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Evaluation de l’efficacité in vivo d’anticorps thérapeutiques contre le virus Nipah en modèle hamster
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
30 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit des anticorps puis une infection par le virus Nipah en intra-nasal sous anesthésie, avant d'être tué pour prélèvement du sang et des organes. Le porteur indique que l'infection provoque des atteintes neurologiques et respiratoires comparables à celles observées chez l'humain, suivies par une matrice de score. Il affirme que l'évaluation de l'activité d'un anticorps sur un virus passe encore obligatoirement par un modèle animal.
Objectifs
Le virus Nipah (NiV) est un virus ayant émergé dans les années 90 en Asie du Sud-Est, contre lequel il n’existe pas à l’heure actuelle de vaccin ou traitement. Le virus Nipah est un virus pouvant se propager via les animaux mais également par des contaminations interhumaines. Il est responsable d’encéphalites sévères et/ou de syndromes respiratoires chez l’humain, avec un taux de mortalité relativement élevé (jusqu’à 75% selon les souches). Ce pathogène constitue un problème de santé publique majeur. La maladie induite par ce virus figure sur la liste de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) des maladies prioritaires en matière de recherche et développement. Ce projet collaboratif propose l’évaluation d’anticorps à visée thérapeutique, préalablement criblés in vitro, dans un modèle maîtrisé pour le virus Nipah.
Bénéfices attendus
Dans le contexte d’absence de traitement ou vaccin contre le virus Nipah, le développement et l’évaluation de ces anticorps permettraient d’identifier un ou plusieurs candidats. Ce/ces anticorps pourront ensuite être potentiellement utilisés chez l’Homme en contexte de traitement après une exposition potentielle au virus chez les personnels de santé ou manipulateur du virus, ou en traitement curatif chez les patients.
Procédures
La procédure expérimentale soumettra chacun des animaux, de la réception jusqu’à la fin du protocole à : des anesthésies gazeuses (au nombre de 3 prévues au protocole, hors cas de gestion de la douleur), une administration des anticorps par voie intra-péritonéale (sur animal anesthésié), une administration du virus par voie intra-nasale (sur animal anesthésié), et enfin à une anesthésie puis mise à mort pour réaliser les prélèvements de sang et des organes d’interêt.
Impact sur les animaux
L’infection par le virus Nipah engendre, dans les modèles d’études caractérisés, des atteintes neurologiques et troubles respiratoires, relativement comparables à ceux observées chez les humains. Les animaux inclus dans cette étude seront surveillés quotidiennement afin de détecter précocement tous symptômes comme décrits dans la matrice de score (modifications de l’aspect, perte de poids, diminution de la réactivité, troubles de la démarche, troubles respiratoires, signes neurologiques).
Devenir
L'étude implique que les organes puissent être prélevés sur l'ensemble des animaux (n=30), ceux-ci étant répartis en 5 groupes expérimentaux. Par conséquent, seule la mise à mort des 30 individus de l'étude permettra d'obtenir des données virologiques suffisantes permettant de comparer l'efficacité des anticorps comme mesure thérapeutique antivirale.
Remplacement
Il existe désormais plusieurs méthodes alternatives in vitro, dérivées de la culture cellulaire (classiquement utilisée depuis des décennies). Ces nouvelles technologies tendent à recréer artificiellement les interactions inter cellulaires que nous pouvons retrouver dans un organisme. Bien que très prometteuses, ces techniques restent très localisées et répondent à des problématiques assez ciblées. Suite au développement et à la caractérisation in vitro d’anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines du virus Nipah, l’activité antivirale de ces anticorps a pu être évaluée par criblage contre le virus Nipah (souche Malaisie). Ces différentes étapes ont abouti à l’identification de 3 candidats. Afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de ceux-ci, ils doivent désormais être confrontés dans un modèle plus complexe mimant l’infection par le virus Nipah. Ces tests in vitro ne permettent pas actuellement de répondre à des questions globales telles que la mise en place de la pathologie, le développement symptomatologique ou la mise en place des réactions immunitaires suite à une réponse à un traitement et à une épreuve virale. L’étude de l’activité d’un anticorps sur un virus passe donc encore obligatoirement par l’utilisation d’un modèle animal.
Réduction
Les animaux inclus dans cette étude seront infectés par une dose étudiée précédemment et permettant une observation de symptômes chez la totalité des individus. Des prélèvements seront réalisés sur chaque animal afin de collecter du sang pour des analyses complémentaires mais également pour permettre une formation à des gestes techniques adaptés aux conditions de sécurité biologique.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par 3 dans des cages adaptées au système d’hébergement. Malgré le confinement plus strict lié aux activités du laboratoire, les conditions d’hébergement classiques sont maintenues. Les observations journalières seront réalisées afin d’évaluer l’état de chacun des animaux selon une matrice de score établie pour ce modèle et selon le virus utilisé et les signes cliniques attendus. En période de week-end avant challenge viral, un système de vidéosurveillance permettra de visualiser si les animaux ont toujours de la nourriture et de la boisson. À tout moment, en cas de doute sur l’état d’un ou plusieurs animaux, une entrée en zone sera programmée pour procéder à une observation des animaux et à une possible décision d’arrêter le protocole.
Choix des espèces
Le hamster doré est le modèle de référence pour l’étude du virus Nipah. Il a été développé il y a quasiment 20 ans puis a été utilisé dans le cadre de divers projets collaboratifs. Les animaux seront âgés de 6 à 8 semaines selon la disponibilité. Ces âges correspondent aux stades de développement des hamsters utilisés par la communauté scientifique pour les études pré-cliniques portant sur le virus Nipah.
Etude in vivo d’un composé aux propriétés antibactériennes ciblant Helicobacter pylori
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la bactérie Helicobacter pylori puis gavées d'un composé nommé EX-01, jusqu'à deux fois par jour pendant quatorze jours, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le porteur vise un médicament contre l'infection à H. pylori, associée aux cancers de l'estomac, et renvoie cette retombée à terme. Il affirme que des expériences chez la souris sont "indispensables" pour confirmer l'activité du composé, jugée impossible à modéliser in vitro.
Objectifs
Le cancer gastrique est actuellement la 4e cause de mortalité par cancer dans le monde. L’infection chronique par Helicobacter pylori est considérée comme étant reponsable dans plus de 93% des carcinomes gastriques. Le composé EX-01, naturellement présent dans l’alimentation, dont l’inocuité a été montrée mais dont la composition est actuellement confidentielle car en instance de brevetage, a montré des effets antibiotiques in vitro sur Helicobacter et Campylobacter. Il a également montré des effets anti-cancéreux dans les cancers de la prostate et du pancréas mais son action n’a pas encoré été étudiée dans le cancer de l’estomac. Nous souhaitons donc à présent étudier in vivo les effets de ce composé, l’objectif à terme étant la création d’un nouveau médicament pour le traitement de l’infection à H. pylori chez l’Homme. L’objectif de ce projet est d’étudier in vivo chez la souris les effets du composé EX-01 sur la colonisation de l’estomac par la bactérie Helicobacter pylori.
Bénéfices attendus
L’objectif à terme est de développer un nouveau médicament pour le traitement de l’infection à H. pylori.
Procédures
Gavage sur animal vigile: 20 souris, 1 fois par jour sur 3 jours Gavage sur animal vigile: 40 souris, 1 fois par jour sur 3 jours puis 2 fois par jour sur 14 jours
Impact sur les animaux
Possible perte de poids liée au stress du gavage 2 fois par jour, et à l’infection à H. pylori. L’infection à H.Pylori peut induire une légère inflammation au niveau de l’estomac au bout de 5 semaines
Devenir
Nous souhaitons faire des analyses sur les prélèvements issus des animaux. Pour cela les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour que leurs organes soient prélevés.
Remplacement
L’effet antibactérien du composé EX-01 sur la croissance de H. pylori a été montré in vitro (dépôt de brevet en cours). L’absence de toxicité chez la souris a été démontrée. Des expérimentations chez la souris avec ce composé sont indispensables afin de confirmer sa biodisponibilité et son activité in vivo dans la muqueuse gastrique (environnement acide susceptible d’affecter l’activité de la molécule), éléments qui ne peuvent pas être modélisés in vitro.
Réduction
Le modèle d’infection à H. pylori est connu et maitrisé par notre équipe. Sur les échantillons prélevés nous prévoyons de réaliser des analyses biologiques de H. pylori à partir de la muqueuse gastrique des souris infectées, et l’analyse histopathologique pour quantifier l’inflammation gastrique. Des études statistiques seront réalisées : d’après les publications précédentes de l’équipe et d’après la littérature scientifique sur ces modèles murins d’infection par H. pylori, qui présentent une certaine hétérogénéité de réponse entre animaux, des groupes de 10 animaux par condition expérimentale sont requis.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (nids de litière). Les souris seront suivies quotidiennement par le personnel de l’animalerie ainsi que par les expérimentateurs. Si l'animal commence à perdre du poids, de la nourriture humidifiée sera mise dans la cage. Si l’état de l’animal ne s’améliore pas en 48 h il sera immédiatement euthanasié. Si l'animal présente des signes de souffrance trop importants il sera euthanasié sans attendre. Les souris seront pesées deux fois par semaine, si la perte de poids est de 10% par rapport à la semaine précédente l’animal sera euthanasié sans attendre.
Choix des espèces
Le modèle d’infection à H. pylori a été mis au point chez la souris C57BL6J et est maitrisé au laboratoire. Les souris seront utilisées à un âge de 6 semaines car c’est l'âge optimal pour permettre une infection à H. pylori. Après ce stade l’infection ne se met pas en place.
Evaluation de l’efficacité de composés antiviraux sur un modèle in vivo de souris infectées par du virus de la vaccine
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles sont infectées par le virus de la vaccine par voie intranasale, dont une partie pour établir la dose létale, puis traitées par des injections deux fois par jour, avec perte de poids, détresse respiratoire et léthargie possibles. La mise à mort est justifiée par des raisons de biosécurité empêchant leur sortie de l'installation. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne rend compte d'une infection multiviscérale et présente le projet comme une préparation contre une réémergence de la variole.
Objectifs
L'objectif du projet est d'établir la preuve d'efficacité thérapeutique in vivo de molécules ciblant de nombreux virus et notamment les « Poxvirus ». Les Poxvirus sont des virus qui infectent les hommes et les animaux et sont responsables dans l’histoire d’épidémies très graves comme le virus de la variole ayant un taux de mortalité aux alentours des 30%. Bien qu’éradiqué, le virus est maintenu dans deux centres de recherche (aux Etats-Unis et en Russie) et une reconstruction du virus par génie génétique est possible. Une réapparition accidentelle ou une réintroduction volontaire du virus pourrait engendrer une pandémie avec un taux de mortalité estimé de 15 à 90%. D'autres poxvirus circulent, comme le monkeypox et le camelpox, et sont préoccupants. Il n'existe à l'heure actuelle qu'une seule molécule anti-poxvirus approuvée, mais les poxvirus développent rapidement des résistances contre celle-ci. Il est donc nécessaire de disposer de plusieurs antiviraux efficaces. Nous avons développé des molécules capables de bloquer la formation du virus et ainsi bloquer sa dissémination dans l'organisme. Les performances in vitro des molécules et les résultats préliminaires obtenus nous confortent et apportent un rationnel suffisant pour la poursuite des développements.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d'établir l'efficacité de molécules d’intérêt contre une infection par un poxvirus. Ces résultats ouvriront la voie à une création de société pour assurer le développement pharmaceutique de ces molécules. Ce développement impliquera le test chez une seconde espèce animale, la poursuite des développements notamment une optimisation de la formulation et des études toxicologiques. En cas de succès, à plus long terme, le bénéfice final sera de pouvoir proposer des molécules thérapeutiques antivariolique et anti-poxvirus pour le traitement des émergences virales et assurer des stocks nationaux de préparation contre une réémergence de la variole d'origine accidentelle ou provoquée. Comme le montre la crise COVID, la vaccination d'une population importante est très complexe, longue, et requiert d'avoir en parallèle à disposition des médicaments antiviraux pour faire face aux premières phases de l’épidémie.
Procédures
Procédure 1a : détermination de la DL90 (dose létale 90%) du poxvirus ; les animaux seront anesthésiés une fois par injection intrapéritonéale puis infectés une fois par instillation intranasale. Procédure 1b : évaluation de l'innocuité du traitement sur 10 jours ; les animaux recevront 2 fois par jour pendant maximum 10 jours une injection au niveau du flanc d’une des molécules à différentes doses. Procédure 2a : évaluation de l'efficacité anti VACV-WR de la molécule ; les animaux seront anesthésiés une fois par injection intrapéritonéale puis infectés une fois par instillation intranasale et recevront 2 fois par jour pendant maximum 12 jours une injection des molécules au niveau du flanc. Un suivi précis des animaux sera alors réalisé. Les animaux en fin de procédure seront mis à mort après sédation préalable . Procédure 2b : Analyse des titres viraux dans les poumons à J+4 post-infection ; les animaux seront anesthésiés une fois puis infectés une fois par instillation intranasale. Les animaux recevront 2 fois par jour pendant maximum 6 jours une injection de la molécule au niveau du flanc. Les animaux en fin de procédure seront mis à mort après sédation préalable.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables suivants peuvent être observés jusqu'à atteinte des points limites préalablement définis : perte de poids rapide ou progressive de 20 %, difficultés respiratoires, réduction de la mobilité, nécrose tissulaire au point d’injection, léthargie.
Devenir
Expérience 1a : Les souris n'ayant pas été mis à mort au cours de la détermination de la DL90 du virus de la vaccine le seront à la fin de la procédure pour des raisons de biosécurité empêchant leur sortie de l'installation. Expérience 1b : Les souris utilisées pour l'évaluation de l'innocuité du traitement sur 10 jours seront mis à mort à la fin de la procédure pour des raisons de biosécurité empêchant leur sortie de l'installation. Expérience 2a : Les souris n'ayant pas été euthanasiées au cours de l'essai d'efficacité antivirale de la molécule seront mis à mort à la fin de la procédure pour des raisons de biosécurité empêchant leur sortie de l'installation. Expérience 2b : Les souris utilisées pour l'analyse des titres viraux à J+4 post-infection dans les poumons seront mis à mort pour dissection.
Remplacement
Il n’existe aucune méthode alternative permettant d’évaluer les effets bénéfiques d’une molécule luttant contre une infection avec du virus de la vaccine. Les méthodes in vitro et ex vivo ne rendent pas compte de la complexité d'une infection multiviscérale.
Réduction
Nous avons calculé le nombre d’animaux de façon à obtenir des données statistiquement fiables avec le moins d’animaux possible. Seule la molécule la plus efficace in vitro est testée in vivo, et avec le minimum de conditions de concentrations et de plannings de traitement nécessaires au retour scientifique permettant d'évaluer le potentiel antiviral de la molécule testée. Le nombre d’animaux par groupe est suffisant pour mettre en évidence des différences de survie par la méthode de Kaplan-Meier et de charge virale par le test de Mann-Whitney.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux sur litière et avec un enrichissement (abri et matériel de nidification) afin de réduire le stress. Les souris sont hébergées en groupes avec un enrichissement du milieu (maison en carton, coton). Les procédures d’instillation du virus sont réalisées sur animal anesthésié et lors de l'anesthésie les animaux sont placés sur un tapis chauffant pour éviter l'hypothermie. Les animaux sont quotidiennement suivis par l’expérimentateur et en cas de signes de souffrance persistante l’expérience sera stoppée.
Choix des espèces
La souris est un bon modèle d'étude pour évaluer l'efficacité de molécules antivirales contre le virus de la vaccine, avec notamment une réplication importante du virus dans les voies respiratoires. La littérature sur ce modèle est suffisamment riche pour permettre une comparaison de l’efficacité de la molécule. Souris Balb/c âgées de 4 à 6 semaines : il s’agit de la souche la plus utilisée pour les infections par du virus de la vaccine et l’âge est bien adapté car les souris âgées de 4 à 6 semaines ont déjà un système immunitaire fonctionnel.
Evaluation d’un nouveau procédé visant à éradiquer des bactéries indésirables dans le tractus gastro-intestinal
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles reçoivent jusqu'à cinq gavages successifs d'une bactérie pathogène puis d'une bactérie modifiée, pour tester une approche censée éradiquer des bactéries multirésistantes dans l'intestin. Le porteur indique que l'infection par Citrobacter rodentium provoque perte de poids et inconforts digestifs. Il affirme qu'il est "indispensable" d'avoir recours aux animaux pour observer l'efficacité du traitement dans un "organisme entier", les applications cliniques restant hypothétiques.
Objectifs
La résistance aux antibiotiques constitue aujourd’hui l’une des plus graves menaces pesant sur la santé humaine et la sécurité alimentaire à l’échelle mondiale. En effet, un nombre croissant d’infections bactériennes deviennent de plus en plus difficiles à traiter car l’antibiothérapie n’est plus efficace lorsque l’agent pathogène responsable de l’infection est multi-résistant. Dans ce contexte, notre projet vise à développer une nouvelle approche antimicrobienne innovante permettant d’éradiquer spécifiquement un agent pathogène ciblé. Cette méthode est basée sur l’utilisation d’une souche bactérienne capable de transférer un système de ciseaux moléculaires qui coupe le chromosome de l'agent pathogène et conduit à sa destruction. Cet outil a été validé in vitro en utilisant des cultures bactériennes pures. L’étape suivante est désormais d’évaluer l’efficacité de cette méthode in vivo lors d’infections expérimentales d’animaux à travers l’utilisation de 2 modèles.
Bénéfices attendus
Dans le contexte actuel nécessitant l’identification de nouvelles stratégies antibactériennes, l’approche TAP(Targeted Antibacterial Plasmids) testée dans ce projet pourrait devenir une nouvelle stratégie antibactérienne contribuant à améliorer la santé humaine, animale et végétale. Cela représenterait une véritable avancée pour la microbiologie clinique et environnementale, en démontrant une efficacité de l’approche TAP pour limiter le devenir d'une infection intestinale ou de permettre la décolonisation du tractus digestif par des souches multi-résistantes aux antibiotiques (portage asymptomatique). Sous couvert de s’adapter à l'évolution de la réglementation OGM (Organisme Génétiquement Modifié) , la technologie TAP permettrait de concevoir des microbes « thérapeutiques » pour cibler spécifiquement les souches multirésistantes ou les agents pathogènes dans le microbiote intestinal, tout en respectant les espèces commensales résidentes dont nous savons qu'elles sont bénéfiques pour la santé de l'hôte. Cette méthode pourrait s’appliquer aussi bien à l’éradication d’agent pathogène intestinaux qu’à la décolonisation préventive de souches multirésistantes associées à un portage asymptomatique, et ainsi de réduire la probabilité de dissémination de la résistance et donc l’émergence de nouvelles souches pathogènes multirésistantes.
Procédures
Afin d'évaluer une nouvelle approche antimicrobienne, il sera nécessaire de réaliser des gavages oraux de souris dont la fréquence varie en fonction des lots d'animaux (gavage avec une bactérie responsable d'infection intestinale ou multi-résistante aux antibiotiques en tant qu'agent à éradiquer; gavage avec une bactérie bénéfique intégrant le système anti-microbien visant à supprimer la bactérie indésirable préalablement inoculée). Au maximum, les souris subiront 5 gavages avec une fréquence de gavage tous les 2 jours.
Impact sur les animaux
Le premier modèle expérimental impliquant une colonisation du tractus digestif des souris par une souche d'E. coli exprimant une BLSE (beta-lactamase à spectre étendue) ne genère aucune nuisance particuliere d'après les données de la littérature. Le second modèle impliquant une infection par le pathogène C. rodentium va induire différents effets indésirables sur les animaux tels que perte de poids et inconforts associés à la pathologie intestinale.
Devenir
L’ensemble des animaux prévus pour chaque procédure expérimentale sera euthanasié par dislocation cervicale
Remplacement
Les études in vitro de l'approche TAP en condition de laboratoire ont d’ores et déjà été effectuées et ont permis de valider l’efficacité de cette nouvelle approche antimicrobienne (Nucleic Acids Res. 2021;49(6):3584-3598). Dans une optique de développement de nouvelles stratégies anti-infection, il est indispensable d’avoir recours aux animaux pour observer l’efficacité du traitement dans un organisme entier afin de prendre en compte la complexité du système qui intègre à la fois la réponse immunitaire, la structure du tractus digestif ainsi que la présence du microbiote intestinal. Il n’existe pas de modèles cellulaires reproduisant la complexité de ces interactions.
Réduction
Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre d’animaux nécessaire pour répondre aux différentes questions scientifiques à la fois pour garder une puissance statistique suffisante dans le traitement de nos résultats, et pour palier l’exclusion de certains animaux au cours de l’expérimentation. Après application d'un test de Grubbs pour repérer et exclure de possibles valeurs aberrantes, un test ANOVA sera appliqué afin d'évaluer l'impact des traitements sur les paramètres mesurés. Il s’agit d’un nombre d’animaux maximal qui sera revu à la baisse en fonction des premiers résultats obtenus qui pourront dans certains cas ne pas nécessiter de répétitions pour valider les observations. Par ailleurs, certains lots d'animaux sont partagés entre les deux procédures expérimentales afin de limiter le nombre d'animaux utilisés sans pour autant amoindrir la qualité scientifique des données.
Raffinement
Les protocoles expérimentaux ont été raffinés à partir des données de la littérature et de notre expérience antérieure. Un enrichissement de l'environnement est prévu par ajout de cylindre de coton dans les cages (Cocon SERLAB). L’ensemble des animaux seront suivis quotidiennement par du personnel qualifié selon une grille de suivi clinique claire comprenant 4 stades distincts établis en fonction de la perte de poids et de l'état visuel des animaux (pelage et comportements). Si les points limites tels que définis dans le projet sont atteints, les animaux seront immédiatement sortis du protocole expérimental et euthanasiés selon la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
La souris est l’hôte naturel de l’agent pathogène Citrobacter rodentium utilisé dans cette étude et constitue un bon modèle pour étudier les infections bactériennes intestinales chez les mammifères. Animaux de 4 à 6 semaines. L’utilisation d’animaux pesant entre 18 et 20 g le jour de l’infection permet de limiter la variabilité de réponse entre animaux vis-à-vis de l’infection.
Etude de l’effet anti-inflammatoire d’hydrogels synthétisés à partir d’acide hyaluronique chargés en LipoxinA4 dans un modèle d’inflammation murin.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit sous anesthésie quatre injections sous-cutanées dorsales, dont une de LPS destinée à déclencher une inflammation, pour évaluer un hydrogel chargé en lipoxine A4. Le porteur indique que le dispositif peut gêner les mouvements des animaux et prévoit une mise à mort par dislocation cervicale afin de prélever la membrane. Il affirme qu'il est "nécessaire" de travailler sur des systèmes biologiques complexes, les applications en dentisterie restant renvoyées au long terme.
Objectifs
Le contexte clinique du projet est celui de maladies inflammatoires orales (inflammation pulpaire = pulpite et inflammation parodontale = parodontite). Les parodontites et les pulpites sont des maladies respectivement du parodonte (tissu de soutien de la dent) et de l’endodonte (tissu conjonctif situé à l’intérieur de la dent). Ces deux affections sont très fréquentes, génèrent des douleurs, des pertes dentaires, une altération de la qualité de vie et des coûts pour les individus et la société. Dans ces deux situations, des microorganismes sont à l’origine d’une inflammation des tissus conjonctifs constitués par le parodonte et par l’endodonte. Cette réaction inflammatoire est au départ normale et a pour objectif un retour à la normale appelée « homéostasie ». L’homéostasie fait intervenir des médiateurs spécialisés appelés « médiateurs lipidiques pro-résolutifs » tels que les « lipoxines ». Ces dernières ont été étudiées in vitro et in vivo, et ont montré́ une action efficace à différents niveaux de la réponse immunitaire.De plus, les lipoxines ont été étudiées dans différents contexte inflammatoire (maladies auto-immunes, cancers, parodontites...) sur des modèles animaux. Pour répondre à ces besoins, nous avons créé un dispositif (hydrogels) permettant la libération in situ des LXA4. L’objectif du projet est donc d’évaluer le caractère anti-inflammatoire de notre proposition thérapeutique. Pour cela, nous utiliserons le modèle murin de poche d’air sous-cutané (air pouch). Nous induirons la formation d’une cavité en injectant de l’air stérile en sous-cutané au niveau dorsal puis nous procèderons à l’injection de nos hydrogels plus ou moins chargés en LXA4 avant de simuler une inflammation. Ce modèle est pertinent car il permet d’étudier les composants de l'inflammation, la résolution de la réponse inflammatoire, la réponse au stress oxydatif et par conséquent les cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement de l'inflammation.
Bénéfices attendus
Ce modèle nous permettra d’induire une inflammation dans un système global ce qui n’est malheureusement pas possible avec les expérimentations in vitro. Nous pourrons alors évaluer l’effet anti-inflammatoire de nos hydrogels chargés en LXA4. Les médicaments anti-inflammatoires actuellement disponibles, ont pour objectif d'atténuer une inflammation excessive sans compromettre la défense de l'hôte. Les nouvelles stratégies thérapeutiques utilisant des LXA4, qui améliorent la résolution de l’inflammation pourraient avoir un meilleur rapport bénéfice/risque. A court terme ce protocole nous permettra de répondre à plusieurs questions. Tout d’abord, nous pourrons choisir une formulation d’hydrogel, la plus efficace pour favoriser la résolution de l’inflammation. Nous pourrons également valider l’effet de la LXA4 in vivo dans un système complexe et non seulement in vitro sur les macrophages. Notre proposition peut également être avantageuse par rapport à d'autres systèmes d'administration de médicaments (tels que des nanoparticules synthétiques) qui ont des effets toxiques indésirables potentiels. A plus long terme, ce protocole marquera une avancée dans l’élaboration d’un système complexe permettant de relarguer des molécules anti-inflammatoires telles que la LXA4 de manière contrôlée dans le temps. En clinique, l’objectif final sera d’apporter une alternative supérieure en termes de cicatrisation et de régénération des tissus concernés dans le cadre des pulpites et parodontites. Bien que notre perspective se concentre sur le domaine de la dentisterie, l'utilisation de notre proposition thérapeutique pourrait être déployée afin de traiter de multiples maladies inflammatoires et/ou des défauts osseux.
Procédures
Injections sous cutanées sur animaux anesthésiés sous isoflurane : 4 injections / souris (2 injections d’air + 1 injection hydrogel / contrôle + 1 injection LPS). Chaque injection prendra quelques secondes. Les animaux seront observés après chaque injection pour s'assurer de leur bonne santé.
Impact sur les animaux
Ce modèle bien décrit, entrainera une inflammation contrôlée du tissu sous cutané au niveau de la poche dorsale. Ce protocole de classe modérée ne devrait pas conduire à des effets indésirables ou douloureux pour les animaux bien qu’ils peuvent néanmoins entraîner une gêne dans les mouvements et déplacements des animaux. La lipoxine A4 n’est pas un produit irritant (information vérifiée dans la fiche de données de sécurité du produit fourni par Cayman). Nous resterons bien évidemment très attentifs sur tout comportement anormal des animaux de manière à soulager leur douleur si celle-ci venait à apparaître.
Devenir
Mise à mort par dislocation cervicale pour tous les animaux. Les animaux doivent être mis à mort afin de pouvoir récupérer la membrane de la poche créée et ainsi d'effectuer les analyses histologiques post mortem nécessaires à notre projet.
Remplacement
Cette étude prend en compte la règle des 3R. Les expériences in vitro ne permettent malheureusement pas de mimer les interactions complexes intervenant entre les différents acteurs cellulaires (macrophages, neutrophiles, monocytes…) et les différents systèmes (immunitaires, vasculaires…). Il est donc nécessaire de travailler sur des systèmes biologiques complexes représentés par les animaux afin de mieux étudier les mécanismes mis en jeu lors de la réponse inflammatoire.
Réduction
Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les formulations d’hydrogels ont été testées et sélectionnées en amont pour leur biocompatibilité et leur caractère anti-inflammatoire in vitro. Compte-tenu d’études comparables déjà effectuées, le nombre d’animaux par groupe correspond au nombre minimal requis pour atteindre une significativité statistique (n=6). L’épaisseur de la membrane de la poche sera comparée dans les différents groupes par une analyse de variance puisqu’il s’agit de valeurs quantitatives indépendantes. Le même type de test sera utilisé pour la comparaison de la quantité de leucocytes présents dans l’exsudat. Le fait de répéter les expérimentations selon l’homogénéité des premiers résultats permettra d’étudier la reproductibilité des effets observés.
Raffinement
Pour réduire l’angoisse, les animaux seront manipulés plusieurs jours avant l’expérimentation dans un but d’habituation et leur environnement sera enrichi (alpha-dri). Les souris seront hébergées à raison de 5 souris par cage. Nous raffinerons également en réduisant les éventuelles douleurs via des antalgiques (buprénorphine) lors des expérimentations afin d’améliorer la reproductibilité et la qualité des résultats obtenus. Les souris seront observées et pesées quotidiennement jusqu’à la fin de l’expérimentation. Par ailleurs, des points limites ont été identifiés et les procédures de raffinement à mettre en œuvre lors de l’atteinte de ces points limites ont été décrites. Enfin, les analyses menées sur chaque animal seront complètes : d’une part l’exsudat sera récupéré pour analyse des cytokines et de l’expression génique des cellules, et d’autre part la membrane sera récupérée pour analyses histologiques
Choix des espèces
L’utilisation de souris est justifiée puisque le modèle d’injection d’air stérile sous-cutané a été développé chez cet animal de manière rapide et reproductible. Ces modèles sont décrits et reconnus dans le domaine de l’inflammation. Les animaux reçus auront 6 semaines, ils auront une semaine d’acclimatation dans l’animalerie avant le début du protocole. Les souris auront donc 7 semaines au début du protocole et 8 semaines à la fin du protocole. Ce choix correspond à notre volonté de travailler sur de jeunes adultes afin d’éviter les effets liés à la sénescence, de plus cela correspond aux protocoles standards retrouvés dans la littérature concernant ce modèle d’inflammation.
Tests précliniques d’efficacité d’anticorps monoclonaux dans le traitement ou la prévention d’une infection aiguë à Pseudomonas aeruginosa
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
1 056 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Elles sont infectées par la bactérie Pseudomonas aeruginosa, sous forme pulmonaire ou généralisée, les groupes non traités étant maintenus jusqu'à 48 heures avec les signes de l'infection avant la mise à mort. Le projet teste des anticorps contre des bactéries résistantes aux antibiotiques, débouchés cliniques annoncés au conditionnel. Le porteur affirme que les tests in vitro ne rendent pas compte d'un "système immunitaire entier" et que le passage in vivo est requis.
Objectifs
La résistance des bactéries aux antibiotiques est un problème majeur de santé publique. On estime à plus d’1 million le nombre de décès dus à ces bactéries multirésistantes par an dans le monde. Parmi ces germes, Pseudomonas aeruginosa est un pathogène qui affecte particulièrement les patients hospitalisés. Cette bactérie est fréquemment responsable d’infections pulmonaires, de la peau, et parfois généralisée. L’augmentation du nombre de ces germes multirésistants fait craindre l’apparition et le développement de germes resistants à tous les traitements, alors qu’aucune nouvelle classe d’antibiotiques n’a été découverte depuis plus de 20 ans. Le développement de nouveaux médicaments est donc nécessaire et urgent. Il a récemment été montré que certaines souris vaccinées contre une protéine de P. aeruginosa produite en laboratoire étaient protégées vis-à-vis d’une infection à cette bactérie. De plus, il a été publié que les anticorps produits par cette vaccination pouvaient à eux seuls protéger les souris d’une infection létale à P. aeruginosa. Ces anticorps pourraient donc être utilisés comme thérapie contre des bactéries P. aeruginosa résistantes aux antibiotiques. Nous avons pour cela sélectionné et produit 2 anticorps. Le but du projet est de tester l’efficacité de ces anticorps dans un modèle murin d’infection à P. aeruginosa. Cette efficacité sera testée sur des animaux infectés par des bactéries sensibles et résistantes aux antibiotiques. Dans l’hypothèse où l’efficacité d’au moins 1 de ces anticorps est confirmée, la dose minimale efficace sera établie et des analyses complémentaires aideront à définir le mécanisme d’action de ces anticorps et à présager d’une efficacité semblable chez l’Homme. L’efficacité de ces anticorps pourra être évaluée en thérapeutique ainsi qu’en préventif. Ces 2 approches étant pertinentes dans un contexte de limitation de la mortalité due aux bactéries multirésistantes en soins intensifs. Si les résultats sont positifs, cette étude d’efficacité pourra rapidement ouvrir la voie vers des essais cliniques chez l’Homme.
Bénéfices attendus
L’objectif du projet est d’évaluer chez la souris l’efficacité d’anticorps dans le traitement ou la prévention d’une infection à P. aeruginosa résistante aux antibiotiques. Le projet permettra ainsi de déterminer sous quelle forme, à quelle dose, selon quel mode d’administration (thérapeutique et/ou préventif), contre quel type d’infection (pulmonaire et/ou généralisée) et contre quelles bactéries (résistantes à 1 ou plusieurs classes d’antibiotiques), ces anticorps pourraient être employés chez l’Homme. Les résultats de différentes analyses menées à l’issue du projet aideront également à définir le mécanisme d’action de ces anticorps et à présager d’une efficacité semblable chez l’Homme. Ces démonstrations d’efficacité chez la souris seront requises pour pouvoir effectuer les tests pré-cliniques réglementaires préalables à la réalisation des essais cliniques chez l’Homme. Si l’absence de toxicité et l’efficacité de nos anticorps sont confirmées lors des essais cliniques, nos anticorps pourraient être utilisés pour traiter ou prévenir la survenue d’infections à P. aeruginosa dont certaines sont multirésistantes aux antibiotiques et affectent fréquemment les patients hospitalisés en soins intensifs. Enfin, la démonstration d’efficacité de nos anticorps chez la souris servira également de preuve de concept validant le choix de leur cible, la technologie associée à leur développement ainsi que l’approche des anticorps pour traiter ou prévenir les infections bactériennes résistantes aux antibiotiques ; ce qui représentera une avancée majeure dans la lutte contre l’antibiorésistance. Notre plateforme de développement d’anticorps pourra alors être rapidement dédiée au développement de nouveaux anticorps dirigés contre d’autres bactéries multirésistantes.
Procédures
Des souris seront vaccinées au travers de 4 injections réalisées à 2 semaines d’intervalle l’une de l’autre sur animaux vigiles. Le sang des souris sera prélevé sous anesthésie générale. Des souris seront ensuite infectées par injection bactérienne. Les différents types de traitements seront administrés aux souris par injection. Induction de l’anesthésie générale : 10 min/souris (maximum 2 anesthésies par souris) ; Prélèvement sanguin : 2 min/souris ; Administration par injection : 1 min/souris (maximum 4 injections par souris).
Impact sur les animaux
Les souris subissent un stress léger dû aux contentions et une douleur légère due aux administrations par injections (maximum 4 injections).12h suite à l'inoculation bactérienne, les souris peuvent présenter des signes infectieux pendant maximum 96h, tels que prostration, fièvre, poils ébouriffés, dos voussé, inactivité et mouvements respiratoires rapides.
Devenir
Toutes les souris infectées seront gardés en vie jusqu’à 96h pour les souris des groupes traités, et jusqu’à maximum 48h pour les souris des groupes non traités. Toutes les souris seront mises à mort afin de récupérer le sang et les organes pour analyses post-mortem.
Remplacement
L’objectif du projet est de déterminer si les anticorps d'intérêt sont capables de neutraliser une infection à la bactérie Pseudomonas aeruginosa afin de pouvoir, le cas échéant, les utiliser à des fins thérapeutiques ou préventives chez l’Homme. Un certain nombre d'animaux a été remplacé par des expériences in vitro permettant de standardiser et d’optimiser les protocoles expérimentaux à appliquer chez l’animal. Dans le cas présent, deux anticorps d’intérêt particulier ont pu être sélectionnés in vitro. Cependant, ces tests ne rendent pas compte de la complexité d’un organisme vivant, et en particulier ne prennent pas en compte l’existence d’un système immunitaire entier. La fixation de nos anticorps à la surface de la bactérie est en effet la première étape d’un processus immunologique complexe menant à l’élimination par le système immunitaire du pathogène. Il fait intervenir de nombreuses cellules immunitaires ainsi que des médiateurs de l’immunité dont l’équilibre et l’action dans le temps sont consubstantiels de l’efficacité de la réponse immunitaire initiée par nos anticorps. Ces interactions et équilibres fins sont impossibles à ce jour à reproduire in vitro, d’autant plus que l’analyse de la maladie et de l’efficacité́ des anticorps se fondent sur l’étude de plusieurs tissus/organes (rate, ganglions lymphatiques) et des cellules immunitaires. La seule interprétation de résultats in vitro ne permettrait donc en aucun cas de conclure quant à la validité du traitement. C’est pour cette raison, qu’après un long processus de sélection in vitro, nous devons tester nos deux anticorps candidats in vivo.
Réduction
Il a préalablement été démontré que traiter des souris n’ayant jamais été infectées par la bactérie Pseudomonas aeruginosa avec le sérum de souris immunisées leur permettait de surmonter une infection généralisée à P. aeruginosa. Notre approche expérimentale vise à inclure tous les contrôles pertinents afin de valider définitivement chaque étape. Par ailleurs, notre stratégie consiste à tester séquentiellement, par ordre décroissant de pertinence, différentes options concernant la voie d’inoculation, la voie d’administration des anticorps, l’approche thérapeutique ou préventive, ou encore le type d'anticorps. Lorsqu’une option est validée, nous passons à la procédure suivante. En procédant de la sorte, nous limitons au maximum le nombre de conditions testées et donc le nombre d’animaux utilisés dans le cadre de cette étude. Des prélèvements de sang et d’organes seront également réalisés à l’issue de chaque expérience et conservés en cas de besoin, afin de ne pas avoir à reproduire ces expériences. Enfin, le nombre de souris nécessaire pour chaque expérience a été établi en tenant compte de la variabilité inter-individuelle dans la réponse à l’infection et au traitement et afin d’atteindre une puissance statistique suffisante. Le nombre de souris permettra de réaliser des tests statistiques nécessaires à l’interprétation des expériences.
Raffinement
Les souris seront hébergées à 6 par cage et elles évolueront dans un environnement enrichi. Le prélèvement sanguin réalisé notamment chez les souris immunisées se fera par ponction intracardiaque (procédure terminale) après anesthésie générale. L’inoculation de bactéries (P. aeruginosa), d’anticorps ou de fragments d’anticorps aux souris par voie orotrachéale se fera après anesthésie générale pour réduire leur stress, leur éviter de ressentir une quelconque douleur et faciliter la réalisation de la procédure par l’expérimentateur. Toutes les souris bénéficieront d’une surveillance accrue à partir de 12h après leur infection, durée à partir de laquelle les premiers signes cliniques de l’infection devraient apparaitre. L’apparence physique, le comportement, la dyspnée et la température corporelle de toutes les souris seront évalués toutes les 2h de 7h à 19h et un score leur sera attribué. Si le score d’une souris atteint la valeur limite fixée, celle-ci sera mise à mort. Afin d'éviter la mort spontanée, les points limites seront avancés le soir. Une étude rétrospective sera réalisée afin de mieux déterminer les futurs points limites lors de prochaines procédures ayant le même modèle infectieux.
Choix des espèces
Des souris ont déjà été utilisées pour démontrer l’efficacité d’un sérum (d’anticorps) provenant de souris vaccinées contre P. aeruginosa. Il s’agit d’un modèle approprié à l’étude de la réponse immunitaire et validé par la communauté scientifique. Les souris utilisées seront âgées de 6 semaines. Elles seront réceptionnées à l’âge de 5 semaines puis seront stabulées pendant 1 semaine d'acclimatation. A ce stade, les souris sont sevrées et disposent d’un système immunitaire mature, permettant leur étude.
Évaluation in vivo sur le modèle souris infectées par Plasmodium berghei des propriétés prophylactiques et thérapeutiques de candidats anti-paludiques.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
3 180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont infectées par le parasite du paludisme Plasmodium berghei, suivies par prélèvements sanguins répétés et traitées par gavage ou injection, puis tuées. Une partie est aussi utilisée pour des repas sanguins de moustiques et des exsanguinations. Le projet teste des candidats antipaludiques, dont des extraits d'Artemisia. Le porteur affirme que le recours à l'animal est justifié par la "nécessité" de tester ces composés dans un "organisme entier".
Objectifs
Le Paludisme (ou Malaria) est une maladie parasitaire qui reste un problème majeur de santé publique dans le monde. Elle sévit dans 87 pays au niveau de la ceinture intertropicale et concerne près de la moitié de la population mondiale. Le Paludisme est dû à un parasite eucaryote unicellulaire appelé Plasmodium dont 5 espèces infectent l’Homme, les 2 majoritaires étant Plasmodium falciparum et vivax. D’après le rapport de l’OMS 2021, il a été répertorié 241 millions de cas de paludisme en 2020 dont 82% en Afrique où en 2018, P. falciparum était responsable de 99,7% des cas, alors que 53% des cas en Asie du Sud-Est étaient dus à P. vivax. Le Paludisme a fait 627 000 morts en 2020, principalement des enfants de moins de 5 ans de par leur faible immunité face à la maladie et 95% en Afrique car P. falciparum est responsable de la quasi-totalité des cas graves. La mise en place de techniques préventives telles que la distribution de moustiquaires imprégnées à grande échelle mais aussi l’amélioration du diagnostic ainsi que la mise au point de traitements ont permis de diminuer l’incidence du paludisme au cours des années. Puis tout récemment, le 06 octobre 2021, un 1er vaccin, le RTS,S/AS01 (Mosquirix) a été approuvé par l’OMS pour les enfants de moins de 5 ans avec une efficacité d’environ 30% ce qui représente une 1ère étape en terme de vaccination mais ne suffira pas à contenir la maladie en l’état. Or, il faut faire face à l’apparition régulière de résistances aux différents traitements administrés dans toutes les zones où le paludisme sévit (chloroquine, sulfadoxine pyrimethamine, méfloquine, etc…). Les derniers traitements en date et recommandés par l’OMS sont des combinaisons thérapeutiques à base d’artémisinine (ART), ou ACTs. Mais des parasites résistants à l’ART et à ses partenaires sont apparus progressivement en Asie du Sud Est (Cambodge) depuis quelques années pouvant entraîner des échecs thérapeutiques avec ces traitements. Des parasites multi-résistants, dont à l’ART, ont récemment été mis en évidence au Rwanda et en Ouganda, ce qui est inquiétant quant à leur propagation en Afrique. Face à cette situation, il est urgent d’identifier des molécules innovantes et efficaces avec des modes d’action différents en ciblant de nouvelles cibles thérapeutiques. Puis, sur du plus court terme, d’évaluer l’efficacité des infusions à base d’Artemisia déjà largement utilisées, notamment en Afrique.
Bénéfices attendus
Des résultats antérieurs ont permis de sélectionner des produits inhibiteurs d’une enzyme parasitaire appelée SUB1 qui a été décrite comme une nouvelle cible thérapeutique. Parmi eux, certains ont également une efficacité sur le parasite Plasmodium falciparum cultivé in vitro aux stades spécifiques auxquels SUB1 joue un rôle essentiel ce qui prouve leur capacité à traverser les barrières physiques que sont les membranes cellulaires et donc leur possibilité d’atteindre leur cible pour pouvoir l’inhiber efficacement. L’objectif est maintenant de poursuivre l’optimisation, en collaboration avec nos collègues chimistes, afin de sélectionner au maximum une dizaine de composés intéressants de part ces premières étapes de validation biochimiques et biologiques et donc de les tester en conditions réelles dans un organisme entier. Ce projet nous permettra d’évaluer l’activité anti-parasitaire des inhibiteurs de SUB1 in vivo en vue de les qualifier, ou pas, comme susceptibles d’entrer dans les phases ultérieures d’évaluation pré-cliniques. Différents extraits de plantes Artemisia annua et afra ont été testés sur des parasites sensibles et résistants aux combinaisons thérapeutiques à base d’artémisinine (ART) venant de patients du Cambodge. Pour une concentration en ART équivalente, ces extraits de plantes sont tout aussi efficaces que l’ART synthétique. Une adaptation du protocole afin de se rapprocher des conditions réelles d’une prise de traitement sur 3 jours et d’un équivalent par infusion sur 7 jours a permis de constater que ça améliore l’effet thérapeutique voire permet d’éliminer complètement les parasites même résistants après 7 expositions consécutives. Il semblerait possible d’améliorer la demi-vie initialement courte de l’ART via des inhibiteurs de la métabolisation de celle-ci ou par d’autres composés présents dans Artemisia. L’évaluation d’extraits d’Artemisia apportera des réponses précieuses quant à leur efficacité thérapeutique et prophylactique in vivo chez des parasites sensibles ou résistants à l’artémisinine. Ces données participeront, avec nos travaux réalisés sur la culture ex vivo de parasites P.falciparum résistants et sensibles à l’ART, à mieux caractériser l’activité anti-parasitaire des d’infusions à base d’Artemisia.
Procédures
L’infection des souris avec des globules rouges murins infectés par une injection intra-péritonéale ou intraveineuse dure une dizaine de secondes. Le suivi de la parasitémie se fait par prélèvements sanguins à la queue à partir du 2ème jour après l’infection et tous les jours jusqu’à J7 ou J8 puis tous les 2/3 jours jusqu’à maximum J30. Le geste ne nécessite pas d’échauffement préalable des animaux et ne nécessite que quelques secondes. L’administration des traitements se fait soit par injection intra-péritonéale à l’aide d’une seringue à insuline (30G) ou gavage intra-gastrique à l’aide de canules de gavage adaptées car flexibles et nécessite une dizaine de secondes. En fonction des procédures le traitement est administré en une seule fois ou répété jusqu’à 3 fois par jour pendant 7 jours au maximum. L’anesthésie se fait par injection intrapéritonéale d’un mélange de Xylazine / Kétanime à l’aide d’une seringue à insuline 30G et ne dure que quelques secondes. Une fois anesthésiées les souris infectées vont soit subir une exsanquination totale soit être utilisées pour infecter des moustiques via un repas sanguin. Ces 2 interventions nécessitent quelques minutes. Les manipulations de bioluminescence nécessiteront l’injection en intra-péritonéale d’une solution de D-Luciférine à chacune des souris qui sont alors remises en cage pour 5 minutes suite auxquelles elles sont anesthésiées par 5 minutes d’exposition à l’isoflurane puis maintenues endormies le temps de l’acquisition des images de bio-luminescence (10 à 15 minutes). Les souris sont ensuite replacées dans leur cage et surveillées jusqu’à leur réveil complet. Cette procédure aura lieu à 3 reprises à plusieurs heures d’intervalle.
Impact sur les animaux
Les souris seront infectées par le parasite P. berghei via une injection intra-péritonéale ou intra-veineuse ce qui occasionnera une gêne légère due à l’injection. Les souris seront maintenues en vie jusqu’à l’apparition des premiers effets indésirables de la maladie qui apparaissent graduellement : poils hérissés, mobilité lente ou prostration, état flasque de la queue, perte de plus de 10% du poids initial, équivalent au score 1 de la grille d’évaluation de la douleur, du stress et de l’inconfort du SBEA. .
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Une fois infecté par P. berghei et même dans le cas où le traitement administré a été un succès, les animaux seront mis à mort en fin d’expérimentation et donc non réutilisés afin de ne pas apporter de biais expérimentaux car pour des raisons de reproductibilité, toutes nos expériences sont effectuées sur des animaux dont le poids est similaire et donc l’âge identique afin de standardiser la posologie des traitements administrés.
Remplacement
Le recours à l'expérimentation animale est justifié par la nécessité de tester des composés candidats médicaments (que se soient de nouveaux composés chimiques ou des extraits de plante) dans un organisme entier, première phase indispensable avant d’éventuels essais pré-cliniques, et notamment dans un premier temps chez les rongeurs, ayant à disposition le modèle P. berghei/souris. Ce modèle permettra d’illustrer la capacité des composés sélectionnés à atteindre leur(s) cible(s) et donc à franchir les différentes barrières physiologiques, mais aussi de tenir compte de la métabolisation des composés qui ne peut être abordée in vitro, et ainsi de mesurer leur efficacité in vivo. De plus, il n’existe pas de technique qui permet de réaliser l’ensemble du cycle de vie complexe du parasite in vitro : chez les espèces qui infectent les rongeurs, le cycle de multiplication de P. berghei dans les globules rouges ne peut pas être reproduit in vitro. Les parasites doivent donc être propagés dans le sang des animaux avec un suivi de la parasitémie pour nos expériences mais aussi afin d’éviter que soit atteinte la phase d’occurrence des complications. Il est à noter cependant que seuls les inhibiteurs de SUB1 et les extraits de plantes dûment testés in vitro sur la culture de P.falciparum et ayant montré une activité anti-parasitaire significative seront testés in vivo. Enfin, concernant la cytotoxicité : - La cytotoxicité des inhibiteurs de SUB1 sera au préalable évaluée sur différents types cellulaires in vitro ; - Les extraits d’Artemisia sont issus de pharmacopées traditionnelles et sont bus tous les jours par des millions de personnes depuis des siècles sans qu’aucune toxicité n’ait été observée.
Réduction
Une analyse statistique issue d’expériences réalisées par le groupe il y a plusieurs années et très similaires à celles que nous aurons besoin de réaliser dans le futur a permis d’établir qu’une taille d’échantillon de minimum 5 animaux par groupe permet de détecter les différences de parasitémies interprétables eu égard aux questions posées, ie effet anti-parasitaire observé significatif ou pas pour un tel groupe de souris infectées par P. berghei, comparativement aux contrôles positif et négatif et donc cohérent avec la problématique biologique. Nous utilisons le nombre minimal possible d’animaux pour nos expériences tout en gardant une marge de sécurité d’une ou 2 souris par groupe en cas de problèmes lors de l’expérimentation ou intrinsèque à l’animal. Nous estimons donc que des groupes expérimentaux de maximum 7 individus par condition testée permettent en toute circonstance une appréciation significative au sens statistique du terme. Notre expérience montre que ce nombre d'animaux génère des écart-types exploitables. Ceci permet aussi de réduire le nombre d'expériences à répliquer et par conséquent le nombre d'animaux utilisés. Puis la stratégie choisie est de tester une pré-sélection de composés chimiques et un nombre réduit d’extraits de plante selon des protocoles expérimentaux plus allégés et nécessitant donc moins d’animaux (groupe de 3 individus) pour ensuite ne sélectionner qu’un nombre réduit de 2 candidats "pre-leads" anti-SUB1 et 2 extraits d’Artemisia dont les effets thérapeutiques et prophylactiques seront caractérisés plus précisément. L’objectif de cette pré-sélection est donc de réduire le nombre de composés et extraits à caractériser de façon complète, étape nécessitant plus de conditions expérimentales et donc plus d’animaux. Le statut immunologique d’animaux naïfs, ie n’ayant jamais été infectés, versus d’autres ayant préalablement été infectés représenterait une variable expérimentale susceptible d’introduire un biais expérimental de nature à nuire à la reproductibilité des résultats d’une expérience à l’autre. En conséquence, une fois infectés par P. berghei, et même dans le cas où le traitement administré aura été un succès, ces animaux seront mis à mort en fin d’expérimentation et donc non réutilisés.
Raffinement
1) Les souris sont hébergées dans des animaleries agréées. La température et la photo-périodicité de ces animaleries sont contrôlées. L’accès aux animaleries est strictement contrôlé et les animaux sont manipulés par des animaliers qualifiés et par des expérimentateurs formés. Les cages, contenant au maximum 7 individus, sont changées de façon hebdomadaire et y sont ajoutées en plus du biberon de boisson et la nourriture, des enrichissements de bien-être tels que des cotons, etc… 2) Pour les souris auxquelles sont inoculées Plasmodium berghei, la souche ANKA utilisée est adaptée aux rongeurs de laboratoire. Les souris infectées sont suivies régulièrement et les parasitémies déterminées. Les animaux sont mis à mort avant que n’apparaissent des symptômes graves de la maladie, liés à des parasitémies importantes, à l’origine de dommages systémiques (prostration, poils hérissés, perte de poids). 3) Pour éviter l’inconfort, notamment lors des repas sanguins des moustiques puis lors de l’acquisition d’imagerie de bio-luminescence, et la souffrance de l’animal lors de l’exsanguination afin de récolter le sang parasité pour en faire des cryo-stabilats, les animaux sont anesthésiés avec un mélange de Xylazine/Kétamine administrés par voie intra-péritonéale.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée pour ce projet est la souris (souches Swiss, BALB/C, NMRI Swiss, C57BL/6). Les hôtes naturels des parasites P. berghei sont des espèces de rongeurs sauvages (Grammomys, Thamnomys) d’Afrique Centrale. Des isolats de ces parasites ont été transmis et adaptés aux souris et rats de laboratoire depuis de nombreuses années par plusieurs équipes. Il est reconnu dans la communauté scientifique que l’infection des rongeurs avec ces parasites est un modèle biologiquement pertinent pour étudier plusieurs aspects du paludisme chez l’homme. La plupart des concepts, en particulier lors de la recherche de molécules anti-palustres préventives et/ou thérapeutiques ainsi que dans les 1ères phases de la validation d’un médicament, issus des modèles rongeurs se sont révélés exacts chez l’homme. La preuve de l’intérêt d’une recherche rigoureuse chez le rongeur pour éclairer ou suggérer la recherche chez l’homme n’est plus à faire. Les inoculations de parasites aux souris Swiss pour l’obtention des stabilats seront réalisées sur des jeunes adultes femelles de 3-4 semaines car elles ne sont pas immunocompétentes ce qui favorise l’infection par le parasite. Les expériences de l’évaluation des effets prophylactique et thérapeutique in vivo seront réalisées respectivement sur des souris femelles adultes C57BL/6 âgées de 7-8 semaines et NMRI Swiss ou BALB/C de 6 semaines car nous souhaitons que le poids de départ de ces souris au début de l’expérience soit d’environ 20g, paramètre important pour l’administration des différents traitements testés.
Analyse comparative de méthodes de détection des neurotoxines botuliques
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
1 968 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque souris reçoit une injection de neurotoxine botulique qui provoque une paralysie motrice et une insuffisance respiratoire irréversibles, avant une mise à mort par dislocation cervicale. Le projet compare des méthodes de détection en s'appuyant sur le test de létalité DL50 chez la souris, présenté comme la méthode "de référence". Le porteur revendique un objectif de remplacement "à terme", tout en maintenant l'usage de la souris comme standard de sensibilité.
Objectifs
Dans son ensemble, ce projet a pour ambition de répondre aux trois questions scientifiques décrites ci-dessous et qui s’inscrivent plus largement dans le défi sociétal de diminuer ou proscrire le recours aux tests diagnostiques sur animaux : 1) Établir des recommandations sur la validité et les limites des principales méthodes de détection des neurotoxines botuliques (BoNT). Cette étude dans son ensemble apportera des éléments scientifiques factuels permettant de définir les méthodes les plus sensibles et les plus spécifiques vis-à-vis de matrices environnementales et cliniques et en fonction des principaux sérotypes et sous-types de BoNT isolés en clinique. 2) Harmoniser et valider des produits de référence et des méthodes partagées dans le plus grand nombre possible de laboratoires Européens. 3) Établir des recommandations sur les développements technologiques à poursuivre pour améliorer la sensibilité ou spécificité des méthodes de diagnostic des neurotoxines botuliques et en particulier pour les sous-types les plus rarement retrouvés en clinique.
Bénéfices attendus
Les résultats apportés par ce programme auront des retombées tant en santé humaine qu’en terme de réduction du nombre d’animaux utilisés pour le diagnostic du botulisme : Bénéfices à court terme : - Un progrès notable sera obtenu en Europe par l’évaluation comparative de différentes méthodes de détection des neurotoxines vis-à-vis des principaux sérotypes et sous-types de BoNT isolés en clinique. - Le test de létalité chez la souris servira de standard de sensibilité de détection de l’activité des neurotoxines botuliques dans différentes matrices. Bénéfices à long terme : - Ce projet est une étape nécessaire en vue de l’utilisation de méthodes de remplacement du test de létalité chez la souris pour le diagnostic des neurotoxines botuliques. Ce programme permettra une comparaison complète de cinq méthodes in vitro en s’appuyant sur des données comparatives de dose léthale 50 (quantité d'une matière, administrée en une seule fois, qui cause la mort de 50 % (la moitié) d'un groupe d'animaux d'essai) obtenues sur modèle souris. - L’amélioration des méthodes biochimiques de détection des neurotoxines botuliques contribuera à l’amélioration du diagnostic précoce du botulisme, point essentiel à la réussite du traitement par sérothérapie et des réponses à la menace biologique au niveau national et international. Ce projet permettra de réduire le risque biologique dans les sociétés civiles. - Ce projet va donc directement permettre l’implémentation de la Directive européenne 2010/63/EU pour la protection des animaux et la réduction drastique de leur utilisation.
Procédures
Les animaux sont soumis à une seule injection intrapéritonéale (geste validé 19A)
Impact sur les animaux
Les signes caractéristiques de paralysie due à l’activité des toxines botuliques sont une paralysie motrice et une insuffisance respiratoire avec discordance respiratoire se manifestant par un resserrement de la ceinture abdominale et un soulèvement de la cage thoracique non synchrone avec les mouvements des flancs. Des signes précurseurs peuvent être observés notamment l’attitude générale de l’animal et/ou sa fourrure moins lisse et soignée. Les signes peuvent apparaitre plus ou moins rapidement en fonction du sérotype et sous-type de toxine botulique. Une fois que les signes apparaissent, ils évoluent de façon irréversible sauf dans le cas de doses inférieures proche de la LD50 (léger creusement des flancs) pour lesquelles les souris peuvent survivre et récupérer. Il est donc essentiel de procéder à un suivi de l’évolution du processus d’intoxication chez l’animal jusqu’aux premiers signes de souffrance sur une durée de 4 jours (selon la directive Européenne de la pharmacopée 10.0 référence 01/2020:0085, https://pheur.edqm.eu/home). Nous avons mis en place une surveillance quotidienne des animaux injectés, pour que tout animal présentant les signes avancés caractéristiques de paralysie irréversible due à la toxine botulique (symptomatologie combinée de paralysie motrice, insuffisance respiratoire et resserrement majeur de la ceinture abdominale) soient mis à mort par dislocation cervicale pour éviter une souffrance prolongée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
Les méthodes alternatives nouvellement développées pour la détection des neurotoxines botulique et leur sérotypage nécessitent pour un futur développement clinique une étape d’évaluation de leur sensibilité et spécificité par un groupe de laboratoires experts et ce vis-à-vis du test de létalité chez la souris qui est aujourd’hui la méthode standard de détection de l’activité des neurotoxines botuliques. A terme ce projet à pour ambition d’apporter des éléments rationnels pour progresser vers un remplacement des tests souris dans le diagnostique du botulisme et l’étude des toxines botuliques.
Réduction
La méthode de réduction est l’emploi du plus faible nombre de souris possible afin d’atteindre un coefficient de variation proche de 20% idéalement. Les conditions recommandées par les biostatisticien.ne.s ont conduit à : 1) l’utilisation de groupe de 2 ou 4 animaux et tests d’un minimum de dilutions encadrant les LD50. 2) bonnes pratiques de laboratoire et gestion des résultats pour permettre de limiter le nombre d’expériences nécessaires à l’obtention de résultats fiables tout en intégrant les recommandations de la pharmacopée Européenne 10.0 référence 01/2020:0085.
Raffinement
La surveillance des souris a été accrue afin de détecter le plus tôt possible les signes cliniques du botulisme. Nous cherchons à identifier des critères précoces notés sur la feuille d’observation qui nous permettront de prévoir l’apparition des symptômes de paralysie et donc mettre à mort l’animal. Des cotons « Dietgel » sont placés dans la cage dans le cas ou certaines souris auraient du mal à se déplacer. Si nous observons une déshydratation des souris nous leur injecterons 0.5 mL de sérum physiologique par voie sous cutanée.
Choix des espèces
Le test de référence de létalité sur souris est la seule méthode reconnue de référence dans la pharmacopée 10.0 référence 01/2020:0085 pour la détection et le dosage des toxines botuliques. Cette méthode doit être réalisée sur modèle souris afin d’obtenir la meilleure sensibilité de tous les sérotypes connus pour être pathogènes chez l’homme. Souris adultes swiss IOPS âgées de 4-7 semaines. La sensibilité des souris aux toxines botuliques dépend de leur âge et de leur poids. Le test de référence de létalité sur souris est la seule méthode reconnue de référence dans la pharmacopée pour la détection et le dosage des toxines botuliques, ainsi que pour la détermination d’anticorps neutralisants. Cette méthode doit être réalisée sur la souris à ce stade de développement afin d’obtenir la meilleure sensibilité.
Etude de pharmacocinétique et d’évaluation précoce de toxicité de composés à visée thérapeutique
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
3 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Souvent humanisées ou immunodéficientes, elles reçoivent des injections répétées et jusqu'à 5 à 10 prélèvements sanguins par semaine, puis un prélèvement terminal d'organes, pour valider des modèles inscrits au catalogue de la société genOway. Le porteur indique que les prélèvements et injections répétés peuvent causer des douleurs et que les études de toxicité peuvent dégrader l'état général des animaux, une crème anesthésiante étant appliquée par endroits. Il affirme qu'aucune alternative non animale n'existe pour la pharmacocinétique et la toxicité, ces mécanismes ne pouvant selon lui être reproduits hors d'un animal.
Objectifs
Des modèles animaux génétiquement modifiés, exprimant des cibles thérapeutiques humaines ou reconstitués avec un système immunitaire humain sont développés pour la réalisation d’études précliniques transposables à l’homme et la sélection de nouveaux composés thérapeutiques innovants pour le cancer, les maladies infectieuses, les maladies inflammatoires. Leur validation avant commercialisation passe par l’évaluation de composés thérapeutiques commercialisé ou en développement pour montrer la pertinence des observations faites, comparé à ce qui est déjà décrit chez l’homme. Des études de preuves de concept sont réalisées dans ces modèles animaux pour démontrer leur pertinence et faire ensuite des criblages à plus large échelle, choisir la dose optimale du composé et/ou son schéma d’administration. Le projet décrit des études de pharmacocinétique évaluant la durée de vie d’un composé thérapeutique et sa vitesse d’élimination entre autres. La durée de vie d’un composé est un paramètre majeur de l’activité d’un nouveau traitement. Ce projet décrit aussi des études préliminaires de toxicité de nouveaux composés thérapeutiques dans des modèles animaux mimant des éventuels effets indésirables chez l’homme. Dans ces études, de nouveaux composés thérapeutiques ou des composés déjà connus seront administrés, des prélèvements de sang à différents temps après l’administration des composés seront réalisés pour mesurer la quantité de composé présente dans le sang ou détecter des facteurs liés à une éventuelle toxicité. Les souris recevront une ou plusieurs injections (maximum 3/semaine), ces dernières durant au maximum 1 minute chacune. Selon la voie d’injection les souris seront anesthésiées avant l’injection. Les prélèvements de sang seront au maximum de 5 à 10/semaine/souris suivis d’1 ou 2 semaines de repos sans prélèvement. Chaque prélèvement dure au maximum 1 minute. En fin d’études, les animaux seront euthanasiés pour analyser certains organes pouvant étudier la toxicité éventuelle du composé testé et sa durée de vie. La règle des 3R sera respectée en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés au strict nécessaire pour assurer les analyses souhaitées et la pertinence des informations scientifiques recherchées. Les procédures envisagées n’entraineront pas de souffrance aigue et longue. En cas de souffrance passagère, des analgésiques/anesthésiants locaux ou oraux seront administrés. L’environnement des animaux sera enrichi.
Bénéfices attendus
Le projet décrit ici vise à permettre la validation de nouveaux modèles animaux expérimentaux, rendus translationnels par l’humanisation de certaines cibles ou du système immunitaire des souris ou de facteurs impliqués dans la pharmacocinétique de composés thérapeutique. La validation de ces modèles permettra de les proposer dans le catalogue de genOway pour qu’ils soient à la disposition des équipes développant de nouveaux composés thérapeutiques. Cela permettra une évaluation translationnelle de leurs innovations thérapeutiques. Ces études d’évaluation de nouveaux composés thérapeutiques pourront aussi être conduites à genOway et sont décrites ici. Ces études permettront de faire avancer la recherche biolmédicale et de sélectionner les meilleurs candidats thérapeutiques pour de futurs développements cliniques.
Procédures
La nature des procédures inclues dans le projet nécessite des prélèvements sanguins multiples. Ces derniers peuvent être source de douleurs de courte durée, surtout s’ils sont répétés sur le même site de prélèvement. Les effets douloureux devraient être limités à quelques minutes ou heures. Un prélèvement sanguin tel que dure au maximum 1 minute. Les voies de prélèvements sanguins pourront être modifiées afin d’éviter une trop grande répétition au même site, tout apparition de dommages sur la peau ou de dommage de la veine, entrainera aussi un changement de site de prélèvements voire de voie. Enfin une crème anesthésiante pourra être appliqué avant les prélèvements pour limiter la douleur occasionnée. Dans certains cas, les administrations de composés pourront aussi être répétées et ces administrations répétées selon la voie choisie et si le site d’administration est conservé peuvent conduire à une souffrance passagère. Les effets douloureux devraient être limités à quelques minutes ou heures. La durée d’une injection n’excède jamais 1 minute. Dans la mesure du possible, le site d’administration sera changé entre 2 administrations et/ou l’application en local d’une crème anesthésiante sera réalisée afin de limiter lasouffrance animale. Dans le cas des études préliminaires de toxicité aigue ou chronique, la toxicité éventuelle des composés testés peut conduire à une dégradation de l’état général de l’animal pouvant se traduire par une modification du comportement, une perte de poids, une baisse ou une hausse de température. En cas de toxicité aigue, ces effets seront de courtes durée (24 à 72h). En cas de toxicité chronique, ces effets peuvent apparaitre plus tardivement et durer plus longtemps. Tous ces paramètres seront suivis quotidiennement pour ce type de procédures et les critères de points limites seront appliqués afin de veiller à ne pas laisser souffrir les animaux. Un analgésique par voie orale pourra être administré en cas de signes cliniques de souffrance avant l’atteinte des points limites.
Impact sur les animaux
La nature des procédures inclues dans le projet nécessite des prélèvements sanguins multiples. Ces derniers peuvent être source de douleurs, surtout s’ils sont répétés sur le même site de prélèvement. Les effets douloureux devraient limités à quelques minutes ou heures. Les voies de prélèvements sanguins pourront être modifiées afin d’éviter une trop grande répétition au même site, tout apparition de dommages sur la peau ou de dommage de la veine, entrainera aussi un changement de site de prélèvement voire de voie. Enfin une crème anesthésiante pourra être appliquée avant les prélèvements pour limiter la douleur occasionnée. Dans certains cas, les administrations de composés pourront aussi être répétées et ces administrations répétées selon la voie choisie et si le site d’administration est conservé peuvent conduire à une souffrance passagère. Les effets douloureux devraient être limités à quelques minutes ou heures. Dans la mesure du possible, le site d’administration sera changé entre 2 administrations et/ou l’application en local d’une crème anesthésiante sera réalisée afin de limiter la souffrance animale. Dans le cas des études préliminaires de toxicité aigue ou chronique, la toxicité éventuelle des composés testés peut conduire à une dégradation de l’état général de l’animal pouvant se traduire par une modification du comportement, une perte de poids, une baisse ou une hausse de température. En cas de toxicité aigue, ces effets seront de courtes durée (24 à 72h). En cas de toxicité chronique, ces effets peuvent apparaitre plus tardivement et durer plus longtemps. Tous ces paramètres seront suivis quotidiennement pour ce type de procédures et les critères de points limites seront appliqués afin de veiller à ne pas laisser souffrir les animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de permettre des analyses sur les différents organes et compléter les observations faites sur le sang au cours de la procédure.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative non animales dans ce domaine car les études de pharmacocinétique et de toxicité préliminaire font intervenir des mécanismes physiologiques complexes qui ne peuvent être reproduits en dehors d’un être animal. Ces études doivent être conduites sur des animaux vivants afin de reproduire et prédire ce qu’il pourra se passer dans un être humain à qui sera administré les composés thérapeutiques ultérieurement.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par lot est calculé pour obtenir des résultats qui soient statistiquement interprétables. Les volumes de prélèvements de sang seront limités pour obtenir la quantité nécessaire mais sans excès de sérum afin de faire les mesures voulues. Cela doit permettre de prélever plusieurs fois le même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. Le nombre de souris ne sera augmenté que quand les volumes nécessaires seront trop élevés d’un point de vue éthique pour être fait sur les mêmes animaux tout au long de l’étude. Enfin, dans la mesure du possible, à la place d’animaux non traités qui seraient en plus dans les études, nous réaliserons un prélèvement avant l’administration des composés d’intérêt afin d’avoir un niveau basal des paramètres mesurés et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés. En fin d’étude à la mise à mort des animaux, plusieurs organes pourront être prélevés pour faire diverses explorations et ainsi mutualiser l’utilisation des animaux pour explorer différents questions et paramètres au sein de la même expérience et ainsi limiter le nombre global d’animaux utilisés pour répondre à la question scientifique posée en évitant les répétitions trop nombreuses des expériences.
Raffinement
Dans le cadre des études décrites ici, les animaux seront surveillés quotidiennement. Une crème anesthésiante pourra être appliquée au site d’injection en cas d’injection répétées sans changement de site et dans la mesure du possible, les injections répétées seront faites en changeant régulièrement de site d’injection pour limiter la douleur. Cette même crème pourra être appliquée pour les prélèvements sanguins répétés. Là encore le site de prélèvement voire la voie pourront être modifiés dans la mesure du possible et en cas d’apparition de lésion cutanée et de dommages au niveau de la veine prélevée. En cas de lésion, des soins seront réalisés (désinfectant et cicatrisantcutané) et l’évolution sera surveillée avec application des points limites le cas échéant. Lors des études préliminaires de toxicité, un monitoring clinique régulier et fréquent avec l’établissement d’un score clinique et la mesure fréquente de la température et du poids de l’animal vise à détecter au plus tôt des manifestations cliniques de la toxicité éventuelle des composés testés. L’apparition de ces signes conduira à une surveillance accrue des animaux concernés. En cas de signe de souffrance, un analgésique pourra être administré dans l’eau de boisson. En cas d’atteinte de signes cliniques sévères (point limite) ou de la combinaison de 3 signes cliniques modérés, les animaux concernés seront mis à mort pour limiter leur souffrance.
Choix des espèces
LLe rongeur par sa taille et sa manipulation aisée, est un modèle de choix pour l’humanisation de certaines cibles thérapeutiques, l’humanisation du système immunitaire par reconstitution ou l’humanisation de facteurs intervenant dans la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de certains composés thérapeutiques. Aujourd’hui les conditions zootechniques et le niveau d’ingénierie génétique sont tels que la construction à façon de lignées profondément immunodéficientes ou présentant l’humanisation d’une ou plusieurs cibles thérapeutiques est possible. Ces animaux permettent des avancées majeures dans la compréhension des maladies humaines et de sélectionner des thérapies adaptées et performantes.Les souris humanisées pour certaines cibles thérapeutiques ou facteurs seront utilisées dans ces procédures dès l’âge de 6 semaines et jusqu’à un âge d’environ 16 semaines. En effet, il faut que les souris inclues dans ces études soient suffisamment matures notamment d’un point de vue du système immunitaire pour que les résultats observés soient pertinents. Les souris humanisées pour leur système immunitaire seront utilisées à un âge de 16 à 30 semaines, afin que la reconstitution du système immunitaire humain soit établie et stable, ce que nous avons précédemment établi pour la tranche d’âge citée ici. Les souris génétiquement modifiées pour les cibles ou facteurs humains seront utilisées dans ces procédures dès l’âge de 6 semaines et jusqu’à un âge d’environ 16 semaines. En effet, il faut que les souris inclues dans ces études soient suffisamment matures notamment d’un point de vue du système immunitaire pour que les résultats observés soient pertinents. Les souris BRGSF-HIS seront utilisées à un âge de 16 à 30 semaines, afin que la reconstitution du système immunitaire humain soit établie et stable, ce que nous avons précédemment établi pour la tranche d’âge citée ici.
Développement d’un modèle souris d’infection au virus du Nil occidental (West Nile virus)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par le virus du Nil occidental via une injection dans le coussinet plantaire, puis reçoivent chaque jour des candidats médicaments avant prélèvement d'organes. Le porteur indique que l'infection provoque un affaiblissement des membres postérieurs, une posture voûtée et une perte de poids, et qu'environ 30 % des souris meurent en dix à douze jours. Il présente le projet comme une prestation de service destinée à "répondre aux attentes de différents clients" et revendique un modèle "indispensable" faute d'alternative in vitro.
Objectifs
L'infection par le virus du Nil occidental (VNO) est une zoonose transmise par les moustiques qui est endémo-épidémique en Europe. Le virus se transmet entre les oiseaux par la piqûre de moustiques infectés et, accessoirement, les humains et d'autres mammifères peuvent être infectés. Environ 80 % des infections au VNO chez les humains sont asymptomatiques. La fièvre du Nil occidental (WNF) est la présentation clinique la plus courante. Les personnes âgées et immunodéprimées sont plus à risque de développer la maladie neuroinvasive du Nil occidental (WNND). Actuellement, les vaccins homologués ne sont pas encore prêts pour un usage humain, et le traitement est pour la plupart non spécifique et de soutien. Le développement d'un modèle de souris pour tester l'efficacité de médicaments anti-viraux ou vaccins permettra de contribuer à acquérir des données précliniques indispensables au développement de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
L'utilisation d'un modèle de souris pour étudier la physiopathologie de l'infection humaine par le virus du Nil occidental (VNO) peut contribuer à acquérir des connaissances concernant la cinétique de la réponse immunitaire et des voies spécifiques responsables du contrôle de l'infection par le VNO et de la clairance virale. Ce modèle préclinique in vivo permettra de tester l'efficacité de nouveaux candidats médicaments anti-viraux. Le développement de ce nouveau modèle pré-clinique permettra de répondre aux attentes de différents clients et contribuera au développement de thérapies anti-infectieuses innovantes. La demande d'un modèle préclinique prédictif est forte tant dans les domaines de recherche académique que dans les sociétés pharmaceutiques qui développent les molécules anti-infectieuses de demain, mais se heurte à une offre limitée.
Procédures
Ce projet a été écrit afin de réaliser de la prestation de service. Il nous est donc difficile à ce jour de définir le nombre d’intervention et leur durée mais le nombre de prélèvements est limité. Pour chaque injection (sous-cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse) la durée maximale est de 1min, cela comprend le temps de la contention et de l'injection. Pour les prises de sang, l'animal est anesthésié dans la boite à induction pendant 2 à 3 min, puis la prise de sang est réalisée. L’animal est ensuite remis dans sa cage et surveillé. L’ensemble dure maximum 5 min. Pour des procédures dites « classiques », les souris anesthésiées seront infectées par le virus par injection dans le coussinet plantaire d'une patte arrière et l’administration de candidats médicaments sera réalisée tous les jours pendant maximum 12 jours avant prélèvement d’organes
Impact sur les animaux
Chez la souris, l'infection au WNV induit les signes cliniques habituels d'une maladie infectieuse : affaiblissement des membres postérieurs, posture voûtée, poil rugueux ou non soigné, activité réduite, respiration difficile, perte de poids et la mort dans 30% des cas. La cinétique de l'infection et des signes cliniques doit être établie pour chaque souche de virus car celle-ci varie considérablement d'un virus à un autre. 30% des souris infectées succombent à l'infection dans les 10–12 jours après l'infection, selon la dose d'inoculum.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour réaliser les différents prélèvements. Il n’y a pas de possibilité de remplacement, vu le contexte hautement pathogène
Remplacement
Le recours à l’animal de laboratoire se justifie dans le sens où l’efficacité in vivo d’un composé sur une infection résulte non seulement de l’effet de ce dernier sur les micro-organismes mais également de la réponse du système immunitaire de l’hôte sur ces agents pathogènes. Il n’existe aucun modèle in vitro mimant de façon précise ces interactions complexes. L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus). Les modèles souris sont largement utilisés par les équipes de Recherche publique et privée dans le domaine des maladies infectieuses. Les souris sont généralement sensibles à l'infection par le VNO, et constituent le modèle de choix pour l'investigation de cette pathologie. Faciles à travailler, les souris se prêtent aux analyses immunologiques en raison d'un large panel d'outils d'analyses permettant de disséquer les mécanismes du développement de la physiopathologie
Réduction
Une attention toute particulière est portée sur le nombre d’animaux utilisés dans le projet. Nous travaillons avec une compagnie spécialisée dans les biostatistiques. Cette collaboration nous permet d’utiliser le nombre strictement nécessaire pour chaque expérience et de l’optimiser durant toute la durée du projet. Le nombre estimé est 200 animaux / an. Le nombre d'étude variera en fonction de la demande client. En fonction de la diversité et du nombre des paramètres biologiques à analyser entre 8 et 15 souris seront nécessaires par groupe. Le nombre d’animaux inclus dans chaque étude peut varier de 20 à 40, en fonction du nombre de groupes différents à générer dans chaque étude (nombre de molécules à tester, doses différentes de la molécule testée).
Raffinement
Le bien-être de l’animal sera en permanence au centre de nos préoccupations. Les souris sont hébergées dans des cages à 22 ± 2 °C et 50 ± 10% d’hygrométrie, en portoirs ventilés ou isolateurs, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé chaque semaine. Des sacs dégradables contenant la litière sont ajoutés pour leur permettre de faire un nid et une bûchette en bois, comme enrichissement du milieu. Les animaux ont une semaine d’acclimatation avant que les procédures ne débutent. Les conditions d’expérimentation font l’objet d’un suivi attentif du bien-être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement par la structure en charge du bien-être animal. Afin de palier l'inconfort occasionné par l'injection dans le coussinet plantaire, des croquettes imbibées d'eau seront placées dans la cage afin de favoriser la prise alimentaire Pour le confort de l'animal, la prévention du stress est intégrée aux procédures expérimentales par l'utilisation d'une anesthésie gazeuse (isoflurane) pendant tous les gestes douloureux, lors des différentes injections des traitements potentiels (injection intraveineuse, injection intra-musculaire...). Tout animal présentant des signes de douleur, souffrance ou stress sera mise à mort. Les critères d’arrêt utilisés sont: - Le suivi quotidien du poids - La combinaison de plusieurs des signes cliniques : posture courbée, piloérection, difficulté respiratoire, prostration ou perte d’activité, perte de réponse à un stimulus. Une grille de scoring (en annexe) permettra le suivi quotidien et une intervention précoce en cas de signes dus à la pathologie.
Choix des espèces
L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus). Les modèles souris sont largement utilisés par les équipes de Recherche publique et privée dans le domaine des maladies infectieuses. Les souris sont généralement sensibles à l'infection par le VNO, et constituent le modèle de choix pour l'investigation de cette pathologie. Les souris se prêtent aux analyses immunologiques en raison d'un large panel d'outils d'analyses permettant de disséquer les mécanismes du développement de la physiopathologie Une infection systémique par le VNO est pratiquée chez de jeunes souris adultes (âgées de 6 à 10 semaines)
Evaluation des effets anti-inflammatoires de 4 formulations sur l’inflammation générale chez le rat
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cinquante d'entre eux reçoivent sans anesthésie une injection de parois bactériennes déclenchant une inflammation générale, suivie de traitements répétés, de prises de température rectale toutes les heures et d'une évaluation comportementale, pour tester quatre formulations anti-inflammatoires. Le porteur indique que l'inflammation induit une souffrance modérée et que la contention répétée génère un stress chez tous les animaux. Il affirme que le remplacement par des modèles in vitro n'est pas envisageable pour mesurer des paramètres physiologiques et comportementaux.
Objectifs
L’inflammation est une réaction de défense immunitaire stéréotypée du corps à une agression : infection, brûlure, allergie…. L'inflammation chronique est reconnue comme une réponse à de nombreuses transformations de l'environnement et du comportement modernes (sédentarité, malbouffe, pollution,…) et un facteur important dans le développement de maladies de civilisation telles que la résistance à l'insuline, l'obésité, les maladies cardiovasculaires, les maladies immunitaires, et même les troubles de l'humeur et du comportement. L’inflammation se manifeste par différentes phases successives au niveau des vaisseaux avec leur dilatation et une augmentation de leur perméabilité, et des cellules de l’organisme, notamment des globules blancs. Cela permet d’augmenter la circulation du sang afin d’éliminer les cellules mortes et les toxines responsables de cette inflammation, et d’apporter les éléments nécessaires à la guérison, notamment des globules blancs (lymphocytes) pour combattre les corps étrangers. Les objectifs de ce projet sont d’évaluer les effets anti-inflammatoires de 4 formulations administrées de façon répétée sur l’inflammation générale induite chez le rat par des bactéries appelées lipopolysaccharides ou LPS. Les 4 formulations testées ont été sélectionnées sur la base d’études in vitro ayant démontré des propriétés anti-inflammatoires qu’il est nécessaire de confirmer in vivo sur un modèle animal avant d’envisager un développement chez l’Homme.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet va permettre d’évaluer les effets anti-inflammatoires de 4 formulations administrées de façon répétée sur l’inflammation générale induite chez le rat par des parois bactériennes. Les données physiologiques et comportementales générées par l’ensemble des paramètres mesurés au cours de l’expérimentation et les analyses qui seront effectuées sur le sang, ainsi que les analyses qui seront effectuées sur les organes prélevés, en fin d’expérimentation, permettront de sélectionner une ou plusieurs formulations afin de poursuivre leur développement et d’envisager leur utilisation future chez l’Homme. Cela permettrait à terme de proposer de nouvelles solutions thérapeutiques pour le traitement de pathologies inflammatoires aiguës mais également chroniques.
Procédures
50 des 60 rats seront soumis à l’induction d’une inflammation générale par injection de parois bactérienne, les 10 rats restant recevant l’injection de placebo. L’induction de l'inflammation générale est effectuée 1 seule fois sans anesthésie, le geste étant très rapidement en quelques secondes. Les rats seront observés toutes les heures pendant les 24 heures de l’expérimentation. Les 60 rats seront traités avec chacune des 4 formulations anti-inflammatoires à évaluer, immédiatement après induction de l’inflammation générale puis 6 heures, 12 heures et 18 heures après celle-ci. Les injections seront effectuées sans anesthésie après placement des rats dans une boîte de contention spécifique adaptée à leur poids et leur taille, celles-ci étant effectuées en moins d’1 minute. Une prise de température corporelle au niveau rectal sera effectuée sur les 60 rats toutes les heures pendant 12 heures ainsi qu'à 18 heures et 24 heures après induction de l’inflammation générale. Les mesures seront faites sur animal vigile. A la fin de l’expérimentation une évaluation comportementale sera effectuée en plaçant chacun des 60 rats dans un dispositif expérimental spécifique pendant 5 minutes pour déterminer les effets de l’induction de l’inflammation générale et des traitements réalisés sur leur comportement locomoteur. Cette évaluation sera faire sur animal vigile. Enfin un prélèvement de sang sera réalisé sur les 60 rats, sous anesthésie générale, effectué une seule fois et en une minute environ avant leur mise à mort.
Impact sur les animaux
L’induction d’une inflammation générale affectant l’organisme entier va induire une souffrance modérée pour 50 des 60 rats utilisés pour ce projet, se traduisant par des modifications dans leur comportement et dans leurs paramètres physiologiques. La mise en cage de contention pour effectuer les traitements avec les 4 formulations à évaluer et la réalisation de celles-ci, ainsi que les mesures répétées de température corporelle, vont induire un stress pour la totalité des animaux. Le placement des animaux dans le dispositif expérimental pour la réalisation de l’évaluation comportementale à la fin de l’expérimentation pourra également générer un stress léger mais très limité dans le temps, la durée du test étant de seulement 5 minutes.
Devenir
A l’issue de l’unique procédure expérimentale, après réalisation d’un prélèvement de sang, les rats seront mis à mort afin de permettre le prélèvement d’organes et de pouvoir ainsi réaliser un ensemble d’analyses permettant d’étudier les effets de l’inflammation générale induite et des traitements avec les 4 formulations évaluées sur ces organes.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro (culture de cellules) ou ex vivo (organes isolés) pour évaluer les effets anti-inflammatoires de formulations au travers de paramètres physiologiques tels que la température corporelle et surtout de paramètres comportementaux. Les 4 formulations qui seront évaluées dans ce projet ont cependant été sélectionnées sur la base d’études in vitro ayant démontré des propriétés anti-inflammatoires qu’il est donc nécessaire de confirmer in vivo sur un modèle animal avant d’envisager un développement chez l’Homme.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé à partir de résultats d’études antérieures et d’un calcul de puissance statistique. Sur la base de ce calcul il est nécessaire d’utiliser au moins 9,5 rats par groupe de traitement pour 6 groupes de traitement. Nous utiliserons donc des groupes de 10 rats.
Raffinement
Les administrations et les mesures de température corporelle ne pouvant pas être effectuées sous anesthésie afin de ne pas impacter la physiologie et le comportement des rats, et de ne pas intérférer avec l’interprétation des résultats de l’étude, les rats seront observés quotidiennement depuis leur arrivée jusqu’au démarrage des expérimentations, et toutes les heures pendant les 24 heures de l’expérimentation. Leur poids sera mesuré avant l’induction ou non de l’inflammation générale et 24 heures après. Si des modifications importantes du comportement sont observées suite à l’induction de l’inflammation générale ou les administrations des traitements, ceux-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Des briques d’Aspen seront placées dans chaque cage de rats comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacées lors de chaque change de litière.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de la réponse à l’induction d’une inflammation générale, sa facilité de manipulation pour la réalisation d’injections en condition vigile et pour l’évaluation comportementale largement décrite dans la littérature scientifique sur cette espèce. Les animaux seront de jeunes rats âgées de 6-7 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7-8 semaines pour la réalisation des expérimentations. Cela correspond à l’âge moyen de rats décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur ce modèle d’inflammation générale, et de rats utilisés lors d’études précédentes menées dans notre laboratoire selon le même protocole expérimental et ayant donné des résultats probants.
Etude de la réaction inflammatoire à Cutibacterium acnes chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
504 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit sous anesthésie deux injections d'air pour former une poche cutanée, puis une injection infectieuse par la bactérie Cutibacterium acnes, avant un prélèvement sanguin terminal, pour étudier la réponse inflammatoire à ce microbe impliqué dans les infections de prothèses. Le porteur indique que l'infection peut provoquer gonflement, écoulement, perte de poids et repli de l'animal. Il affirme avoir atteint "les limites des modèles in vitro" et juge indispensable l'étude d'un "hôte complet".
Objectifs
Le projet vise à étudier la réponse de souris mise en contact avec une bactérie causant des infections lors de la mise en place de prothèses (Cutibacterium acnes (C. acnes)). En effet, ce microbe est responsable de nombreuses infections qui ont la particularité ne se manifester que très discrètement, voire pas, au niveau clinique aboutissant à une prise en charge trop tardive. Nous cherchons donc à caractériser la réponse de l’organisme à ce microbe afin de savoir si cette faible réponse est liée à un défaut de reconnaissance par l’hôte ou bien à la mise en place de stratégies de défense par le microbe. Les microbes utilisés seront de deux types : une bactérie de référence commercialement disponible et trois bactéries récupérée sur des infections humaines cliniques réelles. Ces bactérie ont déjà été étudiées en laboratoire dans le cadre d’interactions avec des cellules du système immunitaires de l'homme et ont permis de mettre en évidence une réponse augmentée lors de l’utilisation des souches cliniques. Cependant, ces conditions d’étude étant extrêmement éloignées de la réalité il est nécessaire d’analyser la réponse du système immunitaire dans un organisme complet afin de pouvoir conforter les réponses obtenues in vitro et pouvoir ainsi envisager de découvrir de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous proposons donc d’utiliser un modèle d’étude, développé chez la souris, des réponses de l’organisme vis-à-vis d’agents infectieux afin de collecter, quantifier et identifier la réponse de l’organisme. Ce travail permettra de mieux comprendre les interactions entre les cellules de l’hôte et le microbe dans un contexte d’infection sur prothèse et donc à plus long terme mieux lutter contre ce type d’infections. Ce projet nécessitera l’utilisation d’au minimum 126 souris et n’excèdera pas 504 souris. Des procédures de réduction faisant appel à des analyses intermédiaires de la réaction permettront de stopper toute condition d’expérience qui ne fonctionne pas ou génère un mal-être exagéré des animaux et ainsi de réduire au maximum le nombre d’animaux exposés.
Bénéfices attendus
Cutibacterium acnes (C. acnes), microbe naturellement présent sur la peau humaine, est surtout connu pour son rôle dans l’acnée. Cependant ce microbe est également identifié comme responsable d’infections au niveau des os, et plus particulièrement autours des prothèses articulaires (IOA). La prise en charge des infections à C. acnes est complexe et coûteuse avec la nécessité de coupler plusieurs antibiotiques et la nécessité d’un changement de prothèse, et donc de nouvelles interventions chirurgicales pour le patient. C. acnes semble pouvoir échapper au système de défense de l'organisme probablement, en partie, grâce à sa capacité à se dissimuler. Peu de données sont disponibles sur l’existence de marqueurs spécifiques de ces infections. Aussi, le projet ici présenté nous permettra d’étudier la réponse de l'organisme, dans un environnement proche de celui qui est retrouvé autour d’une prothèse, induit par diférentes souches de C. acnes. Rapidement, ce travail permettra de mieux comprendre les interactions entre l'organisme et ce microbe. A plus long terme, les résultats obtenus devraient permettre d’améliorer la prise en charge des patients souffrant d’une infection ostéo-articulaire et donc mieux lutter contre ce type d’infections.
Procédures
Chaque animal sera soumis à deux injections d’air sous la peau pour former une poche ainsi qu’à une injection supplémentaire pour l’infection. Un prélèvement sanguin terminal sera réalisé. Chaque injection sera précédée d’une anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Nous proposons d’utiliser le modèle de poche a air car il est souvent utilisé en recherche et n’entraine pas de souffrance particulière chez l’animal. Il permet de délimiter physiquement une cavité qui permettra de contenir les agents pathogènes en évitant leur dissémination dans le corps de l’animal. Compte tenu des éléments disponibles dans la littérature, nous n’attendons pas une très forte réaction qui pourrait changer le comportement des animaux. Néanmoins il est possible d’observer un gonflement, un écoulement et/ou une irritation susceptibles d’amener à une diminution de l’activité de l’animal, pouvant l’empécher de se nourrir correctement et donc mener à une perte de poids et un comportement de repli.
Devenir
A l’issue des procédures tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour observer le recrutement des cellules immunitaires ainsi que du sang pour d’autres analyses indispensables à l’évaluation de la réponse inflammatoire.
Remplacement
Une phase initiale de recherche in-vitro a permis d’apporter un grand nombre de données concernant les capacités de réponses du système immunitaire face aux infections par C. acnes. Cet agent microbien est incriminé dans de nombreuses infections sur matériel prothétique qui ont la particularité de ne se manifester que très discrètement, voire de façon paucisymptomatique, au niveau inflammatoire. Cette diversité a été retrouvée in-vitro. Les 4 souches étudiées ont déjà été étudiées in-vitro dans le cadre d’interactions avec des cellules de l’immunité et ont permis de mettre en évidence des réponses inflammatoires différentes. Nous cherchons maintenant à caractériser la réponse d’un hôte complet afin de déterminer si cette très faible réponse est liée à un défaut de reconnaissance par l’hôte voire à une réponse complexe faisant intervenir les différents acteurs du système immunitaire ou bien à la mise en place de stratégies particulières par le microorganisme, les modèles de culture cellulaire étant assez éloignés de la réalité physiologique. Dans ce cadre, nous pensons avoir atteints les limites des modèles in vitro disponibles concernant les informations que nous pouvons obtenir. Aucun test alternatif ne peut remplacer l’étude in vivo de l’intégralité des systèmes physiologiques de l’hôte impliqués dans la réponse inflammatoire aigüe vis-à-vis des infections bactériennes
Réduction
Des méthodes de réduction du nombre d'animaux impliqués dans l'expérimentation (mise en place d'expérimentation sur un nombre réduit d'animaux avec poursuite uniquement si l'expérimentation fonctionne, arrêt précoce des conditions jugées non exploitables, analyse/projection mathématiques à mi-parcours avec arrêt de l’étude si aucun résultat exploitable ne peut être envisagé) seront appliquées. Pour que les valeurs obtenues soient exploitables du point de vue statistique un nombre minimum de 6 animaux par groupe sera utilisé. Les données quantitatives obtenues seront analysées par des tests permettant la comparaison d’échantillons de faible taille. Une logique d’arrêt des procédures est mise en place : en cas de dépassement par 3 animaux pour chaque groupe de points limites, la procédure sera interrompue.
Raffinement
A leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés pendant une semaine pour leur permettre de s’acclimater à leur nouvel environnement. Les cages seront enrichies de divers matériaux permettant aux animaux d’exprimer des comportements variés dans leur lieu d’hébergement. Tout au long de l’étude, un suivi régulier sera effectué de façon à observer l’apparence, le comportement des animaux et à contrôler l’absence de points limites tout au long de l’étude. A chaque manipulation les animaux seront anesthésiés afin de limiter le stress et la douleur. Un suivi rapproché sera effectué dès les premiers signes d’inconfort détectés. Un protocole de suivi définissant des points limites aisément mesurables ainsi que les mesures à prendre en cas d’atteinte est réalisé conformément aux études de prise en charge des éventuelles souffrances exprimées. Ainsi, en fonction du résultat, une prise en charge adaptée sera réalisée. En cas de situation non connue l’appel à un vétérinaire sera réalisé.
Choix des espèces
Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique rencontrée en médecine humaine, les souris C57Bl6 utilisées seront des souris adultes âgées de 8 semaines.