Maladies infectieuses
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Caractérisation dans un modèle murin de la réponse immunitaire par un produit exprimant une molécule thérapeutique
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
350 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse dans le sinus rétro-orbital de l'œil sous anesthésie, puis des prélèvements sanguins au même endroit, avant une mise à mort permettant de prélever leurs organes. Le projet vise à documenter un effet inattendu observé lors d'une étude précédente d'un candidat d'immunothérapie, en vue d'un dossier réglementaire. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ne mime le système immunitaire complet et qu'il est "obligé" de recourir à la souris.
Objectifs
L’équipe s’intéresse au développement de petites molécules exprimées par des vecteurs viraux notamment pour restaurer le système immunitaire dans certaines pathologies. Plusieurs de ces molécules sont déjà en développement clinique mais il est possible que l’expression d’une ou plusieurs de ces molécules via un vecteur pourrait permettre une expression prolongée et/ou une distribution différente dans l’organisme de ces protéines, voire engendrer une activité biologique différente de celle de la forme non vectorisée et ainsi avoir une efficacité accrue. Des études précédentes (dans des modèles murins) ont permis d’obtenir une preuve de concept pour un candidat, administré par voie intraveineuse, basé sur vecteur virale modifié codant pour une protéine agissant sur le système immunitaire majoritairement décrite pour agir sur un certain type de lymphocyte. Lors de ces études, il a été observé un effet non négligeable et inattendu de ce candidat sur un autre type de cellule. Malheureusement, nous n'avons pas pu investiguer en détails les effets du candidat sur ces cellules, ces dernières n'étant pas la cible privilégiée dans notre étude précédente. Par conséquent, nous souhaitons réaliser une nouvelle étude préclinique ayant pour objectif l'étude de l'impact de ce candidat sur ce type cellulaire dans des souris naïves. Ces résultats permettront de mieux appréhender le(s) mécanisme(s) d’action de notre candidat, dans le but d’étoffer les dossiers règlementaires nécessaires pour initier un développement clinique chez l’homme.
Bénéfices attendus
Ce projet rentre dans une thématique de recherche plus large dont l’objectif global est de développer de nouveaux traitements pour traiter l’immunosuppression en restaurant le système immunitaire des patients et ainsi prévenir les infections secondaires pouvant leur être fatales. Précédemment, nous avons montré la pertinence de vectoriser une protéine particulière sur sa capacité à booster le système immunitaire de souris saines. Néanmoins, lors de cette évaluation, nous avons observé un effet inattendu sur un type particulier de cellule, qui n’a pas pu être pleinement étudié, les tests d’analyse étant focalisé sur la réponse cellulaire T. L’objectif à court terme de ce projet de recherche est donc de confirmer et de documenter plus en profondeur l’effet biologique observé sur ces cellules cibles. Ces résultats permettront de mieux appréhender le mécanisme d’action du produit ce qui peut être critique pour la suite du développement du produit en phase clinique. En effet, mieux connaître le mécanisme d’action d’un produit d’immunothérapie permettrait de mieux cibler les patients pour lesquels le produit pourrait être testé.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : -Injections des produits en intraveineuse au niveau du sinus rétro-orbital sous anesthésie locale suivie d’une anesthésie gazeuse à l’isoflurane sur tous les animaux : (1 fois/souris et 2 à 3 min/animaux) - Prélèvements sanguins au niveau du sinus rétro-orbital sur animaux vigiles après anesthésie locale (1 fois/ souris et 1 à 2 min/souris)
Impact sur les animaux
Aucune toxicité du produit n’est attendue puisque celui-ci a déjà été évalué chez la souris. Néanmoins, les animaux peuvent ressentir un désagrément voire une douleur modérée au moment de l’injection des candidats (injection intra veineuse au niveau du sinus rétro-orbital) qui est minorée par l’utilisation d’une anesthésie locale suivie d’une anesthésie générale mais également lors des prélèvements sanguins à l’œil. La douleur est sont atténuée par l’utilisation d’une anesthésie locale.
Devenir
Le but du projet étant d’évaluer l’activité biologique de notre candidat sur différents types cellulaires provenant de différents organes au cours du temps, il est donc nécessaire de mettre à mort tous les animaux inclus dans la procédure.
Remplacement
Les objectifs de ce projet étant d‘évaluer un candidat d’immunothérapie, susceptible de suivre un développement clinique chez l’homme, nous sommes donc contraints de respecter les obligations réglementaires à savoir qu’un produit ne peut pas passer en clinique en se basant uniquement sur des résultats générés in vitro. La caractérisation in vitro de ce candidat a déjà été réalisée. Désormais, nous voulons évaluer au cours du temps les effets de notre candidat sur une population lymphocytaire et ses sous-types dans différents organes dont le pic de la réponse peut différer, ce qui nécessite l’utilisation d’un organisme vivant entier. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro mimant le système immunitaire complet murin et susceptible d’apporter le même niveau d’information pour répondre à ces objectifs. L’utilisation des invertébrés ne semble pas judicieuse en raison d’un système immunitaire très différent de celui d’un vertébré. Nous sommes donc obligés de faire appel à un vertébré, la souris.
Réduction
Tout au long du projet, nous avons essayé de réduire le nombre de souris sans toutefois compromettre la fiabilité des résultats. Ce type d’expérience ayant déjà été réalisé au cours du projet global, nous avons donc pu calculer la taille de l’effet de notre produit sur cette population at ainsi déterminer le nombre de souris nécessaire par groupe pour avoir une puissance statistique adéquat. Vingt souris par groupe seront donc nécessaires pour comparer deux à deux les moyennes des groupes et pour montrer une différence statistique entre les groupes d’intérêt, moins de souris (10 souris/temps) pour le groupe injecté par le tampon de dilution du MVA car les effets biologiques ne varient pas au cours du temps. Dans ce projet, nous prélèverons post mortem la plupart des organes cibles de notre candidat afin de répondre à un maximum de question dans un seul protocole.
Raffinement
Mise en place du raffinement dans la procédure : L’injection intraveineuse au niveau du sinus rétro orbital de notre candidat est réalisée sur animaux anesthésiés, une anesthésie locale par de la tétracaine suivie d'une anesthésie générale gazeuse. Les prélèvements sanguins à l’œil se font sur animaux vigiles après application d’un anesthésique local quelques minutes avant. Les points limites ont été définis de manière suffisamment prédictive et précoce pour éviter toute souffrance de l'animal de la naissance à la mort. Tout au long de la procédure nos animaux sont surveillés au moins 5 fois par semaine avec une observation accrue quelques heures après l’injection des produits (entre 4h et 6h post injection) même s’il n’est pas attendu d’effet délétère de ces derniers sur l’état général des animaux. Néanmoins, en cas d’apparition de signes cliniques (pelage ébouriffé, terne), une surveillance accrue avec suivi de la température sera effectuée. En cas de fièvre (température > 39°C), du doliprane sera donné dans l’eau de boisson (0.6mL/mL). Si persistance de la fièvre (> 2 jours) ou de tout autre signe clinique (immobilité, prostration, apathie) pouvant traduire une douleur/détérioration de l’état général, ce sera un critère de point limite et il y aura mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
Le modèle murin est un bon modèle animal pour étudier la réponse cellulaire car le système immunitaire de la souris est bien décrit et les réactifs nécessaires sont largement disponibles. D’autre part, ayant déjà validé l’efficacité de ce candidat chez la souris, il nous semble pertinent de confirmer et d’approfondir les résultats inattendus précédemment observés dans le même modèle. Nous utiliserons des souris avec un système immunitaire mature, c'est à dire des animaux d'au moins sept semaines pour ces études précliniques
Infestation expérimentale de souris par voie orale avec des oeufs d’Echinococcus multilocularis
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Maladies infectieuses
50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infestées par gavage avec des œufs du parasite Echinococcus multilocularis, dont le développement d'une masse larvaire dans l'abdomen provoque une prise de poids progressive et des difficultés de locomotion, avant une prise de sang intracardiaque et une autopsie. Le porteur fixe un point limite de poids à 60 grammes et prévoit la mise à mort des souris présentant des troubles locomoteurs trop importants. Sur le remplacement, il se borne à affirmer qu'il n'existe pas de méthode in vitro pour suivre la dissémination du parasite.
Objectifs
Les échinococcoses sont responsables de zoonoses (infections ou maladies pouvant se transmettre directement ou indirectement entre les animaux et les humains) parasitaires dues à un ver plat (Cestode) qui peut infecter l'homme sous son stade larvaire. Deux formes sont décrites en France: l'échinococcose alvéolaire (EA) et l'échinococcose kystique (EK), causées par des espèces d’échinocoques différentes. Cette demande ne concerne que l'échinococcose alvéolaire. L'échinococcose alvéolaire (EA) touche principalement le foie chez les personnes infectées, après une incubation jusqu‘à 15 ans. Trente cinq nouveaux cas humains d'EA sont diagnostiqués en moyenne tous les ans en France. Chez l'homme la maladie est très invalidante et ce diagnostic, en général tardif, est suivi de l'instauration d'un traitement à vie ou d'une exerèse partielle du foie. Dans certains cas, des antigenes parasitaires sont retrouvés dans la circulation sanguine. L’agent causant cette maladie est Echinococcus multilocularis, qui comme tous les Taenidae, boucle son cycle de développement en passant par 2 hôtes : un rongeur (en général le campagnol terrestre) comme hôte intermédiaire qui héberge le stade larvaire et un carnivore (en général le renard) comme hôte définitif porteur du stade adulte (vers) dans ses intestins. L'homme se contamine par ingestion des œufs microscopiques du parasite disséminés dans l’environnement via les fèces des hôtes définitifs. Ce projet vise à infester des souris avec des œufs d’ Echinococcus multilocularis par voie orale. La forme larvaire du parasite obtenue suite aux infections expérimentales servira : => au suivi du développement de la forme larvaire suite a une infestation par la voie naturelle notamment en vue d’une détection précoce et facilitée pouvant attester de la survie du parasite => à suivre la cinétique d’apparition de marqueurs (antigènes et ADN libre circulant) et leurs localisations dans différents organes en complément du développement usuel de lésions hépatiques.
Bénéfices attendus
Ces données récoltées doivent permettre de 1/contribuer à une meilleure compréhension de la dissémination du parasite notamment des échinoccoses secondaires (dissémination depuis la lésion hépatique initiale), 2/compléter les informations sur la détection d’ADN libre circulant pouvant être un marqueur de la survie du parasite chez les patients sous traitement et 3/émettre des hypothèses sur la potentielle manipulation comportementale de l’hôte par le parasite
Procédures
Tous les animaux seront : 1/ anesthésiés à J0 pour gavage avec des oeufs d'échinocoques (durée totale= moins d'une minute). 2/ anesthésiés (le dernier jour de leur suivi) pour subir une prise de sang totale par voie intra-cardiaque, et une autopsie pour collecte d'organes (durée totale = environ 10/15 minutes)
Impact sur les animaux
L'infestation par le parasite entraine une prise de poids progressive des souris en raison du dévelopement de la masse parasitaire dans l’abdomen, qui à terme entraine des difficultés de mobilité/locomotion.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort pour autopsie puis collecte d'organes/sang.
Remplacement
Il n'existe actuellement pas de méthode alternative in vitro pour le suivi de la dissémination de marqueurs du parasite chez son hôte.
Réduction
Le projet utilisera 50 souris sur 2 ans. Cela se justifie par l’infestation par deux souches parasitaires différentes de 2 fois 5 lots de 5 souris qui seront euthanasiées à 15 jours, 1, 2, 3 et 6 mois post infestation afin de disposer d’une cinétique du developpement parasitaire . De par notre expérience, nous savons qu'environ 3 souris infectées sur 5 développent une forme larvaire au niveau du foie L’effectif a donc été estimé à 25 animaux/an/souche testée, soit 50 souris afin de pouvoir étudier la présence potentielle de marqueurs parasitaires.
Raffinement
Les prises de sang intracardiaques seront réalisées sous anesthésie gazeuse et injectable. Une analgésie sera pratiquée 1 heure avant l'anesthésie. Les souris seront surveillées tous les jours. Une pesée mensuelle permettra de suivre l'atteinte d'un point limite fixé à 60 grammes. Si toutefois, les souris montrent des signes de mal-être, des problèmes locomoteurs trop importants, alors les animaux seront mis à mort. L'observation d'une pathologie intercurrente qui ne peut être soignée (ou entraînant une douleur qui ne peut être contrôlée) entraîne la mise à mort compassionnelle de l'animal.
Choix des espèces
Les hôtes intermédiaires d'Echinococcus multilocularis sont les rongeurs sauvages et plus particulièrement le campagnol. Comme il n'existe pas de méthode alternative in-vitro pour suivre la diffusion de marqueurs dans l’organisme de l’hôte, il est nécessaire d'utiliser un modèle souris. Notre expérience a montré que le stade de développement des animaux n'avait pas d'influence sur la sensibilité au parasite et le developement de la forme larvaire. Les souris utilisées auront un poids compris entre 10 et 20 grammes.
Création de modèles de cathétérisation vasculaire et non vasculaire chez le rongeur destiné à des études toxicologiques, pharmacodynamiques ou pharmacocinétiques
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Rats : 12000
15 500 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Chaque animal subit une chirurgie sous anesthésie générale pour poser à demeure un cathéter dans un vaisseau, un organe ou le cerveau, puis peut recevoir jusqu'à quatre prélèvements sanguins ou gavages par jour, avec un hébergement isolé jusqu'à sept jours. L'établissement décrit une activité de fourniture de rongeurs cathétérisés "prêts à l'emploi", les animaux étant ensuite expédiés vivants aux laboratoires ou tués en cas d'atteinte d'un point limite ou pour contrôle qualité. Il justifie l'élevage d'animaux "surnuméraires" par les taux d'échec chirurgical et conclut que la complexité des mécanismes exclut un modèle in vitro.
Objectifs
L’objectif du projet est de permettre la production et la mise à disposition pour la communauté scientifique de modèles de rongeurs équipés de manière permanente (par technique chirurgicale) de cathéters dans des vaisseaux, des organes ou le cerveau permettant soit la libération de substances (comme des médicaments ou des hormones) de manière répétée ou continue, soit le prélèvement de fluides biologiques (sang, bile, liquide cérébro spinal)
Bénéfices attendus
L’utilisation de modèles cathétérisés permet l’administration répétée ou continue de substances d’intérêts (comme des médicaments ou des hormones) ou la mesure et le suivi de paramètres biologiques grâce au prélèvement de fluides biologiques comme le sang, la bile ou le liquide cérébro spinal chez l’animal tout en minimisant les manipulations de la part du scientifique et sans anesthésie. Cela permet donc la réduction très importante du stress provoqué chez l’animal par des injections ou des prélèvements de manière répétée à différents sites d’injection ou de prélèvement. Ces administrations et mesures pourront permettre à la communauté scientifique d’augmenter leurs connaissances et leurs compréhensions sur différents domaines de recherche (devenir d’un médicament dans le corps, toxicité d’un médicament, maladies cardiaques, maladies du cerveau, hypertension, cancer, infertilité, ...) tout en réduisant les nuisances possibles sur l’animal.
Procédures
Tous les animaux dans le cadre de ce projet seront soumis à une procédure chirurgicale unique d’une durée d’une demi-heure à une heure sous anesthésie générale et à la mise en place d’un matériel cathétérisé. Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis à des prélèvements sanguins ou à des gavages (maximum 4 prélèvements sanguins/gavages par jour). Les actes de prélèvements, de gavages et d’injection ont une durée d’une dizaine de secondes à une minute. Un hébergement isolé peut être nécessaire pour les besoins du projet pour une durée maximale de 7 jours. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux font suite à la mise en place du cathéter suite à la chirurgie : douleur, stress et perte de poids possible chez tous les animaux dus aux contentions, aux procédures chirurgicales, à la présence du matériel cathétérisé. Hébergement individuel possible jusqu’à une semaine.
Devenir
Les animaux sont à la demande, expédiés chez les scientifiques ou sont mis à mort dans le cas d’atteinte d’un point limite ou pour contrôle qualité du modèle.
Remplacement
La production de modèles cathétérisés a pour objectif de mettre à disposition des modèles prêts à l’emploi pour les scientifiques. Les animaux opérés sont intégrés dans des programmes de recherche ou d’études précliniques. Ces programmes visent à étudier les réactions des organes ou leurs interactions face à une substance, de comprendre la vie d’une substance à l’intérieur d’un organisme ou sa toxicité, ce qui entraine l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels programmes sur des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire est défini par le scientifique. Il est possible que des animaux surnuméraires doivent être utilisés de par les contraintes du modèle, ce nombre étant basé sur les taux de réussite connus et attendus des modèles. La réduction de ces animaux surnuméraires repose sur : l'expertise de l’équipe chirurgie et la maitrise des procédures, les locaux adaptés, les données historiques, l’observation de l’état clinique de l’animal en péri-opératoire afin d’adapter les traitements post-opératoires et de diminuer la mortalité éventuelle. Le nombre d’animaux surnuméraires utilisés dans chaque procédure est déterminé au cas par cas, en fonction du degré de difficulté du modèle, du taux de succès de la chirurgie, du nombre d’animaux à opérer, de la souche, du sexe et de la provenance.
Raffinement
Les cathétérisations permettent le suivi de paramètres biologiques ou encore l’administration de substances répétées ou en continu en minimisant les manipulations de la part du scientifique et sans anesthésie ce qui permet une réduction très importante pour l’animal du stress provoqué par des prélèvements ou des injections répétés à différents sites. Le contrôle de la douleur est réalisé par une administration d’analgésique avant la chirurgie et lors du post-opératoire ainsi qu’en cas de besoin. L’utilisation complémentaire d’anesthésique local peut être effectuée, si nécessaire. Une injection systématique sous-cutanée de sérum physiologique de réhydratation est pratiquée pour tous les animaux au réveil. Une habituation par la manipulation des animaux peut être effectuée dès la phase d’acclimatation (en fonction du stress observé de l’animal à réception, par exemple). Une observation quotidienne de l’état clinique général des animaux est réalisée tout au long de la procédure. Des soins spécifiques sont apportés en cas de signes cliniques (traitements médicamenteux, soins locaux, ajout d’enrichissement, mesures de réhydratation ou de réchauffement, ajout d’aliment, de gel hydratant, de litière ou d’eau complémentée ou non directement dans la cage afin d’en améliorer l’accès). En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Des points limites spécifiques sont établis et raffinés au fur et à mesure des observations. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score et document qualité d’enregistrement permettant une traçabilité.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce et de la souche est très généralement effectué par le scientifique mais l’équipe de chirurgie se réserve le droit de proposer des changements de modèles sur la base de son expérience. Le rat et la souris sont des animaux couramment utilisés dans ce type de projet. Ce sont des mammifères dont l’anatomie et la physiologie sont proches de l’homme, la disponibilité de données historiques chez ces espèces permet d’obtenir des informations fiables et pertinentes. Sont concernés les animaux sevrés à partir de 3 semaines, dont la taille et le poids sont compatibles avec la pose du matériel cathétérisé, selon les recommandations éthiques en vigueur.
Etude de la diffusion de nouveaux antibiotiques au niveau du système nerveux central (SNC) (Saisine version 5)
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Maladies infectieuses
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
264 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des antibiotiques par voie intraveineuse, intra-péritonéale ou par gavage, puis un prélèvement de liquide céphalo-rachidien après rasage et incision du crâne sous anesthésie, ainsi qu'un prélèvement de sang, pour étudier la diffusion cérébrale de nouvelles molécules. Sur une partie des souris, une inflammation est déclenchée par injection de LPS. Le porteur affirme que l'usage des animaux est "indispensable", les approches in vitro ne prenant selon lui pas en compte la pharmacocinétique, et fixe la mise à mort à une perte de poids de 20 %.
Objectifs
Les infections bactériennes du système nerveux central (SNC) sont des pathologies graves, avec un taux de mortalité élevé. Le traitement de ces infections repose sur un traitement antibiotique adapté. Cependant, en cas de résistance bactérienne, notamment chez les staphylocoques résistants à la méticilline (SRM), les options thérapeutiques peuvent être limitées. A l’heure actuelle, les molécules recommandées dans les infections du SNC à SRM sont la vancomycine et le linézolide (recommandations de la société américaine de maladie infectieuse 2017). Cependant ces antibiotiques peuvent poser le problème d’une tolérance médiocre (effets indésirables hématologique du linézolide, effets indésirables rénaux de la vancomycine) et de résistances acquises émergentes. La dalbavancine et l'oritavancine, le tédizolide, ou la délafloxacine sont des nouveaux antibiotiques, actifs sur les staphylocoques résistants à la méticilline, qui possèdent des propriétés pharmacocinétiques innovantes (longue demi-vie) ou des profils de tolérances favorables. Cependant, malgré leur potentiel intérêt dans les infections du SNC, il n’existe pas de donnée à l’heure actuelle sur leur diffusion dans le système nerveux central. L’inflammation, qui peut être présente en situation infectieuse a également une influence sur la diffusion au niveau cérébral, de part son impact sur la barrière hémato-encéphalique (BHE). Il est donc primordial d’étudier la diffusion de ces molécules en conditions saine et inflammatoire. Ainsi, l’objectif de notre travail est d’étudier la diffusion dans le système nerveux central (pharmacocinétique) de ces nouveaux antibiotiques dans un modèle in vivo (en conditions saine et inflammatoire), et d’explorer les différents facteurs pharmacologiques et moléculaires modulant cette diffusion.
Bénéfices attendus
La possibilité d’usage de ces molécules pour lutter contre les infections cérébrales par des germes résistants est un chalenge. Les données de diffusion de ces nouvelles molécules dans le système nerveux central pourront ouvrir les portes à un essai clinique de pharmacocinétique chez l’Homme, préalable nécessaire à l’utilisation en clinique de ces molécules dans le traitement des infections du système nerveux central.
Procédures
Nous administrerons des antibiotiques aux souris, par voie intra-veineuse (IV) en 10 à 15 secondes, intra-péritonéale (IP) en 10 à 15 secondes ou par voie orale en 5 secondes. Dans le cas d’administration IV, l’injection se fera par voie rétro-orbitale en 10 à 15 secondes. Dans le cas de l’administration par voie orale, l’administration sera réalisée par gavage intra-gastrique 1x/j en 5 secondes, soit par administration continue dans l’eau de boisson. Nous réaliserons des prélèvements de sang (200µl) et de Liquide Céphalo-Rachidien (LCR) (5µl) sur ces animaux. Un seul prélèvement de chaque liquide biologique sera réalisé par animal. Dans l'ordre et après anesthésies de l'animal, le LCR puis le sang seront prélevés. Pour prélever le LCR, le crâne de l'animal, placé sur un tapis chauffant (37°C), est rasé et la peau incisée sur 1cm après injection sur le site de prélèvement en SC de lidocaine 10 min avant l'intervention. Le prélèvement lui-même prend environ 5 min. Puis, le sang sera prélevé dans la veine caudale de l'animal. Pour se faire, l'animal aura au préalable reçu une injection de buprénorphine 30min avant l'acte et ce afin de diminuer la douleur liée à ce prélèvement. L'inflammation systémique est induite par l'administration de LPS (lipopolysaccharide) par voie IP en 10 à 15 secondes. L’administration des antibiotiques aura lieu 2 heures après l’administration de LPS.
Impact sur les animaux
Douleur légère lors de l’injection intraveineuse d’antibiotiques sans effet secondaire. Douleurs légères à modérées suivant l’administration intra-péritonéale de LPS.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront sacrifiés, afin de pouvoir réaliser l’étude histologique et pharmacocinétique au sein des tissus cibles (parenchyme cérébral).
Remplacement
L'utilisation des animaux est indispensable en raison de la complexité des différents acteurs cellulaires et moléculaires qui sont impliqués dans la diffusion du médicament. L'approche in vitro qui permet l'analyse de paramètres définis ne peut pas remplacer l'utilisation des animaux car elle ne prend pas en compte les problèmes de pharmacocinétique du médicament ou des effets physiopathologiques (inflammation). Pour cette étude seront utilisés des souris (Espèce Mus Musculus A1). La souris est le plus petit mammifère utilisable en recherche expérimentale. Son élevage aisé en animalerie permet des conditions environnementales contrôlées. La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertèbres. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez proche de celle de l'Homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine. Des souris C57Bl/6J femelles seront utilisées au stade adulte (8 semaines).
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au maximum. Le nombre de souris (n = 24) par groupe de traitement a été calculé pour avoir un nombre de points pharmacocinétiques minimum (8 points) permettant de réaliser une courbe des concentrations du traitement testé en fonction du temps, dans le plasma et dans le LCR (liquide céphalo-rachidien). Afin d'obtenir un résultat statistique cohérent, un minimum de 3 animaux par point pharmacocinétique est nécessaire (triplicata de chaque point pharmacocinétique). Les analyses statistiques des résultats sont réalisées avec des tests non paramétriques. Le nombre de 264 souris nécessaires au total (10 groupes de traitement + 10% de souris supplémentaires en cas de mortalité) a été calculé au plus juste afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux.
Raffinement
Les prélèvements du LCR (5µl) et sanguin (200µl) se font sous anesthésie par un mélange d'air et d'isofluorane (3% induction et 1,5% maintien). Dans l'ordre et après anesthésies de l'animal : le LCR, puis le sang seront prélevés après injection d'un antalgique général type buprénorphine (SC 0.05 mg/kg) 30 min avant le prélèvement sanguin à la veine caudale et d'une anesthésie locale (SC) type lidocaïne (3mg/kg) 10min avant prélèvement du LCR. L'inflammation systémique est induite par l'administration de LPS (lipopolysaccharide), et les souris seront analgésiées par administration de buprénorpine par voie SC (0,1mg/kg) 30 minutes avant l’injection de LPS. La douleur de l’animal sera suivie toutes les heures suivant l’administration du LPS. Réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse : les animaux sont hébergés à raison de 5 souris par cage de type 2L)). Ils seront expérimentés par du personnel formé et qualifié. Ils seront surveillés quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques et auront en permanence accès à l'eau et à la nourriture. Chaque cage est pourvue d’un enrichissement du milieu (nids de « woodwoll »). Durant les périodes d'expérimentation, ils seront anesthésiés sous l'isoflurane. Des points limites précis de douleur ressentie par les animaux (cf partie suivante) sont définis et les animaux seront euthanasiés si on ne peut soulager leur douleur. L'estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Le score limite est de 12. Au-delà l’animal sera euthanasié sans attendre. SURVEILLANCES REALISEES: Une surveillance quotidienne du poids des animaux sera effectuée. L’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Les critères prépondérant sont les suivants selon les critères de : - Perte de poids des animaux par rapport au poids initial>20%
Choix des espèces
Pour cette étude seront utilisés des souris (Espèce Mus Musculus A1). La souris est le plus petit mammifère utilisable en recherche expérimentale. Son élevage aisé en animalerie permet des conditions environnementales contrôlées. La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertèbres. L'organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l'homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine. Des souris C57Bl/6J femelles seront utilisées au stade adulte (8 semaines). Souris C57Bl/6J utilisées au stade adulte (8 semaines). Le choix d’une souris adulte est nécessaires d’un point de vue pharmacocinétique et physiologique (comparabilité des résultats, système hépatique et rénale fonctionnels, quantité de LCR prélevable).
Infections nosocomiales : Détermination du profil de biodistribution de nouveaux candidats antibactériens et évaluation de leurs efficacités
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
288 souris en gravité légère et 1 050 en gravité modérée vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. Immunodéprimées, elles sont infectées par des bactéries responsables d'infections urinaires et pulmonaires, puis tuées par exsanguination de l'aorte abdominale pour prélèvement d'organes, afin de tester de nouveaux candidats antibactériens. Le porteur décrit pourtant une infection pouvant être sévère, avec perte de poids, difficultés respiratoires et hypothermie. Il affirme qu'en l'absence de modèle in vitro reproduisant l'interaction entre pathogène et système immunitaire, le recours au modèle animal s'impose.
Objectifs
L’objectif est d’évaluer dans un modèle murin l’efficacité de nouveaux candidats antibactériens vis-à-vis des pathogènes majeurs responsables des infections nosocomiales
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont : (1) Mise au point/caractérisation d’un modèle de d’infection bactérienne mimant les infections cliniques majeures (Infections urinaires et infections pulmonaires) induites respectivement par E coli et P aeruginosa (2) Evaluer la biodistribution et l’efficacité des nouveaux candidats antibactériens, (3) Etablir Un suivi longitudinal aux moyens des systèmes d’imagerie du petit animal sera mis en place. Les résultats de cette étude pourraient être ainsi prédictifs de l’approche thérapeutique à déployer chez les patients.
Procédures
(1) Prélèvements réalisés sur animaux vigiles a. Urines : 1 seule fois par animal (point terminal) (1-2 min) (2) Prélèvements réalisés sur animaux sous anesthésies : a. Prélèvements sanguins : 1 seule fois par animal (point terminal) ; ils seront réalisés par exsanguination, en ponctionnant l’aorte abdominale. Pour cela, les souris auront préalablement une (i) anesthésie générale par exposition à l’isolflurane (5% dans 95% d’O2) et (ii) une anesthésie locale administrée par voie SC al (Lidocaine) (5-7min).
Impact sur les animaux
Les infections bactériennes des souris immunodéprimées peuvent entrainer une infection sévère entrainant une perte de poids potentielle, des difficultés respiratoires (dyspnée), problème de miction (dysurie, hématurie) ou une baisse de la température corporelle (hypothermie).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car des prélèvements d’organes sont nécessaires.
Remplacement
L’absence de modèles in vitro relevant permettant de reproduire la majorité des interactions entre agent pathogène et/ou agent antimicrobien et système immunitaire (réponse inflammatoire) nous oriente vers l’utilisation de modèles animaux
Réduction
L’évaluation du nombre minimal d’animaux à inclure pour pouvoir observer l’effet escompté a été déterminé avec des tests statistiques pour petits échantillons a été déterminé en collaboration avec des biostatisticiens en utilisant ANOVA test. Par ailleurs, l’utilisation de l’imagerie permettra de réduire le nombre de souris, chaque animal étant son propre contrôle
Raffinement
Afin de prendre en compte la souffrance des animaux, un suivi par imagerie ainsi qu’un suivi clinique seront mis en place, basé sur des observations quotidiennes des souris. Un score clinique sera établi en fonction de différents critères (apparence générale, posture, activité, poids…). Des scores seront définis pour les points limites pour mettre à mort les souris immédiatement dès qu’ils sont atteints.
Choix des espèces
Dans la recherche préclinique, les modèles murins permettent d’intégrer un grand nombre des caractéristiques de la pathologie humaine. Par ailleurs, l’ensemble des technologies d’imagerie pré-clinique est conçu pour des rongeurs de petite taille, principalement des souris Des souris adultes (8 à 12 semaines), femelles, immunodéprimées chimiquement (pour mimer l’état d’immunodépression des personnes ayant contractées des infections nosocomiales, seront utilisées pour ce projet
Virus du Nil occidental (West Nile virus) : évaluation dans un modèle animal des facteurs génétiques impliqués dans la virulence
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Infectées par le virus West Nile, elles peuvent développer une perte de poids, une perte d'équilibre, une paralysie et mourir, un point limite de deux signes cliniques déclenchant la mise à mort des animaux qui se dégradent. Le porteur compare la virulence de virus chimériques assemblés en laboratoire pour identifier les facteurs génétiques en cause. Il indique que la capacité du virus à infecter le système nerveux ne peut s'étudier qu'in vivo et présente ce modèle comme "nécessaire".
Objectifs
L’infection au virus West Nile (VWN) constitue un risque majeur pour la santé humaine et animale notamment chez les oiseaux sauvages et les équidés. Les symptômes liés à la maladie vont de la simple fièvre jusqu’à des atteintes neurologiques pouvant être mortelles dans les cas les plus sévères. Ce virus est présent dans de nombreux pays européens, avec 49 cas équins et 1 humain en 2015 ou encore 13 cas équins et 26 cas humains dans le sud de la France en 2018. Le VWN est retrouvé tous les ans dans le sud de la France. Sa transmission est assurée par les moustiques du genre Culex. Le réchauffement climatique impactant la distribution des espèces de moustiques, la répartition géographique de certains agents vectorisés par ces derniers, dont le VWN, peut se voir modifiée dans les prochaines années. La compréhension des mécanismes de la virulence chez l’hôte vertébré permet d’anticiper et de réagir rapidement face aux nouvelles épidémies. Actuellement, malgré la présence de traitement chez l’animal, aucun vaccin n’a été développé chez l’Homme. L’étude des facteurs impliqués dans la virulence s’ancre dans une dynamique de proposition de nouvelles cibles afin de disposer de solutions vaccinales. La souche WN Israël 1998 est considérée comme très virulente chez l’oiseau, tandis que la souche WN Italie 2008 est faiblement virulente. Des outils innovants en laboratoire ont rendu possible la génération de VWN modifiés, appelés chimères, par un assemblage artificiel de régions génétiques d’intérêts issus de ces deux souches et potentiellement impliquées dans la différence de leur virulence. Ces chimères ont déjà fait l’objet d’une étude dans des modèles cellulaires en laboratoire. Mais le VWN a la capacité à infecter le système nerveux. Cette capacité neuroinvasive ne peut s’étudier qu’à l’aide d’un modèle in vivo. L’évaluation de la virulence de ces chimères sur un modèle murin permettra de mieux comprendre le mécanisme de virulence de ces deux souches et d’identifier les facteurs génétiques potentiellement impliqués dans la virulence chez les vertébrés.
Bénéfices attendus
Nous avons choisi d’étudier la différence de virulence (dangerosité, capacité à se répliquer et à entraîner une possible mortalité) engendrée par la souche WN Israël 1998 et la souche Italie 2008 en modifiant leur génome. Pour cela, nous avons décidé d’échanger une partie de génome d’un virus avec une partie du génome de l’autre virus afin de reconstituer un génome entier, modifié, comprenant d’une part des fragments du premier virus et d’autre part des fragments du deuxième virus. Nous avons eu recours à une méthode au laboratoire permettant de remplacer un fragment génomique du virus Israël 1998, par le même fragment mais issu du virus Italie 2008. Ces virus ayant une virulence différente, cela permet de comprendre quel fragment peut être responsable d’une virulence amoindrie chez Italie 2008 par rapport à Israël 1998. A plus long terme, cette étude permettra d’identifier de nouvelles cibles pour la lutte antivirale.
Procédures
Seuls des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris vigiles (à la queue ou à la joue) ou sur souris anesthésiés (au sinus rétro orbital) par des personnes formées à cette pratique. Le prélèvement dure quelques secondes par souris. Les souris seront contrôlés tous les jours.
Impact sur les animaux
Les souris sont sensibles à l’infection par WNV. Les signes cliniques décrits sont la perte de poids, perte d’équilibre et de motricité d’un membre, paralysie et la mort. Les animaux seront contrôlés tous les jours puis 2 fois par jour dès l’apparition des premiers signes cliniques. Un point limite a été défini pour décider de la mise à mort d’animaux, à savoir la présence simultanée de deux des signes cliniques suivants: perte de poids supérieure à 15%, perte d’appétit, poils ébouriffés, dos voûté, perte d’équilibre, perte de certaines capacités motrices.
Devenir
West Nile est un virus de classe 3, zoonotique. Les souris peuvent mourir de l’infection. Toutefois, un point limite (moment à partir duquel l’expérimentation sera arrêtée) est défini pour cette procédure expérimentale à savoir la présence simultanée de deux signes cliniques suivants: perte de poids supérieure à 15%, perte d’appétit, poils ébouriffés, dos voûté, perte d’équilibre, perte de certaines capacités motrices. Dans le cas où les souris n’ont pas présenté ces signes avant la fin de l’expérimentation, elles seront mises à mort le dernier jour expérimental, pour permettre la récupération d’organes, et l’analyse de la quantité de virus dans ces différents prélèvements.
Remplacement
Les différences de comportement des constructions virales réalisées entre les virus WN Israël 1998 et Italie 2008 ont d’abord été étudiées sur des modèles alternatifs (culture cellulaire). Cependant, le modèle in vitro ne permet pas d’évaluer le pouvoir infectieux (développement de signes cliniques, présence de virus dans la circulation sanguine), la localisation du virus dans un organisme (« préférence ») et la virulence (mortalité). Le modèle in vivo est nécessaire pour cette étude.
Réduction
Au total 60 souris maximum seront impliquées dans ce projet d’étude. Six groupes seront constitués. Cinq souris seront utilisées par groupe afin d’obtenir des résultats robustes statistiquement et scientifiquement. Le nombre de 5 souris par groupe nous permettra d’analyser les résultats obtenus au cours de cette procédure expérimentale par des tests statistiques non paramétriques (Kruskal-Wallis pour une comparaison de moyennes d’échantillons indépendants (quantité moyenne de virus retrouvé dans le sang à un temps donné, suivi de mortalité), test t pour une comparaison de moyenne entre seulement deux échantillons,...). Un résultat sera considéré comme statistiquement significatif si la valeur « p » est strictement inférieure à 5% (p < 0,05). Un duplicat pourra être effectué en cas de la non infection des souris ou bien réaliser la même étude pour d’autres virus West Nile modifiés avec des facteurs génétiques d’intérêts.
Raffinement
Les souris seront plusieurs par cage (5/cage) avec un enrichissement de leur milieu (petite cabane, papier, coton). Une surveillance bi-quotidienne des animaux est mise en place à compter de l’apparition des premiers signes cliniques. Un point limite a été défini pour décider de la mise à mort d’animaux trop sévèrement atteints, à savoir la présence simultanée de deux des signes cliniques suivants: perte de poids supérieure à 15%, perte de poids, poils ébouriffés, dos voûté, troubles de la coordination des mouvements, perte d’équilibre, perte de motricité.
Choix des espèces
La souris est largement utilisée comme modèle d’infection pour le virus West Nile, de par sa grande sensibilité à l’infection après inoculation par différentes voies. Elle développe généralement des signes neurologiques quelques jours post-inoculation. La souris représente donc le modèle idéal en laboratoire pour cette étude. Les souris auront entre 7 et 8 semaines. Les souris seront donc des adultes et cela facilitera les prélèvements sanguins car elles seront plus grosses.
Evaluation de l’impact du sepsis chez la souris immunodéprimée
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur provoque un sepsis par ligature et ponction du caecum ou par injection de bactéries, après immunodépression chimique, puis elles sont tuées pour prélèvement d'organes. Le porteur indique que la chirurgie et l'infection peuvent provoquer douleur, souffrance et affaiblissement. Il affirme que le modèle n'est absolument pas reproductible in vitro, le bénéfice annoncé se limitant à une meilleure compréhension du lien entre immunodépression et infection.
Objectifs
Ce projet de recherche représente une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes de développement d’une infection grave de type sepsis chez des sujets immunodéprimés. En effet, les infections abdominales sont fréquentes, à l’origine d’infections graves, appelées en fonction de la gravité sepsis ou choc septique, et responsables de nombreuses hospitalisations en soins intensifs. Cet état de sepsis entraîne une dysfonction du système immunitaire acquise propice à l’acquisition d’infections nosocomiales. Ces dernières sont responsables de la majorité des décès observés en réanimation pouvant survenir tardivement, plusieurs jours voire semaines après l’admission des patients. Ce phénomène d’immunosuppression acquise liée au sepsis a bien été étudié et caractérisé sur des modèles souris d’infection intraabdominale par CLP (« Cecal Ligature and Puncture » ou ligature et ponction du caecum) entrainant une lésion digestive (comparable aux sepsis abdominaux chirurgicaux). Cependant, la majorité des patients hospitalisés en réanimation pour sepsis sont des patients également immunodéprimés porteurs d’une pathologie hématologique les exposant aux infections d’origine digestive. Ces infections sont généralement liées à une leucopénie à l’origine d’une translocation bactérienne dans le sang. Cette bactériémie d’origine digestive, mais sans lésion du tube digestif, est généralement traitée par des antibiotiques associés aux mesures symptomatiques propres à la réanimation (remplissage vasculaire, analgésie…). Afin de se rapprocher au plus près des conditions décrites chez l’Homme, l’utilisation de la technique « Cecal Slurry », permettant l’injection directe de bactéries digestives dans la cavité péritonéale des souris mimerait ainsi les infections observées chez les patients d’hématologie. Plus précisément, une connaissance plus approfondie des modifications immunologiques induites par le sepsis chez des souris préalablement immunodéprimées permettrait de reproduire au mieux ce qui se produit chez l’Homme et ainsi de mettre en place des stratégies thérapeutiques chez les patients immunodéprimés hospitalisés en soins intensifs pour sepsis ou choc septique afin d’améliorer leur pronostic. Ainsi ce projet de recherche a pour but, dans un premier temps de comparer les deux techniques d’induction de sepsis : CLP et « Cecal Slurry » puis d’évaluer l’impact du sepsis chez les souris immunodéprimées.
Bénéfices attendus
Nos travaux devraient déboucher sur une meilleure compréhension des liens entre immunodépression induite et infection.
Procédures
L’induction du sepsis par CLP (« Cecal Ligature and Puncture » ou ligature et ponction du caecum) nécessitera une intervention chirurgicale de l’intestin des animaux sous anesthésie gazeuse d’environ 10min. Les animaux recevront au préalable une injection d’analgésique en sous cutané, cette injection durera moins d’une minute. Les animaux vigiles recevront un traitement antibiotique en intra-péritonéale une fois par jour pendant 5 jours, l'injection durera moins d'une minute. Les animaux vigiles recevront en sous-cutanée une seule fois une injection permettant leur réhydratation, cette injection durera également moins d'une minute. Pour l’induction du sepsis par « Cecal Slurry », les animaux vigiles recevront une seule fois une injection en intra-péritonéale d’une quantité de bactéries commensales bien définie qui permettra d'induire un sepsis, geste réalisé en moins d'une minute. Les animaux vigiles recevront un traitement antibiotique en intra-péritonéale deux fois par jour pendant 5 jours, l'injection durera moins d'une minute. Les animaux vigiles recevront en sous-cutanée une seule fois une injection permettant leur réhydratation, cette injection durera également moins d'une minute. La myéloablation chimique des souris vigiles nécessitera une injection en intra-péritonéal 1 fois par jour pendant 2 jours l'injection durera moins d'une minute. L’induction de la pneumopathie par Staphylococcus aureus, nécessitera l’anesthésie des animaux par anesthésie gazeuse d’environ 5 minutes durant lesquelles les animaux recevront une suspension bactérienne par instillation intratrachéale.
Impact sur les animaux
L‘induction d’un sepsis par la technique de CLP (« Cecal Ligature and Puncture » ou ligature et ponction du caecum) peut engendrer une douleur, une souffrance et une angoisse des animaux liées à la chirurgie. De plus, le développement d’une immunodépression induite par un traitement chimique mais également l’infection abdominale peuvent engendrer un affaiblissement de l'animal.
Devenir
Afin d'évaluer les conséquences de l'infection induite sur les animaux immunodéprimés, l'accès aux organes d'intérêts ainsi qu'aux fluides biologiques est indispensable, nous ne pouvons donc pas garder les animaux en vie.
Remplacement
L'évaluation de l'impact du sepsis chez la souris immunodéprimée nécessite l’accès aux organes d’intérêt afin d’évaluer les conséquences de cette infection sur l’organisme dans sa totalité. En effet, ceci n’est absolument pas reproductible in vitro car l’induction d’un sepsis engendre une des modifications cellulaires dans différents organes tels que la rate, les poumons mais également le sang périphérique.
Réduction
Les procédures expérimentales sont rigoureusement planifiées afin de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Notre précédent projet, ayant eu pour objectif de caractériser les dysfonctions immunitaires suite à un sepsis induit par la technique de CLP, nous a permis de déterminer le nombre d’animaux nécessaire afin d’avoir des résultats statistiquement significatifs. De plus, le laboratoire possède déjà une expertise à la fois sur le développement d'infections abdominales et sur le développement de modèle murin d’immunodépression, ce qui nous permettra d'utiliser moins d'animaux pour la mise en place de cette étude.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées : locaux confinés, portoirs ventilés, eau et nourriture ad libitum, maximum 5 animaux/cage et aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. L'utilisation d’analgésiques permettra d’éviter toute souffrance aux animaux. De plus, l’évaluation régulière du score de grimace des animaux et le suivi de leur poids et de leur comportement permettra d’avoir un contrôle continu sur leur état de santé.
Choix des espèces
Ce modèle murin permettra de développer une immunodépression induite, retrouvée fréquemment chez l’Homme, suivi d'une dysfonction immunitaire induite par un sepsis. Ce modèle nous permettra ainsi de caractériser cette dysfonction immunitaire. Le développement d'une immunodépression suivi d’une infection n'est pas reproductible in vitro car il touche le système immunitaire dans son ensemble. De plus, le modèle murin d’immunodépression induite par traitement chimique est un modèle animal connu et bien caractérisé et le développement d'infections abdominales a récemment été développé et caractérisé au sein de notre laboratoire. La très grande majorité des travaux scientifiques réalisés utilise des souris de 7-9 semaines.
Etude du rôle des vésicules de membrane externe bactériennes dans l’induction et l’aggravation de sepsis.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
1 760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections de vésicules bactériennes qui provoquent un sepsis, un dysfonctionnement d'organe potentiellement mortel suivi par un score clinique jusqu'à une perte de 20 % du poids. Une moitié est tuée à un stade précoce, l'autre gardée pour l'étude des séquelles avant d'être tuée à son tour. Le projet étudie le rôle de ces vésicules dans la gravité du sepsis, le porteur indiquant que les modèles animaux restent "essentiels" pour tester les traitements à l'échelle de l'"organisme entier".
Objectifs
Le sepsis est un problème majeur de santé publique, défini comme un dysfonctionnement d'organe potentiellement mortel causé par une réponse dérégulée de l'hôte face à une infection. Les sepsis dus à une infection par des bactéries Gram-négatif sont associés à une mortalité plus élevée que ceux associés à une infection par des bactéries Gram-positif. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent la pathogénicité des souches septiques ne sont pas encore totalement compris. Nous avons montré que les bactéries Gram-négatives Escherichia coli (E.coli) pathogènes et responsables de sepsis produisent des vésicules à partir de leur membrane externe, appelées OMV pour outer membrane vesicle en anglais, ayant des propriétés particulières qui contribuent à la virulence de ces souches. En effet, ces OMV spécifiques ont la capacité d'induire seules un sepsis particulièrement grave. Nous postulons donc que ces OMV jouent un rôle majeur dans la sévérité des infections bactériennes et notamment du sepsis. Notre objectif est de comprendre comment ces OMV contribuent à la physiopathologie des infections par des infections à Gram négatif et au sepsis en particulier (mise en place et aggravation / séquelles à court et moyen terme).
Bénéfices attendus
Ces résultats devraient permettre de mieux appréhender le rôle et l’impact des OMV d’E. coli dans l’induction et l’aggravation du sepsis et ses conséquences néfastes à court et moyen terme. Ces résultats apporteront donc des informations à la fois fondamentales dans la connaissance de la physiopathologie des sepsis mais aussi donneront des pistes pour adapter les traitements de supports à utiliser chez les patients septiques admis en unité de soin intensif.
Procédures
Les animaux se subiront aucune intervention vigile autres que des injection intra-péritonéales, intra-veineuse ou sous-cutanées, à une fréquence faible (2 fois sur toute la procédure). Les animaux qui se verront administrer les OMV par voie intra-vésicale seront au préalablement anesthésiés par anesthésie injectable (Ketamine-100mg/kg/Xylazine- 10mg/kg, i.p., 10ml/kg) ou anesthésie gazeuse (4% isoflurane) durant toute la durée de l'intervention, qui durera environ 5 minutes. Ces animaux seront privés d’eau 2h avant cette instillation et jusqu’à 2h après cette procédure. Sur tous les animaux, nous procéderons à une anesthésie terminale par injection de 100μl d’un mélange de rompun/ketamine 1000 (2 ml de ketamine, 500μl de Rompun QSP10ml NaCl 0,9%) avant une prise de sang à la veine cave d’un volume de 700µL à 1mL en environ 15 secondes et qui sera suivie par l'euthanasie de l'animal par dislocation cervicale.
Impact sur les animaux
Certaines procédures expérimentales prévues chez la souris peuvent entraîner une souffrance chez l'animal avec des effets systémiques (sepsis). Ainsi, les paramètres cliniques (aspect du poil [score 1], posture courbée [score 2], défaut de mobilité [score 3]) et la mesure du poids (perte de poids 20% [score 3]) seront observés et quantifiés toutes les heures pendant 8 heures le jour de l’administration des OMV puis quotidiennement à partir du deuxième jour et jusqu’à la fin des expériences (sauf les pesées qui seront réalisées seulement 2 fois par semaine) et serviront d’une part comme paramètres expérimentaux validant impact des OMV et d’autre part comme critères d’évaluation objectifs de la souffrance de l’animal. Ceci nous permettra de déterminer un point limite : score≥ 3 et/ou perte de poids > 20%.
Devenir
A l'issue des procédures 1 et 2, la moitié des animaux sera euthanasiée pour évaluer l'impact des OMV sur les temps précoces après induction d'un sepsis afin d'établir leur rôle dans la phase aigüe. L'autre moitié des animaux sera gardée en vie et utilisée pour la procédure 3 qui vise à évaluer le rôle des OMV dans l'apparition de séquelles à court et moyen terme après apparition du sepsis. A l'issue de la procédure 3, tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser un score lésionnel macroscopique et microscopique.
Remplacement
Des expérimentations alternatives in vitro ont été préalablement réalisées pour démontrer l'effet des OMV sur les cellules impliquées dans l’induction du choc septique (plaquettes sanguines, neutrophiles, macrophages, cellules endothéliales) et valider ainsi la preuve de concept du projet. Cependant, les modèles animaux sont des éléments essentiels de la recherche sur le sepsis pour étudier de manière exhaustive les différentes étapes de l’induction d’un sepsis et pour tester l’effet des traitements habituellement prescrits à l’échelle d’un organisme entier.
Réduction
Le modèle d’injection des OMV par voie systémique, par voie intrapéritonéale et par voie intra-vésicale ainsi que les infections par des E. coli ont été validés dans l’équipe, ce qui facilite les étapes d'optimisation réduisant ainsi le nombre d'animaux requis pour ce projet. Nous utiliserons 10 animaux par groupes (et 5 animaux pour le groupe contrôle). Ce nombre a été estimé en fonction des tests statistiques qui seront utilisés.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans des cages à 20-24°C et 30-50% d’hygrométrie, en portoirs ventilés (dans des cages d’une superficie de 500cm2 avec un nombre de 5 animaux par cage), avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 1 fois par semaine. Du coton ou du sopalin sont ajoutés pour leur permettre de faire un nid. Les animaux ont deux semaines d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Pour les procédures d’injection des OMV par voie systémique, les animaux seront surveillés de manière permanente jusqu’au sacrifice (qui aura lieu entre 2 à 12h après l’injection des OMV). Pour les autres procédures, les paramètres cliniques (aspect du poil [score 1], posture courbée [score 2], défaut de mobilité [score 3]) et la mesure du poids (perte de poids 20% [score 3]) observés et quantifiés quotidiennement (sauf les pesées qui seront réalisées seulement 2 fois par semaine) et serviront d’une part comme paramètres expérimentaux validant l’efficacité du traitement et d’autre part comme critères d’évaluation objectifs de la souffrance de l’animal. Ceci nous permettra de déterminer un point limite : score≥ 3 et/ou perte de poids > 20%. Le dépassement de ces points limites conduira à l’euthanasie de l’animal concerné selon le décret N°2013-18 du 1er février 2013 relatif à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques.
Choix des espèces
La souris est le mammifère le plus facilement manipulable et le modèle plus décrit pour l’étude du sepsis. Les doses d’OMV à utiliser sont déjà validées dans cette espèce. Souris de 7 à 8 semaines pour toutes les procédures sauf la procédure 3. Dans la littérature, les souris utilisées pour l’étude du sepsis sont classiquement âgées de 5 à 6 semaines, âge auquel elles sont considérées comme adultes. Nous prenons une marge de deux semaines pour permettre l’acclimatation.
Etude des séquelles de la malaria cérébrale par neuroimagerie
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
504 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et sévère. Elles sont infectées par un parasite provoquant une malaria cérébrale, une partie n'étant pas traitée et développant perte de poids, hypothermie et troubles neurologiques avant d'être tuées, les autres suivies par IRM sous anesthésie pendant six mois puis soumises à des études comportementales non détaillées. Le projet étudie les séquelles cérébrales de la maladie. Le porteur affirme que le recours à l'animal est incontournable, aucune méthode in vitro ou in silico n'existant selon lui.
Objectifs
La malaria est une cause majeure de morbidité et de mortalité avec 241 millions de cas cliniques et plus de 627000 morts en 2020 (OMS). Elle est causée par un parasite du genre Plasmodium inoculé par le moustique Anophèle. La majorité des décès survient chez les enfants de moins de 5 ans en Afrique sub-saharienne. La malaria cérébrale, complication la plus létale de l’infection par Plasmodium falciparum, se traduit par une encéphalopathie accompagnée de convulsions, de pertes de conscience, et d’un coma conduisant au décès dans 15 à 20 % des cas, tandis que des déficits neurologiques peuvent subsister chez les survivants. Il n’existe à ce jour aucun traitement efficace de cette complication. Dix à 20 % des sujets survivant à une malaria cérébrale présentent des troubles neurologiques importants immédiatement après la maladie (cécité corticale, parésie, hypotonie, ataxie, épilepsie, troubles de la mémoire, de l’élocution etc...) qui peuvent régresser ou persister. Chez d’autres sujets, sans séquelles apparentes après la maladie, des atteintes neurologiques telles qu’une épilepsie, ou une hyperactivité avec déficit de l’attention se manifesteront plus tardivement. Alors que les séquelles de la complication cérébrale contribuent au coût humain, social et économique de la malaria en compromettant le développement et l’éducation des enfants qui en sont atteints, elles ne sont que très peu étudiées. Malgré l’autorisation en 2021 d’un vaccin contre la malaria (RTS,S/AS01) destiné à la population pédiatrique, il est peu probable qu’il conduise à l’éradication de la maladie et de sa complication la plus létale, puisqu’on estime qu’il ne permettra de réduire que 30% de la mortalité résultant des formes sévères de malaria. Nous utiliserons un modèle de malaria cérébrale avec survie obtenu chez la souris infectée par Plasmodium Berghei ANKA et traitée par un antimalarique dès l’apparition des signes neurologiques (504 souris seront utilisées). Ce modèle nous permettra d’étudier sur le long terme l’évolution des séquelles cérébrales sur les plans anatomique, métabolique, vasculaire et fonctionnel. Nous mettrons en œuvre des techniques d’imagerie non-invasives (IRM) réalisées sous anesthésie. Ces études permettront d’obtenir une information sur la distribution spatiale et temporelle des lésions, et de vérifier différentes hypothèses comme l’atteinte persistante des capillaires ou l’altération des connexions neuronales (connectome) aux niveaux structural et fonctionnel.
Bénéfices attendus
Cette étude repose sur l’emploi d’un modèle de malaria cérébrale chez la souris très utilisé en pathologie car présentant de nombreux points communs avec la maladie pédiatrique. Elle s’appuie aussi sur des méthodes avancées de neuroimagerie transposables à l’homme qui permettent l’exploration non-invasive du cerveau. L’étude par imagerie de la malaria cérébrale chez la souris a permis d’identifier pour la première fois en 2005 l’œdème cérébral ischémique comme principale caractéristique de la maladie et cause de décès. Ces résultats ont été confirmés 10 ans plus tard par deux études conduites sur des cohortes pédiatriques en Afrique, les enfants malades ayant bénéficié d’un examen clinique par neuroimagerie. L’objectif de notre projet est l’identification des lésions ou anomalies sous-tendant les déficits neurologiques chez les sujets ayant survécu au syndrome cérébral. Ces travaux réalisés sur un modèle expérimental très proche de la maladie humaine devraient permettre de mieux comprendre la nature des séquelles cérébrales chez les animaux ayants survécu à une malaria cérébrale qu’elles soient structurales, métaboliques, vasculaires, ou fonctionnelles. Notre étude est susceptible de fournir des marqueurs diagnostiques/pronostiques transposables à l’homme qui permettraient d’améliorer le suivi des patients et d’évaluer l’efficacité d’interventions thérapeutiques.
Procédures
Inoculation du parasite : les animaux induits pour la malaria cérébrale seront inoculés avec le parasite par une unique injection intrapéritonéale à l’état vigile, l’intervention n’est pas douloureuse et ne dure que quelques secondes. Examen clinique : le suivi des animaux induits pour la malaria et non traités par un antimalarique inclura 2 prélèvements sanguins pour suivi de la parasitémie. Le prélèvement d’une goutte de sang au niveau de la queue sera réalisé à l’état vigile, sans contention. Les animaux malades et traités subiront 3 prélèvements. Traitement : les souris induites pour la malaria et traitées recevront une injection intrapéritonéale quotidienne à l’état vigile du traitement anti-malarique pendant 10 jours. Les groupes contrôles recevront une injection quotidienne à l’état vigile d’une solution saline ou du traitement antimalarique selon les groupes. Imagerie cérébrale: les animaux seront imagés sous anesthésie, la durée de l’examen sera inférieure à 1h30. Les animaux contrôles et les animaux induits pour la malaria cérébrale et traités subiront 7 examens au total sur une période de 6 mois. Les souris induites pour la malaria cérébrale mais non traitées seront imagées deux fois (une semaine avant inoculation et une fois pendant la maladie). Les animaux contrôles et les animaux induits par la malaria cérébrale seront soumis à deux études comportementales, une fois à la fin du suivi de six mois.
Impact sur les animaux
Les animaux contrôles seront examinés par IRM avant administration d’une solution saline ou de chloroquine (selon les groupes), puis une fois par mois pendant 6 mois après la fin du traitement. La solution saline et la chloroquine seront administrées en ip une fois par jour pendant 10 jours. Elles ne produisent aucun effet délétère détectable par examen clinique ou monitoring physiologique. L’examen IRM sera conduit sous anesthésie gazeuse. Les seules nuisances ou effets indésirables possibles pour ces deux groupes sont essentiellement la défaillance cardiorespiratoire sous anesthésie, très rare avec l’isoflurane administré à faible dose. L’utilisation d’un monitoring physiologique permet en général de détecter les premiers signes de défaillance et d’interrompre immédiatement l’anesthésie ce qui permet le réveil rapide des animaux. Les animaux induits pour la malaria cérébrale et non traités seront examinés par IRM avant l’injection du parasite. Quatre à 6 jours après l’injection, les animaux présenteront les premiers signes de la maladie (perte de poids, poil hérissé, yeux mi-clos, léthargie). Puis, 6 à 8 jours après l’inoculation, les manifestations neurologiques apparaitront (hypothermie, diminution de la coordination et de la motricité) pouvant conduire au coma et à la mort. Les animaux seront imagés lors des premières manifestations neurologiques et euthanasiés sous anesthésie. L’examen par IRM et l’euthanasie auront lieu avant la survenue d’une hypothermie sévère, de convulsions et du coma. Les animaux induits pour la malaria cérébrale et traités à la chloroquine seront examinés par IRM avant l’injection du parasite. Ils seront traités dès l’apparition des premières manifestations neurologiques. Ils seraient euthanasiés s’ils présentaient une aggravation de leur état, la chloroquine étant inefficace à un stade avancé de la maladie. Les animaux traités efficacement par la chloroquine seront suivis comme les groupes contrôles par IRM pendant 6 mois. Les animaux ayant eu une malaria cérébrale sont moins actifs que les sujets contrôles. Les autres effets indésirables possibles sont liés au risque anesthésique pendant les examens IRM.
Devenir
A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront euthanasiés afin de prélever le cerveau en vue d’analyses biochimiques ou immunohistochimiques selon les cas.
Remplacement
Le recours à l’animal est incontournable car la détection des séquelles cérébrales et le suivi de leur évolution au cours du temps ainsi que leur impact sur la fonction cérébrale ne peuvent être réalisés que sur des animaux vivants. Il n'existe pas de méthode alternative in vitro ou in silico. Notre projet étudiera l’évolution de plusieurs paramètres cérébraux comme le métabolisme, le débit sanguin, le connectome structural, et le connectome fonctionnel. Le suivi de ces paramètres nous permettra d’identifier la nature des séquelles de la malaria cérébrale et de mieux comprendre leur impact sur la fonction cérébrale à divers âges de la vie.
Réduction
L’utilisation de techniques d’imagerie non invasive permettra de réduire le nombre d’animaux grâce au suivi longitudinal de chaque individu ce qui permettra le recueil d’un grand nombre de données anatomiques, métaboliques et fonctionnelles sur un même animal dans des conditions de stress minimal.
Raffinement
Le raffinement concernera toutes les procédures du projet ainsi que les conditions d’hébergement des animaux et devrait permettre de réduire le stress, l’angoisse et la douleur. En ce qui concerne l’induction de la malaria cérébrale et son traitement, un examen clinique quotidien permettra de déceler sans retard des signes d’aggravation neurologiques qui nécessiteraient de recourir à l’euthanasie. Tous les examens cliniques par imagerie seront réalisés sous anesthésie gazeuse avec surveillance physiologique. Un délai d'acclimatation minimum de 14 jours et une habituation à l'expérimentateur seront assurés. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, avec cycle jour/nuit, nourriture et boisson ad libitum et enrichissement environnemental. Les cages contiendront des rondins de bois à ronger, du coton pour la nidification, un refuge en plastique, et une roue fast-track avec igloo afin de diminuer les comportements agressifs, réduire l’ennui, et favoriser l’expression d’un maximum de comportements naturels.
Choix des espèces
L’inoculation du parasite murin Plasmodium Berghei ANKA chez la souris est un modèle validé et reconnu de malaria cérébrale pédiatrique qui a permis des avancées majeures dans la compréhension des mécanismes pathogéniques de cette maladie. Dans la majorité des études utilisant le modèle obtenu par inoculation de PbA, les souris induites pour la malaria cérébrale sont de jeunes adultes (entre 8 et 12 semaines). Plusieurs études ont montré une résistance au développement de la malaria cérébrale chez des animaux plus âgés. Nous induirons donc la malaria cérébrale chez des animaux âgés de 8 semaines.
Etude de l’effet d’administration de souches bactériennes probiotiques sur la colonisation néonatale du tube digestif murin par des souches bactériennes pathogènes
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système urogénital
3 640 souris, dont des femelles gestantes et leurs souriceaux, vont être utilisées, toutes tuées par dislocation cervicale à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les nouveau-nés sont colonisés par une bactérie E. coli puis gavés quotidiennement pendant trois à six semaines avec une suspension bactérienne, pour tester des souches probiotiques contre des bactéries résistantes aux antibiotiques. Le porteur indique que le gavage provoque un stress mais qu'il n'entraîne qu'extrêmement rarement une réponse délétère, et prévoit un surplus de souriceaux dont seuls les mieux colonisés sont conservés. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune expérience in vitro ne peut reproduire la colonisation intestinale in vivo.
Objectifs
Escherichia coli est une bactérie qui colonise le tube digestif de l’Homme et des animaux à sang chaud, dès les premières heures qui suivent la naissance. Un sous-groupe d’E. coli est responsable de maladies telles que les méningites néonatales, les septicémies et les infections urinaires. Le traitement de ces infections passe par l’administration d’antibiotiques. Cependant, dans un contexte de multiplication de résistance bactérienne aux antibiotiques, la recherche d’autres voies de lutte contre ces agents infectieux est nécessaire. Parmi plusieurs stratégies, l’usages de bactéries issues d’un autre sous-groupes de E. coli possèdant des propriétés bénéfiques, notamment la capacité de combattre les souches potentiellement pathogènes, est décrit.
Bénéfices attendus
Le projet vise à amorcer le développement d'une stratégie de lutte contre les bactéries pathogènes multirésistantes aux antibiotiques trouvant leur réservoir dans le tube digestif des mammifères sans utiliser d'antibiotique.
Procédures
- Récolte de fèces sur animaux vigiles - Gavage oral qutodiein pendant 3 à 6 semaines avec 100 uL d'une suspension bactérienne (non visqueuse, non irritante) ou du PBS Administration antibiotique dans l'eau de boisson. Contamination par contact des nouveau-nés par la souche d'intérêt.
Impact sur les animaux
La procédure expérimentale, basée sur un gavage oral des souris avec une suspension bactérienne, implique une nuisance (stress) pour l'animal. Cependant, le gavage oral des souris par des E. coli commensales et pathogènes n’occasionne qu’extrêmement rarement une réponse délétère pour l’animal. Lors de l'expérimentation pilote, aucun individu n'a présenté de signe imputable à la colonisation bactérienne initiale ni aux gavages quotidiens. Le prélèvement de féces sur animaux vigiles n'induit pas de douleur. Cependant un léger stress peut être provoqué par la préhension de l'animal avant le prélèvement, il sera limité par l'habituation et dure 1 à 2 minutes le temps du prélèvement.
Devenir
L'ensemble des animaux est euthanasié par dislocation cervicale à l'issu de la procédure expérimentale.
Remplacement
Aucune expérimentation alternative ne peut remplacer l'aspect in vivo de ce projet. Des expérimentations in vitro de diminution du nombre et de la croissance de notre bactérie cible ont été effectués au laboratoire en réponse à notre souche probiotique. Différentes doses et combinaisons (mutants, souches expérimentales) ont pu être testées permettant de sélectionner la souche probiotique la plus efficace et pertinente in vitro. Cependant, l'objectif du projet étant de démontrer l'efficacité de la souche probiotique Nissle à réduire le portage intestinal d'une souche multirésistance, les systèmes in vitro (tube à essai) ne nous permet pas d'appréhender cette question. Seule une approche in vivo nous permettra de prendre en compte la complexité de l'organisme et l'effet de l'administration quotidienne par gavage de la souche probiotique sur le portage de la souche multirésistante dans l'intestin.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires est calculé au plus juste en tenant compte des éléments suivants : - Une expérimentation pilote a permis de montrer que des résultats positifs pouvaient être observés chez certains animaux (n= 4 animaux par groupe dans cette expérience obtenus à partir de différentes femelles gestantes) pour deux souches probiotiques sélectionnées après 28 jours de gavage. Les résultats obtenus ont permis de sélectionner une souche probiotique pertinente à tester sur un plus grand nombre d'animaux pour conclure sur son efficacité. - Notre expérience montre que les femelles Swiss font des portées comprenant en moyenne 12 souriceaux. Afin de garantir 10 mâles et 10 femelles colonisés par groupe, 7 femelles gestantes sont nécessaires, avec un attendu de 84 souriceaux. Le surplus de souriceaux permettra de ne conserver que les animaux dont la colonisation est suffisament élevé (au moins 10^8 log(CFU/g de fèces)) et stable entre les 2 points initiaux de mesure, ainsi que de compenser un sexe-ratio différent de 1 (données imprévisibles). L'expérimentation pilote a permis de montrer que pour constituer notre effectif final de 64 souris, 7 mères gestantes étaient nécessaires. 91 individus seront nécessaires par expérimentation (7 femelles gestantes + 84 souriceaux). Nous serons amenés à reproduire ce protocole pour valider nos données (répétition) et utiliser différents probioiques (nombre estimé à 6) contre différents variants de E. coli pathogènes (nombre estimé à 10). Ainsi, nous pensons sur la période de 5 ans utiliser 3640 souris (dont 280 femelles gestantes). - Les résultats obtenus sont comparés avec le logiciel Prism GraphPad 8, en utiliant le test du Chi-2 (comapraison des moyennes de charges bactériennes dans les fèces en CFU/g de fèces) ou le test exact de Fischer (comparaison des proportions de souris toujours excrétrices de bactéries pathogènse par rapport au nombre total de souris).
Raffinement
Le suivi expérimental repose sur des techniques non-invasives. Le prélèvement de fèces sur animaux vigiles n'induit pas de douleur mais une habituation à la contention par l'expérimentateur sera réalisée avant les prélèvements. La contention des animaux lors des gavages oraux et des récoltes de selles s'effectue par du personnel qualifié et expérimenté dans la manipulation des souris. Les gavages sont réalisés avec des sondes souples. La solution de gavage est de volume limité (100 uL maximum par administration). Celle-ci n'est ni visqueuse, ni irritante. Compte-tenu de la fréquence des gavages, ceux-ci sont réalisés uniquement par du personnel qualifié, en veillant à ne pas placer la sonde trop profondément dans l'oesophage, et l'administration se fait lentement. Durant cette phase, les souris sont évaluées individuellement à l'aide de critères cliniques et pesées 2 fois par semaine, opérations effectuées par des personnels formés et habitués à la manipulation de souris notamment dans le cadre de ce modèle expérimental. Nous serons attentifs à d'éventuels signes de souffrance et mettrons en place une grille d'évaluation. La grille d'évaluation comprendra les points suivants: - qualité du poil (lisse/hérissé; propre/sale), - perte de poids éventuelle (supérieure ou pas à 15%), prostration: l'animal sera mis sur la main de l'expérimentateur (mesure de la vivacité: curieux (redresse la tête, sens en alerte) / prostré (mise en boule, recroquevillé), mesure de la mobilité: mouvement exploratoire se déplaçant sur la main / pas de mouvement), qualité et aspect des selles (normales, molles, présence de diarrhées ou sang). Si un point limite est atteint alors la procédure s'arrêtera et l'animal sera euthanasié. Les animaux seront hébergés en présence d'un enrichissement (même quantité de coton dans toutes les cages) en présence d'une petite maison en plastique rouge transparente pour leur permettre de se faire un nid tout en nous permettant de les observer sans les déranger.
Choix des espèces
La souris est le mammifère le plus facilement manipulable pour l’étude de l’établissement de la colonisation intestinale. Aucune expérimentation alternative ne peut remplacer l'aspect in vivo de ce projet. L'administration de bactéries à effet probiotique s'effectue par gavage quotidien. Une administration par voie orale d'une culture fraîche à cette fréquence offre toutes les chances d'une efficacité rapide. L'expérimentation pilote a permis de montrer que des résultats positifs pouvaient être observés chez certains gavage. Femelles reproductrices et souriceaux agés de moins de 2 jours pour la colonisation via l'environnement de la souche pathogène (absence de contact). Souriceaux âgés de J21 à J70 pour le suivi de la colonisation dans les selles et gavages avec le probiotique
Evaluation préclinique de l’influence de composés sur le système immunitaire
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Rats : 1200
Hamsters dorés : 1600
7 200 souris, 1 200 rats et 1 600 hamsters vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever le sang et les organes lymphoïdes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cette société de prestation les expose à des composés vaccinaux ou pharmacologiques par une à cinq injections sous anesthésie, afin de mesurer la réponse immunitaire induite. Le porteur indique attendre des pertes de poids et des douleurs transitoires au point d'injection. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité observée in vivo, l'évaluation chez l'animal étant présentée comme "nécessaire" pour sélectionner les candidats médicaments.
Objectifs
Notre société développe et propose des modèles de recherche, adaptés aux études visant à mesurer l’efficacité et l’innocuité de candidats thérapeutiques et vaccinaux. La réponse du système immunitaire est une composante importante de notre organisme à considérer dans le développement de nouveaux vaccins ou de nouveaux composés pharmacologiques, en particulier d’origine biotechnologique. En pratique, ces études consistent à injecter, dans la plupart des cas à plusieurs reprises à une ou plusieurs semaines d’intervalle, un produit à potentiel immunogène, dans le but d’évaluer la réponse immunitaire induite (dans le sang et les tissus lymphoïdes). Ce programme de recherche s’intéresse à mieux caractériser cette composante chez le rongeur, et plus particulièrement l’immunogénicité de nouvelles formulations ou composés (adjuvants, vaccins, protéines thérapeutiques, etc.). Pour cela, un composé induisant potentiellement une réponse immune sera injecté aux animaux. Afin d’évaluer et de caractériser cette réponse immune, des prélèvements, sanguins notamment, seront ensuite réalisés tout au long de l’étude afin de suivre, par exemple, l’émergence d’anticorps dirigés contre l’antigène injecté dans le sérum, ou l’activation cellulaire associée spécifiquement au composé d’intérêt. Dans cette procédure, aucun challenge infectieux ne sera réalisé sur les animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif de pathologies existantes ou dont l’immunogénicité doit être testée. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette maladie pour laquelle les options sont pour le moment limitées.
Procédures
Les animaux (rats, souris ou hamsters) immunocompétents ou partiellement immunodéficients (à un niveau de déficit n’induisant pas de risque infectieux significativement supérieur pour l’animal) transgéniques ou non, humanisés ou non, seront exposés à des composés de différente nature (entité chimique de type vecteur ou adjjuvant vaccinal, biologique, et/oubiotechnologique (nucléique et protéique), etc.) Les animaux recevront en général 1 à 5 injections administrations du produit potentiellement immunogène avec au minimum une semaine d’intervalle entre les injections mais potentiellement plusieurs mois. Cette procédure aura lieu sous anesthésie générale qui durera environ une heure. Afin d’évaluer de potentiels traitements, des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale,soit sous anesthésie générale d’environ une heure, intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie, oralesoit sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ), sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon). Les volumes administrés respecteront les recommandations. Les animaux seront observés tous les jours, et pesés au minimum 2 fois par semaine. Le site d’injection sera observé sur les quelques jours suivant l’administration pour surveiller l’absence de réactions dans la zone, et l’état général des animaux sera vérifié. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés au cours de la vie de l’animal pour le suivi des réponses immunitaires ou d’autres paramètres biologiques. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera environ une heure. La fréquence et le volume de ces prélèvements sera conforme aux recommandations vétérinaires pour la voie utilisée. Ces recommandations incluent une potentielle réhydratation sous cutanée des animaux en cas de prélèvements répétés / à volume important. En fin de projet, les animaux seront euthanasiés. Un prélèvement de sang terminal en intracardiaque pourra être réalisé sous anesthésie générale profonde puis des prélèvements d’organes pourront etre effectués après euthanasie.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, nous pouvons nous attendre à des pertes de poids et des douleurs transitoires au site d’injection et dans la zone (ganglion drainant).
Devenir
En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour récupération de grandes quantités de sang et d’organes lymphoïdes afin de vérifier la réponse immunitaire induit par les vaccinations.
Remplacement
Des modèles in vitro permettent d’étudier certains processus de l’immunité et sont utilisés pour présélectionner les composés les plus intéressants mais aucun ne reproduit la complexité observée in vivo. C’est pourquoi l’évaluation chez l’animal des propriétés immunogènes des candidats médicaments chimiques ou biologiques est nécessaire, pour sélectionner le meilleur composé pouvant être amené dans les études cliniques chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est le plus faible possible en fonction des objectifs de l’étude et de la puissance statistique nécessaire. Entre 3 et 50 animaux seront inclus par groupe. Seuls des rats, souris et hamsters seront utilisés dans le cadre de ce projet. Ces espèces sont utilisées pour tester les effets de composés sur le système immunitaire.
Raffinement
Les prélèvements sanguins sont de faibles volumes et seront réalisés à l’aide de la méthode la moins invasive possible. Les volumes et fréquences d’administration et de prélèvement sont conformes aux bonnes pratiques et toutes les techniques sont réalisées par du personnel formé et compétent. Enfin, les prélèvements d’organes/tissus sont réalisés après euthanasie. Dans tous les cas, les animaux sont observés régulièrement et des mesures sont mises en œuvre pour arrêter, minimiser ou diminuer la souffrance et/ ou détresse de l’animal en cas d’apparition de signe clinique indésirable.
Choix des espèces
Les études à l’aide des petits rongeurs, notamment les souris, sont depuis longtemps la première étape de l’exploration du rôle physiopathologique du système immunitaire ou de l’efficacité de tout nouvel immunomodulateur, qu’il soit d’origine chimique ou biotechnologie. Selon le type de profil immunologique ou le type de prélèvement nécessaire, le rat et le hamster pourront également être utilisés. L’excellente connaissance du système immunitaire des rongeurs, conduisant souvent à une meilleure connaissance du même système chez l’Homme, permet d’explorer de nouvelles pistes immuno-pharmacologiques. Les animaux pourront être partiellement immunodéficients (à un niveau de déficit n’induisant pas de risque infectieux significativement supérieur pour l’animal), puisque cela s’avère d’un fort intérêt pour certaines approches expérimentales pathologiques e.g. maladies infectieuses. Par ailleurs, les rats, les souris et les hamsters autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement. Seuls les animaux sevrés seront utilisés. Les animaux seront utilisés à partir de 5 semaines pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles, c’est-à-dire un système immunitaire établi, d’après la littérature sur le sujet.
Evaluation pharmacologique de composés naturels ou de synthèse pour le traitement de la Covid-19
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
4 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par le SARS-CoV-2 en intra-nasal ou intra-gastrique puis gavées de molécules jusqu'à dix jours, avant prélèvement d'organes, l'infection provoquant posture courbée, détresse respiratoire et prostration. Le porteur présente le projet comme une plateforme de prestation de service à destination de futurs clients académiques ou privés, testant des antiviraux à la demande. Il affirme qu'il est "crucial" d'utiliser un organisme vivant entier et que des modèles in vivo sont "incontournables".
Objectifs
Le SARS-CoV2 est le virus responsable de la maladie appelée COVID-19. Le manque de vaccin et d'antiviraux a révélé un besoin urgent d'études in vivo pertinentes afin d'évaluer de nouvelles molécules potentiellement anti-SARS-CoV2. Différents modèles de souris dont un modèle de souris génétiquement modifiées pour être sensibles au virus SARS-CoV2 a été décrit dans la littérature. Ces souris, disponibles dans le commerce sont un outil de choix pour étudier la pathogenèse du SARS-CoV2 et pour évaluer les vaccins et les produits thérapeutiques COVID-19. L’ambition de ce projet est de proposer une plateforme technologique, à destination de futurs clients, académiques ou privés, où des souris sensibles au virus seront utilisées pour tester de nouvelles molécules antivirales pour le traitement de la COVID-19. Pour comprendre les différents mécanismes biologiques et l’influence du système immunitaire de l’hôte sur le virus, il est en effet crucial à ce stade, d’utiliser un organisme vivant dans son ensemble. Différentes techniques in vitro ont déjà été utilisées en amont. Nous avons donc pour objectif de contribuer au développement de thérapies innovantes dans le domaine de l'infectiologie afin de répondre à un problème majeur qu’est l'épidémie de Covid-19.
Bénéfices attendus
L’utilisation d’un modèle souris pour étudier la pathogenèse du SARS-CoV2 contribue à comprendre les différents mécanismes biologiques et l’influence du système immunitaire de l’hôte sur le virus. Ce modèle préclinique in vivo permet d’évaluer des vaccins et des produits thérapeutiques Covid19
Procédures
Ce projet a été écrit afin de réaliser de la prestation de service. Il nous est donc difficile à ce jour de définir le nombre d’intervention et leur durée mais le nombre de prélèvements est limité. Pour chaque injection (sous-cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse) mais également pour le gavage la durée maximale est de 1min, cela comprend le temps de la contention et de l'injection. Pour les prises de sang, l'animal est anesthésié dans la boite à induction pendant 2 à 3 min, puis la prise de sang est réalisée. L’animal est ensuite remis dans sa cage et surveillé. L’ensemble dure maximum 5 min. Certains animaux seront soumis à 2 tests de tolérance au glucose au cours de la procédure Pour des procédures dites « classiques », les souris anesthésiées seront infectées par le SARS-CoV2 selon la voie définie (voie intra nasale ou voie intra gastrique), un gavage de molécules tous les jours pendant maximum 10 jours avant prélèvement d’organes
Impact sur les animaux
Chez la souris, l’infection au SARS-CoV2 induit les signes cliniques d’une maladie infectieuse : posture courbée, pelage en piloérection, respiration difficile, prostration ou perte d’activité et perte de réponse à un stimulus.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort. Il n’y a pas de possibilité de replacement, vu le contexte hautement pathogène
Remplacement
L’amplitude de l'épidémie de Covid-19 ainsi que l'absence de traitement de référence rend urgente la découverte de nouvelles solutions thérapeutiques innovantes. Le recours à l’animal de laboratoire s’inscrit dans le cadre de l'étude de l’efficacité in vivo d’un composé sur une infection, qui résulte non seulement de l’effet de ce composé sur le virus mais également de la réponse du système immunitaire de l’hôte sur cet agent pathogène. Il n’existe aucun modèle in vitro mimant de façon précise ces interactions complexes. Afin d’évaluer l’activité thérapeutique de nouvelles substances, des modèles pharmacologiques in vivo mimant les pathologies sont incontournables. Les souris sont largement utilisées par les équipes de Recherche publique et privée dans le domaine des maladies infectieuses pour les études d'immunologie et de lésions pulmonaires. Elles ont un système immunitaire bien caractérisé. Les souris sont généralement sensibles à l’infection par le SARS-CoV2 et constituent le modèle de choix pour l’investigation de cette pathologie.
Réduction
Une attention toute particulière est portée sur le nombre d’animaux utilisés dans le projet. Nous travaillons avec une compagnie spécialisée dans les biostatistiques. Cette collaboration nous permet d’utiliser le nombre strictement nécessaire pour chaque expérience et de l’optimiser durant toute la durée du projet. Le nombre calculé de souris nécessaires sera au maximum de 4500 sur 2 ans. Le nombre d’animaux inclus dans chaque étude peut varier de 20 à 100, en fonction du nombre de groupes différents à générer dans chaque étude (nombre de molécules antivirales à tester, doses différentes de la molécule antivirale). Le nombre d'études variera en fonction de la demande des utilisateurs de la plateforme. Cet écart dans le nombre d’animaux par étude justifie la fourchette d’évaluation du nombre de souris requises pour une année.
Raffinement
Le bien-être de l’animal sera en permanence au centre de nos préoccupations. Les souris sont hébergées dans des cages à 22 ± 2 °C et 50 ± 10% d’hygrométrie, en portoirs ventilés ou isolateurs, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé chaque semaine. Pour les souris mâles en condition d’obésité et de diabète un change supplémentaire sera réalisé en fonction de l’état de la litière en particulier dû à la production d’urine. Des sacs dégradables contenant la litière sont ajoutés pour leur permettre de faire un nid, comme enrichissement du milieu. Les animaux ont une semaine d’acclimatation avant que les procédures ne débutent. Les conditions d’expérimentation font l’objet d’un suivi attentif du bien-être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement par la structure en charge du bien-être animal. Pour le confort de l'animal, la prévention du stress est intégrée aux procédures expérimentales par l'utilisation d'une anesthésie gazeuse (isoflurane) pendant tous les gestes douloureux, lors des différentes injections des traitements potentiels (injection intraveineuse, injection intra-musculaire...). Tout animal présentant des signes de douleur, souffrance ou stress sera mise à mort. Les critères d’arrêt utilisés sont: - Le suivi quotidien du poids - La combinaison de plusieurs des signes cliniques : posture courbée, piloérection, difficulté respiratoire, prostration ou perte d’activité, perte de réponse à un stimulus. Une grille de scoring permettra le suivi quotidien et une intervention précoce en cas de signes dus à la pathologie.
Choix des espèces
Plusieurs modèles animaux d'infection au Sars-CoV-2 sont actuellement utilisés par la communauté scientifique : les primates non humains, les chats, les furets, les hamsters et les souris. Les souris sont largement utilisées dans les études d'immunologie et de lésions pulmonaires, ont un système immunitaire bien caractérisé et un cycle de reproduction rapide. Leur taille, leur reproduction et leur croissance rapides constituent des avantages non négligeables pour accélérer la complétion des études associées à des tests statistiques pour conclure à l'efficacité des interventions potentielles. Souris de 5 à 10 semaines minimum et jusqu’à 30 semaines.