Troubles cardiaques

496 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après trois mois d'un régime induisant surpoids et troubles métaboliques, elles subissent un test au glucose puis une chirurgie reproduisant un accident vasculaire cérébral, suivie de tests comportementaux non précisés à sept et vingt et un jours. Le porteur indique que le modèle provoque douleur peropératoire, perte sensorimotrice, perte de poids et déshydratation, les souris étant tuées pour prélever les tissus. Il affirme que l'étude de l'ischémie cérébrale dans ce contexte métabolique ne peut s'envisager que dans un "organisme entier" et présente les retombées cliniques comme applicables à l'humain.

Objectifs

Les maladies cardiaques sont l'une des principales causes de problèmes de santé et de décès chez les personnes âgées, en raison des problèmes de santé associés (vieillissement de leurs artères et troubles métaboliques). Ce projet de recherche se concentre sur l'accident vasculaire cérébral, maladie de plus en plus fréquente chez les personnes de plus de 60 ans. Aujourd’hui aucune thérapie ne permet une bonne prise en charge de la maladie. Chez ces patients, les comorbidités, telles que l’hyperglycémie et l’hyperlipidémie sont des facteurs de risque bien identifiés, aggravant les conséquences de la maladie. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre et caractériser le rôle des comorbidités liées à l’âge dans la modulation de la réponse des mécanismes de réparation après la survenue d’un accident vasculaire cérébral. Nous utiliserons un modèle classiquement utilisé et qui est proche de l’accident vasculaire cérébral chez l’Homme. Par ailleurs, la prise en compte des problèmes de santé associés à l'âge est nécessaire pour déterminer l’impact de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cette étude, qui sera menée sur 2 établissements utilisateurs, permettra de mieux comprendre les caractéristiques de l'accident vasculaire cérébral dans le contexte de vieillissement et ses problèmes de santé associés dans l’optique d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des comorbidités dans les conséquences de l'accident vasculaire cérébral. Les bénéfices attendus concernent la progression des connaissances scientifiques, connaissances qui pourront être appliquées à l'Homme et ce grâce à la prise en compte de la réalité de la clinique (âge et comorbidités).

Procédures

Après 3 mois d’administration d’un régime riche en protéines et en lipides et pauvre en glucides, les souris suivent un test d’intolérance au glucose (une injection de glucose intrapéritonéale et mesure de la glycémie). Cette première intervention sera réalisée dans un des 2 établissements utilisateur (EU1 et EU2). Puis, nous mimerons l’accident vasculaire cérébral en utilisant un modèle in vivo (chirurgie de 10 min) au sein de l'EU2. Les effets du régime sur la réponse après AVC seront analysés à J7 et J21 après la mise en place du modèle d’AVC à l’aide de tests de comportement.

Impact sur les animaux

L’âge (animaux âgés de plus de 6 mois) et le changement de l’alimentation induit une prise de poids (animaux de 35 – 60g). L’injection intrapéritonéale de glucose et la mesure de la glycémie sont également une nuisance pour l’animal. Le modèle d’AVC induit une douleur peropératoire et perte sensorimotrice. Une perte de poids et déshydratation peuvent également être attendues. Les tests comportementaux peuvent également être une source de stress pour les animaux.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour récupérer les tissus et faire les analyses histologiques, protéiques et génomiques

Remplacement

Notre projet a démarré par des études in vitro rapportant les effets d’un modèle de stress métabolique sur les fonctions de cellules endothéliales de vaisseaux cérébraux, notre but est maintenant d’étudier l’ischémie cérébrale dans ce contexte de stress métabolique (comorbidités), qui met jeu en des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants puisque l'étude des conséquences métaboliques du vieillissement et son retentissement sur le vaisseau et sa fonctionnalité, avec ou sans traitement, ne peut s'envisager que dans un organisme entier.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant en accord avec notre expérience sur ces modèles et un calcul de puissance. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront une analgésie en pré- per- et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 48h. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse). En post-chirurgie une attention particulière sera portée aux animaux jusqu’au réveil. Un suivi clinique et une surveillance des animaux seront réalisés à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et/ou mis à mort selon le score. Enfin, le bien-être animal sera aussi amélioré par l’enrichissement du milieu. Les cages seront pourvues de coton, bâtonnets de bois, igloo. Les souris sont placées dans une pièce au calme. Une chambre de réveil thermostatée sera utilisée en post-chirurgie. Le transport des animaux sera effectué en conditions ventilé et suivi de température.

Choix des espèces

Des études précédentes ont montré la pertinence du modèle souris pour étudier les maladies cardiovasculaires liées à l’âge et ses comorbidités. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’accident vasculaire cérébral (AVC) et pour lequel les outils sont nombreux pour le suivi de cette étude et ultérieurement pour le suivi de cette pathologie (anticorps, imagerie, modèles génétiquement modifiés). L’AVC étant essentiellement une pathologie de l’âge adulte. Le choix du modèle sera réalisé en utilisant des animaux âgés d’au moins 6 mois, âge permettant de mimer la physiologie du vaisseau à l’âge adulte. Pour prendre en compte les comorbidités liées au vieillissement, les animaux seront préparés par la mise en place d’un régime conduisant à des comorbidités en accord avec les recommandations données par le groupe de réflexion sur les modèles précliniques d’AVC. Les souris C57BL/6J utilisées pour cette étude seront âgées de 24 semaines (6 mois) avant les 3 mois de régime.

313 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une mutation reproduisant le syndrome NARP, avec un déficit de poids d'environ 20 %, un défaut cardiaque et musculaire, et subissent des prélèvements de sang et d'urine ainsi que des tests de force, d'équilibre et d'endurance, des IRM et des échocardiographies sous anesthésie, de un à six mois. Le porteur indique qu'aucune caractérisation détaillée de cette lignée n'a été faite auparavant et que l'objectif est d'identifier des déficits mesurables avant de tester des candidats médicaments. Sur le remplacement, il affirme que les modèles cellulaires restent incomplets pour un phénomène impliquant l'"organisme tout entier", et présente le recours à la souris comme une "nécessité".

Objectifs

Le syndrome NARP (Neuropathie Ataxie Rétinite Pigmentaire) est une pathologie rare qui affecte majoritairement les fonctions cardiaques, musculaires, et neurologiques et pour laquelle il n'y a toujours pas de traitement. Au laboratoire nous avons identifié des candidats médicaments efficaces sur les cellules de patients atteints du syndrome NARP. Afin de pouvoir proposer le traitement à des patients il nous faut prouver leur efficité dans un animal entier (ici le modèle murin). Avant, il est nécessaire d'identifier des déficits clairs dans le modèle souris du syndrome de Barth. Ce projet vise donc à caractériser finement le modèle souris du Syndrome NARP d'un point de vue cardiaque, musculaire, comportementale etc.... Ceci permettra ensuite de tester si les candidats médicaments efficaces en cellules de patients sont capables de diminuer les défauts mis en évidence dans l'étape de caractérisation du modèle murin. Si tel est le cas, on aura la preuve de leur efficacité dans un animal entier. L'objectif ultime étant de proposer les candidats médicaments efficaces dans les cellules de patients et le modèle murin du syndrome NARP à des patients atteints du syndrome NARP.

Bénéfices attendus

Avant de tester des candidats médicaments, il est nécessaire de caractériser la lignée murine, modèle du syndrome NARP, dans nos animaleries afin d'identifier les meilleurs paramètres pour les futurs tests médicamenteux. Cela n'a jamais été fait auparavant de manière détaillée. Seront analysés, le comportement, le poids, la fertilité, les portées, les avortements spontanés, la mortalité périnatale, l'acidose, la force musculaire, l'endurance, la coordination, les fonctions cardiaques, les fonctions mitochondriales sur tissus et des dosages sanguins et urinaires.

Procédures

Prélèvements sanguins et urinaires aux âges de 1 mois, 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excédera pas 10 minutes. Tests comportementaux (force musculaire, motricité, équilibre et endurance) aux âges de 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 15 minutes. IRMs et echocardiographies aux âges de 2, 4 et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 30 minutes et les souris subiront des anesthésies.

Impact sur les animaux

Des nuisances liées aux souris présentant un phénotype dommageable peuvent être attendues. Comme d'autres modèles murins similaires (avec des déficits mitochondriaux) nous pouvons attendre, à l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents, un défaut cardiaque et un défaut musculaire. Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. L'analyse par IRM et échocardographie nécesite une anesthésie. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données IRM ou échocardiographiques. Le suivi des performances sur tapis de course, rotarod ou grip test teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement terminaux de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de caractériser à différents niveaux le modèle murin.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires eucaryotes pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome NARP, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également avant de procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaires a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes cités. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8 animaux par groupe. Afin de palier une éventuelle mort prématurée des animaux (suite à une blessure par exemple), nous prévoyons 20-25 pourcents d’animaux en plus, soit 10 souris par groupe.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure chargée du Bien Etre des Animaux (SBEA), les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 1 fois par semaine. Si l'animal perd entre 10 et 15 pourcents par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 25 pourcents l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Nous raffinons nos expérimentations en utilisant les animaux de chaque groupe pour recueillir plusieurs types de données. Sur chaque animal, l’ensemble des organes et tissus pouvant être recueillis sont prélevés afin d’anticiper les expérimentations futures. Pour toutes les procédures, les animaux seront observés quotidiennement, et les points limites seront évalués en détail: Plaie/Traumatisme, Comportement/Mouvement, Aspect général, Evolution pondérale. Un score sera attribué, qui déterminera les traitements/observations à suivre: Score 0-2 = aucune douleur => pas de traitement. Score 3-5 = Observation plus importante et gel diet et croquettes humides au fond de la cage. Score 6-7=douleur légère à modérée=>Nettoyer d'éventuelles plaies et injection en sous cutanée d'un anti douleur et euthanasie si pas d'amélioration sous 24H. Score 8-9 = euthanasie de l'animal pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. Les animaux seront transférés dans différentes animaleries selon les analyses. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquate et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des cages de transport adaptées contenant copeaux, cotons et nourritures. Les souris contrôles seront toujours séparées des souris modèle de la maladie. Les transferts seront effectués une semaine avant les analyses pour laisser un temps d'acclimatation dans la nouvelle animalerie.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99 pourcents d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. Les animaux seront suivis de leur naissance (mortalités, suivi des portées, génotypage, avortements spontanés) à l'âge de 2 ans. Les animaux seront caractérisés dès l'âge de 10 jours pour un suivi de poids hebdomadaire, aux âges de 2, 4 et 6 mois pour des tests d'endurance, de force musculaire, de coordination et de fonction cardiaque et aux âges de 1, 2 ,4 et 6 mois pour des dosages sanguins et urinaires, et des prélèvements d'organes.

270 souris, 270 rats et 270 cochons d'Inde vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cette société de prestations teste pour ses clients des molécules dont elle indique ignorer la nature et les effets, administrées par des voies multiples, avec des prélèvements sanguins par ponction rétro-orbitale, sublinguale ou intracardiaque et des séjours de 24 heures en cage à métabolisme qui isolent chaque animal. Le porteur reconnaît qu'il lui est difficile d'anticiper les nuisances puisqu'il ne connaît pas les composés testés. Il conclut que l'absence de modèle in vitro rend le recours à l'animal "incontournable" et fixe six animaux par groupe d'après quinze ans d'expérience, sans test statistique.

Objectifs

Ce projet approuvé par la direction de la société permettra d’évaluer l’absorption, la distribution et le métabolisme de candidats médicaments dans l’organisme après administration afin d’obtenir des données de pharmacocinétiques et pharmacodynamie. Etant une société de prestations de service, nous testons les molécules de nos clients dont nous n’avons aucune connaissance sur le type/famille de molécule. Cependant, ces molécules seront testées dans le cadre de la recherche de pathologies rénales, urologiques, oncologiques, gastro-entérologiques…nos principales thématiques de recherche.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de récolter du matériel biologique (sang, organes, urines, fecès, salive….) afin d’avoir des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques de candidats médicaments. Ces différentes données, obtenues au tout début des études pré-cliniques, permettront par la suite d’adapter les doses et la fréquence d’administration des composés dans des études plus complexes (pouvant mimer une pathologie).

Procédures

Les animaux seront traités par des molécules par différentes voies possible (per os, intrapéritonéale, intra-veineuse, sous-cutanée, intradermique, intra-vésicale…). Ces gestes sont en général rapides et durent moins d’une minute/animal. Les animaux pourront être anesthésiés pour certains gestes ou prélèvements (gazeuse : isoflurane ou fixe : xylazine/kétamine). Ces anesthésies devraient être rapides et ne pas durer plus de 1 heure (pour les administrations intra-vésicales). Des prélèvements sanguins sur animal vigil ou anesthésié au niveau des veines caudales, saphènes, de la veine abdominale, en sublinguale, submandibulaire, rétro-orbital ou intracardiaque pourront être réalisés. Ces gestes sont rapides et durent moins de 5 min. Les animaux pourront être mis dans les cages à métabolisme et seront donc isolés de leurs congénères quelque temps (24H maximum).

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux. Cependant, les animaux vont être manipulés et vont recevoir des administrations de produits, pouvant engendrer un stress et une légère douleur. Les animaux pourront être mis dans des cages à métabolisme, et donc être isolés temporairement de leurs congénères (24 heures maximum), avoir des prélèvements sanguins, être anesthésiés…tout cela peut provoquer une nuisance.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés car des prélèvements de sang et d’organes seront réalisés.

Remplacement

Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent fournir du matériel biologique afin de réaliser différents tests de pharmacocinétique ou pharmacodynamie. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. En général, ces études préliminaires de pharmacocinétique et pharmacodynamie ne sont pas réalisées sur un grand nombre d’animaux car ce sont des études préliminaires aux tests pré-cliniques. Aucun test statistique n’est utilisé pour déterminer le nombre d’animaux par groupe. Cependant, de par notre expérience de plus de 15 ans, nous savons qu’un nombre de 6 animaux par groupe est suffisant pour avoir des données fiables et statistiquement significatives. Dans une même étude, il sera rare que différentes espèces soient utilisées. Nous prévoyons de réaliser 3 études par an par espèce avec 18 animaux par étude.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Différents types d’enrichissement seront ajoutés aux animaux (coton, aspen brick (bout de bois), igloo en polycarbonate, tunnel, carré de coton…). Les procédures nécessitant une anesthésie seront réalisées avec des plaques chauffantes thermorégulées afin d'éviter une hypothermie à l'animal. Les méthodes utilisées pour récolter tout ce matériel biologique (par exemple les cages métaboliques avec une phase d’acclimatation pour réduire le stress) sont peu invasives et ne devraient pas provoquer chez l’animal un grand stress, ni de souffrance particulière et ne nécessitent donc pas l’utilisation d’antalgique. Tous les gestes techniques seront réalisés par du personnel compétent et qualifié diminuant ainsi les temps de contention et la souffrance ou le stress possible. Le personnel, sensibilisé au raffinement et à l’éthique animal, pourra modifier quelques protocoles, enrichissement des cages…. en fonction des nouvelles techniques mises au point et nouvelles obligations dans le but d’améliorer les conditions des animaux de laboratoire. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids supérieure à 20%, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … . Si un animal présentait un signe de douleur, de mal-être, il serait isolé dans un premier temps, hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Dans notre laboratoire, nous utilisons ces 3 espèces (rat, souris et cobaye) selon les modèles et aires thérapeutiques employés. Ces trois espèces seront donc utilisées pour réaliser des études de pharmacocinétique et pharmacodynamie. Les animaux utilisés seront très dépendants des demandes de nos clients et de la thématique étudiée. Nous essayerons le plus possible d’utiliser des animaux âgés de 7 à 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines. Cependant, l’utilisation d’animaux plus jeunes ou plus âgés sera possible.

410 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour mettre au point un modèle de lésion rénale aiguë. Chaque animal subit une microchirurgie d'environ quarante-cinq minutes avec ablation d'un rein et interruption de la circulation de l'autre pendant trente minutes, suivie de prélèvements sanguins quotidiens et de traitements pendant sept jours. Le porteur liste parmi les effets attendus des lésions rénales, des douleurs et une anesthésie profonde pouvant entraîner la mort des animaux âgés. Il justifie ce modèle par le taux d'échec des essais cliniques, qu'il attribue à une "faible pertinence" des modèles existants, et affirme que les modèles in vitro ne peuvent "substituer" les tests sur animaux.

Objectifs

10% de la population mondiale est atteinte de maladie rénale chronique (CKD). Cette condition pathologique caractérisée par de nombreuses atteintes tissulaires au niveau rénale conduisent à la perte de fonction de l’organe et des décès prématurés due à des problèmes cardiovasculaires. Cependant, les mécanismes et facteurs impliqués dans l’accélération de la maladie sont encore mal identifiés. A ce jour, il n’existe encore aucune thérapie permettant de soigner ou de limiter l’avancement des maladies rénales chroniques. Malgré une intensification des efforts de recherche dans le développement de nouveaux médicaments, les industriels pharmaceutiques font face à un taux très important d’échec dans les phases de tests cliniques sur l’Homme. Une raison avancée à ces taux d’échec clinique élevés est une faible pertinence des modèles expérimentaux utilisés lors des phases précliniques. En effet, les modèles utilisés couramment ne permettent pas de reproduire les conditions observées chez l’Homme et manque de pertinence physiologique. L'objectif de ce projet est de mettre en place un nouveau modèle expérimental de souris afin d'évaluer l'efficacité de médicaments ciblant les lésions rénales aïgues. Le modèle de souris développé dans ce projet permettra d'améliorer la prédiction d'efficacité de nouveaux candidats médicaments afin de limiter la progression des maladies rénales chez l'Homme.

Bénéfices attendus

La mise en place et le succès de ce projet permettra de proposer un nouveau modèle expérimental in vivo qui exprime une série de désordres physiologiques retrouvés chez l’Homme. Ainsi les tests précliniques d’efficacité de nouveaux candidats médicaments pour le traitement des maladies rénales, pourront être réalisés sur un modèle pertinent d’un point de vue physio-pathologique avec le but de réduire le taux d’échec d’efficacité des candidats médicaments pendant les phases cliniques.

Procédures

Chaque animal subira : - 1 seule procédure de microchirurgie d'une durée totale d'environ 45 min: Laparotomie, ablation du rein droit, puis clampage de l'artère et de la veine rénale du rein gauche pendant 30 minutes (ischémie). Déclampage puis suture de l'abdomen (muscle et peau). - prélèvements sanguin quotidien (sur 7 jours) de 20 à 100 ul de sang par légère incision au niveau de la queue ou via une ponction de la veine faciale (durèe environ 1 min par animal). - traitements quotidien par les candidats médicaments pendant 7 jours consécutifs (durèe inférieure à 1 min par animal).

Impact sur les animaux

Les animaux qui interviendront dans ce projet subiront des effets indésirables liés à la procédure de microchirurgie. Ces effets indésirables ont été classés par ordre décroissant de gravité et de probabilité : - Lésions du rein ayant subit la procédure d’ischémie reperfusion. La conséquence est une réduction significative de la fonction de ce rein après quelques semaines. - Douleurs liées à la microchirurgie, notamment à l’incision cutanée et musculaire pour l’accès au rein à clamper - Anesthésie profonde pouvant entraîner la mort chez les animaux âgés - Perte de poids après chirurgie - Lésions vasculaires au niveau du clamp pouvant entraîner une mauvaise reperfusion de l’organe

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort et disséqués afin de collecter le rein pour des analyses histologiques.

Remplacement

En parallèle des modèles expérimentaux basés sur l'utilisation d'animaux (rongeurs), nous travaillons au développement de modèles in vitro basés sur la culture de cellules rénales humaines. Cependant, ces modèles in vitro ne peuvent pas substituer l'importance des observations réalisées par les tests sur animaux. En effet, la complexité physiologique et les réponses systémiques aux candidats médicaments ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Réduction

Les procédures chirurgicales et expérimentales seront basées sur les protocoles détaillés dans la littérature. Sur la deuxième phase de test de produits pharmaceutiques, un nombre de 13 souris par groupe de composé testé sera utilisé. Ce nombre a été déterminé en fonction du risque de perte lors de la procédure chirurgicale, et de l'efficacité hétérogène des interventions chirurgicale. Celui-ci est estimé à 30% de perte ou absence de réponse. De ce fait, avec 13 souris par groupe au départ, nous pourrions envisager un nombre de 9 souris par groupe en fin de procédure de traitement. Ce nombre sera suffisant pour effectuer des observations scientifiquement et statistiquement pertinentes. Les effets des candidats médicaments seront évalués par comparaison avec les groupes traités par le solvant seul. Les données enregistrées seront analysées par des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Afin de réduire au maximum les douleurs et l'inconfort aux animaux, un manipulateur expérimenté en microchirurgie sur rongeurs sera responsable de la procédure chirurgicale. De plus, les procédures de microchirurgies seront réalisées sous anesthésie générale. L’animal recevra aussi une injection sous-cutanée d’analgésique pour réduire les douleurs au réveil. Un control quotidien avant, pendant et jusqu'au terme de l'experimentation sera effectué par les expérimentateurs afin de garantir la propreté des cages, des quantités suffisantes d'eau et de nourriture ainsi qu'un enrichissement adéquat dans les cages d'hébergement (igloo polycarbonates autoclavables et réutilisables + carton) . Pendant les périodes de traitement par les candidats médicaments, les expérimentateurs conduiront un suivi quotidien du poids corporel, de la comsommation d'eau et de nourriture ainsi que de l'état général des animaux. Ces observations seront enregistrées et analysées. Les animaux qui auront perdu plus de 20% de leur poids initial ou dont l'état général est dégradé (isolement, baisse d'activité, entretien de la fourrure, perte de poils, respiration anormale) sur 2 jours consécutifs seront retirés de l'expérimentation et mis à mort. A noter que les candidats médicaments qui seront testés pour leur efficacité auront déjà été évalués pour leur toxicité au préalable (études in vivo de Tox. et PK/PD faites par les concépteurs des molécules), et que le risque d'effets secondaires liés au traitement est minime. De plus, l'étude sera conduite par des personnels qualifiés et formés au respect des conditions du bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée par la communauté scientifique dans le cadre de l’étude de la fonction rénale après une ischémie-reperfusion. L’avantage de ce type d’animal est qu’il répond très bien à la procédure d’uninephrectomie + ischémie-reperfusion et constitue un excellent mime pathophysiologique des conditions retrouvées chez l’Homme. De plus, grâce à leur système immunitaire spécifique, les souris ne présentent pas de risque d’infection postopératoire. La procédure sera réalisée sur des animaux disponibles auprès d’élevages agrées (Charles River ou Janvier laboratory). Les animaux utilisés auront atteint l'age adulte, c'est à dire plus de 8 semaines. Le choix de cet âge est basé par la procédure décrite par des études scientifiques précedentes, qui ont identifié que 8 semaines représente l'âge optimal pour la réussite de cette procédure de microchirurgie.

496 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après trois mois de régime gras destiné à induire un surpoids, elles subissent un test d'intolérance au glucose par injection, puis une chirurgie reproduisant un accident vasculaire cérébral, suivie de tests comportementaux non précisés à sept et vingt-et-un jours. Le porteur indique attendre une douleur peropératoire, une perte sensorimotrice, une perte de poids et une déshydratation. L'objectif est de comprendre le rôle des comorbidités liées à l'âge dans l'AVC, le porteur justifiant le recours à l'animal par des mécanismes qui "ne peuvent s'envisager que dans un organisme entier".

Objectifs

Les maladies cardiaques sont l'une des principales causes de problèmes de santé et de décès chez les personnes âgées, en raison des problèmes de santé associés (vieillissement de leurs artères et troubles métaboliques). Ce projet de recherche se concentre sur l'accident vasculaire cérébral, maladie de plus en plus fréquente chez les personnes de plus de 60 ans. Aujourd’hui aucune thérapie ne permet une bonne prise en charge de la maladie. Chez ces patients, les comorbidités, telles que l’hyperglycémie et l’hyperlipidémie sont des facteurs de risque bien identifiés, aggravant les conséquences de la maladie. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre et caractériser le rôle des comorbidités liées à l’âge dans la modulation de la réponse des mécanismes de réparation après la survenue d’un accident vasculaire cérébral. Nous utiliserons un modèle classiquement utilisé et qui est proche de l’accident vasculaire cérébral chez l’Homme. Par ailleurs, la prise en compte des problèmes de santé associés à l'âge est nécessaire pour déterminer l’impact de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cette étude, qui sera menée sur 2 établissements utilisateurs, permettra de mieux comprendre les caractéristiques de l'accident vasculaire cérébral dans le contexte de vieillissement et ses problèmes de santé associés dans l’optique d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des comorbidités dans les conséquences de l'accident vasculaire cérébral. Les bénéfices attendus concernent la progression des connaissances scientifiques, connaissances qui pourront être appliquées à l'Homme et ce grâce à la prise en compte de la réalité de la clinique (âge et comorbidités).

Procédures

Après 3 mois d’administration d’un régime riche en protéines et en lipides et pauvre en glucides, les souris suivent un test d’intolérance au glucose (une injection de glucose intrapéritonéale et mesure de la glycémie). Cette première intervention sera réalisée dans un des 2 établissements utilisateur (EU1 et EU2). Puis, nous mimerons l’accident vasculaire cérébral en utilisant un modèle in vivo (chirurgie de 10 min) au sein de l'EU2. Les effets du régime sur la réponse après AVC seront analysés à J7 et J21 après la mise en place du modèle d’AVC à l’aide de tests de comportement.

Impact sur les animaux

L’âge (animaux âgés de plus de 6 mois) et le changement de l’alimentation induit une prise de poids (animaux de 35 – 60g). L’injection intrapéritonéale de glucose et la mesure de la glycémie sont également une nuisance pour l’animal. Le modèle d’AVC induit une douleur peropératoire et perte sensorimotrice. Une perte de poids et déshydratation peuvent également être attendues. Les tests comportementaux peuvent également être une source de stress pour les animaux.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour récupérer les tissus et faire les analyses histologiques, protéiques et génomiques

Remplacement

Notre projet a démarré par des études in vitro rapportant les effets d’un modèle de stress métabolique sur les fonctions de cellules endothéliales de vaisseaux cérébraux, notre but est maintenant d’étudier l’ischémie cérébrale dans ce contexte de stress métabolique (comorbidités), qui met jeu en des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants puisque l'étude des conséquences métaboliques du vieillissement et son retentissement sur le vaisseau et sa fonctionnalité, avec ou sans traitement, ne peut s'envisager que dans un organisme entier.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant en accord avec notre expérience sur ces modèles et un calcul de puissance. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront une analgésie en pré- per- et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 48h. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse). En post-chirurgie une attention particulière sera portée aux animaux jusqu’au réveil. Un suivi clinique et une surveillance des animaux seront réalisés à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et/ou mis à mort selon le score. Enfin, le bien-être animal sera aussi amélioré par l’enrichissement du milieu. Les cages seront pourvues de coton, bâtonnets de bois, igloo. Les souris sont placées dans une pièce au calme. Une chambre de réveil thermostatée sera utilisée en post-chirurgie. Le transport des animaux sera effectué en conditions ventilé et suivi de température.

Choix des espèces

Des études précédentes ont montré la pertinence du modèle souris pour étudier les maladies cardiovasculaires liées à l’âge et ses comorbidités. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’accident vasculaire cérébral (AVC) et pour lequel les outils sont nombreux pour le suivi de cette étude et ultérieurement pour le suivi de cette pathologie (anticorps, imagerie, modèles génétiquement modifiés). L’AVC étant essentiellement une pathologie de l’âge adulte. Le choix du modèle sera réalisé en utilisant des animaux âgés d’au moins 6 mois, âge permettant de mimer la physiologie du vaisseau à l’âge adulte. Pour prendre en compte les comorbidités liées au vieillissement, les animaux seront préparés par la mise en place d’un régime conduisant à des comorbidités en accord avec les recommandations données par le groupe de réflexion sur les modèles précliniques d’AVC. Les souris C57BL/6J utilisées pour cette étude seront âgées de 24 semaines (6 mois) avant les 3 mois de régime.

313 souris génétiquement modifiées pour modéliser le syndrome NARP vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements de sang et d'urine à quatre âges, des tests de force musculaire, de motricité, d'équilibre et d'endurance, ainsi que des IRM et échocardiographies sous anesthésie, le porteur attendant un déficit de poids d'environ 20 %, un défaut cardiaque et musculaire. L'objectif est de caractériser cette lignée avant de tester des candidats médicaments, une étape que le porteur décrit comme "jamais faite auparavant de manière détaillée". Sur le remplacement, il affirme que les modèles cellulaires restent "incomplets" et que le recours à l'"organisme tout entier" est une "nécessité".

Objectifs

Le syndrome NARP (Neuropathie Ataxie Rétinite Pigmentaire) est une pathologie rare qui affecte majoritairement les fonctions cardiaques, musculaires, et neurologiques et pour laquelle il n'y a toujours pas de traitement. Au laboratoire nous avons identifié des candidats médicaments efficaces sur les cellules de patients atteints du syndrome NARP. Afin de pouvoir proposer le traitement à des patients il nous faut prouver leur efficité dans un animal entier (ici le modèle murin). Avant, il est nécessaire d'identifier des déficits clairs dans le modèle souris du syndrome de Barth. Ce projet vise donc à caractériser finement le modèle souris du Syndrome NARP d'un point de vue cardiaque, musculaire, comportementale etc.... Ceci permettra ensuite de tester si les candidats médicaments efficaces en cellules de patients sont capables de diminuer les défauts mis en évidence dans l'étape de caractérisation du modèle murin. Si tel est le cas, on aura la preuve de leur efficacité dans un animal entier. L'objectif ultime étant de proposer les candidats médicaments efficaces dans les cellules de patients et le modèle murin du syndrome NARP à des patients atteints du syndrome NARP.

Bénéfices attendus

Avant de tester des candidats médicaments, il est nécessaire de caractériser la lignée murine, modèle du syndrome NARP, dans nos animaleries afin d'identifier les meilleurs paramètres pour les futurs tests médicamenteux. Cela n'a jamais été fait auparavant de manière détaillée. Seront analysés, le comportement, le poids, la fertilité, les portées, les avortements spontanés, la mortalité périnatale, l'acidose, la force musculaire, l'endurance, la coordination, les fonctions cardiaques, les fonctions mitochondriales sur tissus et des dosages sanguins et urinaires.

Procédures

Prélèvements sanguins et urinaires aux âges de 1 mois, 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excédera pas 10 minutes. Tests comportementaux (force musculaire, motricité, équilibre et endurance) aux âges de 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 15 minutes. IRMs et echocardiographies aux âges de 2, 4 et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 30 minutes et les souris subiront des anesthésies.

Impact sur les animaux

Des nuisances liées aux souris présentant un phénotype dommageable peuvent être attendues. Comme d'autres modèles murins similaires (avec des déficits mitochondriaux) nous pouvons attendre, à l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents, un défaut cardiaque et un défaut musculaire. Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. L'analyse par IRM et échocardographie nécesite une anesthésie. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données IRM ou échocardiographiques. Le suivi des performances sur tapis de course, rotarod ou grip test teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement terminaux de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de caractériser à différents niveaux le modèle murin.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires eucaryotes pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome NARP, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également avant de procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaires a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes cités. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8 animaux par groupe. Afin de palier une éventuelle mort prématurée des animaux (suite à une blessure par exemple), nous prévoyons 20-25 pourcents d’animaux en plus, soit 10 souris par groupe.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure chargée du Bien Etre des Animaux (SBEA), les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 1 fois par semaine. Si l'animal perd entre 10 et 15 pourcents par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 25 pourcents l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Nous raffinons nos expérimentations en utilisant les animaux de chaque groupe pour recueillir plusieurs types de données. Sur chaque animal, l’ensemble des organes et tissus pouvant être recueillis sont prélevés afin d’anticiper les expérimentations futures. Pour toutes les procédures, les animaux seront observés quotidiennement, et les points limites seront évalués en détail: Plaie/Traumatisme, Comportement/Mouvement, Aspect général, Evolution pondérale. Un score sera attribué, qui déterminera les traitements/observations à suivre: Score 0-2 = aucune douleur => pas de traitement. Score 3-5 = Observation plus importante et gel diet et croquettes humides au fond de la cage. Score 6-7=douleur légère à modérée=>Nettoyer d'éventuelles plaies et injection en sous cutanée d'un anti douleur et euthanasie si pas d'amélioration sous 24H. Score 8-9 = euthanasie de l'animal pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. Les animaux seront transférés dans différentes animaleries selon les analyses. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquate et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des cages de transport adaptées contenant copeaux, cotons et nourritures. Les souris contrôles seront toujours séparées des souris modèle de la maladie. Les transferts seront effectués une semaine avant les analyses pour laisser un temps d'acclimatation dans la nouvelle animalerie.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99 pourcents d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. Les animaux seront suivis de leur naissance (mortalités, suivi des portées, génotypage, avortements spontanés) à l'âge de 2 ans. Les animaux seront caractérisés dès l'âge de 10 jours pour un suivi de poids hebdomadaire, aux âges de 2, 4 et 6 mois pour des tests d'endurance, de force musculaire, de coordination et de fonction cardiaque et aux âges de 1, 2 ,4 et 6 mois pour des dosages sanguins et urinaires, et des prélèvements d'organes.

220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation pulmonaire leur est induite par injection de bléomycine ou de LPS, puis elles reçoivent un agent de contraste par un cathéter posé sous anesthésie pour tester une technique d'imagerie à particules magnétiques. Le porteur indique que la fibrose pulmonaire peut provoquer des difficultés respiratoires, de la prostration et une perte de poids, les animaux perdant plus de 15 % de leur poids étant tués. Il affirme que les procédures ont un caractère de stricte 'nécessité' et ne peuvent pas être remplacées par des méthodes sans animaux vivants.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de tester in vivo l'imagerie à particules magnétiques (MPI) pour le diagnostic précoce de l'inflammation pulmonaire en utilisant un nouvel agent de contraste composé de microparticules de polydopamine couplées à un anticorps anti-VCAM-1. Ces molécules d’adhésion endothéliales VCAM-1 sont exprimées à la surface des cellules endothéliales lors d’un épisode inflammatoire aigu ou chronique comme une inflammation systémique, une atteinte rénale ou une maladie rénale chronique. Des tests préliminaires sur cet agent de contraste en imagerie à particules magnétiques ont montré que les propriétés magnétiques de cet agent de contraste permettaient une sensibilité de détection en MPI supérieur à celle de l’imagerie par résonance magnétique (IRM). D’autres part, des études in vitro et in vivo ont montré les propriétés biocompatibles et biodégradables de cet agent de contraste et il a été également démontré que cette stratégie était efficace pour cibler les cellules endothéliales activées humaines, ouvrant la voie à une potentielle translation en clinique. L'utilisation de cet agent de contraste semble donc être un outil prometteur pour la détection en pré-clinique de l'inflammation en MPI et nous prévoyons de tester dans ce projet la capacité de détecter l’inflammation pulmonaire dans différents modèles chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce nouvel agent de contraste a montré une sensibilité et une spécificité élevées pour détecter l'inflammation in vivo dans le cerveau, les reins et la muqueuse intestinale. Nous savons que ces microparticules ont un signal en MPI du fait de leur propriété magnétiques spécifiques. Il est donc attendu de la technique d'imagerie MPI utilisant les M3P qu'elle puisse elle aussi permettre d'imager de manière ultra-sensible, spécifique et précoce l'inflammation pulmonaire par rapport aux animaux contrôles n'ayant pas d'inflammation.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : o Induction du modèle inflammatoire par une unique injection d’un produit induisant l’inflammation (durée : inférieure à 10min) o Pesée lors des manipulations (durée : inférieure à 5 min) o Pose d’un cathéter sous anesthésie profonde (durée : environ 15min) o Imagerie MPI avec injection de produit de contraste (durée : environ 30min).

Impact sur les animaux

Les deux modèles présentés peuvent en effet induire des effets indésirables sur les animaux. La bléomycine est un agent anti-cancéreux dont un de ces effets secondaire est d’induire de la fibrose pulmonaire, d’où son utilisation courante en recherche préclinique pour l’induction d’inflammation pulmonaire. Le LPS est un sucre que l'on trouve à la surface des bactéries dont l'injection simule la présence de bactérie et induit ainsi une réaction immunitaire forte. Il est important de noter que la dose de LPS choisie pour ce projet (100 µL à 0.5 mg/mL) n'induit pas de mortalité chez les souris. L'induction de l’inflammation pulmonaire et la fibrose pulmonaire peuvent entrainer des difficultés respiratoires. Dans ces deux modèles, les animaux peuvent être en mal-être qui peut alors être repéré par de la prostration, une inactivité dans la cage, un arrêt de la prise alimentaire et de boisson suivie d'une perte de poids. Lors du protocole d'imagerie MPI, celui-ci se déroulera sous anesthésie générale des animaux mais la pose du cathéter veineux pour l'administration de l'agent de contraste peut provoquer un hématome.

Devenir

Tous les animaux de cet étude sont mis à mort à l’issue des 2 procédures.

Remplacement

Des tests in vitro ont été réalisées sur l'gent de contraste en imagerie à particules magnétiques (utilisation de "fantômes") et ont permis de montrer que les propriétés magnétiques des microparticules conféraient un signal spécifique en imagerie à particules magnétiques (MPI). Toutefois, les expériences in vivo ne peuvent pas être totalement remplacées par des études in vitro car il est nécessaire d'estimer l'affinité de l'agent de contraste pour les molécules d'adhésion endothéliales exprimées en conditions inflammatoires ainsi que les temps de ciblage et de détectabilité de l'agent de contraste en imagerie MPI lorsqu'elles sont injectées dans un organisme. D'après les études pilotes citées, on sait que l'agent de contraste cible efficacement l'inflammation dans d'autres pathologies et l'on souhaite savoir si ce ciblage sera détectable en imagerie MPI pour révéler l'inflammation pulmonaire. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures par rapport à nos précédents projets, ayant utilisé des protocoles d'imagerie similaires pour évaluer l'inflammation dans d'autres tissus avec les mêmes types de microparticules. Dans ces deux études précédentes il a été montré que 5 animaux par modèle étaient suffisants pour obtenir une différence significative du signal en imagerie par résonance magnétique. Les données de ces 5 animaux étaient comparées à 5 autres animaux du groupe contrôle. Il semble intéressant d'étudier l'effet sexe sur le développement de ces modèles d'inflammation ainsi que l'efficacité du ciblage de l'agent de contraste et de leur détection par imagerie photoacoustique, nous prévoyons donc de réaliser chaque modèle sur 5 souris mâles et 5 souris femelles. Avec les animaux contrôles (recevant des injections de liquide physiologique), cela fait donc 20 animaux par modèle. De plus, nous aurons besoin d'évaluer la sensibilité et la spécificité de la méthode en utilisant des microparticules non ciblées, en utilisant 20 autres animaux (10 animaux pour chaque modèle d'inflammation (5 mâles et 5 femelles) et 10 animaux contrôles (5 mâles et 5 femelles aussi) ), amenant au total à 40 animaux par modèle. Ces effectifs ont été confirmés par un calcul de taille d'échantillons avec pour paramètres : moyenne anticipée groupe 1 (modèle) = 10 +/- 5 et groupe 2 (contrôle) = 1, alpha = 0.05, ayant donné un résultat de 5 animaux nécessaires par groupe. Les moyennes de signal obtenues seront analysées par un test de Mann-Whitney.

Raffinement

Les animaux auront le temps d’acclimatation d’une semaine. Un enrichissement du milieu d'hébergement des animaux de type boite à œuf, tunnel PVC et/ou igloo PVC est prévu. A partir du début de la mise en place des modèles, une attention particulière sera accordée à l'état général des animaux, notamment pour vérifier l'absence d'apparition de signes de détresse ou de douleur extérieure (points limites cités plus loin) ainsi que la bonne prise alimentaire et de boisson. Une coupelle de croquettes humides aura été préalablement placée dans la cage afin de permettre aux animaux malades de s'alimenter et de s'hydrater plus facilement. Une attention particulière sera aussi accordée à l'évolution de la masse corporelle avec une pesée quotidienne afin de vérifier que la perte de poids n'est pas supérieure à 15%. Après induction des deux modèles, une surveillance sera faite 15 minutes après les instillations (LPS ou bléomycine), puis 1 heure après et 2 fois par jour jusqu’à l’euthanasie des animaux. De plus, pendant la durée des modèles et avant la perfusion intracardiaque réalisée pour le prélèvement des organes d'intérêt (reins), la douleur des animaux sera réduite au maximum en veillant à couvrir ces temps d'étude par une analgésie. En amont de ce projet, pour limiter la douleur engendrée par l’intubation lors de l’injection intratrachéale, nous avons choisi de n'utiliser qu'une dose de LPS, connue pour ne pas induire de mortalité chez les souris. Les points limites suivants et les décisions prises en conséquence sont définis comme suit : Niveau 1 : diminution de l’activité dans la cage, réduction de l’interaction avec les congénères, absence de toilettage, dos vouté, rétrécissement de l’ouverture orbitaire, changement de position des oreilles et des moustaches (oreilles vers l’extérieur, moustaches vers l’avant ou vers l’extérieur) --> Augmentation de la surveillance (4 fois par jour). Niveau 2 : perte de poids de plus de 15 %, prostration dans la cage, absence de réaction au toucher, tremblements/convulsions, saignements rectaux --> Mise à mort de l’animal par administration d’une dose létale d’anesthésique.

Choix des espèces

D’un point de vue scientifique cette étude va permettre des recherches translationnelles ou appliquées menées pour le diagnostic d’un mauvais état de santé chez l'homme. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude d’un diagnostic positif d'inflammation cérébrale doit s’effectuer sur des modèles in vivo.