Maladies infectieuses

974 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection du parasite du paludisme puis subissent des prélèvements sanguins quotidiens pendant sept à dix jours, pour évaluer l'effet d'une mutation sur la résistance à la sulfadoxine. Le porteur indique que l'infection peut provoquer une hyperparasitémie, une anémie et un neuropaludisme, et précise qu'aucun analgésique ne sera administré pour ne pas fausser les résultats. Il affirme que les tests in vitro se sont révélés non reproductibles et qualifie le modèle murin d'"indispensable".

Objectifs

La combinaison sulfadoxine/pyriméthamine est le traitement prophylactique recommandé pour la prévention du paludisme chez la femme enceinte et l’enfant de moins de 5 ans. Cependant, la résistance à cette combinaison thérapeutique est due à l’émergence de mutations sur les gènes dhfr et dhps de Plasmodium falciparum. La mutation I431V de DHPS chez P. falciparum fut identifiée pour la première fois au Nigéria en 2006 et des quintuples mutants de DHPS furent décrits en Afrique Centrale. Cette nouvelle mutation semble être une mutation émergente dans ces pays. A ce jour il n’existe aucune donnée phénotypique de ce génotype. Les expérimentations in vitro sur des isolats de P. falciparum n’ont pas permis de déterminer de manière fiable et reproductible la concentration inhibitrice à 50% (CI50) de la sulfadoxine. La forte homologie entre les enzymes DHPS de P. falciparum et de P. berghei fait du parasite murin un bon modèle d’études du niveau de résistance à la sulfadoxine.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’obtenir les premières données phénotypiques dues à la nouvelle mutation I431V de DHPS décrite en Afrique Centrale. L’évaluation de l’effet de cette mutation sur la résistance à la sulfadoxine est primordiale et indispensable pour prédire de l’efficacité du traitement préventif intermittent par sulfadoxine/pyriméthamine utilisé chez les femmes enceintes et les enfants de moins de 5 ans. Ce travail sera une première étape qui permettra d’évaluer la nécessité de la mise en place d’études à grande échelle sur le terrain afin d’actualiser les recommandations mondiales.

Procédures

Injection par voie intra-péritonéale (1 injection, durée estimée 10 secondes). Induction d'une maladie expérimentale : paludisme pendant 7 à 10 jours. Prélèvement sanguin quotidien pendant 7 à 10 jours (durée estimée 10 secondes).

Impact sur les animaux

La souris peut développer une hyperparasitémie accompagnée d’anémie et/ou un neuropaludisme. La surveillance et le suivi quotidiens de la parasitémie permettront de s’affranchir de ces risques.

Devenir

Procédure 1 : Souris et rat euthanasiés au CO2 pour réalisation d'exsanguination. Procédures 2 et 3 : Mise à mort par dislocation cervicale avant apparition des signes de gravité du paludisme (hyperparasitémie et/ou neuropaludisme).

Remplacement

Pour étudier la résistance des parasites aux différents antipaludiques, des tests in vitro peuvent être réalisés. Cependant, les expérimentations in vitro sur des isolats de P. falciaprum menées au laboratoire n’ont pas permis de déterminer de manière fiable et reproductible la concentration inhibitrice à 50% (CI50) de la sulfadoxine. Ces variabilités techniques majeures sont décrites dans la littérature. Un modèle murin in vivo est donc indispensable pour obtenir des données phénotypiques des différents génotypes de DHPS.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé a priori en respectant les critères pour une analyse statistique appropriée (test de Student). Les rongeurs utilisés sont consanguins, de mêmes âge et sexe, réduisant la variabilité entre les animaux et donc le nombre nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Dans un objectif de réduction, des rats seront utilisés à certaines étapes de la procédure 1 afin de recueillir la quantité de parasites nécessaire à l’expérimentation.

Raffinement

Le bien-être de l’animal est aussi un facteur de variabilité expérimentale. Les animaux seront hébergés en cage de 2 rats ou de 5 souris, conformément aux recommandations de l'établissement utilisateur. Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement de l’habitat. Aucun traitement analgésique ne pourra être administré sous peine d'interférer avec les paramètres étudiés. Nous effectuerons une surveillance quotidienne des souris (état général, prise de nourriture, toilette, mouvements), afin de détecter le plus précocement les signes de souffrance. L’expérimentation sera arrêtée en cas de dégradation trop importante d’un animal selon les points limites d’arrêt de la procédure définis en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal (SBEA) pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des hôtes intermédiaires de Plasmodium berghei et constitue un modèle animal reconnu Des souris âgées de 6 semaines et des rats âgés de 9 semaines seront utilisés puisqu’ils auront terminé leur croissance.

42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur crée une plaie cutanée qu'on infecte par des bactéries avant de poser un pansement au chitosane, avec un suivi par imagerie sous anesthésie pendant cinq à quatorze jours. Le porteur indique que l'infection peut provoquer des démangeaisons au niveau de la plaie. Il présente l'étude comme une preuve de concept préalable à des tests sur "gros animal" puis à un essai clinique humain.

Objectifs

Les infections de plaies traumatiques et chirurgicales sont un problème majeur dans le domaine médical. L’émergence de bactéries multi-résistantes aux antibiotiques est un phénomène inquiétant. La notion de «bon usage » des antibiotiques doit être élargie à la notion de « moindre usage ». Dès lors, il existe un besoin croissant d’utilisation de produits antimicrobiens topiques (application directement sur le site d'infection) pouvant être appliqués sur des plaies potentiellement infectées. Le chitosane est utilisé pour de nombreuses applications médicales et pharmaceutiques. Les préparations de chitosane ont beaucoup attiré l’attention en raison de leurs propriétés biologiques potentiellement bénéfiques. Ces propriétés incluent notamment l'hémostase (la coagulation), l'activité antimicrobienne et la stimulation de la guérison. L'activité antimicrobienne à large spectre du chitosane a suggéré qu'il pourrait être utilisé comme pansement pour plaie.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de montrer qu’un pansement guérit une plaie cutanée infectée sans traitement antibiotique : c’est une alternative à la thérapie actuelle, lourde et source de résistance aux antibiotiques. Cette preuve de concept sera un préalable à une étude de confirmation sur gros animal et ensuite un essai clinique chez des patients humains.

Procédures

Les souris subiront une intervention chirurgicale sur la peau (création de la plaie + traitement, 30 minutes en tout) puis seront suivies 5 jours (18 souris, 5 suivis) ou jusqu'à 14 jours (24 souris, 8 suivis) par imagerie PhotoImageur. Chaque procédure PhotonImageur dure 5 minutes (les souris seront anesthésiées).

Impact sur les animaux

L’expérimentation implique l'anesthésie, la réalisation de la plaie, l’inoculation des bactéries, la pose du pansement avec une suture, puis la réalisation d’imagerie. L’infection provoquée pourra provoquer des démangeaisons au niveau de la plaie cutanée.

Devenir

Suite à l’euthanasie, la plaie sera observée : - Signes inflammatoires locaux - Présence d’abcès - Taille de la plaie. Une analyse bactériologique et histologique sera réalisée sur chaque plaie avec les tissus adjacents.

Remplacement

En raison des interactions complexes entre l'hôte et l'agent pathogène, les systèmes in vitro ne peuvent pas reproduire fidèlement les conditions d'infection et de guérison des tissus. Il est donc nécessaire de disposer de modèles animaux qui reflètent l'infection des tissus pour évaluer les stratégies d'ingénierie tissulaire.

Réduction

Un suivi par photonimagerie diminue le nombre de souris nécessaires à l’étude en permettant un suivi bactérien longitudinal et en évitant les sacrifices aux temps intermédiaires. L’étude sera réalisée sur 6 souris par groupe et les résultats seront analysés avec les tests statistiques adaptés.

Raffinement

- Un personnel qualifié sera mobilisé autour des animaux avant, après et pendant les interventions. Le chirurgien est chevronné. - Les conditions expérimentales ne provoquent pas de contraintes pouvant affecter le bien-être des animaux : pas de diminution de l’enrichissement ni de la socialisation, accès normal à l’eau et à l’aliment et respect des comportements normaux. L’hébergement est réalisé en cages ventilées individuellement. Elles sont stérilisées par autoclavage. L’enrichissement est adapté. - Des protocoles précis de prémédications, d’analgésie, d’anesthésie et de mise à mort sont mis en place. - Plusieurs points limites éthiques généraux et spécifiques seront suivis tout au long du projet afin d’éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

Les résultats de cette étude préclinique serviront pour la prise en charge de plaies infectées avec la mise en place d’un nouveau pansement. Cette étude ne peut en effet être réalisée directement chez le patient mais détient un potentiel translationnel car elle est réalisée chez le mammifère. La souris est un modèle couramment utilisé dans les études sur la cicatrisation de la peau et l’effet de différentes modalités de traitement. La région dorsale sera utilisée pour l’évaluation des pansements pour la réduction des possibilités de grattade par la souris et la facilité d’évaluation quotidienne. L’utilisation des souris permet de répondre à un certain nombre de questions et d’être prédictif des résultats chez l’homme car il tient compte de la biologie tissulaire. En effet, le modèle animal cherche à répliquer l’environnement biologique et la réponse biologique face aux bactéries. Les souris seront âgées de 7 semaines et pèseront environ 20-25gr. Des souris âgées de plus de 6 semaines sont choisies afin qu'elles aient atteint une taille adulte pour diminuer les risques anesthésiques et pour faciliter l'intervention chirurgicale. Toutes les souris auront le même âge pour une meilleur comparaison des résultats mais également pour que la taille de la plaie soit proportionnelle à la taille de la souris.

26 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par un paludisme murin (Plasmodium berghei), reçoivent des composés par gavage et subissent des prélèvements sanguins répétés à la queue puis un prélèvement rétro-orbitaire terminal, pour tester des molécules dérivées des Phenmiazines. Le porteur indique qu'une parasitémie élevée peut provoquer une anémie, une perte de mobilité et une perte de poids. Les retombées en clinique humaine restent renvoyées au conditionnel, et le remplacement est écarté au motif qu'il n'existerait "pas de solution viable" hors modèle animal.

Objectifs

importantes dans le fonctionnement du parasite responsable du paludisme. Ces iinhibiteurs appartiennent à la famille des Phenmiazine[1-3].Le projet comprant également l’évaluation de la cytotoxicité dans le but d’un essai préclinique. Les tests visant à évaluer l’efficacité antipaludique in vitro contre Plasmdium spp ont permis d’isoler les composés ayant les meilleures activités. L’ensemble de ces démarches prises ensemble nous amènent à analyser l’efficacité antipaludique de ces molécules dans un système de paludisme murin qui est la base des essais pré-clinique dans la recherche de thérapie expérimentale. Les données collectées permettront de déterminer si des tests cliniques plus poussés peuvent être poursuivis. Par ailleurs les Phenmiazines seraient un atout dans la lutte antipaludique en raison de la diminution des thérapies efficaces et de la résistance croissante aux antipaludiques de la part de Plasmodium falciparum. Elles seraient également un atout chimique car elles n'appartiennent à aucune des familles chimiques antipaludiques déjà recommandées par l'OMS

Bénéfices attendus

A court termes, les bénéfices attendus résident dans la confirmation des résultats in vitro. Une évaluation de la quantité de molécules candidates restantes dans le sang après injection totale est un point important de l'évaluation in vivo pour savoir si ces molécules sont plus ou moins éliminées pendant l'infection. Ce projet permettrait également de mettre en évidence l'efficacité de nouvelles molécules dans la thérapeutique antipaludique. A plus long terme, ceci apporterait une nouvelle famille chimique antipaludique dont le mécanisme reste à approfondir. Si les résultats venaient à se confirmer, ce serait l’opportunité de développer un principe actif sur la base structurale de ces molécules, et un potentiel médicament avec des paramètres pharmacocinétiques compatibles Le but étant de mettre au point des composés efficaces en clinique humaine contre le paludisme, alors que l’arsenal des thérapies utiles et efficaces diminue rapidement.

Procédures

Procédure [1] 2 souris : prélèvement veineux à la queue - tous les 3 jours pendant 10 jours+ A 7% de parasitémie, 1 anesthésie et 1 prélèvement rétro orbitaire - totalité du sang prélevé et euthanasie (durée 30 minutes) - Procédure [2] 24 souris : prélèvement veineux à la queue - tous les 2 jours à compter de J2 (post infection) pendant 30 jours + pesée tous les 2 jours à compter de J1 (post infection) pendant 30 jours - Jour de l'euthanasie injection de bleu Evans en ip 50 µL à 50mg/kg, incubation 1h maximum puis anesthésie et dislocation cervicale. Cocktail kétamine xylasine pour des souris de 18g : 100 mg/kg de Kétamine et 10 mg/kg de xylazine. Les nuisances correspondent à des contentions, des piqures au niveau de la queue pour prélèvement, des injections intrapéritonéales et l’ingestion (per os) de médicaments candidats pour l’expérience. Dans le modèle de paludisme murin, les souris auront des parasitémies qui à taux élevé (>75%) peuvent entrainer une anémie donc une perte de mobilité et une perte de poids transitoire

Impact sur les animaux

Les molécules évaluées sont des molécules qui ont déjà été testées sur des souris pour la cytotoxicité. Les doses utilisées sont en dessous du seuil de toxicité obtenues lors de notre étude in vivo. L'infection par Plasmodium berghei conduit à la mort chez les BALB/c pour des parasitémies supérieures à 80% néanmoins le choix de ce modèle réside également sur le fait que ces souris résistent très bien à des parasitémies élevées en affichant un tableau clinique facile à suivre.

Devenir

Procédure [1] 2 souris euthanasiées par dislocation cervicale après réalisation du prélèvement rétro orbitaire sous anesthésie. La récupération de la totalité du sang infecté ne permet pas de maintenir la souris en vie. Ce sang est important pour infecter les souris de la procédure 2 et maintenir notre souche de paludisme murin. Procédure [2] 24 souris euthanasiées par dislocation cervicale après anesthésie. L'euthanasie des souris permet de récupérer rapidement les organes (cerveau, cœur, foie, poumons, reins, rate) des souris et le sang afin de doser les médicaments présents dans les tissus, mener les études de protéomique et d'histologie nécessaires à l'étude des dommages tissulaires liées à l'infection. Les souris ayant été déjà traitées et infectées, il est difficile de les réinfecter en raison d'une résistance à la réinfection manuelle et une réactivité du système immunitaire. Il est difficile de les réutiliser pour un essai similaire de pharmacothérapie, les souris ayant pris du poids et de l’âge ce qui limite également la possibilité de réinfection [16-19]

Remplacement

Pour ce projet, il n’existe pas de solution viable de remplacement pour le moment. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques est justifiée par la complexité de la pathologie étudiée, le paludisme. Cette infection parasitaire touche les hématies et l’augmentation de la parasitémie entraine un tableau clinique complexe au niveau des différents organes en raison de l’anémie progressive et l’inflammation croissante liées à l’infection. Ces mécanismes ne peuvent pas être d’étudié dans des systèmes in vitro, ou des bioréacteurs élaborés.

Réduction

La réduction fait partie de notre stratégie d'étude. Elle repose sur une étude bibliographique pour connaitre les dernières études pharmacologiques et antipaludiques en paludisme simple. Le calcul du nombre de sujets dans des groupes de même effectif est donné par une formule mathématique, pour mettre en évidence une différence statistiquement significative entre les deux groupes avec un risque de première espèce alpha égal à 5% et une puissance de 80% est donné par la formule suivante, dans le cadre d’un test bilatéral et avec des effectifs égaux dans les deux groupes.

Raffinement

Le bien-être des animaux est un point important dans notre projet puisqu’ il est évalué dans notre grille de score. Des abris, des éléments à ronger seront fournis (l’enrichissement), et la présence de nids réalisés par les souris est vérifiée tout comme leur capacité de fouissement (expression du caractère naturel de l’animal). Les animaux seront hébergés en conditions standard d’animalerie, avec de l’eau et de la nourriture ad libitum. Ils bénéficieront d’une période de stabulation de 5 jours post livraison dans l’animalerie de l’IHU, puis d’une période de 7 jours pendant laquelle les animaux seront familiarisés quotidiennement à la manipulation par les expérimentateurs. Entre la livraison et l’expérience, les animaux seront placés dans des cages garantissant la surface réglementaire pour chaque souris. Les éventuels signes de souffrance seront systématiquement recherchés et évalués

Choix des espèces

Le modèle murin (Mus musculus) est choisi car il est un support idéal pour l'infection par Plasmodium berghei. Il permet l'étude d'un paludisme proche de celui de l'Homme. Il est d'autant plus pertinent car la souche de paludisme murine a un cycle plus rapide que celle infectant l'Homme. Cette caractéristique est très utile dans une étude d'efficacité antipaludique ou pharmacologique pour confronter l'activité antipaludique d'un candidat face un parasite se multipliant rapidement. Nous retenons les souris BALB/C pour cette étude en raison de leur capacité à résister à des parasitémies élevées (entre 60 à 70%) et afficher un tableau clinique facile à suivre. La simplicité et l'efficacité du modèle BALB/c+Plasmodium berghei en font un support pertinent pour notre étude d'efficacité antipaludique. Les souris BALB/c seront des individus adultes âgés de 8 à 9 semaines à l’arrivée dans l’animalerie mais de 10 à 11 semaines au début des expériences. Cela est dû à la phase de stabulation et d’habituation a la manipulation. Cet âge est compatible avec les procédures expérimentales du projet. Cet âge correspond également à la maturité sexuelle (adulte) mais aussi au début de maturité du système immunitaire.

34 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Ils sont vaccinés puis infectés par le SARS-CoV-2 par voie intranasale, avant des écouvillonnages et lavages nasaux répétés sous anesthésie, pour évaluer des composés antiviraux d'une société qui a validé et financé le projet. Le porteur indique que l'infection provoque fièvre, perte de poids et tremblements sans être létale dans ce modèle, puis que tous les animaux sont tués pour prélever leurs organes. Il décrit tantôt un objectif de traitements antiviraux, tantôt de "vaccins", et affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet d'étudier la transmission du virus.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de composés antiviraux dans un modèle de transmission du virus du SARS-CoV-2 entre individus. Les traitements antiviraux utilisés ont montré des résultats intéressants lors d’études in-vitro ou lors d’études précliniques sur d’autres types de virus, encourageant la réalisation d’études d’efficacité en préclinique sur le virus SARS-CoV-2. Ce projet a ainsi fait l'objet d'une évaluation par le comité scientifique de la société fabriquant les traitements et a été approuvé par celui-ci. Ce projet permettra de mettre sur le marché un/des traitement(s) antiviral(aux) contre la COVID 19.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre sur le marché des vaccins contre la COVID 19.

Procédures

Pour limiter au maximum le stress des animaux, l’intégralité des actes décrits ci-dessous seront réalisés sur animaux anesthésiés. Les animaux des groupes tests seront, avant d’être mis en contact avec les animaux infectés au SARS-CoV-2, vaccinés par instillation intranasale à raison d’une administration par animal. Le virus du SARS-CoV-2 étant un virus aéroporté, l’infection des animaux du groupe infecté se fera également par instillation intranasale en dose unique. Enfin, des prélèvements réguliers, d’écouvillonnages oropharyngés et des lavages nasaux, à raison au maximum d’une fois par jour tous les deux jours seront réalisés et ce pendant les 7 jours suivants le contact entre les animaux infectés et non-infectés. Une même anesthésie permettra d'effectuer les 2 prélèvements à la suite évitant ainsi les anesthésies multiples pour un même jour (chaque intervention (infection et prélèvement) ne nécessitant qu'une minute par animal).

Impact sur les animaux

Les animaux vont être infectés au virus du SARS-CoV-2 entrainant l’apparition de signes cliniques des animaux reflétant la réalité clinique (principalement fièvre, perte de poids, pilo-érection et tremblements). Toutefois, il est connu dans la littérature scientifique mais aussi d’après les observations des précédentes études réalisées dans notre établissement utilisant le modèle hamster que, contrairement au modèle murin, l’infection au SARS-CoV-2 dans ce modèle n’est pas léthale. A titre indicatif, nous avons observé qu'une infection induit dans le modèle hamster des pertes de poids de l’ordre 5% avec un retour à la normale (poids avant infection) dans les 5 à 7 jours post-infection. Les animaux vont être manipulés régulièrement pour différents actes (administration des vaccins, pesées, scoring clinique, prélèvements, etc). Ces actes pouvant stresser les animaux et leur infliger des douleurs aussi pour palier à ce cela des mesures de raffinements ont été prévues : les animaux seront manipulés quotidiennement afin de les habituer à la contention et des anesthésies seront systématiquement réalisées pour tous actes invasifs.

Devenir

L’ensemble des animaux utilisés pour ce projet seront euthanasiés à la fin de chaque étude pour pouvoir réaliser des prélèvements d’organes en vue d’analyses anatomopathologiques ou de charges virales.

Remplacement

La transmission d’un virus aéroporté comme le SARS-CoV-2 résulte de plusieurs facteurs tels que la durée et l’intensité d’exposition aux particules infectieuses, la stabilité du virus dans les gouttelettes d’aérosols et de l’infection suivante dans le nouvel hôte. Aussi, il n’existe actuellement aucune méthode alternative permettant d’étudier la transmission d’un virus d’un organisme à l’autre et d’évaluer l’efficacité d’un traitement sur un organisme vivant sans l’utilisation de modèles animaux.

Réduction

Cette étude a fait l’objet d’une réflexion étayée par des connaissances statistiques et des données de la littérature scientifique afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Toutefois, pour obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant de conclure sur une réelle efficacité des traitements testés, des groupes de 6 animaux seront utilisés. Des études internes menées par la société fabriquant les traitements ont déjà utilisé le ratio de 1 pour 3 dans un modèle de furet pour la grippe avant de déterminer la réplication du virus pour chaque animal sentinelle après le co-hébergement. L’utilisation de ce ratio permettra de mieux simuler une situation naturelle pour laquelle un individu infecté est capable d’infecter un plus grand nombre d’individus non-infectés lors de contacts directs. De plus, en préférant ce ratio de 1 pour 3 à un ratio de 1 pour 1, nous diminuons considérablement le nombre total d’animal à inclure dans l’étude limitant ainsi le nombre et la souffrance des animaux donneurs indexés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés avec un enrichissement approprié à leur besoin et suivant leur âge (exemple : les hamsters de plus petite taille disposeront de plus de litière en fond de cage pour pouvoir accéder plus facilement à l’abreuvement et à la nourriture). Les animaux seront suivis quotidiennement pendant toute la durée de l'étude grâce à une grille d'évaluation appropriée. En cas d'atteinte de points limites préalablement définis sans possible amélioration de l'état de santé des animaux, ils seront euthanasiés pour arrêter toute souffrance excessive. Pour éviter tout stress aux animaux, ils seront systématiquement anesthésiés lors de la réalisation d'actes techniques invasifs. Durant la phase de co-hébergement en surnombre, les animaux seront suivis 2 fois par jour. Les animaux ne seront pas manipulés lors de cette seconde visite mais simplement observés pour éviter de stresser les animaux. Chaque groupe social sera placé avec le minimum d’éléments lui permettant de reproduire son nid, ses briquettes de bois à ronger et un peu de litière provenant de sa cage d’origine afin que les animaux puissent garder leurs repères. En cas de détection de signes d’agressivité des animaux entre eux, des enrichissements supplémentaires seront ajoutés dans les cages. Si les signes d’agressivité persistent, l’animal dominant sera alors isolé du reste du groupe.

Choix des espèces

L’efficacité des composés antiviraux sera évaluée sur la souche de hamster Golden Syrian, qui a été décrit comme un excellent modèle pour une infection au SARS-CoV-2. Contrairement aux modèles murins transgéniques, les hamsters Golden Syrian expriment naturellement un récepteur d’entrée du virus du SARS-CoV-2. Cette expression leur permet d’être infectés à la COVID-19 conduisant au développement de signes cliniques plus proches de ceux observés chez l’Homme. D'après les données de la littérature scientifique, les hamsters utilisés dans le cadre des études SARS-CoV-2 sont généralement âgés de 4 à 10 semaines. Des animaux jeunes adultes (âgés de 7 semaines au moment de l'infection) seront utilisés pour l'étude. Cet âge représente un état physiologique stable pour le hamster, ce qui est adapté aux besoins de l'étude.

1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent, sous anesthésie, une injection de Staphylococcus aureus ou de sa toxine, avec des prélèvements de sang, pour tester si l'absence de cavéoline-1 aggrave l'infection. Le porteur indique que les souris peuvent montrer prostration, apathie, hérissement des poils, perte de plus de 20 % du poids et forte variation de température, et que les effets sont irréversibles. Il affirme que la perméabilité vasculaire au cours de l'infection ne peut être évaluée qu'en système intégré chez l'animal.

Objectifs

Staphylococcus aureus (S. aureus) est une bactérie fréquemment retrouvée dans le nez, le tractus respiratoire et la peau. Dans certaines conditions, S. aureus peut causer un grand nombre de maladies, allant des infections mineures comme des infections superficielles de la peau et des tissus mous jusqu’à des infections mortelles telles que le syndrome de choc toxique, la pneumonie, la septicémie et l'endocardite infectieuse. C'est toujours actuellement l'une des cinq causes les plus fréquentes d'infections acquises dans les hôpitaux et souvent la cause d'infections postopératoires. Chaque année, environ 750 000 patients dans les hôpitaux de France contractent une infection staphylococcique, soit environ 4 000 décès. Par conséquent, il est crucial de définir les facteurs de risque qui contribuent à l'invasion de l'hôte par S. aureus. Les toxines de S. aureus induisent la formation de pores à travers les cellules qui favorisent la perméabilité des vaisseaux sanguins et la dissémination de la bactérie dans les organes. La protéine cavéoline-1 est un régulateur critique qui limite la formation et l’élargissement de ces pores. La perte d’expression de la cavéoline-1 entraine un doublement du nombre de pores et leur élargissement d’un facteur 3. Ces résultats étant basés sur des études in vitro, l’objectif de notre étude est de démontrer que la perte d’expression de la cavéoline-1 chez l’animal est responsable d’une hyper-susceptibilité des animaux à l'infection par S. aureus.

Bénéfices attendus

Les travaux préalables ont permis de montrer un lien causal entre la formation des pores induits par S. aureus et la survenue de dysfonctions vasculaires (œdème, hémorragie et aggravation de l’infection). Ce projet doit permettre d’apporter un bénéfice à la compréhension de la formation des pores vasculaires et leur importance dans la régulation de la perméabilité vasculaire . Ceci aura en outre des retombées probables dans la compréhension de certaines formes de maladies vasculaires conduisant à des hémorragies spontanées sans diminution du nombre de plaquettes.

Procédures

L'injection des bactéries aura lieu une seule fois sur animaux anesthésiés (durée d'anesthésie 10 min). Des prélèvements sanguins à la queue seront effectués également après anesthésie et la souris maintenue endormie jusqu'à l'arrêt des saignements (anesthésie totale 15 min). Les expériences d'injection de colorant non toxique pour vérifier l'intégrité des vaisseaux seront effectuées sur animaux sous anesthésie, maintenue pendant 20 minutes, jusqu'au prélèvement de sang en aorte qui entraine l'arrêt cardiaque et respiratoire.

Impact sur les animaux

L’ensemble des résultats obtenus in vitro sur cellules concordent pour indiquer que la perte d’expression de la cavéoline-1 entraine une augmentation du nombre et du diamètre des pores cellulaires lors de l’intoxication par la toxine EDIN. On peut anticiper que si les effets in vitro sont reproduits chez l'animal, l'absence de cavéoline-1 devrait aggraver les symptomes lors de la bactériémie à S. aureus produisant l’EDIN-B. Les animaux pourraient ainsi montrer des signes d’hyper-susceptibilité à l’infection à travers l'augmentation de perméabilité vasculaire, manifestés par un phénotype caractéristique de prostration, immobilité, apathie, hérissement des poils ou/et perte de poids de plus de 20%. La multiplication des bactéries pourrait entrainer une modification importante de la température corporelle, soit une fièvre, soit une hypothermie en cas de choc septique. Par ailleurs, concernant les nuisances liées aux actes expérimentaux, les animaux vigiles seront soumis à des actes de contentions afin d'injecter un mélange anesthésiant. Toutes les autres manipulations seront effectuées sous anesthésie. Les prélèvements non terminaux à l'extrêmité de la queue seront effectués par section < à 0.5 mm et les souris réveillées une fois l'hémostase réalisée afin de minimiser les nuisances au réveil.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue du projet car les effets des bactéries et de la toxine sont irréversibles après l’injection et les animaux ne peuvent être ré-utilisés sous peine de créer des biais.

Remplacement

La cavéoline-1 est un gène de susceptibilité à la formation de pores transendothéliaux induits par l’EDIN-B, une toxine produite lors d'une infection par Staphylocoque. La formation de ces pores corrèle avec l’apparition de complications vasculaires. L’évaluation de la pathogénicité vasculaire de l’exotoxine EDIN-B en terme de perméabilité vasculaire au niveau des différents organes ne peut se faire que par une étude chez l’animal en système intégré.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux nous partirons de nos données antérieures sur l’infection bactérienne induite par Staphylococcus aureus. Pour limiter le nombre d’animaux engagés dans cette étude nous procèderons en étapes successives, la première étape étant la comparaison des sensibilités des souris contrôles ou présentant une absence de cavéoline-1 aux souches bactériennes exprimant ou non la toxine. Si une différence est présente, l'étape-2 servira à confirmer le rôle de la toxine Edin avec des souches mutantes contrôles. Enfin, la perméabilité vasculaire sera examinée après injection i.v. de la toxine EDIN purifiée. Les effectifs ont été calculés sur la base d'une analyse de puissance. Sachant que toutes les souris ne développent pas de bactériémie, pour un risque 5% et une puissance de 80%, nous avons calculé des effectifs de 30 animaux par groupe. Ceci correspond à une différence entre les groupes variant de 0.13 à 0.35, suffisante pour répondre à la question biologique.

Raffinement

Les points-limites ont été établis pour soustraire l’animal à la souffrance, et une surveillance quotidienne des animaux nous permettra de détecter au plus tôt ces points limites. Les souris sont maintenues dans leur groupe, qui aura été mis en place une semaine avant le démarrage des expériences. La cage est enrichie en jouets, et en frisure et coton à déchiqueter pour favoriser la nidation et maintenir la température en cas de refroidissement des animaux. De la nourriture sera systématiquement placée dans le fond de la cage avant le début de l'expérience, et aux premiers signes d'apatie on rajoutera de la nourriture gélifiée, plus apétante et hydratée.

Choix des espèces

La souris est l'espèce de choix pour l'étude de l'infection par Staphylococcus aureus. C'est une espèce naturellement colonisée par S. aureus comme l'homme, qui développe des symptomes similaires à ce que l'on observe chez l'homme. De plus dans le cas de cette étude, il s'agit de déterminer le rôle de la cavéoline-1 dans le développement de l'infection, et l'utilisation des souris transgéniques invalidées pour la cavéoline-1, mâles et femelles, nous permettra d'obtenir des conclusions claires.

300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit huit injections d'antigène, dont certaines avec l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux servant au contrôle de protéines-médicaments. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, chaque antigène empêchant selon lui leur réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable", aucune méthode in vitro n'étant selon lui aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (10 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant, notamment dans le contrôle et la qualification de protéines médicaments. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit huit injections d'antigène, souvent couplées à l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, un antigène différent empêchant selon lui toute réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable" et qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (20 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

2444 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux et des adultes reçoivent des vaccins, des injections d’anticorps et une infection nasale par un grand nombre de bactéries de la coqueluche, avant le prélèvement de leur nez, de leurs poumons et de leurs organes lymphoïdes, pour identifier des anticorps maternels protecteurs. Le porteur indique que l’infection peut tuer l’animal, souiller son pelage et gêner sa respiration, la perte de poids survenant juste avant la mort. Il précise que les mères sont tuées au sevrage et affirme qu’aucun modèle in vitro ne peut remplacer cette étude.

Objectifs

Prévenir les maladies infectieuses chez l’enfant par l’immunisation maternelle et l’immunisation de l’enfant s’avère être une nécessité pour les maladies à taux infectieux (R0) élevé. Le nombre de maladies que l’on peut prévenir par la vaccination a considérablement chuté ces dix dernières années. Néanmoins, les maladies infectieuses constituent la première cause de mortalité chez les enfants de moins de 5 ans, en particulier dans les pays en voie de développement. Le développement de nouveaux vaccins fondés sur l’identification d’anticorps protecteurs est nécessaire pour parvenir à réduire la mortalité infantile. La coqueluche figure parmi les maladies avec un R0 très élevé et pour lesquelles le taux de mortalité infantile est élevé. Les formes graves de la coqueluche touchant les nouveau-nés sont associées à une augmentation du nombre de globules blancs dans le sang (hyperleucocytose) entraînant une hypertension artérielle pulmonaire, conditionnant le pronostic vital notamment lorsqu’une défaillance cardiovasculaire apparaît. Par le passé la mise en place d’un modèle d’hyperleucocytose chez le souriceau a permis de montrer le rôle de la toxine pertussique (PT) dans ce phénomène. Les objectifs de ce projet sont les suivant : - Objectif 1 : Identification d’anticorps anti-PT conférant une immunité contre la coqueluche. - Objectif 2 : Etude du passage sélectif des anticorps de la mère à la progéniture et de la contribution des anticorps à la clairance du pathogène chez la progéniture infectée. - Objectif 3 : Immuno-modulation de la réponse immune de la progéniture par les anticorps maternels.

Bénéfices attendus

Les bénéfices apportés par ce projet seront multiples. Nous caractériseront les anticorps anti-PT protecteurs contre la coqueluche et contribuant à la clairance du pathogène. Nous déterminerons l’impact du transfert d’anticorps anti-PT sur la réponse immune des souriceaux à une vaccination contre la coqueluche ou à un challenge infectieux. Dans cette optique, nous étudierons l’effet de différents vaccins anticoquelucheux dans le but d’identifier la meilleure stratégie vaccinale et de concevoir des vaccins plus performants.

Procédures

Les vaccinations seront réalisées sur animaux vigiles, par injection sous-cutanée, qui est l'injection la plus indolore ayant prouvée son efficacité. L'injection en sous-cutané dure 1 à 2 minutes/animal (en comptant la contension nécessaire à l'injection). Deux séries de vaccinations à 4 semaines d'interval sont réalisées. Cela concerne 174 animaux. Les injections d'anticorps sont réalisées sur des souriceaux vigiles, en intrapéritonéal et dans un volume minimal de 50 uL ou bien à des souris adultes endormies, en retroorbital, dans un volume minimal de 100 uL de façon à limiter la douleur de l'animal. L'injection dure 1 à 2 minutes/animal (en comptant la contension nécessaire à l'injection) Une seule injection par animal est réalisée. Cela concerne 1860 animaux. Les infections en intranasal sont réalisées sur des souris endormies et dans des volumes minimaux pour éviter que l'animal se noie. L'injection en intranasal des bactéries prend 2 minutes/animal (temps de la contension et du maintien de l'animal après inoculation pour éviter qu'il se noie et vérifier son rythme cardiaque). Un animal est infecté une seule fois au cours des expériences. Cela concerne 2444 animaux. Toutes les procédures chirurgicales sont réalisées sur des animaux euthanasiés à l'issu des expériences. L'euthanasie dure 1 à 2 min/animal (en comptant la contension nécessaire à l'injection et le temps que le produit fasse effet). Cela engage la totalité des animaux inclus dans les expériences (2444).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, seule l'infection est susceptible d'induire de fortes nuisssances aux animaux. En effet, pour induire une hyperleucocytose chez les souris nous devrons inoculer un nombre élevé de bactéries virulentes ce qui peut causer la mort de l’animal. Les souris malades ont le pelage souillé et des difficultés à respirer et elles perdent du poids.

Devenir

Pour évaluer la protection des anticorps glycosylés anti-PT contre la coqueluche dans le modèle murin nous devons euthanasier l'animal et prélever son sang afin de mesurer l'augmentation du nombre de leucocytes circulants, symptôme le plus précoce associé à la maladie dans le modèle murin. La perte de poids apparaît tardivement et quasi de façon concommitente avec la mort de l'animal. De plus, nous récolterons le nez et les poumons des animaux euthanasiés pour mesurer la charge bactérienne ou la réponse immune locale. Des organes lymphoides primaires ou secondaires tels que la rate et le thymus seront également prélevés pour étudier la réponse immune en périphérie. Les mères sont euthanasiées au moment du sevrage (4 semaines) et leur sang est collecté pour mesurer le taux d'anticorps circulant et les caractériser.

Remplacement

L’étude des effets de la vaccination maternelle sur la réponse immune de la progéniture ne peut être substituée par des modèles in vitro.

Réduction

Différentes mises au point seront réalisées afin d’identifier les conditions optimales pour répondre aux problématiques posées; ce qui permettra de réaliser les expériences de grande échelle (telle que le criblage d’une banque d’anticorps glycosylés) sur un nombre minimal d’animaux.

Raffinement

Des points limites ont été définis, qui seront surveillés quotidiennement tels que le comportement apathique des souris, leur pelage souillé, leur difficulté à respirer et la perte de poids. Les souris gestantes ne seront pas transportées pour limiter le stress à l’animal. Les souris gestantes auront un régime alimentaire adapté (croquettes enrichies). Du coton sera mis dans les cages pour permettre aux souris de faire un nid.

Choix des espèces

Dans un but d'étude de potentialité vaccinale et d'immunorégulation induite par les anticorps, il n'existe pas d'autres possibilités que le recours à l'In vivo, et donc aux souris dans notre cas puisqu'elles représentent un bon modèle adapté à nos études. Il est connu que la coqueluche touche tous les âges de la population et elle est mortelle chez les nourrissons non encore correctement protégés par la vaccination. Pour faire le parallèle avec le modèle murin, nous travaillerons sur des souriceaux de 7 à 9 jours, âges auquels le système immunitaire des souris est comparable à celui d'un nouveau-né. Nous emploierons des souris de 4 semaines, âge auquel le système immunitaire des souris est comparable à celui d'un enfant pour étudier l'effet des anticorps maternels sur la réponse immune des souriceaux à une vaccination. Des souris adultes de 7 semaines, au système immunitaire mature, seront également employées comme outil de criblage, la reproductibilité et la faisabilité des expériences étant meilleure comparé au modèle d'infection néonatale.