’échelle de l’organisme entier, le recours à l’animal reste indispensable.

Réduction

L’approche d’imagerie intravitale envisagée permet un suivi des individus dans le temps, ce qui limite le nombre d’animaux utilisés. Ainsi, selon la question biologique étudiée, entre 4 et 8 groupes seront nécessaires, contrôles inclus, et plusieurs mesures seront réalisées au cours du temps sur chaque animal. Dans ces conditions, les effectifs permettront de mettre en évidence avec suffisamment de puissance des effets moyens à larges (d entre 0.7 et 0.9). Avec 3 répétitions pour chaque expérience et plusieurs cages par groupe, les effets techniques pourront également être quantifiés et pris en compte dans l'analyse à l'aide de modèles à effets mixtes.

Raffinement

L’approche d’imagerie intravitale envisagée minimise le nombre et la gravité des gestes techniques réalisés sur les animaux. La fréquence des observations est limitée à 3 fois par semaine et sous anesthésie gazeuse peu profonde pendant environ 10 minutes. Les prélèvements sanguins caudaux sont réalisés après application topique de lidocaïne. Les souris sont hébergées dans des conditions optimales en portoirs ventilés en animalerie A3 sous la surveillance de zootechniciens spécialisés. Elles sont suivies quotidiennement durant toute la durée de la procédure par un des 2 expérimentateurs formés impliqués dans l’étude. Leur poids est mesuré et leur état de bien-être est contrôlé avec la grille de suivi utilisée pour évaluer leur douleur, leur stress, leur inconfort, mise au point par la SBEA et disponible sur le site internet de l’animalerie centrale. Elles disposent en permanence de nourriture, d’eau et de coton (enrichissement). Une attention particulière sera prêtée aux points limites suivants : prostration ou asthénie, aspect général altéré (pelage ébouriffé, palissement des oreilles, yeux vitreux, vivacité) et perte de poids > 20% du poids initial. La durée maximum de la procédure dans le contexte d’une infection chronique est trop courte pour que des symptômes apparaissent nettement. Dans tous les cas, les phénotypes de virulence attendus pour les souches de parasites mutées sont des diminutions voire des pertes totales de virulence par rapport aux souches contrôles.

Choix des espèces

La souris est le plus petit modèle Mammifère validé disponible et suffisamment proche de l’homme pour permettre un accès à toutes les informations recherchées et une interprétation / extrapolation par analogie, et à la fois le moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Adultes de 7 semaines. Il s’agit du modèle le plus fréquemment utilisé dans la littérature, ce qui nous permettra des comparaisons.