Maladies infectieuses

Proposés à l'adoption par une association après six mois d'utilisation, dix lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une fois par semaine, chacun est attaché pendant que plusieurs centaines de poux de corps humains d'élevage se nourrissent de son sang, la séance pouvant durer environ deux heures pour les cinq stades du parasite. Le porteur décrit une irritation passagère et un inconfort lié à la contention, et prévoit une mise à mort seulement en cas de maladie grave ou d'impossibilité de placement. Il affirme que le lapin est la seule espèce sur laquelle ces poux, sélectionnés il y a plusieurs décennies, peuvent survivre, et que ce nourrissage reste "nécessaire" le temps de mettre au point une alternative in vitro.

Objectifs

L'infestion de la peau et des cheveux par des poux touche des millions de personnes dans le monde et est toujours très fréquente en France, notamment chez les enfants scolarisés. Les poux représentent un problème de santé publique et un coût financier non négligeable pour les populations touchées. Afin de lutter contre ces parasites, il est important de tester l'efficacité des nouveaux produits antipoux avant leur mise sur le marché. Cependant, il est très difficile de se procurer des poux sur les humains. C'est la raison pour laquelle, des poux d’élevage sont utilisés avec l'avantage d'être disponibles en grande quantité à tout moment de l'année. Ce sont des poux de corps humains sélectionnés il y a plusieurs décennies, pour leur capacité à se nourrir du sang de lapin pour assurer leur survie. Le lapin est la seule espèce animale disponible pour l'élevage de poux. L'objectif du projet est de maintenir l'élévage de poux en les nourrissant sur des lapins puis de tester sur ces poux, l’efficacité de produits capables de tuer poux et lentes, ou de répulsifs développés par l'industrie pharmaceutique. De par cette expertise sur les poux et les antipoux, le deuxième objectif est de diffuser les connaissances nécessaires à la lutte contre la pédiculose auprès des étudiants, des services scolaires (interventions dans les écoles) et du grand public (conseils aux familles, expertise auprès des médias), confrontés à cette infestation.

Bénéfices attendus

Les résultats du projet permettront d'orienter le développement de produits antipoux et répulsifs efficaces et de conseiller leurs utilisateurs.

Procédures

Les animaux subiront la piqûre de poux une fois par semaine pendant 6 mois.

Impact sur les animaux

Les lapins seront hébergés individuellement en box de 1,3 m x 0,5 m, avec contacts visuels et auditifs entre congénères et non collectivement pour éviter les conflits. La contention du lapin nécessaire pendant le nourrissage des poux peut engendrer du stress. Les lapins pèsent plusieurs kilos et il est indispensable de les attacher pour assurer leur sécurité, ce qui peut provoquer un inconfort le temps de la procédure. Les liens sont en tissu et ne provoquent pas de blessures, irritations ou dépilation. Les poux des différents stades (adultes et 4 stades larvaires) ne doivent pas être mélangés. Les poux mettent environ 15-20 minutes à prendre un repas complet, ce qui fait une durée totale d’environ 2 heures pour le nourrissage des 5 stades en prenant en compte leur dépôt et leur ramassage. Si la quantité de poux est faible, deux stades peuvent être déposés côte à côte, ce qui diminue cette durée. Le nourrissage des poux (plusieurs centaines) peut entraîner une irritation passagère qui disparaît après quelques minutes.

Devenir

A l'issue de la procédure hebdomadaire, les animaux sont hébergés à l'animalerie. Après une période de 6 mois d'utilisation, tous les animaux seront proposés à l'adoption en famille d'accueil par l'intermédiaire d'une association. Les animaux ne seront mis à mort qu'en cas de pathologie grave indépendante de la procédure, de blessure grave accidentelle ou d'impossibilité de les placer en fin de projet. La décision de mise à mort sera préalablement soumise aux responsables du projet initial et au vétérinaire référent.

Remplacement

Le nourrissage des poux sur animal vivant est le seul moyen à ce jour de garantir la survie des poux, insectes hématophages stricts à tous les stades (adultes et larves), et le maintien du cycle (reproduction et pontes). Le lapin est le seul animal sur lequel les poux humains ont été adaptés il y a plusieurs décennies. Ces poux d’élevage meurent en cas d’ingestion de sang humain, puisqu’ils ne sont plus capables de le digérer. Le nourrissage sur lapin est nécessaire le temps de mettre en place un mode de nourrissage in vitro des poux sur sang de lapin permettant l'obtention d'une colonie conséquente et viable sur plusieurs générations.

Réduction

Le nourrissage des poux se fait par roulement sur 4 lapins. Afin de réduire les contraintes individuelles, la durée d’utilisation de ces lapins sera limitée à 6 mois, soit 8 lapins pour la durée du projet. Deux animaux supplémentaires sont prévus pour compenser l'éventuelle sortie prématurée d’animaux du projet.

Raffinement

Les lapins seront hébergés en accord avec les directives européennes, individuellement en box de 1,3 m x 0,5 m, avec contacts visuels et auditifs entre congénères, afin d’éviter les conflits en hébergement collectif. Le sol des box sera recouvert de copeaux de bois pour un plus grand confort et muni d'une tablette leur permettant de grimper ou de se cacher. De plus, leur environnement sera enrichi d’une balle en plastique pour jouer et régulièrement d'un bouchon de fibres pour se faire les dents. Des enrichissements seront ajoutés ponctuellement pour varier leur quotidien ("rabbit relaxer" par exemple). Une grille scorée basée sur l'échelle d’évaluation des expressions faciales éditée par le National Centre for the Replacement, Refinement & Reduction of Animals in Research (NC3Rs) sera utilisée pour évaluer l’état sanitaire des lapins. Les signes pris en compte seront la contraction orbitaire, l’aplatissement des joues, la position « tombante » du museau, des moustaches et des oreilles avec les scores absent (0), modéré (1) et évident (2). Une acclimatation d’une semaine est prévue à l’arrivée des lapins et une habituation à la procédure est mise en place sur plusieurs jours avant le tout premier nourrissage des poux. A chaque étape d'habituation et après chaque nourrissage des poux, le lapin recevra de la carotte de culture biologique en renforcement positif. A la fin du projet, les lapins seront proposés à l’adoption en famille d’accueil par l’intermédiaire d’une association.

Choix des espèces

Le lapin est la seule espèce sur laquelle les poux de corps humains d’élevage peuvent se nourrir et assurer leur survie sur plusieurs générations. Les adultes sont préférables pour avoir une surface de peau la plus grande possible et ainsi réduire la durée de nourrissage des poux.

Vérifier qu'un modèle de souris prédit l'efficacité d'un futur vaccin contre le paludisme, avant qu'un essai chez des volontaires humains ne le dise: 1 500 souris immunodéprimées et greffées de globules rouges humains ou de singe vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur foie. Chacune reçoit jusqu'à vingt injections de globules rouges en vingt et un jours et subit jusqu'à dix-neuf prélèvements de sang sur animal vigile, puis une infection par Plasmodium vivax. Le porteur signale un risque de péritonite lié aux injections répétées, une anémie liée à la fréquence des prélèvements et une sensibilité accrue aux infections du fait de l'immunodépression. Il écrit qu'un test in vitro développé en parallèle pourrait, à terme, permettre de ne plus recourir à ce modèle murin.

Objectifs

Le paludisme reste un défi majeur en santé publique, avec environ 250 millions de cas cliniques chaque année et près de 600 000 décès. Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax sont les deux espèces de parasites les plus répandues. Bien que P.vivax soit moins mortel que P.falciparum, il touche plus d'un tiers de la population mondiale à cause de sa capacité à former des hypnozoïtes, des formes dormantes dans le foie. En effet, les formes sporozoïtes injectées par les moustiques gagnent le foie puis, certaines infectent rapidement les globules rouges (paludisme) alors que d'autres restent inactives pendant des mois ou des années dans le foie. Leur réactivation provoque des rechutes de la maladie, compliquant ainsi la lutte contre l'infection. Actuellement, il n'existe aucun vaccin contre P. vivax. Une grande initiative Européenne vise à développer des vaccins de nouvelle génération offrant une protection contre ce parasite. L'objectif de ce projet est donc d'évaluer la protection apportée par les anticorps produits après vaccination chez un modèle spécifique de souris et chez les volontaires humains. Ce projet représente une opportunité précieuse de déterminer si ce modèle de souris peut prédire l'efficacité des futurs vaccins avant qu'elle ne soit évaluée chez l'Homme.

Bénéfices attendus

Ce projet offrira une occasion unique d’évaluer la pertinence prédictive de modèles de souris humanisées/simianisées pour les globules rouges en comparant directement la protection conférée par les anticorps générés par le vaccin chez les participants humains et dans ces modèles animaux. Les résultats permettront de mieux apprécier la fiabilité et les limites de ces modèles comme référence pour l’évaluation préclinique de futurs candidats vaccinaux.

Procédures

Pour ce projet, certains animaux recevront des injections pour moduler leur statut immunitaire (animal vigile, 7 fois, 1 minute). Tous les animaux recevront une injection de globules rouges (animal vigile, 20 fois maximum sur 21 jours, 1 minute) qui servira également de compensation des fluides prélevés. Tous les animaux auront des prélèvements sanguins de petit volume (animal vigile, 19 fois maximum, 5 minutes). Un lot d'animaux recevra un sérum par deux voies différentes (animal anesthésie 45 minutes,1 fois, 5 minutes par acte OU animal vigile, 1 fois, 1 minute). Tous les animaux seront infectés (animal anesthésié 45 minutes ou animal vigile suivant le site d'injection, 1 fois, 5 minutes par acte). Tous les animaux auront un prélèvement sanguin de volume plus élevé (animal anesthésié, 1 fois, 1 minute) qui interviendra juste avant l'euthanasie des animaux par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les animaux sont immunodéprimés, par conséquent ils sont plus sensibles aux infections. L'infection avec le parasite du Plasmodium au stade sanguin uniquement pourra engendrer une réponse inflammatoire et une perte de poids. Les animaux pourront avoir des administrations qui pourront engendrer une douleur légère de courte durée au point d'injection et des douleurs abdominales ou une péritonite pour les injections répétées. Les animaux seront soumis à des administrations et à un prélèvement sanguin sous anesthésie : l’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Plusieurs prélèvements sanguins seront effectués sur animal vigile, cela pourra engendrer une douleur légère de courte durée lors du prélèvement et dans de rares cas un hématome. La fréquence des prélèvements pourrait engendrer une anémie et une perte de poids. Les animaux étant immunodéprimés, il y a un risque d'infection lors des injections et des prélèvements. Les différentes manipulations des animaux pourront engendrer un léger stress.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés par une méthode réglementaire car il est nécessaire de prélever différents organes et principalement le foie afin de vérifier la présence et le stade de développement du parasite.

Remplacement

Plasmodium vivax étant un parasite strictement specifique à l'homme, il n'est pas possible, à l'heure actuelle, de remplacer les modèles de souris. Cependant, pour ce qui est de la prediction de protection, la réalisation d'expériences in vitro en parallele avec celles in vivo nous permettra de determiner si le modèle in vitro que nous developpons est tout aussi efficace que le modele in vivo de souris humanisée pour prédire la protection. En conséquence, ces études pourraient éventuellement permettre de ne plus avoir recours à ce modèle murin dans ce contexte spécifique à l'avenir.

Réduction

1500 animaux au maximum seront utilisés dans ce projet dont 420 pour valider le modèle de souris et 1080 pour tester 12 sérums et anticorps sur les 5 ans du projet. Les tests d'efficacité des vaccins seront réalisés uniquement si le modèle murin est validé. Sur la base d'autres études réalisées avec le même type de modèle de souris, des groupes expérimentaux de 5 souris sont suffisants pour répondre aux questions posées. A la fin du projet, différents organes seront prélevés afin de valoriser au maximum l'utilisation des animaux.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Pour limiter l'expression du phénotype dommageable des animaux qui sont immunodéprimés, tout le matériel en contact avec eux est stérilisé. Les administrations qui pourraient stresser modérément les animaux sont réalisés sous anesthésie. Lors des anesthésies, les animaux sont maintenus sur tapis chauffant pour limiter l'hypothermie. Le réveil des animaux est réalisé dans un environnement chaud avec un accès facilité à l'eau et la nourriture. Les yeux sont protégés avec un gel ophtalmique jusqu'au réveil. Les prélèvements sanguins seront compensés par les administrations de globules rouges. Le poids des animaux sera controlé régulièrement pour limiter la perte de poids par la mise en place d'actions. Par ailleurs, le personnel impliqué est formé et expérimenté, les actes techniques et le matériel utilisé pour chaque type d'injection sera toujours le plus adapté afin de réduire au maximum l’inconfort des animaux. Ainsi, la douleur et le stress sont limités en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

La souris est le modèle le mieux développé et connu pour les greffes de cellules hétérologues. Les lignées immunodéficientes et transgéniques pour les gènes d'intérêt permettant la greffe de globules rouges hétérologues n'existent que chez la souris. Les souris sont utilisées à partir de 2 mois car elles doivent être adultes pour supporter la transplantation des globules rouges nécessaire au projet.

Une perte de poids de 15 % ou l'apparition de difficultés respiratoires déclenchent la mise à mort immédiate. 96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une puce sous la peau, huit prises de sang à la veine submandibulaire, deux à dix administrations nasales du vaccin sans anesthésie, puis une inoculation du virus par le nez, le porteur indiquant que l'infection provoque une léthargie et des difficultés respiratoires pouvant entraîner la mort huit jours plus tard. L'enjeu déclaré est d'appuyer une demande d'essai clinique pour un candidat vaccin contre les symptômes du covid long, déjà évalué chez l'humain en prophylaxie.

Objectifs

Le COVID-19, causé par le virus SARS-CoV-2, a affecté des millions de personnes dans le monde, entraînant non seulement des problèmes respiratoires mais aussi des symptômes neurologiques graves, y compris des atteintes cérébrales. Des recherches récentes ont montré que ces complications persistent chez certains patients, formant ce qu'on appelle le 'covid-long'. La vaccination a démontré son efficacité à la fois dans la prévention et le traitement du covid-long. Nous proposons d'évaluer le potentiel thérapeutique de notre vaccin dans un modèle murin, qui reproduisent les symptômes du covid-long, y compris les atteintes cérébrales. Ce modèle animal nous permettra d'étudier comment notre vaccin peut moduler les symptômes persistants du COVID-19, en particulier ceux affectant le système nerveux central. Ce vaccin, conçu pour cibler plusieurs variants du virus, pourrait offrir des perspectives prometteuses pour le traitement de ces formes graves de la maladie.

Bénéfices attendus

Les resultats de ce projet feraient l’objet d’une publication scientifique mais pourraient également servir de données preclinique à une demande d’essais clinique thérapeutique chez l’homme pour le traitement des symptomes liés au covid-long avec le candidat vaccin LVT-001 qui sera déjà évalué en clinque fin 2024 en prophylactique.

Procédures

Tous les animaux, soit 96 souris. Des puces d’identification dorsales en voie sous-cutanée (12 minutes par animal, 1 fois). Des prises de sang à la veine submandibulaire (5 minutes par animal, 8 fois soit une fois par semaine). Inoculation du vaccin par voie nasale sans anesthésie générale. (10 minutes par animal, entre 2 à 10 fois selon les lots). Challenge infectieux par voie nasale sous anesthésie générale (10 min par animal, 1 fois). Prélèvement d'urine (20 seconde maximum par animal, 1 fois).

Impact sur les animaux

Pour le challenge viral par voie nasale, une perte de poids moyen de 15% est observée en premier lieu entre 3 et 5 jours post infection et suivie très rapidement par une léthargie, des difficultés respiratoires pouvant entrainer la mort 8 jours post infection. Pour éviter toute souffrance aux animaux, une perte de poids moyen de 15% et/ou l’apparition de difficultés respiratoires entrainera la mise à mort sans délai. Une variabilité pouvant être liée à la souche virale, les points limites seront ajustés selon nos observations bi/quotidiennes pour éviter toute souffrance aux animaux. MODIFICATION : Les administrations en voie SOUS-CUTANEE pour les anesthésies générales peuvent entrainer une légère douleur au niveau du site d’injection ET SONT MOINS NOCIVE QUE LA VOIE INTRAPERITONEALE, TOUT EN MAINTENANT UNE EFFICACITE COMPARABLE. Une légère douleur locale peut-être observée au site d’implantations de la puce télémétrique. Les prises de sang peuvent également entrainer une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. Les différentes contentions effectuées peuvent engendrer du stress pour l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole et les organes (poumons, cerveau, tête, sang) sont prélevés post mortem pour les analyses de charge virale, pour le recrutement cellulaire et sécrétion de médiateurs biochimiques.

Remplacement

Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution qui pourrait restituer fidèlement un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base d’un test non paramétrique, déjà éprouvé notamment pour l’étude de la réponse immunitaire humorale et cellulaire. Ce nombre d’animaux repose également sur notre experience precedente d’utilisation du même modèle animal dans le cadre d’essais de protection prophylactique avec le même candidat vaccin.

Raffinement

Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes et bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger) dans la zone d'hébergement défini par la structure chargée du bien-être animal de l’établissement. Les souris sont hébergées, avant infection, en animalerie sur des portoirs ventilés puis en isolateur après infection expérimentale (environnement confiné). Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites. Tout type de médication pouvant interférer avec la réponse immunitaire est proscrit. Des critères d’arrêt sont prévus dans le projet afin de prendre en compte d’éventuels effets inattendus. Les procédures sont réalisées par du personnel déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire. Après chaque prise de sang et chaque instillation nasale sur animaux vigiles, une récompense positive alimentaire de type bouchée fruitée ou rondelle de banane séchée ou popcorn ou graines de tournesol sera réalisée.

Choix des espèces

Aucune méthode de substitution n’est envisageable au modèle animal qui est un système de régulation complexe permettant d’évaluer la réponse thérapeutique induite par la vaccination post-infection dans l’étude du covid long. Le modèle murin est à présent bien décrit dans la littérature et représente le modèle de référence pour l’étude des challenges infectieux Covid. Il a été récemment étendu à l’étude des symptômes et pathologies liées au Covid long avec notamment sa propension à reproduire l’infection du SNC par le virus. Ainsi ce modèle est le plus relevant pour l’étude de thérapie contre le covid long. Adulte et immunocompétent : afin d’être représentatif en préclinique de la cible clinique du protocole, le modèle le plus pertinent repose sur des adultes immunocompétents.

Jusqu'à vingt-sept injections dans le ventre et neuf prélèvements de sang par animal après une greffe de cœur cousue au niveau du cou: 1 226 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Près de la moitié sont utilisées comme donneuses, infectées par un cytomégalovirus, l'autre moitié recevant leur cœur sous traitement anti-rejet. Donneuses et receveuses sont génétiquement différentes pour reproduire l'incompatibilité entre un donneur d'organe et son receveur, et le porteur indique qu'amplifier le virus dans les glandes salivaires de souris vivantes reste "nécessaire", la culture cellulaire l'affaiblissant. Toutes sont tuées pour prélever poumons, foie, cœur, reins, rate et glandes salivaires.

Objectifs

Lorsqu’un patient subit une transplantation d’organe et qu’il reçoit un organe provenant d’un donneur, son système immunitaire peut alors reconnaître cet organe comme étranger et provoque son rejet. Pour l’éviter, les patients doivent prendre des traitements immnosuppresseurs (anti-rejet). Ces médicaments visent à réduire l’activité de l’ensemble du système immunitaire et protègent l’organe transplanté mais ils rendent aussi les patients plus vulnérables aux infections. L’infection virale la plus fréquente après une transplantation est celle causée par le cytomégalovirus. Ce virus est très répandu dans la population générale. Chez une personne en bonne santé qui s’infecte pour la première fois, les symptômes sont souvent légers voire absents, car le système immunitaire contrôle rapidement l’infection. Le virus reste ensuite dormant, en « latence », dans différents organes (les reins, le foie, le cœur, les poumons…). Le problème apparaît lorsqu’un patient receveur, n’ayant jamais été en contact avec ce virus, reçoit un organe provenant d’un donneur porteur du virus. Sous traitements anti-rejet, le receveur ne peut pas développer une réponse immunitaire efficace contre le virus. L’infection peut alors se réactiver et entraîner des complications graves, compromettant la santé du patient et la survie de l’organe transplanté. L’objectif de ce projet est d’étudier la manière dont le système immunitaire réagit contre le cytomégalovirus après transplantation, en particulier sous traitement anti-rejet. Nous analyserons aussi l’impact des différences génétiques entre donneur et receveur. Pour cela, nous utiliserons un modèle expérimental de transplantation cardiaque chez la souris dans lequel le cœur de souris donneuses infectées de manière latente au cytomégalovirus sera transplanté à des souris receveuses n’ayant jamais été en contact avec le virus et traitées avec différents médicaments anti-rejet. Le choix du modèle de transplantation cardiaque se justifie par la taille plus importante des vaisseaux, rendant la procédure chirurgicale plus simple que pour d’autres organes. Les souris donneuses et receveuses seront génétiquement différentes afin de reproduire ce qui se passe lorsqu’un patient reçoit un organe infecté par le cytomégalovirus provenant d’un donneur génétiquement différent. La réactivation et la propagation du virus seront analysés dans les différents organes des souris receveuses, ainsi que la réponse immunitaire développée par ces souris.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment le cytomégalovirus est transmis au receveur lors d’une transplantation d’organe, ainsi que le rôle des principales cellules immunitaires impliquées dans le contrôle et la résolution de cette infection chez les patients transplantés. Les résultats obtenus permettront de également de préciser l’impact des traitements anti-rejet sur la réactivation et la dissémination du cytomégalovirus et de savoir comment moduler la réponse immunitaire du receveur afin de la rendre efficace contre le cytomégalovirus tout en limitant le risque de rejet, avec pour objectif de réduire la morbi-mortalité liée à ce virus et de prolonger la durée de vie des greffons.

Procédures

Toutes les souris donneuses de greffon cardiaque (soit près de la moitié du nombre total des animaux prévue pour ce projet) recevront une injection (du virus) dans le ventre sur animal vigile en début de procédure. 3 prélèvements sanguins sous anesthésie locale seront réalisés sur les souris donneuses (avant infection, une semaine après infection et quelques jours avant la chirurgie pour confirmer l’état de latence du virus). En fin de procédure, les souris donneuses recevront une injection d’anesthésiques (anesthésie générale profonde) dans le ventre et une injection d’analgésique morphinique dans le ventre avant la chirurgie. La peau sera désinfectée et incisée afin de prélever le cœur des souris donneuses. Durée de l’opération chirurgicale : 1h. Toutes les souris receveuses de greffon cardiaque (l’autre moitié des animaux de ce projet) seront anesthésiées profondément via une injection d’anesthésiques dans le ventre et recevront au total 4 injections sous la peau d’analgésique morphinique sur une période de 2 jours. Ainsi, sous anesthésie profonde générale et analgésie, la peau sera désinfectée et incisée afin de greffer le cœur de la souris donneuse au niveau du cou, puis suturée. L’opération chirurgicale durera 2h maximum. De plus, elles seront également soumises à des injections dans le ventre répétées 3 fois par semaine sur animal vigile (soit au maximum 27 injections sur 63 jours maximum), et à des prélèvements sanguins hebdomadaires sous anesthésie locale (soit jusqu’à 9 prélèvements maximum). Les injections dans le ventre et les prélèvements sanguins dureront 30 secondes (contention comprise).

Impact sur les animaux

Les injections et les prélèvements de sang répétés sont susceptibles d’entrainer un stress (lors de la contention) et une légère douleur lors de l’acte. La greffe de cœur correspond à une procédure bien documentée, les potentiels effets indésirables sont associés la plupart du temps à des soucis d’anesthésie lors de la chirurgie ou de suture des vaisseaux. L’intervention chirurgicale entrainera une gêne lors du réveil et une douleur malgré les analgésiques et risque d’engendrer des difficultés de mouvements ou des démangeaisons lors de la cicatrisation. L'infection à cytomégalovirus, aux doses utilisées ici, n'engendre pas de symptômes chez les animaux immunocompétents (c’est-à-dire non traités avec les traitements anti-rejet). Pour les souris traitées avec le traitement anti-rejet, l'infection peut causer l'apparition de signes généraux telles qu'une perte de poids ou une prostration, ou encore une hépatite (inflammation hépatique non douloureuse), ou une colite (associée à des diarrhées). L’infection durera 4 mois (pour les souris donneuses immunocompétentes) ou 2 mois (pour les souris receveuses sous traitement anti-rejet) au maximum. De manière générale, ces procédures peuvent donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l’état général des animaux. Les points cliniques généraux (aspect du poil, comportement, pesée) seront observés selon une fréquence déterminée pour chaque procédure ou étape au sein d’une même procédure. Les points limites propres à chaque procédure ont été décrits pour éviter toute souffrance.

Devenir

Les souris seront mises à mort avec une méthode réglementaire en fin de procédure afin de récupérer différents organes (poumons, foie, coeur, reins, rate et glandes salivaires). La mise à mort des animaux est donc nécessaire pour toutes les analyses biologiques et biochimiques. Toutes les souris ayant atteint un point limite avant la fin de la procédure seront également mises à mort avec une méthode réglementaire.

Remplacement

Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe et les interactions cellulaires aboutissant à la réponse dirigée contre le cytomégalovirus font intervenir de multiples acteurs immunitaires présents dans différents tissus ou organes lymphoïdes, ce qui est impossible à reproduire in vitro. De plus, le phénomène d’ischémie-reperfusion (lésions dues à l’arrêt puis retour du flux sanguin) est impossible à reproduire sur des modèles in vitro simplifiés, nous avons donc besoin de toute la complexité vasculaire et inflammatoire de l’organisme vivant pour reproduire ce phénomène observé en transplantation d’organe. Dans certains cas, la génération du stock de virus peut être réalisée par amplification sur lignées de cellules in vitro. Cependant, ceci a pour effet de dimiuner la virulence du virus, contrairement au virus amplifié in vivo et isolé à partir de glandes salivaires. Etant donné que, dans notre cas, nous devons utiliser la souche non modifiée et peu virulente afin d’étudier la réponse physiologique de certaines cellules immunitaires en particulier (ce qui n’est pas possible avec les autres souches de virus modifiées plus virulentes), et que le virus doit être suffisamment virulent afin d’infecter des hôtes immunocompétents et d’obtenir une infection latente (virus en état de dormance), une amplification initiale du virus in vivo (au niveau des glandes salivaires de la souris) est donc une étape nécessaire et non remplaçable par une amplification in vitro.

Réduction

Des calculs d’effectifs ont permis d’établir le nombre minimal d’animaux par groupe afin d’assurer la robustesse des analyses. Afin d’atteindre un effectif de 5-6 animaux par expérience, sachant que 2 types de protocoles expérimentaux incompatibles seront réalisés (soit 10-12 animaux par groupe), en prenant en compte le taux de réussite de 80-90% pour les greffes cardiaques, nous prévoyons 14 animaux par groupe. Au total, le nombre d’animaux prévus pour ce projet est de 1226 souris (mus musculus). Néanmoins, ce nombre est suceptible d’être revu à la baisse au cours du projet. L’étape de génération du stock de virus in vivo étant redondante avec un autre projet (déjà validé par le ministère), si la quantité de virus générée dans ce premier projet est également suffisante pour ce nouveau projet, nous ne réaliserons pas cette procédure. De même, le nombre d’animaux prévus pour l’entrainement technique à la greffe cardique correspond à un nombre maximal : ainsi, dès validation de la technique, nous passerons à l’étape suivante. Les différentes étapes de ce projet se feront séquentiellement afin de sélectionner au mieux les groupes les plus pertinents au fur et à mesure de l’avancée du projet, et ainsi de limiter le nombre d’animaux utilisés. Le maximum d’échantillons biologiques sera extrait de chaque animal, et plusieurs expériences seront réalisées sur les mêmes échantillons, afin d’éviter d’avoir à reproduire ultérieurement l’expérience par manque de matériel biologique.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera évalué et pris en compte tout au long du protocole grâce un suivi rigoureux, incluant l’observation de leur poids, de leur comportement et de leur état général. Des points limites spécifiques à chaque acte ont été définis afin d’assurer une prise en charge adaptée. Afin de limiter les nuisances et douleurs liées aux injections et aux prélèvements sanguins réguliers, nous alternerons régulièrement des sites d’injection et les sites de prélèvement. Des traitements anesthésiques et analgésiques seront administrés afin de garantir le confort des animaux lors des interventions chirurgicales et des prélèvements sanguins. Bien que la douleur lors des injections ou des prélèvements dans ce protocole sera réduite grâce à l'administration d'analgésiques/anesthésiques, des points limites ont tout de même été définis pour les différentes procédures afin d'intervenir en cas de nécessité et de limiter la souffrance de l'animal. Après chaque chirurgie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant et un suivi rapproché sera effectué. Le protocole chirurgical a été établi de façon à ce que le cœur de la souris receveuse est conservé et fonctionnel, ainsi, la perte du greffon cardiaque (issu de la souris donneuse) ne peut entrainer la mort et la souffrance de l’animal en soi. L'infection au cytomégalovirus des animaux traités sous traitement anti-rejet est susceptible de causer des symptômes spécifiques comme une inflammation du foie ou du côlon. Un suivi quotidien de leur état général sera effectué, et la survenue de diarrhées sera contrôlée. À cela s'ajoute un monitoring spécifique permettant de doser les enzymes du foie grâce aux prélèvement sanguins réalisés de façon hebdomadaire. Ces prélèvements sanguins réguliers sont donc nécessaires afin de suivre l’état de santé des animaux et de réagir plus précocément en cas de résultats insatisfaisants. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement.

Choix des espèces

Du fait de sa similarité avec l’Homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude de la réponse immunitaire anti-virale dans le contexte allogénique. Pour les expériences de transplantation, des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées afin de garantir un système immunitaire pleinement mature capable de répondre à l’infection. Pour la production virale in vivo, des souris immunocompétentes agées de 6 semaines, déjà sevrées, seront utilisées afin d’optimiser le rendement, tout en préservant leur bien-être.

760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois injections d'un vaccin à ARN messager espacées de trois semaines et des prélèvements de sang à la queue avant chaque injection, puis une partie d'entre elles reçoit une injection de Plasmodium berghei, suivie d'imagerie sous anesthésie et d'une prise de sang tous les un à deux jours. Le porteur indique que l'infection peut provoquer un affaiblissement, une anémie et des symptômes neurologiques, avec difficulté à se mouvoir et à s'alimenter, et prévoit de tuer les souris avant l'atteinte des points limites. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune culture cellulaire ne recrée la complexité d'un "organisme entier" doté d'un système immunitaire, tout en annonçant recourir à des cultures pour mesurer l'effet neutralisant des sérums.

Objectifs

Le paludisme reste un problème majeur de santé dans le monde. Les vaccins actuellement disponibles ou en développement sont malheureusement peu efficaces. Nos recherches visent à identifier de nouvelles cibles vaccinales ciblant les premières étapes d'infection chez l'homme après la transmission de Plasmodium, le parasite responsable du paludisme, par un moustique. Pour cela, nous utilisons un modèle murin d’infection par Plasmodium berghei, qui peut être étudié à tous les stades du cycle parasitaire et permet de valider par des tests pré-cliniques l'efficacité de formulations vaccinales. L'objectif du projet est d'évaluer dans ce modèle murin de nouvelles cibles vaccinales, en utilisant des formulations à base d'ARN messager.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de valider dans un modèle pré-clinique que des formulations à base d'ARNm d'antigènes de Plasmodium sont immunogènes et permettent d'induire une protection contre une infection d'épeuve. La validation pré-clinique chez la souris de nouvelles cibles vaccinales pourrait ouvrir de nouvelles perspective pour lutter contre le paludisme chez l'homme, qui chaque année touche plus de 250 millions de personnes et cause plus de 600000 morts.

Procédures

Un premier groupe d'animaux sera soumis aux interventions suivantes: immunisation par vaccin ARN (3 injections espacées de 3 semaines, durée du geste 10 secondes, sous anesthésie gazeuse), prélèvement de quelques gouttes de sang à la queue (avant chaque immunisation, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), anesthésie gazeuse (acte unique, durée 10 minutes) suivie d’un prélèvement de sang d'un volume plus important (acte unique, durée 10 minutes, sur animaux anesthésiés) puis d'une euthanasie selon une méthode réglementaire. Un second groupe d'animaux sera soumis aux interventions suivantes: immunisation par vaccin ARN (3 injections espacées de 3 semaines, durée du geste 10 secondes, sous anesthésie gazeuse), injection de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), imagerie intravitale sous anesthésie gazeuse (durée 10 minutes), prélèvement d'une goutte de sang à la queue ( tous les 1 à 2 jours pendant 5 à 8 jours, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles).

Impact sur les animaux

La contention des animaux pourra induire un stress de courte durée. Les différents types d'injection pourront entraîner une douleur de courte durée. Les prélèvements sanguins pourront induire une douleur de courte durée aux animaux ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie. L’anesthésie, pour l'imagerie et pour les prélèvements sanguins en fin de procédure, pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. L'infection par P. berghei pourra engendrer un affaiblissement, une anémie, voire des symptômes neurologiques, générant une douleur modérée à l’animal associée à une difficulté à se mouvoir et s’alimenter.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures par des méthodes réglementaires, soit parce que des prélèvements sont nécessaires pour des analyses post-mortem, soit pour éviter d'atteindre des points limites chez les animaux infectés.

Remplacement

Le projet vise à évaluer dans un modèle murin des vaccins à base d'ARNm ciblant des antigènes de Plasmodium, l'agent du paludisme. L'analyse de l'effet d'une immunisation nécessite le recours à un organisme muni d'un système immunitaire pour pouvoir étudier les réponses anticorps. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires du système immunitaire impliqués. Par contre, nous utiliserons des systèmes de cultures cellulaires pour analyser in vitro l'effet neutralisant des serums des animaux immunisés.

Réduction

760 animaux seront utilisés pour ce projet. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. L'utilisation d'une méthode d'imagerie intravitale permet de suivre l'infection au cours du temps et ainsi de réduire le nombre d'animaux. L'utilisation d'un groupe témoin pour plusieurs groupes tests permet également de réduire le nombre d'animaux.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum (kraft ou coton pour nidification, croquettes déposées au fond de la cage pour mastication) et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été conçu afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée avant le début des expérimentations. Une période d'habituation de 5 minutes est également respectée dans l'appareil de contention avant les injections sur animaux vigiles, afin de réduire le stress. Certaines procédures sont réalisées sous anesthésie et analgésie pour prévenir la douleur. Les cages des souris en cours de procédure sont clairement identifiées par une étiquette colorée afin de faciliter le suivi clinique. Les souris soumises aux procédures impliquant une infection par Plasmodium sont pesées deux fois par semaine. La présence de points limites définis permet d'éviter la souffrance liée aux complications de l'infection par Plasmodium berghei. Afin de faciliter l’alimentation et l'hydratation chez les animaux fortement infectés par Plasmodium (parasitémie élevée), la nourriture sera donnée sous forme de bouillie ou de gel directement dans la cage. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

La souris représente un hôte permissif à l'infection par Plasmodium berghei, permettant d'évaluer l'efficacité de stratégies d'immunisation contre la phase initiale d'infection du foie. Nous utiliserons deux souches de souris commerciales adaptées aux tests d'immunogénicité et aux tests d'efficacité. Nous utiliserons des souris adultes, âgées de 6 à 10 semaines au début des procédures, permettant d'avoir un système immunitaire mature.

Jusqu'à 72 heures de perfusion continue par cathéter vasculaire, neuf prélèvements sanguins et deux heures d'anesthésie chirurgicale pour poser le dispositif : 706 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par une pyélonéphrite ou une péritonite, provoquée par administration ou par chirurgie, avec perte de poids attendue, prostration possible et isolement jusqu'à 72 heures. Tous sont tués pour compter les bactéries dans leur rein ou leur rate, le projet servant à caler des schémas posologiques de combinaisons d'antibiotiques avant l'essai clinique. Le porteur a retenu une lignée non consanguine parce que sa variabilité génétique reflète mieux, selon lui, la diversité des réponses humaines aux antibiotiques.

Objectifs

La résistance aux antibiotiques constitue un problème de santé majeur. Un certain nombre d’options thérapeutiques sont toutefois apparues ces dernières années dans le traitement des infections sévères à entérobactéries résistantes, mais des résistances apparaissent. L'étude de nouvelles associations d’antibiotiques ainsi que l’optimisation des posologies sont donc nécessaires afin d’améliorer le traitement de ces infections sévères. Ce projet consiste à évaluer de nouvelles posologies chez des rats infectés soit par une pyélonéphrite, soit par une peritonite après perfusion continue de combinaisons d'antibiotiques permettant de reproduire des concentrations humaines chez l'animal.

Bénéfices attendus

Cette étude in vivo permettra d’évaluer de nouveaux schémas posologiques de ces combinaisons d’antibiotiques qui serviront de base solide pour décider quelles associations et quels schémas posologiques méritent d’être testés en essais cliniques chez l’humain. Cela représente une étape indispensable pour réduire les risques et optimiser la sécurité des patients lors des phases suivantes. À long terme, ce projet pourrait jouer un rôle clé dans la lutte contre les infections graves causées par des bactéries multi-résistantes. En proposant des stratégies thérapeutiques innovantes et validées, nous pourrons améliorer durablement la prise en charge clinique des patients, réduire la morbidité et la mortalité liées à ces infections, et répondre ainsi à un enjeu majeur de santé publique mondiale.

Procédures

Tous les animaux auront une anesthésie. Pour une partie des animaux, l'anesthésie durera 15 minutes pendant lesquelles l'infection sera provoquée par administration. Pour une autre, l'anesthésie durera 30 minutes au cours desquelles l'infection sera provoquée lors d'une chirurgie. Pour le reste des animaux, l'anesthésie durera environ 2 heures au cours desquelles l'infection sera provoquée et des cathéthers vasculaires seront placés lors d'une chirurgie. Les cathéters permettront la perfusion d'antibiotique et les prélèvements sanguins répétés. Sur ces animaux un tiers aura une perfusion de 24 heures au cours desquelles 3 prélèvements sanguins seront faits. Un tiers aura une perfusion de 48 heures au cours de laquelle 6 prélèvements sanguins seront faits. Un tiers aura une perfusion de 72 heures au cours de laquelle 9 prélèvements de sang seront faits.

Impact sur les animaux

Chirurgie : inconfort transitoire au réveil - une perte de poids attendue due à l'infection. Une prostration ou une perte de mobilité à 24 heures post-infection peut survenir. Isolement de l'animal pendant 72 heures maximum, Implantation de cathéters à demeure : gêne légère pendant la durée de la perfusion intraveineuse et pendant les prélèvements.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement et détermination de la concentration bactérienne dans le rein ou la rate.

Remplacement

Dans ce projet, nous commencerons par tester différentes combinaisons de traitements in vitro afin de sélectionner celles qui sont les plus efficaces, comparées aux traitements classiques utilisés seuls ou en association. Cependant, avant d’envisager leur utilisation chez l’humain, il est essentiel de valider ces nouvelles approches chez des animaux infectés, pour vérifier qu’elles fonctionnent bien dans un organisme vivant. À notre connaissance, aucun autre modèle in vitro ou sur ordinateur ne permet aujourd’hui de mener ce type d’étude, qui apporte des informations sur les variations individuelles dans la manière dont les médicaments agissent et sont éliminés.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé pour pouvoir observer une différence claire dans la quantité de bactéries entre les groupes traités et non traités.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant 10 jours. Les procédures d'infection et les technqiues chirurgicales seront réalisées sous des conditions aseptiques et thermorégulées sous anesthésie générale et sous converture antalgique. Des points limites gradés et bien identifiés ont été établies afin d'obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations, ce qui permettra d'agir sans délai. Le système de perfusion utilisé au cours de cette procédure est un système commercial, validé, sécurisé et robuste, il permet une perfusion continue et de réaliser des prélèvements sanguins sans toucher l'animal ce qui réduit le stress.

Choix des espèces

Nous utiliserons des rats agés de 8 semaines ayant atteint la maturité physiologique, modèle couramment utilisé pour l'étude des médicaments. Nous avons choisi une lignée non consanguine qui présente une certaine variabilité génétique entre les individus ce qui permet de mieux refléter la diversité génétique dans les concentrations d'antibiotiques et la réponse aux antibiotiques observée dans la population humaine. De plus, leurs paramètres physiologiques, métaboliques et anatomiques sont bien connus, cela permet une interprétation fiable de des données chez le rat et donc une extrapolation des résultats à l'homme plus robuste.

Pour savoir où le SARS-CoV-2 se cache dans l'organisme après la guérison apparente, 12 macaques à longue queue vont être infectés puis tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit environ quarante-cinq anesthésies générales, quarante-cinq prélèvements de sang, trente écouvillonnages du nez et de la trachée, vingt lavages broncho-alvéolaires, dix ponctions de moelle osseuse et huit retraits de ganglions lymphatiques. Le porteur annonce aussi deux injections de molécules qui imitent une infection bactérienne, destinées à réveiller le virus "endormi", et décrit fièvre, douleurs musculaires, anémie et saignements de nez parmi les suites attendues. La surveillance repose sur une grille de score déjà employée dans le service, les animaux étant tués en fin de projet pour analyser moelle osseuse, ganglions, rate et intestin.

Objectifs

Le Covid long touche environ une personne sur dix après une infection par le virus responsable du Covid-19, le SARS-CoV-2. Il entraîne des symptômes qui persistent plusieurs mois après la guérison initiale, comme une grande fatigue, des troubles de la mémoire ou encore des douleurs multiples (thoraciques, musculaire ou articulaire, céphalées…etc). Les causes précises de ce syndrome restent encore mal comprises. Plusieurs pistes sont étudiées : une inflammation prolongée, un dérèglement du système immunitaire, des déséquilibres hormonaux ou encore la présence persistante du virus dans l’organisme. Pour mieux comprendre ces mécanismes, nous utilisons un modèle animal primate, le macaque cynomolgus, dont les réponses à l’infection à SARS-Cov-2 sont proches de celles de l’humain. Ce modèle permet d’étudier en détail l’évolution de l’infection sur le long terme. Grâce à lui, il a été découvert que le virus, même s’il n’est plus détecté par les tests tels que les écouvillons nasaux, peut rester caché pendant 6 à 18 mois dans les poumons dans certaines cellules immunitaires, les macrophages. Nous avons aussi observé que certaines cellules du système immunitaire, les cellules NK (pour “natural killer”), peuvent s’adapter pour mieux combattre ce virus caché. Une sous-population particulière de ces cellules, les “NK adaptatives”, semble jouer un rôle clé dans le contrôle de l’infection persistante. Ce projet de recherche se poursuit aujourd’hui autour de trois grandes questions : 1/ Où le virus se cache-t-il à long terme ? Nous voulons savoir si les macrophages des poumons sont les seuls refuges du virus, ou si d’autres cellules, dans d’autres organes comme l’intestin, peuvent aussi l’héberger durablement. 2/ Quel est le rôle du système immunitaire ? Nous étudierons si l’état du système immunitaire au moment de l’infection influence la capacité à éliminer le virus. Nous chercherons aussi à comprendre comment les cellules NK adaptatives se développent et agissent. 3/Le virus peut-il se réveiller ? Enfin, nous testerons si ce virus "endormi" peut se réactiver plus tard, par exemple en cas d’infection bactérienne, et provoquer de nouveaux symptômes. Ces recherches visent à mieux diagnostiquer le Covid long et à poser les bases pour développer, à terme, un traitement curatif.

Bénéfices attendus

Une des hypothèses avancées pour le Covid long est que le virus pourrait persister discrètement dans l’organisme, sans être complètement éliminé par le système immunitaire. Dans ce projet de recherche, l’objectif est de mieux comprendre où et comment le virus peut rester caché dans le corps. Les cellules et tissus jouant un rôle de “réservoirs” viraux – comme les poumons, l’intestin, les ganglions lymphatiques ou la moelle osseuse – seront identifiés et étudiés. Leur nombre, leur activité anti-virale et leur évolution dans le temps seront analysées. Une attention particulière sera portée aux macrophages des poumons et aux cellules NK, capables d’éliminer les cellules infectées. On s’intéressera aussi aux facteurs immunitaires (c’est-à-dire l’ensemble des réactions et des cellules de nos défenses naturelles qui permettent de combattre une infection) et aux facteurs épigénétiques (c’est-à-dire les mécanismes qui modifient l’activité de nos gènes sans changer l’ADN) qui peuvent influencer la capacité du corps à éliminer durablement le virus. Pour cela, nous utiliserons un modèle animal primate, le macaque cynomolgus. Grâce à lui, après une infection par le SARS, la dynamique du virus peut être observée dans plusieurs organes et sur une longue période, ce qui ne peut être réalisé chez l’humain. Nous testerons une approche innovante qui consiste à injecter une molécule modulatrice de la réponse immunitaire qui imite une infection bactérienne. L’objectif est de vérifier si, dans ces conditions, le virus encore présent dans l’organisme mais « endormi » peut se réactiver, sans qu’il y ait réellement de nouvelle infection. Plusieurs avancées sont attendues grâce à ce projet : • Une meilleure compréhension de la persistance virale, des mécanismes d’échappement au système immunitaire, et des conditions de réactivation du virus. • La mise en évidence du rôle des cellules NK dites "adaptatives" dans le contrôle de l’infection à long terme. • L’identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour développer des antiviraux ou des immunothérapies. • La détection de marqueurs sanguins utiles au diagnostic du Covid long et à la sélection des patients pour de futurs essais cliniques. Ce projet permettra une avancée majeure dans la compréhension et la prise en charge du Covid long, tout en enrichissant les connaissances scientifiques sur les infections chroniques et l’immunité.

Procédures

Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale (45 fois environ, 30 minutes, tous les animaux) et seront regroupés pour limiter les anesthésies. Les différentes interventions dans ce projet sont : - Infection par le virus SARS-CoV-2 (une fois, 15 min, tous les animaux, - Injection de molécules modulatrices de la réponse immunitaire (deux fois environ, 5 min, tous les animaux) - Prélèvements de sang (45 fois environ, 5 min, tous les animaux) - Prélèvement de moelle osseuse (10 fois environ, 10 minutes, tous les animaux) - Retrait de ganglions lymphatiques périphériques (8 fois environ, 20 minutes, tous les animaux) - Ecouvillonnages nasaux et trachéaux (30 fois environ, 2 minutes, tous les animaux) - Lavage broncho-alvéolaire (20 fois environ, 20 minutes, tous les animaux)

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables peuvent survenir selon le type d’intervention : Nuisances suite à l’infection : Symptômes respiratoires (pneumonie légère à modérée, difficultés respiratoires transitoires, toux légère), fièvre et comportement de fatigue, anorexie transitoire ou diminution de l’appétit avec plus ou moins des pertes de poids mineures, déshydratation. Ces symptômes se résolvent spontanément dans les deux premières semaines qui suivent l’infection. Nuisances suite à l’injection de molécules modulatrices de la réponse immunitaire : Fièvre et comportement de fatigue, douleurs musculaires (tremblements, difficultés locomotrices), anorexie transitoire ou diminution de l’appétit, déshydratation, activation de la réponse immunitaire. Nuisances suite aux prélèvements de sang, moelle osseuse, et anesthésies répétées : Diminution de l’appétit avec plus ou moins des pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Nuisances suite aux lavages bronchoalvéoaires: Toux, difficultés respiratoires légère juste après le geste. Nuisances suite aux écouvillons nasotracheaux: Saignement nasal (léger à modéré). Nuisances suite à l’hébergement individuel : L’hébergement en individuel peut entrainer un stress. Après infection et pendant environ 4 semaines, ils seront hébergés en modules individuels permettant des interactions sociales pour limiter la surinfection virale. Nuisances possibles suite à l’exérèse de ganglions : Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie rare, durée de 1 à 5 jours.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de projet afin de pouvoir analyser tous les organes où sont activées les NK et macrophages (moelle osseuse, ganglions lymphatiques, rate, intestin…)

Remplacement

Pour mieux comprendre comment le virus du Covid-19 (SARS-CoV-2) peut rester présent dans l’organisme sur le long terme, il est essentiel d’étudier ce phénomène dans un organisme vivant. Les expériences faites uniquement sur des cellules isolées, ne permettent pas de reproduire la complexité d’un corps entier. Elles ne reflètent pas non plus le comportement réel des cellules dans leur environnement naturel. C’est pourquoi des études sont menées sur des modèles animaux. Le macaque est l’un des plus adaptés pour ce type de recherche, car il est très proche de l’humain sur le plan biologique. Il possède les mêmes récepteurs cellulaires d’entrée pour le virus), ce qui permet au SARS-CoV-2 d’infecter ses organes de manière similaire à ce qui est observé chez l’humain, qu’il s’agissent des poumons, des intestins, des ganglions lymphatiques ou encore de la moelle osseuse. Grâce à ce modèle, la persistance du virus, l’emplacement de ses réservoirs dans l’organisme et l’évolution des réponses immunitaires peuvent être étudiés dans la durée. De plus, des prélèvements peuvent être réalisés dans différents organes, ce qui n’est pas possible chez l’humain.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum nécessaire à une analyse statistique fiable des résultats par des tests adaptés aux petits échantillons. L’élaboration et l’analyse des résultats de cette étude est réalisée en collaboration avec une équipe de Bioinformatique et Biostatistique. Les tissus prélevés à l’euthanasie seront mis à disposition pour d’autres études.

Raffinement

Anesthésies/ Toutes les interventions et les prélèvements seront réalisées sous anesthésie générale pour éviter d’éventuelles douleurs. Si possible, les prélèvements seront groupés lors d’une seule et même anesthésie. Si des troubles alimentaires apparaissent suite aux anesthésies répétées, une diversification/complémentation alimentaire sera instaurée. Prélèvements / Ils consistent en des prélèvements de sang, de moelle osseuse et des exérèses de ganglions périphériques. Les volumes de sang et de moelle osseuse prélevés seront réduits au minimum. Si des réactions locales apparaissent, un traitement symptomatique pourra être instauré. Exposition au virus / Après exposition aux virus SARS-CoV2, une grille de score sera utilisée pour le suivi de l’infection chez l’animal. Elles ont déjà été établies et utilisées au sein de notre département et assure un bon suivi de l’état de santé des animaux après infection et permet d’alerter les vétérinaires en cas de besoin. Administration des molécules modulatrices de la réponse immunitaire / Si des réactions locales apparaissent suite à l’administration des modulateur, une désinfection et une analgésie locale pourront être appliquées sur décision du vétérinaire. Hébergement individuel / Les animaux sains seront hébergés en groupe sauf avis contraire des vétérinaires ; les animaux infectés seront hébergés en modules individuels permettant des interactions sociales avec un enrichissement augmenté (distribution 2 fois/semaine d’enrichissements destructibles ou sachet surprise au lieu d’1 pour les hébergements en groupe). Cet hébergement individuel est nécessaire pour limiter la surexposition virale. Suite à l’exposition et une fois la production virale terminée (4 semaines maximum), ils seront remis en groupe sociaux. Observations Les animaux seront observés quotidiennement. Des points limites sont prévus et le vétérinaire de l’installation sera alerté en cas d’apparition de signes cliniques inattendus afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux.

Choix des espèces

Pour mieux comprendre comment le virus du Covid-19 (SARS-CoV-2) peut rester dans le corps après une infection, nous utilisons un modèle animal proche de l’humain : le macaque cynomolgus. Ce primate partage de nombreuses caractéristiques biologiques avec l’être humain, notamment les récepteurs que le virus utilise pour entrer dans les cellules. Cela signifie que l’infection se développe chez ce modèle animal de manière très similaire à ce qui est observé chez l’humain, en touchant notamment les poumons, les intestins, les ganglions lymphatiques et la moelle osseuse. Ce modèle permet de suivre l’infection sur le long terme, dans des conditions très contrôlées : nous pouvons choisir précisément la dose de virus administrée et simuler certaines maladies associées (comorbidités), par l’injection de molécules modulatrices de la reponse immunitaire, comme cela se produit chez certains patients humains. Des prélèvements réguliers dans différents organes (sang, ganglions, moelle osseuse) sont possibles sur plusieurs mois, ce qui permet d’observer l’évolution du virus, d’identifier ses "cachettes" dans le corps (appelées réservoirs) et de mieux comprendre les réactions du système immunitaire dans le temps. Ce modèle permet aussi d’étudier le sang pour y repérer des signes spécifiques (biomarqueurs) de la présence du virus dans les différents organes. Ces informations pourraient ensuite être utilisées pour améliorer le diagnostic du Covid long chez l’humain, sans devoir effectuer de prélèvements invasifs. Les recherches se concentrent uniquement sur des modèles animaux adultes. En effet, leur système immunitaire est déjà totalement développé, ce qui permet d’obtenir des résultats plus fiables et comparables à ceux d’adultes humains. Cela aide à mieux comprendre les mécanismes de défense qui fonctionnent — ou échouent — face au virus, et pourquoi il peut parfois persister longtemps dans l’organisme. En résumé, le modèle macaque cynomolgus adulte est aujourd’hui l’un des plus pertinents pour faire progresser la recherche sur la persistance du SARS-CoV-2 et mieux prendre en charge les personnes souffrant de Covid long.