Maladies infectieuses

288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie créant des plaies dorsales maintenues ouvertes par une attelle, puis l'infection de ces plaies par un staphylocoque et des prises de sang répétées, pour mettre au point un modèle de plaie chronique infectée. Le porteur décrit une gêne au réveil et des symptômes d'infection comme une rougeur, un gonflement ou une apathie. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative in vitro pour évaluer la cicatrisation d'une plaie infectée.

Objectifs

L’objectif est à la fois d’optimiser les technologies plasmas existantes et de développer de nouvelles technologies pour éliminer les bactéries résistantes responsables d’infections nosocomiales. Le projet se déroule en trois étapes et feront l’objet de plusieurs demandes d’autorisation de projet. Cette DAP concerne uniquement sur le deuxième objectif, qui est de créer un modèle murin de plaie chronique infectée pour démontrer l'efficacité des plasmas froids pour désinfecter et favoriser la cicatrisation. Il est attendu de la première partie du projet une amélioration de la cicatrisation des plaies chroniques suite à l’utilisation du plasma. Si cela est confirmé, la suite logique des évènements sera de transposer l’utilisation de ce traitement à des plaies chroniques infectées, en commençant par la validation d’un modèle murin de plaie chronique infectée par S. aureus. Une fois la plaie obtenue, elle sera infectée par S. aureus et suivie pendant 7 jours pour évaluer le devenir de l’infection. Cette seconde étape est également une mise au point puisque deux souches de S. aureus à deux concentrations différentes seront testées : une concentration dite faible proche d’une infection nosocomiale et une concentration dite élevée, comparable à ce qui est décrit dans la littéraure.

Bénéfices attendus

Au sein du projet global, il est attendu que l’utilisation du plasma froid avec un nouveau mélange de gaz soit efficace pour lutter contre l’infection par des bactéries résistantes aux antibiotiques ou pas et pour améliorer la cicatrisation des plaies présentant un déficit cicatriciel. A plus long terme, cela pourrait permettre de généraliser l’utilisation de divers dispositifs à plasma à l'être humain, chez des patients souffrant de troubles de la cicatrisation (diabète, immunodépression, etc.) ; mais aussi de lutter contre l’antibiorésistance s’installant notamment sur ces plaies dans le cas d’infections nosocomiales. Cela pourrait également offrir des opportunités de traitement dans divers domaines (chirurgie, ophtalmologie, oncologie, etc.). La généralisation de l’utilisation de cette technologie pour entièrement décontaminer du matériel médical en milieu hospitalier pourrait être envisagée.

Procédures

Des puces d’identification dorsales seront injectées en sous-cutané à tous les animaux (5 minutes par animal). Les animaux seront soumis à une anesthésie générale et à la chirurgie visant à créer les plaies chroniques (biopsy punch et pose de l’attelle avec points de suture, 20 minutes par animal). 5 prises de sang à la veine submandibulaire seront effectuées sur chaque animal tout au long de l’expérience à l’aide d’une aiguille. Tous les animaux seront vigiles (2 minutes par animal). Pendant 3 jours après la chirurgie, tous les animaux recevront des injections d’analgésiques en sous-cutané pour gérer la douleur au maximum (2 minutes par animal). Les plaies des animaux seront infectées par Staphylococcus aureus (dépôt de solution non invasif, 5 minutes par animal). Des prélèvements seront effectués à la surface des plaies de chaque animal à l’aide d’un coton-tige (10 secondes par animal).

Impact sur les animaux

Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après l’injection de la puce d’identification pourrait être observés. Suite à la création des deux plaies dorsales, une douleur et une gêne possible dans les déplacements sont attendues au reveil de l’animal sans analgésie. Si les souris se grattent ou se mordent, des blessures pourraient apparaitre sur le dos ou les flancs. Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après la prise de sang pourrait être observés. Des symptômes de l’infection pourraient être observés après l’inoculation de S. aureus (rougeur et gonflement au niveau de la ou des plaies, diarrhée, troubles locomoteurs, hyperthermie, apathie, isolement).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort soit les 288 souris. Des prélèvements de tissus seront effectués post-mortem pour la partie histologie (zone de biospsie et rate) pour l'analyse biologique de la reconstruction de l'épiderme cutané, ainsi que des prélèvements de la surface de la plaie pour analyses bactériologiques. La décision est prise par les responsables scientifiques et concepteurs.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative non animale pour cette partie du projet, puisque l’objectif est d’évaluer l’efficacité des plasmas à gaz sur l'infection et la cicatrisation d’une plaie en vue d’une standardisation de son utilisation chez l’être humain. Ainsi, il n’est pas possible de remplacer les animaux par un modèle in vitro. Cependant, en fonction des résultats des expériences précédentes. Il sera possible de réduire le nombre d’animaux en sélectionnant la lignée de souris permettant d’obtenir les résultats les plus pertinents.

Réduction

Les volumes de sang à prélever par animal et leur fréquence étant contraints, les volumes prélevés à chaque prise de sang seront « poolés » par 2 (toujours les mêmes). Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques garantissant une puissance de test de 80% minimum en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. Les analyses sont faites sur les animaux du même groupe et de même sexe pour limiter la variabilité.

Raffinement

Dès l'arrivée des animaux à l’animalerie, une semaine d’acclimatation sera effectuée pour limiter au maximum les perturbations liées à un nouvel environnement. Les animaux seront surveillés 2 fois par jour (télémétrie, signes cliniques tels que le poids, l’apparence et le comportement général). Les souris bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger). Les souris sont hébergées en portoirs ventilés confinés. La pose des puces est faite sous anesthésie générale. Pour la partie chirurgie et le suivi post-opératoire : Période préopératoire : injection pré-opératoire d’analgésique au moins 20 minutes avant le début de la chirurgie Période opératoire : anesthésie gazeuse. Période postopératoire : injection post-opératoire immédiate d’anti-inflammatoire suivie d’une injection d’analgésique (même dose) le soir. Injection d’anti-inflammatoire le matin pendant 48h. Injection d’analgésique (même dose) à la demande matin et soir pendant 72h en fonction du résultat de l'évaluation de la douleur, si elle n'est pas contrôlée par l’anti-inflammatoire. Visite animalier matin et soir. Installation d’un matelas chauffant sous la cage de réveil, et installation des souris sous une lampe chauffante n’émettant pas de lumière en cas d’hypothermie. Les souris bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid et objet à ronger). Les souris sont hébergées 4 par cage en portoirs ventilés. Après chaque prise de sang, une récompense positive alimentaire de type bouchés fruitées ou des rondelles de bananes sèches ou popcorn sera réalisée.

Choix des espèces

Il n’existe pas d’alternative non animale puisque l’objectif est d’évaluer l’efficacité des plasmas à gaz sur l'infection et la cicatrisation d’une plaie en vue d’une standardisation de son utilisation chez l’être humain. Ainsi, il n’est pas possible de remplacer les animaux par un modèle in vitro qui permettrait de représenter au mieux un cas clinique. La souris est une espèce adaptée pour ce type de mise au point en expérimentation animale. Les souris utilisées seront âgées de 6-7 semaines, elles doivent être de jeunes adultes pour pouvoir faire les biopsies (décrits dans les modèles publiés) et avoir un système immunitaire mature.

924 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par voie intraveineuse des vecteurs viraux codant des molécules immunothérapeutiques puis des prélèvements sanguins, avant d'être tuées pour analyse de leurs organes, afin de comparer des candidats contre l'immunosuppression qui suit un sepsis. Le porteur indique n'attendre aucune toxicité des produits testés. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative capable d'apporter le même niveau d'information.

Objectifs

Nous nous interessons au développement de molécules agissant sur le système immunitaire exprimées par des vecteurs viraux notamment pour traiter l’immunosuppression post-sepsis. De nombreuses molécules existent sous forme de protéines recombinantes dont certaines d’entre elles sont déjà en développement clinique dans le traitement de l’immunosuppression post-sepsis. L’expression d’une ou plusieurs de ces molécules via un vecteur viral pourrait permettre une expression prolongée, une distribution différente dans l’organisme, voire engendrer une activité biologique différente de celle de la forme soluble et ainsi avoir une efficacité accrue. Des études précédentes ont permis d’obtenir une preuve de concept pour un candidat basé sur un vecteur viral codant pour une molecule agissant sur l’immunité adaptative, administré par voie intraveineuse. Dans le but d’optimiser ce 1er candidat, nous voulons évaluer dans une étude préclinique exploratoire, la possibilité de co-exprimer dans ce vecteur, une molécule agissant sur l’immunité innée avec la molécule agissant sur l’immunité adaptative déjà validée, chez la souris naïve puis dans un modèle murin de souris spécifique de l’immunosuppression induite par le sepsis. Agir à la fois sur la réponse immunitaire innée et adaptative pourrait permettre une meilleure restauration du système immunitaire et ainsi diminuer le temps d’hospitalisation, le taux d’infection secondaire et in fine le taux de mortalité post-première infection et/ou seconde infection. Plusieurs candidats ont été développés : un pour chacune des molécules seules et un pour les deux ensembles. L’objectif final est de démonter l’intérêt de co-exprimer deux molécules agissant sur les deux pans du système immunitaire pour traiter l’immunosuppression induite par le sepsis, dans un même vecteur. Cependant, le modèle murin de sepsis utilisé étant classé sévère, il est primordial de vérifier l’efficacité des produits dans des souris naïves au préalable. En effet, si le(s) produit(s) n’avai(en)t pas l’effet escompté sur le système immunitaire, ou que l’ajout de la seconde cytokine s’avérait délétère pour l’activité déjà connue du produit, il ne serait alors pas testé dans le modèle sepsis.

Bénéfices attendus

Ce projet rentre dans une thématique de recherche plus large dont l’objectif global est de développer de nouveaux traitements pour traiter l’immunosuppression induite notamment par le sepsis en restaurant le système immunitaire des patients et ainsi prévenir les infections secondaires pouvant leur être fatales. L’objectif à court terme de ce projet de recherche est de permettre l’avancement des connaissances scientifiques sur les différents produits d’immunothérapie injectés par voie intraveineuse chez la souris naïve. Les objectifs à long terme sont de tester ces produits d’immunothérapie dans un ou plusieurs modèles de souris immunodéprimées à la suite d’une infection (sepsis). Si un/plusieurs de ces produits permettent de restaurer l’immunosuppression induite chez la souris, ils pourraient faire l’objet d’un développement clinique afin d’espérer obtenir une autorisation de mise sur le marché afin de soigner l’immunosuppression chez l’homme dans l’indication du sepsis.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : -Injection d’un tampon par injection intraveineuse sous brève anesthésie générale gazeuse (1 fois/souris et 2 à 3 min/animaux) après anesthésie locale (15 secondes/souris) pour 14% des animaux -Injection d’un produit d’immunothérapie, parmi les 4 produits à visée thérapeutique à tester, par injection intraveineuse sous brève anesthésie générale gazeuse (1 fois/souris et 2 à 3 min/animaux) après anesthésie locale (15 secondes/souris) pour 86% des animaux -Prélèvement de sang sous anesthésie locale (30secondes/souris) pour 100% des animaux

Impact sur les animaux

Aucune toxicité des produits testés n’est attendue. Les animaux subiront en plus de l’injection des produits d’immunothérapie des prélèvements sanguins après anesthésie locale.

Devenir

Tous les animaux inclus dans les procédures sont mis à mort puis le sang et/ou organes sont prélevés nous permettant d’évaluer l’efficacité de notre produit d’immunothérapie. Aucune souris restante à la fin des deux procédures.

Remplacement

Les objectifs de ce projet sont d’évaluer la durée et le taux d’expression de plusieurs produits d’immunothérapie chez l’animal et de mesurer les activités immunologiques sur différents types cellulaire provenant de différents organes. Il n’existe pas de méthode alternative à l’utilisation d’animaux vivants et susceptible d’apporter le même niveau d’information pour répondre à ces objectifs.

Réduction

Tout au long du projet, nous essayerons de réduire le nombre de souris sans toutefois compromettre la fiabilité des résultats. Le sang de 3 souris/groupe/temps sera prélevé pour la réalisation de la pharmacocinétique (nombre d’animaux suffisant, basé sur les résultats des procédures précédemment réalisées dans le cadre du projet global), pour limiter le nombre d’animaux. Six souris/groupe sont prévues pour couvrir l’éventuelle variabilité des tests immunologiques (variabilité plus importante pour ces tests immunologiques déjà observée au préalable) et permettre l’analyse statistique. Ce type d’expérience ayant déjà été réalisé au cours du projet global, le nombre d’animaux proposé ici pour chacun des types de tests est le minimum requis pour obtenir un résultat fiable. Dans ce projet, pour chaque procédure nous prélèverons post mortern la plupart des organes cibles de notre candidat afin de répondre à un maximum de question dans un seul protocole.

Raffinement

Mise en place du raffinement dans nos procédure : Toutes les injections sont réalisées sur animaux sous anesthésie générale gazeuse après application d’un anesthésique local. Les prélèvements sanguins se font sur animaux vigiles après application d’un anesthésique local quelques minutes avant. Les points limites ont été définis de manière suffisamment prédictive et précoce pour éviter toute souffrance de l'animal de la naissance à la mort. Tout au long des procédures nos animaux sont surveillés au moins 5 fois par semaine avec une observation accrue après injection de nos candidats (2h et 6h post injection) même s’il n’est pas attendu d’effet délétère de nos produits sur l’état général des animaux. Néanmoins, en cas d’apparition de signes cliniques (pelage ébouriffé, terne), une surveillance accrue avec suivi de la température sera effectuée. En cas de fièvre (température > 39°C), du paracétamol sera donné dans l’eau de boisson (0.6mL/mL). Si persistance de la fièvre (> 2 jours) ou de tout autre signe clinique (immobilité, prostration, apathie) pouvant traduire une douleur/détérioration de l’état général, ce sera un critère de point limite et il y aura mise à mort de l’animal. En cas d’apparition de lésion, les yeux seront nettoyés au sérum physiologique afin de mieux évaluer les dommages. Si une infection bactérienne et/ou une dégradation de l’œil sont observées, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle murin est un bon modèle animal pour étudier la réponse immunitaire car le système immunitaire de la souris est bien décrit et les réactifs nécessaires sont largement disponibles. D’autre part, ayant déjà validé l’efficacité d’un des candidats dans ce modèle murin, il nous semble pertinent de valider les autres candidats dans le même modèle, puisqu’une comparaison entre ces différents produits sera réalisée ici. Ces produits d’immunothérapies sont développés pour être utilisés chez l’homme et ils devraient cibler des patients adultes. Pour réaliser les tests préliminaires chez la souris naïves, nous utiliserons des souris avec un système immunitaire fonctionnel. Nous utiliserons donc des animaux d’au moins sept semaines pour ces études précliniques.

639 rats bruns et rats noirs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une infection intranasale par le SARS-CoV-2 sous anesthésie, jusqu'à sept lavages nasaux, des prises de sang répétées et un gavage oral, pour évaluer si ces rongeurs peuvent constituer un réservoir sauvage du virus. Le porteur indique que l'infection respiratoire peut provoquer une baisse d'appétit et une perte de poids, les difficultés respiratoires ou une perte de poids au-delà de 20 % déclenchant la mise à mort. Il affirme que l'étude du potentiel de réservoir ne peut être menée que par des expériences in vivo.

Objectifs

Dès le début de la pandémie de COVID-19, la question de la contamination des animaux proches de l'homme a été posée. Plusieurs études expérimentales ont été menées pour déterminer le spectre d'hôtes du SRAS-CoV-2 apparu à Wuhan, en Chine. Il a été démontré que la sous-famille des Murinae, qui comprend les rats et les souris, n'était pas réceptive (la réceptivité étant la capacité de réplication virale) à l'infection par le SRAS-CoV-2, probablement en raison de différences essentielles au niveau du récepteur utilisé par le virus pour infecter son hôte. L'émergence de nouveaux variants du SARS-CoV-2, en particulier les variants préoccupants B.1.351 et P.1, qui peuvent infecter expérimentalement de jeunes souris, a modifié cette situation, d'où la nécessité de surveiller le risque que les rongeurs sauvages deviennent des réservoirs du virus, à partir desquels il pourrait évoluer et se propager à l'homme. Les rats, en particulier Rattus norvegicus sont devenus des habitants importants de nos villes, tandis que Rattus rattus est plus fréquent dans les zones agricoles et portuaires. Dans les villes où les égouts ne sont pas bétonnés, les estimations sont de 1,5 à 1,7 rats par habitant avec des pullulations reconnues dans les grandes villes comme Paris et Marseille, ou lors de conditions particulières comme les grèves des éboueurs. La proximité de ces espèces sauvages avec les humains ainsi que la possibilité de détecter du matériel génétique du SRAS-CoV-2 dans les effluents incitent à poursuivre les recherches sur le rôle que ces espèces pourraient jouer en tant que réservoir secondaire des variants du SARS-CoV-2, avec des implications dramatiques pour les risques de propagation et les efforts d'éradication putatifs et une mauvaise interprétation des concentrations virales dans les eaux usées si le virus est également excrété par les rongeurs vivant dans les égouts. L'objectif de ce projet est d'étudier le risque d'émergence de réservoirs de rongeurs par une approche d’essai de réceptivité et de transmission.

Bénéfices attendus

L’approche expérimentale couplée à une recherche du virus chez les rats piégés dans de grandes métropoles françaises permettra de répondre à la question de la possibilité de constitution d’un réservoir sauvage d’un des variants du SARS-CoV-2. L’approche expérimentale pemet de savoir si les animaux sont récéptifs et capables de se transmettre l’infection soit de façon directe (par projection d'aérosol entre individus), soit de façon indirecte par voie orale (par le biais des matières fécales). Les études sur le terrain permettront de voir si les rongeurs sont effectivement exposés car il reste toujours une incertitude sur le caractère infectieux du virus retrouvé dans les effluents.

Procédures

1/Lavage nasal sous anesthésie gazeuze (entre 1 à 7 fois selon les procédures et les groups de rats, à raison d'une durée de 30 secondes). 2/Infection intranasale sous anesthésie gazeuse (environ 15 secondes) .3/ Prise de sang à la veine caudale (durée 1 à 2 minutes) sous anesthésie gazeuse (5 répétitions à 3/4 jours d'intervalle sur un seul groupe de 6 rats) 4/ Prise de sang intracardiaque terminale (durée d'une minute environ) sous anesthésie (induction à l’isoflurane et injection intrapéritonéale de kétamine et de Xylazine) + analgésique. 5/ gavage oral sous anesthésie gazeuse (quelques secondes).

Impact sur les animaux

L’infection chez les rongeurs peut provoquer une baisse d’appétit et une perte de poids. Le contrôle visuel sera quotidien et le contrôle du poids effectué tous les 2 jours pour ne pas perturber les rats (Rattus rattus particulièrement). Tout signe inhabituel (tel qu'une baisse d’activité) entrainerait une observation 2 fois par jour. L’infection étant respiratoire, un point limite est fixé : l'observation de difficultés respiratoires, d'une toux très importante ou d'une perte de poids au delà des 20%, entraîne la mise à mort humaine de l'animal. Toute pathologie intercurrente qui ne peut être soignée ou entraînant une douleur qui ne peut être contrôlée entraînera une mise à mort compassionnelle. Les lavages nasaux seront effectués sous anesthésie gazeuse (isoflurane)

Devenir

mise à mort de tous les rats afin d'effectuer des prélèvements (organes et sang)

Remplacement

L'étude du potentiel de constitution d’un réservoir de SARS-CoV-2 sur une espèce sauvage ne peut être réalisée que par des expériences in-vivo. Des études in silico et in vitro d’inoculation de cellules de rats ont déjà montré une possible réplication du virus en fonction du variant.

Réduction

La construction du projet en procédures successives dont la mise en œuvre ne se fait que si la précédente est efficace permet de limiter le nombre d’animaux. L’utilisation de lot de 5 à 6 animaux permet en minimisant leur nombre d’appliquer des tests statistiques non paramétriques.

Raffinement

Les animaux seront observés et approvisionnés en nourriture fraîche quotidiennement. Ces rongeurs seront hébergés en cage de 2 à 3 individus avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette particulièrement les rats noirs et les rats bruns), et de bâtonnets de bois à ronger. Tout signe inhabituel (telle qu'une baisse d’activité) entrainerait une observation 2 fois par jour. Un point limite est fixé : l'observation de difficultés respiratoires (dyspnée, tirage costal, toux très importante, perte de poids au delà des 20%) entraîne la mise à mort humaine de l'animal. Toute pathologie intercurrente qui ne peut être soignée ou entraînant une douleur qui ne peut être contrôlée entraînera une mise à mort compassionnelle. Les seuls prélèvements sont des lavages nasaux qui seront effectués sous anaesthésie gazeuses à l’isoflurane. La mise à mort des rongeurs sera effectuée suite à une anesthésie (induction à l’isoflurane puis injection intrapéritonéale de kétamine à 150mg/kg et de Xylazine à 10 mg/kg associée à une prise de sang terminale intra-cardiaque et une dislocation cervicale.

Choix des espèces

Rattus norvegicus et rattus rattus sont les 2 espèces de rats vivant dans les égouts ou espaces anthropisés suceptibles d’être exposés par les effluents contaminés ou proximité d’avec l’homme. Les rattus norvegicus de laboratoire seront issus d'un éleveur agréé. Les rats bruns et les rats noirs, bien que de type sauvage seront issus d'un élevage également. Seul le rat noir, dont aucun animal de laboratoire ne dérive, nécessite un certificat de capacité puisqu'il est considéré par les autorités comme un animal sauvage. Les essais de réceptivité/sensibilité chez les murinés ayant été menés chez des rongeurs adultes, les rats choisis ici sont des adultes d'un poids compris entre 200 et 300 grammes.

180 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections intramusculaires d'un candidat vaccin peptidique contre la dengue sous anesthésie, ainsi qu'une à deux prises de sang par voie rétro-orbitale, avant d'être tuées pour prélèvement des organes. Le porteur indique qu'aucun signe clinique n'est attendu, le vaccin étant "faiblement immunogène", et que les mâles sont écartés pour éviter le stress lié à un dominant. Il conclut que la réponse immunitaire antivirale ne peut être reproduite in vitro.

Objectifs

La dengue ou « grippe tropicale » est une maladie virale transmise par piqûre de moustique. Chaque année, on rapporte 400 millions de cas de dengue dont 500 000 cas sont associés à des fièvres hémorragiques. A l’heure actuelle, il n’existe pas de vaccin efficace sur le marché. L’objectif de ce projet est d’évaluer la capacité d’un candidat vaccin à induire une réponse immunitaire protectrice de type cellulaire contre le virus de la dengue. Pour cela, des souris recevront deux injections intramusculaires du candidat vaccin (Une immunisation et un rappel 21 jours après). Trois adjuvants différents seront comparés afin de choisir celui permettant d’induire la meilleure réponse cellulaire. Les animaux seront mis à mort à 7 jours ou 28 jours post-rappel afin de permettre la mesure de la réponse cellulaire. Ce projet nécessite l’utilisation de 180 animaux.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, il n’existe aucun vaccin permettant l’induction d’une protection efficace contre le virus de la dengue. Ce projet permettrat de démontrer l’efficacité d'un candidat vaccin à induire une réponse immunitaire cellulaire contre le virus de la dengue.

Procédures

2 injection intramusculaires ( 50 uL) à jours 0 et 21 sur animaux anesthésiés à l'isofluorane. 1 à 2 prélèvements sanguins (150 uL) par voie retro-orbitale sur animaux anesthésiés à l'isofluorane.

Impact sur les animaux

Le candidat vaccin est un vaccin de type peptidique, donc faiblement immunogènes. Ainsi, aucun signe clinique (fièvre, perte de poids…) n’est attendu suite à la vaccination. Les adjuvants sélectionnés sont des adjuvants de type liposomes, couramment utilisés pour l’évaluation de l’immunogénicité de candidats vaccin chez la souris. Les composants de ces adjuvants permettent l’induction d’une inflammation locale modérée au niveau du muscle et du ganglion drainant le muscle, nécessaire à l’initiation de la réponse immunitaire. Cependant, ces adjuvants sont très bien tolérés et aucune réaction locale ou systémique n’est observée après une ou deux injections.

Devenir

Mis à mort pour prélèvement des organes (mesure des paramètres immunologiques)

Remplacement

La réponse immunitaire antivirale est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires dans différentes localisations (muscle, ganglions drainants, rate …). La procédure ne peut donc être reproduite in vitro.

Réduction

Nous utiliserons 5 animaux par groupe expérimental, analysés individuellement. Un test de Mann-Whitney sera réalisé́ car la comparaison porte sur 2 groupes avec un faible nombre d’échantillons, et aucune hypothèse n'est présupposée. En considérant des différences de moyenne d'au moins 20% avec une déviation standard inférieure à 5% et un seuil minimal du risque alpha à 5%, un groupe de 5 animaux permet d’obtenir une puissance de test d'environ 0.8. Les expériences seront répétées une fois pour vérifier la reproductibilité́ et la validité des résultats (Giles, J. The trouble with replication. Nature 442, 344–347 (2006)). La procédure sera réalisée avec des femelles. En effet, les souris mâles sont à écarter dans les expériences longues (> 3 semaines) afin d’éviter le stress éventuel généré par la présence d'un mâle dominant dans la cage. Si aucune réponse CD8 n’est observée 7 jours après rappel, le projet s’arrêtera et la réponse à jour 28 ne sera pas évaluée.

Raffinement

Une semaine d'acclimatation sera réalisée avant la mise en place de chaque expérience. A la réception, des groupes seront réalisés et maintenus tout au long de la procédure pour créer des groupes sociaux et éviter le stress dû à l'isolement. Tous les traitements/prélèvements sont administrés sous PSM II afin de prévenir tout risque d’infection opportuniste. Précautions particulières : - Immunisation par le candidat vaccin : Les injections intramusculaires sont réalisées sous brève anesthésie à l’isofluorane. Aucun signe clinique, local (douleur à la patte) ou systémique (fièvre, perte de poids…) n’est attendu suite à l’immunisation. Les animaux feront néanmoins l’objet d’une surveillance dans les minutes qui suivent l’injection, le lendemain, puis chaque semaine afin de s’assurer qu’aucun signe de souffrance ne soit observé. Une attention particulière sera portée au boitillement évocateur d’un douleur à la patte ayant reçue l’injection. Si une souris présente des signes de souffrance tel que le pelage hérissé, la prostration ou l'absence de réponse aux stimuli extérieurs, elle sera exclue de la procédure et immédiatement mise à mort par dislocation cervicale. - Prélèvements de sang : un collyre anesthésique est appliqué à l’œil avant la procédure pour réduire toute douleur. Les prélèvements de sang sont réalisés sous brève anesthésie à l’isofluorane. Dans le cas où l'œil montrerait des signes d'inflammation après l’injection, il sera soigné par l'application d'une pommade vétérinaire ophtalmique associant un corticostéroïde et un antibiotique (Framycétine).

Choix des espèces

Les éléments immunogènes du candidat vaccin sont capable d'être reconnu par le système immunitaire de la souris. Les souris seront âgées de 8-12 semaines au démarrage de l’expérience, le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant.

98 macaques à longue queue vont être utilisés, dont 22 réutilisés et les autres tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par le virus de la variole du singe après immunisation, puis subissent des prises de sang jusqu'à trois fois par semaine, des lavages broncho-alvéolaires, des biopsies de ganglions, de peau, de poumon, de moelle osseuse et d'intestin, ainsi que des ponctions lombaires. Le porteur décrit des lésions cutanées douloureuses s'étendant sur tout le corps pendant deux à trois semaines, de la fièvre et une fatigue importante, et signale un risque rare de pneumothorax après biopsie pulmonaire. Il affirme que le primate non humain est le "seul modèle" réunissant les éléments nécessaires à l'évaluation de vaccins.

Objectifs

Le projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité de protection et thérapeutique de différents candidats vaccins ou de molécules contre le virus responsable de la récente épidémie de variole du singe. En effet, un nouveau virus circulant issu des souches virales d’Afrique de l’ouest semble capable de se répandre dans la population par des voies de contamination qui n’avaient pas été observées jusqu’alors pour ce virus. Il est donc nécessaire : 1) de vérifier l’efficacité de l’arsenal thérapeutique disponible actuellement, 2) de proposer de nouvelles thérapies et permettre le nouveau positionnement de molécules/vaccins existant. A l’heure actuelle, il existe des vaccins de deuxième et troisième génération contre la variole qui ont permis une éradication de cette maladie dans les années 70-80. Toutefois, l’efficacité de ces vaccins contre la variole du singe n’est pas connue actuellement or la vaccination est une étape critique de la prévention de la maladie. En effet, il n’existe qu’un seul traitement curatif reconnu contre la variole. Certains molécules anti-virales pourraient être utilisées, mais avec la disparition de la variole en 1977, celles-ci n’ont pas été testées chez l’homme. Le but de ce projet est donc de mettre en place un modèle de variole du singe chez le primate non humain en mimant les voies d’entrée du virus responsable de la maladie récemment décrites chez l’homme. Une fois ce modèle établi, nous pourrons tester l’efficacité de candidats vaccins, soit déjà reconnus pour leur efficacité dans le contexte de la variole, soit de nouveaux vaccins innovants. En parallèle, ce nouveau modèle permettra de tester des traitements médicamenteux préventifs ou curatifs. Ces molécules seront soit déjà pressenties pour le traitement de la variole soit de nouvelles molécules innovantes afin de s’adapter au mieux au contexte sanitaire.

Bénéfices attendus

La recherche et/ou la validation de vaccins et de traitements efficaces contre la variole du singe est un enjeu de santé publique. La variole du singe est une pathologie présente dans les régions d’Afrique centrale et occidentale. Bien que moins grave que la variole, son tableau clinique est relativement semblable et présente un taux de mortalité comprise entre 1 et 10% du fait, notamment, d’un manque d’accès à des soins adaptés. Le nouveau virus proche de la souche d’Afrique de l’ouest qui circule actuellement en dehors de ces territoires endémiques semble avoir un taux de mortalité très faible, cependant la grande majorité des nouveaux patients sont dans un contexte de soin favorable. A l’heure actuelle, cette épidémie est encore relativement circonscrite dans une frange définie de la population, le manque d’outil thérapeutique adapté nous laisserait démunis si celle-ci prenait de l’ampleur. Les bénéfices de ce projet sont donc doubles : fournir un arsenal thérapeutique adapté afin de protéger des populations vulnérables mais également de proposer un ensemble d’options préventives et curatives dans l’éventualité de l’aggravation de l’épidémie actuelle.

Procédures

- L’ensemble des procédures sera effectué sur des animaux anesthésiés pour éviter toute souffrance. - L’immunisation ou le traitement des primates sera effectuée par différentes voies, le temps de l’intervention est inférieur à 30 minutes. L’immunisation par voie intestinale ou gastrique peut prendre jusqu’à 1h30. Nous effectuerons l’épreuve virale et cela durera environ 30 minutes par animal. Des puces de température pourront être implantées sous la peau pour suivre la température corporelle en continu (intervention 45 minutes). - Nous effectuerons des prélèvements de sang au maximum 3 fois par semaine pendant la phase aïgue qui représente 4 semaines environ. Ceci nécessitera un temps d’anesthésie de 20 minutes environ. Pour suivre l’évolution de la charge virale, nous effectuerons des prélèvements sanguins, prélèvement des liquides des pustules et de fluides ou lavages des sites infectieux et muqueuses au maximum 3 fois par semaine (10 minutes) pour un nombre total de 30 maximum pour toute l’étude. Pour accéder au tractus respiratoire inférieur, nous effectuerons des lavages broncho-alvéolaires (BAL) avec 4 jours d’intervalle minimum entre chacun des lavages (30 minutes) pour un nombre total de 10 maximum. Différents types de biopsie pourront être réalisés en fonction des besoins de l’étude, comme des prélèvements de ganglions lymphatiques avec deux semaines d’intervalle minimum et 3 prélèvement maximum (45 minutes). Des ponctions lombaires pour accéder au liquide cérébrospinal (1 fois par semaine au maximumet 3 au maximum) et des biopsies de peau pourraient être envisagées (20 min d’intervention). Nous pourrions avoir besoin d’effectuer des biopsies pulmonaires pour évaluer la réponse locale ainsi que des biopsies de moelle osseuse et des biopsies intestinales par endoscopie (90 minutes d’intervention maximum). - Nous utiliserons aussi des méthodes non invasives pour l’analyse de nos candidats thérapeutiques en utilisant deux techniques d’imagerie 5 fois au maximum au cours de l’étude(90 minutes maximum).

Impact sur les animaux

L’infection par le virus responsable de la variole du singe induit de petites lésions au niveau de la peau qui grattent beaucoup et peuvent s’avérer douloureuses dans certains cas. Ces lésions pourront s’étendre sur tout le corps et persisteront 2 à 3 semaines. Par ailleurs, les animaux pourront développer de la fièvre, des courbatures, des céphalées et une fatigue importante. Enfin dans certains cas assez rare, l’animal pourrait se dégrader fortement et une euthanasie pourra être requise afin de limiter sa souffrance. Par ailleurs, l’hébergement individuel lors des phases d’infection avec le virus pourrait entrainer un stress qui sera compensé par un programme défini par la cellule « bien-être animal » de l’établissement pour l’enrichissement plus important de leur milieu de vie. Au niveau des procédures expérimentales, peu d’effets indésirables sont attendus à l’exception de la répétition des anesthésies qui peut entrainer des déficits de l’alimentation et une fatigue chez l’animal. Dans de très rares cas, un pneumothorax (présence anormale d'air dans la cavité pleurale) ou un hémothorax (épanchement de sang dans la cavité pleurale) sont possibles à la suite des biopsies pulmonaires et seront observables en direct lors de l’endoscopie. Les biopsies digestives par endoscopie sont parfois associées à des saignements digestifs. Il est possible que les biopsies entrainent des inflammations et plaies locales qui seront surveillées quotidiennement jusqu’à la récupération complète de l’animal.

Devenir

Dans la majorité des cas, la variole du singe n’est pas mortelle chez le macaque. Toutefois, ce nouveau virus est encore mal connu et le passage à l’humain est connu et documenté. Ceci impose donc la plus grande prudence. Certains animaux seront euthanasiés afin d’accéder aux tissus (histologie) afin de valider le modèle mais également de tester l’innocuité des candidats vaccins et des molécules thérapeutiques testés, pour vérifier l’absence de toxicité. Par ailleurs, si une dégradation de l’état clinique de l’animal est observée, dans le but d’éviter toute souffrance inutile et du fait du risque que représente ce virus pour l’homme, les animaux seront euthanasiés. Si lors de l’établissement du modèle, il est validé qu’un animal qui récupère de la pathologie est complètement exempt de charge virale persistent et de séquelles qui diminueraient fortement le bien-être de l’animal à long terme, alors les animaux qui ne seront pas engagés dans des protocoles d’histologie pourront être réutilisés.

Remplacement

L’évaluation d’approches thérapeutiques dans le contexte de la variole du singe nécessite un modèle expérimental permettant d’étudier les différentes composantes des réponses immunitaires et les changements induits suite à l’immunisation et/ou à l’infection virale. A ce jour, ces différents éléments ne peuvent pas être étudiés à l'aide de simulations informatiques ou dans des modèles in vitro. L'utilisation d'un modèle animal reste donc nécessaire pour reproduire les symptômes et réponses immunitaires induits pas un virus. Le primate non humain est choisi comme modèle animal dans cette étude, car il présente une réponse immunitaire et vaccinale semblable à celle de l’humain pour la plupart des infections. De plus, les outils nécessaires sont disponibles et maitrisés chez cette espèce.

Réduction

Nous devons mettre en place un modèle de variole du singe chez le primate afin de permettre de tester à la fois les vaccins et les molécules thérapeutiques dans les conditions les plus proches de l’homme. Durant cette phase de mise en place du modèle, les essais se feront de manière séquentielle. A l’heure actuelle, il est difficile de savoir si la première dose testée pour chacune des voies sera celle choisie et l’essai suivant ne sera mené qu’en fonction des résultats du précédent. A ce titre, si la dose nécessaire à l’établissement du modèle est trouvée rapidement, certains animaux pourront être utilisés pour confirmer la dose, les restant ne seront pas utilisés. Par ailleurs, la première dose testée repose sur une analyse de la littérature scientifique solide afin de maximiser notre chance de réussite rapide. Concernant les études d’efficacité et thérapeutiques de candidats vaccins des groupes de 6 primates seront utilisés dans les groupes traités ou vaccinés. Dans le cas des groupes contrôles, dans la mesure du possible, des contrôles « historiques » (données issues d’animaux utilisés dans une autre étude précédente, y compris la mise en place du modèle) seront utilisés au maximum.

Raffinement

Tous les animaux sont des animaux d’élevage, toutes les procédures seront effectuées sur des animaux anesthésiés. De plus, des protocoles pour supprimer la douleur ont été définis et validés par l’équipe vétérinaire afin de la réduire au maximum à chaque intervention. Un suivi quotidien de l’état général des animaux par une équipe formée à reconnaître les signes de mal-être ou de souffrance est mis en place. Les hébergements en individuel sont limités au maximum et lorsque cela sera nécessaire, les animaux seront hébergés de manière contiguë. Cet hébergement individuel contigu permet des interactions sociales (conservation du contact physique par le haut de la cage et sensoriel par la mise en place de plaques translucides entre les cages latérales, et cages face à face séparées d’environ 2m). L’enrichissement sera augmenté (distribution 2 fois par semaine d’enrichissements destructibles au lieu d’1). Les interventions par chirurgie mini-invasive, ciblant des organes et tissus préalablement identifiés par imagerie médicale seront privilégiées afin de raffiner les méthodes expérimentales employées et ainsi réduire la douleur postopératoire. Grâce à l’utilisation de différentes techniques d’endoscopie les tissus cibles seront prélevés avec précision en un nombre réduit d’incisions. Les volumes de sang prélevés seront réduits au minimum nécessaire. En cas d’apparition de signes locaux suites aux prélèvements, un traitement symptomatique local pourra être instauré après examen par le vétérinaire. Pour les prélèvements des fluides, une attention sera portée aux animaux lors de ce geste. Le suivi des animaux, la mise en place des points limites et le signalement au vétérinaire s’effectuera suivant une grille d’évaluation clinique validée à la fois par le vétérinaire de l’installation et la structure du bien-être animal. Si l’animal montre des signes de douleur trop importante, un traitement symptomatique pourra être mis en place par le vétérinaire responsable. Si l’état général de l’animal ne s’améliorait pas malgré la prise de mesures, alors l’euthanasie de l’animal serait envisagée.

Choix des espèces

Les espèces de primates non-humains retenues pour cette étude ont été sélectionnées pour deux raisons : - elles représentent le seul modèle réunissant les éléments nécessaires à l’évaluation de vaccins : les réponses immunitaire et vaccinale sont similaires à celles de l’humain, et les techniques et outils d’exploration de la réponse immunitaire et de la réponse vaccinale sont disponibles et maitrisés chez ces espèces, contrairement à d’autres modèles d’infections respiratoires régulièrement utilisées comme le furet. - elles ont déjà fait l’objet de publications scientifiques en tant que modèles d’infection par le virus de la variole du singe historique, et présentent un tableau clinique présentant de forte similarité avec l’homme qui permettra une évaluation satisfaisante des stratégies thérapeutiques qui seront testés. La physiologie, le système immunitaire et la réponse vaccinale évoluent en fonction du stade de développement et de l’âge des individus. Les candidats thérapeutiques étudiés étant susceptibles de faire l’objet d’essais cliniques chez des individus présentant un système immunitaire « mature », il est donc nécessaire de réaliser ces études chez un animal présentant un système immunitaire au même stade. Par ailleurs, l’objectif de ce projet est de mettre en place un modèle de pathologie modérée, or il est connu que la sévérité de la pathologie provoquée par le virus diminue chez les animaux adultes. Pour ces deux raisons, nous utiliserons des animaux adultes, âgés de plus de 2 ans.

1 056 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sur une durée pouvant atteindre 140 jours, elles reçoivent des injections par différentes voies et des prélèvements de sang répétés, pour comparer deux voies d'administration d'un vaccin thérapeutique contre l'hépatite B. Le porteur renvoie les bénéfices à "long terme" et à une éventuelle extension à d'autres pathogènes, et écarte le chimpanzé, seul modèle infectable, pour des raisons éthiques. Il affirme que le recours à "l'organisme entier" est "incontournable" et qu'il n'a pas d'autre solution que d'utiliser l'animal entier.

Objectifs

Plus de 3% de la population mondiale est infectée de manière chronique au virus de l’hépatite B, et 6% des populations africaines et de l’ouest pacifique souffriront à vie de cette maladie infectieuse. Le vaccin contre le virus de l'hépatite B est efficace mais seuls les pays développés y ont accès. Les prognostics pour le futur sont peu optimistes et la communauté scientifique insiste sur le besoin urgent de développer des solutions permettant de guerir contre ce virus. Malheureusement, les deux médicaments disponibles actuellement necessitent de prendre un traitement lourd pendant toute la vie du patient et ne permettent pas d’eliminer l’infection qui, trop souvent, évolue vers des maladies plus sévères du foie (cirrhose puis cancer dans 30% des cas, responsables de 1 million de décès/an). Ce projet a pour objectif de répondre, en partie, à ce besoin scientifique de développer une cure contre le virus de l’hépatite B afin d’accroitre la qualité et l’esperence de vie des patients. Pour ce faire, un médicament innovant a été développé. Il permet d'administrer en même temps deux molécules : un vaccin (antigène) et une molécule stimulante (qui amplifie la réponse due l'antigène). Les dernières années d’experimentation ont permises d’optimiser la 'formule chimique' de ce traitement et de démontrer l’efficacié de ces formulations par rapport aux formes libres de ces deux molécules. Une étude pilote sur souris a également permis de mettre en évidence une valeur ajoutée de la stratégie étudiée. A présent, l'efficacité de ces nouveaux médicaments nécessite d'être étudiée plus amplement par de nouvelles expérimentations afin d’explorer la distribution et l’effet antivirale des formulations en comparant deux voies d’administration : la sous-cutannée, qui a l’avantage de viser le compartiment lymphocytaire et qui est la voie la moins invasive, et l’intraveineuse, qui a l’avantage de déposer nos traitements directement dans l'organe pour le traiter localement. Ce projet se décline en trois procédures, dont deux qui utilisent un modèle murin d'infection au virus étudié.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrie dans la démarche globale de recherche d’une alternative efficace aux traitements conventionnels contre le virus de l’hépatite B. Les vaccins candidats étudiés ici permettent de véhiculer, dans le même médicament, un antigène du virus de l'hépatite B et un adjuvant capable d'amplifier la réponse immunitaire dirigée contre le virus. Un premier candidat médicament a déjà fait ses preuves dans sa capacité à contrôler la présence du virus dans les hépatocytes. Cette nouvelle stratégie thérapeutique sera capable de déclencher une réponse antivirale optimale : à la fois directe dans l’environnement du foie et indirecte en modulant le système immunitaire du patient. Pour toutes ces raisons, ce qui est proposé ici permettrait de pallier les problèmes des traitements actuels et de mieux traiter les patients souffrant du virus de l'hépatite B, avec une alternative qui promet une meilleure observance et une meilleure adhésion au traitement. Selon les résultats obtenus suite à ce projet, il pourra être envisagé de le porter à plus grande échelle. Enfin, l’utilisation de cette technologie est très prometteuse et pourra, à long terme, être adaptée à d’autres pathogènes responsables d’épidémies infectieuses.

Procédures

Les animaux seront susceptibles d'être soumis à : des injections par différentes voies d'administration sur animaux vigiles ou endormis (30 secondes/injection), des prélèvements sanguins sur animaux vigiles, (30 secondes/prélèvement), des marquages pour identifier les animaux (30 secondes/marquage). Ces interventions seront réalisées sur un total de 1056 animaux (sur une durée d'expérience maximale de 140 jours).

Impact sur les animaux

Les gestes de prélèvement et d'injection à l'oeil sont susceptibles d'engendrer un inconfort leger à modéré. Si une souris présente des signes de souffrance ou d’angoisse suite à ces gestes, ou de prostration, elle sera exclue de la procédure et mise à mort. De manière générale, les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par l’expérimentateur (observées 5 jours sur 7 et pesées toutes les semaines dans le cas où les animaux sont infectés) et, si une perte supérieure à 20% du poids maximal, ou tout type de douleur, d’absence de réponse aux stimuli extérieurs, d’inactivité, ou un quelconque comportement anormal est détectée, l’animal sera mis à mort par dislocation cervicale. La lignée génétiquement modifiée utilisée dans ce projet n’est pas une lignée à phénotype dommageable. Les souris recevront exactement les mêmes soins et attentions que l’ensemble des animaux utilisées dans ce projet.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort pour procéder à des analyses biochimiques, biologiques, et tissulaires afin d'obtenir des résultats aux hypothèses formulées.

Remplacement

Des analyses approfondies ont déjà fait l’objet d’études : in vivo sur organisme entier de la biodistribution systémique des traitements grâce à une technique d’imagerie en temps réel et in vitro sur cellules du foie de l’efficacité antivirale des nanovaccins. A présent, il s’agit d’analyser finement la biodistribution intracellulaire des traitements ainsi que l’effet antiviral sur modèle entier. De manière générale, la vaccination repose sur la mise en place d’une réponse immunitaire faisant appel à l’ensemble des organes lymphoïdes, dont les ganglions lymphatiques et le foie, et dans différents organes ciblés. Le recours à l’animal est donc incontournable et le choix du modèle souris est le plus adapté afin d’évaluer l’efficacité d’un schéma vaccinal à deux voies d’administration. Nous n’avons pas d’autre solutions que d’utiliser l’animal dans son entier.

Réduction

Dans l’ensemble, le nombre d’animaux utilisé sera réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet et la significativité statistique des experimentations. Il a été évalué pour 5 ans par une statisticienne à 1056 souris. L'ensemble des expériences sont construites pour réduire le nombre d’animaux, sans pour autant entrainer des contraintes pour ces animaux. Suivant la nature de l'experience, un minimum de 5 individus par groupe ou de 10 individus par groupe est nécessaire pour mettre au point l’expérience et pour avoir des résultats statistiquement fiables. De manière générale, l’ensemble des analyses statistiques seront réalisées en aveugle.

Raffinement

Les points limites sont assez prédictifs pour pouvoir anticiper tout stress et souffrance. A la reception des souris, elles seront acclimatées durant une semaine dans l’établissement utilisateur. Pour les injections intra veineuse, les animaux seront endormis le temps du geste. Avant les prélèvements sanguins, une goutte d'anesthésique local sera utilisée afin d’eliminer la douleur. Les points d’injection suite aux immunisations seront surveillés, comme pour les prélèvements sanguins. Le cas échéant, à partir du jour de l’infection (J0), les animaux seront surveillés 5 jours sur 7 et pesés une/semaine. De manière générale, tout animal montrant un signe de souffrance (tonicité, agitation extrême, prostation, qualité du poil, gonflement de l’absomen, ulcération cutanée, mobilité réduite, douleur, perte de poids, inactivité, stress, comportement anormal) sera immédiatement mis à mort. Une perte supérieure à 20% du poids initial sera considérée comme critère de point limite.

Choix des espèces

Les systèmes in vitro sont utiles pour tester les effets de molécules à visée thérapeutique sur les cellules, mais pas à l’échelle de l’organisme entier parce qu’ils n’incluent pas le microenvironnement hépatique et le système immuniaire. Le seul modèle entier infectable par le virus de l'hépatite B est le chimpanzé mais son utilisation au stade de notre projet est exclue pour des raisons éthiques. Dans ce contexte, la souris est une bonne alternative car bien que non infectable par le VHB, le modèle utilisé permet de mimer l’hépatite virale chronique et ce avec une stabilité sur un an, le tout dans un système immuno-compétent. L'ensemble de ce projet nécessite d'utiliser des animaux sevrés à partir de 6 semaines car le système immunitaire est décrit comme mature et non veillissant à partir de cet âge là.

6 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour produire des souris dites humanisées vendues à des laboratoires. Elles reçoivent une irradiation puis une greffe de cellules humaines par voie intraveineuse, avec des prélèvements sanguins de contrôle, et une partie développe une réaction du greffon contre l'hôte se traduisant par une perte de poids. Le porteur indique que les souris ayant pris la greffe sont expédiées vivantes aux chercheurs, tandis que les échecs et les animaux en fin de protocole sont euthanasiés. Sur le remplacement, il affirme que ces modèles reproduisent la réponse immunitaire "dans son ensemble" et ne peuvent être remplacés, tablant sur un taux de succès de 80 %.

Objectifs

L’étude des pathologies humaines et le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques sont souvent limités par l’absence de modèle animal approprié. La souris est le modèle le plus fréquemment utilisé pour la compréhension du fonctionnement du système immunitaire ainsi que l’étude des maladies infectieuses et des cancers dans l’espèce humaine. Cependant, les résultats expérimentaux obtenus chez la souris ne sont pas toujours transposables à l’homme car les systèmes immunitaires des 2 espèces présentent des différences marquées. Dans certaines conditions expérimentales, la greffe de cellules humaines permet de générer des souris dites humanisées récapitulant une partie du système immunitaire humain. L’objectif de ce projet est de proposer à la communauté scientifique la production de souris humanisées qui serviront de modèles pour la recherche scientifique et médicale. Le type cellulaire greffé (cellules souches ou cellules périphériques du sang) déterminera la spécificité du modèle.

Bénéfices attendus

Le système immunitaire est impliqué dans beaucoup de maladies humaines : cancer, maladies métaboliques, infections virales, phénomènes allergiques. Cependant, il existe des différences importantes entre les systèmes immunitaires humain et murin. Une façon de dépasser ces différences est d’utiliser des modèles murins greffés avec des cellules ou des tissus humains — c'est-à-dire des rongeurs « humanisés » au niveau de leur système immunitaire. Les modèles rongeurs « humanisés » présentent un système immunitaire humain compétent et constituent par conséquent des modèles pertinents pour la recherche dans les domaines de l'immuno-oncologie, la biologie tumorale, les maladies infectieuses, les rejets de greffe et les études de transplantation tissulaire. Quelques-uns des domaines clés dans lesquels les souris humanisées ont considérablement contribué à la compréhension scientifique de la maladie humaine sont décrits ci-après. Les premières études sur des souris humanisées ont permis d'identifier les voies inflammatoires impliquées dans le développement du cancer du sein. Les modèles humanisés ultérieurs ont également permis d'étudier les interactions complexes entre les cellules immunitaires au sein de tumeurs humaines. Il est ainsi possible d’étudier le potentiel thérapeutique de médicaments, seuls ou en combinaison, pour réduire la progression tumorale. Ce type d’approche est aussi à la base du développement des immunothérapies qui rencontrent un succès spectaculaire dans certaines pathologies et pour certains patients. Les modèles murins humanisés sont également de bons modèles d’infection par les virus (ex : HIV, Hépatites, Zika), les bactéries (ex : Salmonelles, Streptocoques…) et les parasites (ex : Leishmania). Notre plateforme d’humanisation de rongeurs proposera à la communauté scientifique des modèles humanisés « prêts à l’emploi ». La préparation des modèles rongeurs humanisés est longue (jusqu’à 15 semaines), délicate et coûteuse. Sur notre plateforme, le process d’humanisation de l’animal sera hautement standardisé et réalisé par des équipes spécialisées afin d’autoriser une reproductibilité maximale des données scientifiques et de réduire le nombre d’animaux requis.

Procédures

En fonction des modèles développés, les animaux pourront recevoir dans un premier temps un traitement de radiothérapie afin d’être à même de recevoir la greffe. Les cellules humaines leur seront ensuite injectées par voie intraveineuse en guise de greffe. Une fois la greffe suffisamment développée dans l’organisme des souris, un ou des prélèvements sanguins pourront être réalisés pour s’assurer que le niveau de greffe est suffisant ou pour analyser d’autres paramètres biologiques d’intérêt.

Impact sur les animaux

Les étapes de radiothérapie, d’injection de cellules et de prélèvement sanguin seront des sources potentielles de douleur et/ou de stress pour l’animal. La radiothérapie endommage le système immunitaire et peut endommager certains organes. L’injection veineuse des cellules humaines nécessite l’utilisation d’une boîte de contention afin de maintenir l’animal immobile pendant quelques minutes. Le prélèvement sanguin nécessitera également une contention de l’animal. Cette contention sera réalisée de façon manuelle ou à l’aide d’une boîte de contention en fonction de la voie d’abord. Par ailleurs, chez les modèles de souris humanisés générés via injection de cellules humaines la maladie du greffon contre l'hôte(GvHD) survient (ce qui n’est pas le cas chez les modèles générés via injection de cellules souches). La GvHD se traduit généralement par un eperte de poids ainsi qu’une activité réduite de l’animal.

Devenir

Les souris ayant été humanisées via injection de cellules du sang ou ayant développé un système immunitaire humain après injection de cellules souches : sont expédiées au scientifique -les souris n’ayant pas réussi à reconstituer un système immunitaire humain ainsi que celles ayant répondu favorablement à la greffe cellulaire mais en fin de protocole seront euthanasiées.

Remplacement

Les modèles constitués par les souris humanisées permettent d’étudier les réponses immunitaires de l’organisme dans son ensemble. Il n’est donc pas possible de les substituer par d’autres méthodes non animales.

Réduction

Nous anticipons un taux de succès de 80% (% de souris développant un niveau suffisant de cellules humaines dans le sang), ce qui représente 4800 animaux validés disponibles pour la recherche pour les 5 ans du projet. Nous travaillerons tout le long du projet à augmenter ce taux de succès au fur et à mesure de l’expérience acquise pour atteindre une réduction maximale d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux utilisés étant immunodéficients, ils seront hébergés dans un environnement indemne de tout germe susceptible de les rendre malades. Ils seront également toujours manipulés sous hotte, de manière à éviter tout risque de contamination. Tout le long de la procédure, les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter une éventuelle dégradation de leur état de bien-être. Le cas échéant, de l’aliment humidifié leur sera mis à disposition sur le sol de la cage et une surveillance accrue sera mise en place avec un suivi vétérinaire. Des soins adaptés seront apportés selon les préconisations de ce dernier (ex : réhydratation, soutien nutritionnel, enrichissement spécifique, soins intensifs, …). En cas d’atteinte de point limite, les animaux seront immédiatement euthanasiés. Concernant l’injection des cellules en intraveineux : les animaux seront placés au préalable dans une armoire chauffante à 38°C (maximum 30 minutes) pour obtenir une vasodilatation et faciliter l’injection. La même approche pourra être suivie pour les prélèvements sanguins. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisées que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. A chaque abord d’une voie vasculaire (pour injection ou prélèvement), un point de compression sera effectué le temps suffisant pour assurer l’arrêt du saignement. Une observation de l’animal sera réalisée au retour dans sa cage pour s’assurer de sa récupération immédiate. Une réhydratation systématique sera réalisée après prélèvement sanguin, au moins équivalent au volume prélevé.

Choix des espèces

Nos modèles humanisés seront développés chez la souris. Seuls des animaux immunodéficients se prêtent à la reconstitution d’un système immunitaire humain fonctionnel. Les seuls modèles animaux immunodéficients disponibles à l’heure actuelle correspondent à des modèles souris et rats. D’autre part, la souris est, à l’heure actuelle, l’espèce la plus utilisée en recherche biomédicale. De nombreuses données expérimentales ont déjà été collectées à l’aide des modèles humanisées murins. Ces choix sont dictés par les données scientifiques internes et externes (publications scientifiques) à notre entreprise quant à l’efficacité de la prise de greffe et les applications spécifiques de ces modèles.

70 chevaux vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 50 d'entre eux replacés en fin de projet et les autres tués. Ils sont immunisés à répétition avec un adjuvant qui peut provoquer des inflammations locales, puis soumis à des plasmaphérèses avec réinjection des globules rouges, pour produire du plasma servant de base à des anticorps polyclonaux. Le porteur, une société de biodéfense, indique viser 95 000 à 150 000 traitements contre des menaces NRBC et des maladies infectieuses. Il affirme que le cheval est l'animal producteur de référence et qu'aucune méthode alternative n'est connue pour ces anticorps.

Objectifs

Le nombre croissant de maladies infectieuses émergentes et ré-émergentes, la mondialisation et la propagation rapide des épidémies, l'absence de traitements et/ou de vaccination satisfaisants, le développement des menaces liées au bioterrorisme et l'augmentation de la résistance aux antimicrobiens ont conduit à une augmentation significative des risques de menaces biologiques. Le développement, l'accès et le déploiement rapides de contre-mesures médicales adéquates sont essentiels pour anticiper de telles urgences de santé publique, et constituent des enjeux nationaux et internationaux critiques comme a pu le confirmer l’émergence récente du virus Sars-Cov-2 et la pandémie mondiale de Covid-19 qui en a résulté. La société est spécialisée dans les traitements contre les maladies infectieuses émergentes et sévères, et les intoxications. Elle développe actuellement un produit dans le domaine de la bio-défense / menaces NRBC (Nucléaire Radiologique Biologique et Chimique). L’entreprise est également impliquée dans le traitement des maladies infectieuses émergentes comprenant la COVID-19, mais également la grippe aviaire H5N1, Ebola et la Fièvre Hémorragique de Crimée Congo (CCHF). En effet elle a notamment développé un produit contre la grippe aviaire H5N1 et un produit anti-Ebola sous l’égide de l’OMS et avec le soutien de l’Agence Européenne du Médicament (EMA). Elle capitalise sur une plateforme technologique de développement et de production à base d’anticorps polyclonaux. Cette plateforme robuste et reproductible s’appuie sur une technologie éprouvée, avec des produits enregistrés et administrés dans le monde entier depuis des décennies, témoignant d'un excellent profil de sécurité. Elle permet à partir d’un antigène d’immuniser des chevaux et de produire du plasma. Ce plasma est ensuite hautement purifié en anticorps dans un laboratoire pilote en grade R&D. Et ces derniers sont évalués dans des études précliniques in vitro et in vivo. Après la démonstration d’efficacité, des lots sont purifiés dans des conditions BPF (Bonnes Pratiques de Fabrication) pour les besoins des études précliniques réglementaires et cliniques. L’objectif de ce projet est d’immuniser des chevaux dans le but de produire des plasmas servant de base à la purification d’anticorps polyclonaux dirigés contre des cibles virales et / ou toxiniques (y compris toxines bactériennes).

Bénéfices attendus

Des fragments d’anticorps hautement purifiés apportent une solution thérapeutique à des problématiques majeures de santé publique. En effet, la société développe actuellement un produit dans le domaine de la bio-défense / menace NRBC. L’entreprise est également impliquée dans le traitement des maladies infectieuses émergentes comprenant la COVID-19, mais également la grippe aviaire H5N1, Ebola et la Fièvre Hémorragique de Crimée Congo (CCHF). Ce projet nécessitera l’utilisation de 70 chevaux sur 5 ans. Ces chevaux permettront de : 1- Production de plasma servant de base à l'obtention de 95000 à 150000 traitements ciblant les risques bio défense et les maladies infectieuses. 2- Production de plasmas servant de base au développement de nouvelles thérapies (Développement pré-clinique et clinique avec essais chez l'Homme.)

Procédures

Deux procédures différentes sont prévues dans ce projet. Dans les deux procédures les animaux seront soumis à deux types d’interventions : → Des immunisations par voie sintra-dermique, sous-cutané ou intra-musculaire. → Des prélèvements de sang. Il s’agit là de prélèvement de sang, avec séparation des globules rouges (plasmaphérèse), puis réinjection des globules rouges selon le résultat de l'analyse sanguine.

Impact sur les animaux

Deux éléments peuvent induire des nuisances : - L’adjuvant : Les antigènes seront administrés avec ou sans adjuvant. Cet adjuvant peut entrainer des inflammations locales au point d’injection. Ces inflammations, seront suivies quotidiennement et traitées si besoin par un protocole de traitement adapté. Si un animal nécessite un traitement par voie parentérale, et que ce traitement n’améliore pas son état général après la fin du délai d’attente, les immunisations pourront être suspendues sur cet animal après décision concertée entre les responsables du projet et le vétérinaire. - Baisse de l’hématocrite : Par ailleurs, les prélèvements de sang, peuvent entrainer une baisse de l’hématocrite des animaux. Ainsi, un test d’hématocrite est réalisé après chaque prélèvement et des réinjections de globules rouges (issus de l’animal), et d’agents d’hématopoïèses sont réalisées lorsque l’hématocrite est trop faible.

Devenir

Les animaux ayant terminée une procédure ne peuvent pas intégrer une autre procédure Ainsi, en fin de procédure, si les animaux sont en bonne santé, ils pourront être replacés après concertation des responsables du projet et en accord avec le vétérinaire. Si les animaux ne peuvent pas être replacés ou réutilisés en interne, ils seront mis à mort après anesthésie. Les animaux ne pourront pas être reconduit dans la filière alimentaire.

Remplacement

L’immunothérapie passive utilisant des immunoglobulines polyclonales spécifiques a déjà démontré son efficacité dans le domaine des maladies infectieuses, intoxications et envenimations. Le cheval est l’animal producteur de référence dans le cadre de ces produits. La production de ces anticorps polyclonaux n’est possible que par des moyens in vivo. Aucune méthode alternative n’est aujourd’hui connue.

Réduction

Le nombre de chevaux nécessaire pour un projet augmente au cours du temps. Néanmoins, le nombre de chevaux entrant dans le projet est calculé au plus juste selon l’avancée du projet afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaire. - Pour les nouvelles indications/nouveaux antigènes : 2 à 4 animaux seront immunisés afin de tester et déterminer l’efficacité de l’immunisation. - Après la démonstration de l’efficacité de l’immunisation, dans le cadre du développement du produit et selon les études précliniques et cliniques programmées, le volume de plasma nécessaire sera calculé précisément. Ce volume permettra de déterminer le nombre d’animaux nécessaires pour l’ensemble du développement du produit. Les résultats obtenus permettront de déterminer de manière fiable le nombre maximal de chevaux nécessaires pour la production des traitements à base d’anticorps. A minima, une revue annuelle sera faite pour optimiser le nombre de chevaux au plus juste des besoins.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions adaptées à leur espèce, logés sur une aire paillée en groupes sociaux de maximum 12 chevaux, fixes dans le temps. Un suivi quotidien leur est apporté par un personnel qualifié, avec une surveillance intensifiée, dans des conditions conformes à la réglementation et assurant leur bien-être. L'observation de signes cliniques déclenche des soins spécifiques sur les conseils d'un vétérinaire. Les animaux ont accès à la nourriture via un distributeur automatique de concentrés en plusieurs fois, au foin et à l’eau à volonté dans une ambiance musicale. Par ailleurs, le projet met en œuvre des procédures maîtrisées et qui ont déjà fait la preuve de leur efficacité pour la production d’immunoglobulines polyclonales équines. Par ailleurs, depuis 2017 ces procédures sont mises en œuvre dans le cadre de l’autorisation précédente, et ont permis de mettre en place et préciser les procédures pour entrainer les animaux, réduire les douleurs et définir les points limites.

Choix des espèces

Le cheval est un animal corpulent permettant de récolter une importante quantité de plasma. Il présente peu de zoonoses, ce qui limite les risques de présence de contaminants nocifs pour l'Homme dans les plasmas. Les chevaux sont des adultes de plus de 3 ans car à partir de cet âge la production d’immunoglobulines est optimale.