Troubles cardiaques
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Gestion de lignées de rongeurs génétiquement altérés
- Conservation des espèces
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Production de routine
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
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- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 25000
300 000 rongeurs vont être utilisés, 275 000 souris et 25 000 rats, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Chaque animal peut subir jusqu'à quatre biopsies de l'oreille ou de la queue et jusqu'à quatre prélèvements sanguins par jour, en plus du tatouage d'identification, et les lignées entretenues peuvent porter un phénotype dommageable dont le porteur admet ne pas toujours connaître l'impact avant caractérisation. À l'issue, les animaux sont soit expédiés, soit tués, le porteur précisant qu'ils "appartiennent au scientifique" et ne peuvent être replacés. L'objet du projet est de fournir des rongeurs génétiquement modifiés à des laboratoires, activité présentée comme un bénéfice en soi puisqu'elle améliore la "qualité génétique, sanitaire et zootechnique" des animaux livrés.
Objectifs
Ce projet a pour objectif la caractérisation et/ou l’élevage de lignée de rongeurs génétiquement modifiées qui développent des traits physiologiques spécifiques, et parfois pathologiques (appelés phénotypes) dû à la mutation des gènes ou encore la réalisation d'une biopsie (prélévement d’un morceau d’oreille le plus souvent, ou de queue) en plus d’une identification par tatouage des animaux. Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés comme modèle expérimental pour la recherche (compréhension de maladies d’origine génétique, par exemple la mucoviscidose, l’hémophilie ou encore la myopathie dans différents domaines : facteurs de risque, mécanismes physiopathologiques, essais thérapeutiques, ...) ou pour le développement de médicaments. A la réception ou à la création de lignées génétiquement modifiées, si nous ne connaissons pas l’impact de la mutation génétique sur l’animal, une caractérisation de la lignée sera réalisée afin d'évaluer le bien-être animal et permettre sa gestion optimale, sa prévention ou son traitement adéquat. Si l’impact de cette mutation est avéré et connu, la gestion de cette lignée y sera adaptée par la définition / surveillance des possibles signes cliniques ainsi que leur prévention et traitement. Pour toute lignée transgénique, il est important de savoir si l’animal est porteur ou non de la mutation génétique, pour cela, une biopsie de taille réduite peut être réalisée qui permettra d’extraire l’ADN de l’animal et ensuite de vérifier si l’animal à la mutation dans son ADN. Enfin, certaines lignées transgéniques sont induites par une hormone. Pour induire cette mutation d’intérêt, une injection de l’hormone pourra également être réalisée. Pour ce projet, nous comptons 300 000 animaux (ajout de 10% en prévision de la hausse d’activité) répartis entre 500 et 600 projets différents. Entre 15- 20% de ces projets concerneront des lignées dont une partie des animaux pourront exprimer des phénotypes parfois pathologiques de leur mutation.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux transgéniques (avec un statut génétique et sanitaire connu) qui leur permettront de réaliser leurs études sur des organismes entiers et vivants. Ainsi, le bénéfice de ce projet sera de permettre une évaluation et une prise en charge des nuisances causées par la mutation génétique des lignées génétiquement altérées et une standardisation et raffinement des méthodes de prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique de ces lignées. Le tout permettra d’avoir une meilleure maitrise de la production et de la qualité génétique, sanitaire et zootechnique des animaux génétiquement altérés à fournir aux scientifiques pour leurs expérimentations.
Procédures
Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis par animal : A maximum 4 biopsies (à l’oreille préférentiellement ; à la queue sur justification scientifique), acte d’une durée maximale d’une minute, à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale d’une minute. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.
Impact sur les animaux
Expression d’un phénotype dommageable et des signes cliniques associés. Douleur, signes cliniques ou stress exprimé pendant l’évaluation Bien Etre Animal. Douleur et stress associés à une biopsie par méthode invasive (4 biopsies maximum, oreille ou queue) en plus d’une identification. Douleur et stress associés à un prélèvement sanguin. Douleur, stress et perte de poids dûs aux contentions. Douleur, stress et perte de poids dûs à l'injection du ligand.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux sont soit expédiés, soit mis à mort (les animaux appartiennent au scientifique et ne peuvent être replacés).
Remplacement
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. Ceci implique l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle et nécessite de disposer d’organismes vivants et entiers afin de pouvoir observer l’impact de l’altération génétique ou d’une molécule thérapeutique dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels projets sur des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux hébergé et mis en accouplement est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et nous mettons en œuvre des améliorations continues de nos méthodes de reproduction pour réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir un niveau d'élevage correspondant aux objectifs du projet (par exemple : Adaptation du sexe du reproducteur transgénique quand il est accouplé avec des animaux non transgéniques afin de maximiser les chances de fertilités (phénotype impactant la reproduction), ou d’éviter les mères dont le phénotype réduit les comportements maternels).
Raffinement
Les observations par le personnel technique permettent d’évaluer le stress, la douleur et la souffrance et d’y répondre au plus vite en faisant appel aux techniciens qualifiés et compétents et au vétérinaire. Si un point d’intervention est atteint, le technicien met en place un enrichissement adapté, un isolement et/ou si besoin la mise à mort de l’animal. En cas de signe clinique particulier, un suivi adapté est mis en place par des techniciens qualifiés et compétents au suivi vétérinaire des animaux. Les lignées connues pour pouvoir présenter un phénotype dommageable peuvent être observées et vérifiées de manière plus fréquente et plus spécifique avec des points limites et des raffinements précis. Ceci est évalué lors de la caractérisation du phénotype de la lignée ou en lien avec le scientifique en charge de cette lignée et le vétérinaire lorsque le phénotype attendu est connu. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score. En cas de détection d’un point limite terminal , l’animal est immédiatement mis à mort. Pour chaque phénotype dommageable, une mise en place de points limites non terminaux est adoptée afin de réaliser un suivi plus précis et plus optimum et la mise en place de soins adaptés (soutien nutritionnel, enrichissement spécifique, …). Si des animaux présentent des signes cliniques qui peuvent être atténués ou guéris à l’aide d’un traitement, avec accord du scientifique, ce traitement est mis en place. Les animaux déclarant un phénotype dommageable léger à modéré mais aptes à voyager seront expédiés avec une communication auprès de l’utilisateur final afin qu’il puisse gérer selon les normes éthiques et de bien-être animal leur réception et utilisation. En cas de prélèvements sanguins, les volumes prélevés ainsi que les périodes de récupération suivront la réglementation, les recommandations de la « Federation of European Laboratory Animal Science Associations » (FELASA) ainsi que les raffinements et bonnes pratiques internes. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisées que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. A chaque abord d’une voie vasculaire, un point de compression sera effectué le temps suffisant pour assurer l’arrêt du saignement. Une observation de l’animal sera réalisée au retour dans sa cage pour s’assurer de sa récupération immédiate.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les espèces pour lesquelles les manipulations génétiques sont développées, maitrisées et avec de nombreuses données scientifiques. De plus, ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables et permettent ainsi de mener de manière plus fiable des études en recherche et développement. Pour ce projet, nous devons caractériser et élever des animaux génétiquement modifiés qui peuvent développer des caractéristiques cliniques spécifiques à tout âge. Pour vérifier la présence de la modification génétique, une biopsie est réalisée le plus souvent (99% des cas) une semaine avant le sevrage ou au sevrage. Dans environ 1% des cas, une nouvelle biopsie à l’âge adulte peut être demandé pour vérification. Une analyse du sang peut également permettre de vérifier que l’animal présente les caractéristiques attendues, cette dernière se fait après 4 semaines d’âge minimum (adulte) Pour finir, la modification génétique peut être induite par l’injection d’une hormone, cette injection peut se faire à partir de 8.5j après la fécondation.
L’épimorphose par reprogrammation cardiomyocytaire pour réduire la fibrose et améliorer la fonction cardiaque chez un modèle porcin d’insuffisance cardiaque droite
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Opérés du thorax par incision latérale pour créer une insuffisance cardiaque droite, 22 cochons seront tous tués, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit trois anesthésies générales à deux, six et huit mois de vie, une ou deux interventions chirurgicales d'environ une heure, une ponction artérielle et des échocardiographies, avant l'explantation du coeur. Le porteur liste comme nuisances le risque d'hémorragie, la douleur de la thoracotomie dans les premiers jours, un risque infectieux pouvant imposer une reprise chirurgicale, et le stress des transports entre le laboratoire et la ferme d'hébergement. Il affirme que le recours aux gros animaux est "indispensable" pour une application clinique à court terme, tout en menant en parallèle des cultures d'organoïdes cardiaques qu'il présente comme un moyen d'éviter plus tard l'usage d'animaux.
Objectifs
1/ Terminer l’étude de notre thérapie cellulaire sur le rythme cardiaque. Une précédente étude a déjà inclus des animaux traités par des progéniteurs cardiaques, c’est à dire de très jeunes cellules engagées pour former de futures cellules cardiaques matures, administrés grâce à un patch appliqué sur la surface du ventricule droit. Afin de faire une analyse comparative du risque d’anomalies du rythme liées aux progéniteurs, il est nécessaire d’inclure des animaux non traités par cette thérapie cellulaire. 2/ Comprendre le processus de rajeunissement des cellules cardiaques de l’animal receveur (processus appelé reprogrammation cellulaire), déclenché par notre thérapie cellulaire en étudiant l’environnement autour de ces cellules. 3/ Tester dans notre modèle animal d’insuffisance cardiaque, certaines protéines impliquées qui seront administrés sous forme d’ARN messager. On évaluera la faisabilité, la sécurité et l'efficacité de cette technique moins invasive pour obtenir une réponse sur la fonction cardiaque équivalente à celle obtenue par l’administration directe de cellules souches.
Bénéfices attendus
Scientifique : ce projet permettra d’approfondir les connaissances sur les mécanismes d’action de la thérapie cellulaire utilisant les progéniteurs cardiaques qui sont de très jeunes cellules souches immatures engagées pour devenir de futures cellules cardiaques matures. Nos résultats, en découvrant une autre action de ces cellules souches greffées, pourraient ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques dans le traitement de l’insuffisance cardiaque (IC) par la découverte de médicaments induisant une reparation du muscle cardiaque. Médical : les perspectives sont d’initier à court terme un essai clinique pour traiter de jeunes patients adultes souffrant d’une IC sévère et évoluée secondaire à une défaillance du ventricule droit. Cette IC est observée dans le suivi à long terme de différentes malformations cardiaques. Certains de ces patients sont orientés vers la transplantation cardiaque. En cas de contrindication à la transplantation ou de délai d’attente du greffon trop prolongé, ces patients pourraient bénéficier de cette thérapie cellulaire afin de prévenir l’IC terminale conduisant au décès. La thérapie cellulaire pourraient être réalisée soit de façon directe par l’administration de patch ou de gel contenant les progéniteurs cardiaques appliqué sur le coeur, soit indirecte par le biais de médicaments produits grâce à l’ARN messager et ayant la même efficacité. Santé publique : l’IC droite des jeunes adultes atteints de malformations cardiaques congénitales apparait comme nouvel enjeu et priorité. En France, 7000 enfants/an naissent avec une cardiopathie dont 90% nécessitera une intervention à la naissance ou au cours des premières semaines/mois de vie. Grâce aux progrès de la prise en charge chirurgicale ces dernières décennies, 90% de ces patients atteignent maintenant l’âge adulte. En France, déjà 350 000 adultes et 4000 enfants naissant chaque année avec une malformation cardiaque complexe qui font croître de manière significative et régulière, (environ de 5% par an) cette population de patients. Un tiers d’entre eux ont des séquelles chirurgicales sévères et/ou des malformations cardiaque sévères qui nécessite pour certains à partir de 30-40 ans une transplantation du coeur en raison d’une insuffisance cardiaque terminale.Les difficultés/le délai d’obtention d’un greffon cardiaque et les moins bons résultats de la transplantation cardiaque dans cette population spécifique justifient la recherche d’alternatives thérapeutiques.
Procédures
Toutes les procédures décrites ci-dessous seront réalisées sous anesthésie générale après prémédication des animaux pour réduire leur angoisse. Néanmoins, tous les animaux devront subir 3 anesthésies générales (à 2 mois, 6 mois et 8 mois de vie afin de réaliser les étapes du protocole, soit selon les groupes 1 ou 2 interventions chirurgicales et une ponction artérielle. Chaque intervention dure environ 1 heure et est précédée d’une échocardiographie (durée 30 minutes environ). En Fin de protocole, les animaux seront euthanasiés selon une méthode conforme à l’Arrêté du 1er février 2013 : sous anesthésie générale
Impact sur les animaux
Les interventions chirurgicales pour créer la pathologie cardiaque et pour administrer la thérapie cellulaire par patch sont effectuées par incision latérale du thorax. Les nuisances sont liées au stress inhérent aux anesthésies générales, au risque d’hémorragie, ainsi qu’à la douleur induite par la thoracotomie dans les premiers jours post-opératoires et au risque infectieux essentiellement local au niveau de la cicatrice pouvant nécessiter une reprise chirurgicale ou des soins sous sédation; les transports entre le laboratoire et la ferme d’hébergement peut être une source de stress.
Devenir
L’euthanasie est rendue nécessaire en fin de protocole chez tous les animaux pour explanter le cœur et réaliser les différentes études tissulaires sur le myocarde.
Remplacement
L’utilisation des gros animaux est dans un premier temps indispensable dans la perspective d’une application clinique à court terme de cette thérapie cellulaire afin d’assurer une sécurité optimale pour le patient (modalité d’administration, tolérance rythmique); par ailleurs le porc a des caractéristiques cardiaques proches de l’Homme ce qui en fait un modèle idéal. Si l’utilisation des animaux est dans un premier temps indispensable dans ce projet préclinique avec un objectif clinique à court terme, une approche in vitro est réalisée parallèlement sur des organoïdes (cardioïdes) obtenu par une technologie de culture de cellules en 3D, conçus pour imiter le scénario potentiel in vivo et éviter ultérieurement l’utilisation des animaux. Les processus de rajeunissement et re- maturation des myocytes (la reprogrammation cellulaire) seront utilisées comme indicateurs avec les mêmes techniques d’étude que chez l’animal.
Réduction
L’étude actuelle étant inscrite dans la suite de notre projet initial, les groupes seront comparés aux animaux déjà utilisés dans nos précédentes études, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires. Le nombre d’animaux utilisé (N=22) a été déterminé par calcul statistique.
Raffinement
- Respect d’une période d’acclimation de 3 jours avant les procedures expérimentales. - Observations quotidiennes par une personne compétente basées sur l’apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales aux stimuli externes (peu enclin aux manipulations, tentative de fuite). Ces contrôles permettent de repérer tout animal malade ou blessé, d’en avertir le responsable du projet et de prendre les mesures appropriées. - Environnement ( balles, jouets en caoutchouc durs mastiquables...)adapté à chaque phase de l’expérimentation pour réduire l’angoisse des animaux - Procédures expérimentales réalisées par du personnel qualifié et expérimenté (chirurgiens séniors, cardiologues séniors, techniciens anesthésistes) permettant un temps interventionnel réduit au maximum. - Contrôle biquotidien en postopératoire par une personne compétente avec évaluation de la douleur. L’évolution du score (calculé selon les observations de l’animal et de tout mal être décelé) permet de noter l’amélioration ou l’aggravation de l’état de l’animal et de prendre les mesures appropriées. - Tout constat d’un mal- être est remonté au responsable du projet et au vétérinaire délégué pour des examens approfondis et traitements adaptés. Si la douleur, la souffrance et l’angoisse ne pouvaient être réduites à leur minimum (augmentation du score), une décision d’interruption d’expérimentation et/ou d’euthanasie sera prise. Des médicaments anesthésiques et antalgiques sont utilisés à chaque étape des experimentations.
Choix des espèces
Le niveau de chirurgie complexe nécessaire à la création de notre modèle ne peut pas être réalisé chez le petit animal. Ce projet étant en phase pré-clinique avec une perspective d’application à l’Homme à court terme, il doit être réalisé sur une espèce animale présentant des caractéristiques cardiaques anatomiques et physiologiques communes à l’Homme. Parmi les différentes espèces animales, le Porc a des paramètres physiologiques cardiaques comparables à ceux de l’Homme. Les animaux ont environ 8 semaines à la première intervention de création de la pathologie, en accord avec la pathologie humaine : en effet les patients atteints de certaines malformations cardiaques sévères sont opérés très jeunes, au cours des premiers mois de vie puis l’insuffisance cardiaque droite se développe chez les jeunes adolescents qui sont en phase de croissance. Chez le porc, la défaillance cardiaque s’installe progressivement après 4 mois d’évolution de la pathologie créée, conformément au développement de la pathologie chez l’homme et par rapport à la courbe de croissance du porc domestique.
Effets thérapeutiques des microvésicules dans un modèle d’ischémie-reperfusion coronaire chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Soumis à une ligature d'artère coronaire pour provoquer un infarctus, 192 rats seront tous tués, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. L'acte chirurgical dure une heure et s'accompagne d'injections intraveineuses, de sept mesures de pression artérielle dont certaines sur animal éveillé, et de mesures de température par voie rectale. Le porteur annonce pour l'ensemble des animaux une mobilité réduite, des douleurs post-opératoires et un stress lié aux manipulations, et prévoit un isolement en cage individuelle pendant les 24 heures suivant l'opération. Il décrit une surveillance de la douleur par score de grimace, orbites rétrécies, renflement du nez, oreilles rejetées en arrière, et affirme que la procédure a un caractère de "stricte nécessité" parce que la réponse immunitaire mobilise l'"organisme entier".
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires constituent l’une des premières causes de décès dans les pays développés. L’infarctus du cœur est déclenché par l’obstruction des artères coronaires qui alimentent le cœur en sang et donc en oxygène. Sans l’oxygène, les cellules du muscle cardiaque (myocarde) meurent rapidement et le cœur ne réussit pas à pomper suffisamment de sang pour répondre aux besoins du corps, ce qui peut conduire à l’arrêt du cœur. La restauration de l'apport sanguin au niveau des artères obstruées est essentielle pour réduire les conséquences de l’infarctus du myocarde. Une approche thérapeutique permettant la reperfusion est de favoriser la dilatation des artères coronaires. Nous avons démontré que l’utilisation de petites vésicules naturelles, appelées microvésicules (MV), portant à leur surface une protéine spécifique, sont capables d’améliorer la fonction vasculaire dans des modèles cellulaires. Cependant, ces modèles d’étude sont limités pour évaluer l’efficacité de ces MV dans l’amélioration de la fonction cardiaque. Ainsi, le but de ce projet est de déterminer si les MV sont capables de réduire les conséquences associées à l’obstruction des artères coronaires en les injectant après l’infarctus du myocarde dans un modèle de ligature d’artère coronaire chez le rat. L’expérimentation animale prévue dans ce projet permettra d’obtenir des données pour mieux comprendre les mécanismes protecteurs des MV ainsi qu’envisager leur utilisation comme un outil thérapeutique potentiel chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Démontrer l’innocuité et efficacité in vivo du traitement avec MV et valider leur participation dans la préservation ou l’amélioration de la fonction des cellules cardiaques lors d’un infarctus de myocarde. En plus, la confirmation des effets in vivo aidera dans la validation de ces MV comme un nouvel outil thérapeutique pour le traitement des conséquences de l’infarctus de myocarde chez l’Homme.
Procédures
Quatre interventions impliquant tous les animaux : induction d’un infarctus de myocarde (durée acte chirurgical : 1 heure), injection intraveineuse réalisée pendant l’anesthésie (durée de chaque injection < 5 minutes), mesure de la pression artérielle (5 minutes, 7 mesures), mesure de la température corporelle (< 1min, 2 mesures).
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les rats seront les suivants : 1) Mobilité réduite dans des cages à cause de l’acte chirurgical après l’induction de l’infarctus de myocarde ; 2) Douleurs post-opératoires à cause de l’acte chirurgical ; 3) Stress lié aux manipulations (prise de la pression artérielle sur animal éveillé, prise de la température au niveau rectal). Les effets indésirables concernent l’ensemble des animaux.
Devenir
A la fin du protocole, des prélèvements de tissus seront effectués sur les animaux euthanasiés. Il est nécessaire d'analyser la réduction de la taille de l'infarctus par études d'histologie dans le cœur pour valider les doses plus efficaces des MV.
Remplacement
La procédure expérimentale a un caractère de stricte nécessité et ne peut pas être remplacée par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, ce projet porte sur les effets des MV sur l’infarctus de myocarde, c'est à dire sur un coeur avec une artère ligaturée puis reperfusée et leur impact dans la fonction cardiaque ne peut se faire que sur des animaux vivants. Les mécanismes cellulaires mis en jeu lors d'un infarctus de myocarde font participer le tissu cardiaque en hypoxie mais également une réponse immunitaire de l'organisme entier.
Réduction
Nous avons réduit le nombre d’animaux à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats en utilisant des données préliminaires de notre laboratoire pour une procédure similaire de ligature coronaire et des études fonctionnelles au niveau cardiaque chez le rat. Également, afin de réduire le nombre d’animaux, plusieurs mesures seront réalisées sur un même animal.
Raffinement
Nous avons raffiné nos approches afin de réduire au minimum la détresse imposée aux animaux qui seront hébergés dans un milieu enrichi permettant de répondre à leurs besoins physiques et comportementaux. Une analgésie pré- et post-opératoire sera réalisée et renouvelée aussi souvent que nécessaire. L’état de santé des animaux sera donc évalué de façon régulière pendant les 24 heures après l’acte chirurgicale en observant leur comportement. Les indices pouvant suggérer une douleur au moyen du score de grimace (rétrécissement des orbites oculaires et yeux mi-clos, renflement du nez, renflement des joues, positionnement des oreilles vers l'arrière, changement de position des vibrisses) seront surveillés. En plus, plusieurs paramètres seront évalués (suivi des cicatrices, formation d’abcès, apparence physique, comportement, réponses comportementales aux stimuli) sur la base d’attribution de scores suivants (cicatrice sans saignement = score 0, cicatrice saignante = score 1, cicatrice inflammée = score 3, formation d'abcès = score 4, cicatrice nécrosée = point limite; apparence physique normale = score 0, pas de toilettage = score 1, poil ébouriffé = score 2; doleur post-opératoire = score 3, détresse cardiorespiratoire = point limite; comportement normal = score 0, prostration et apathie = point limite ). Après l’acte chirurgical, les rats seront placés pendant 24h dans des cages individuelles. Dans la cage, chaque animal aurait à disposition des tubes de carton pour se cacher, grimper et faciliter leur accès à la nourriture.
Choix des espèces
Ce projet vise à analyser les effets thérapeutiques des MV lors d’un infarctus de myocarde. À cette fin, le choix de l'espèce Rattus norvegicus est basé sur notre connaissance de ce modèle ainsi que la disponibilité de données dans la littérature associées à l’étude de modifications dans la taille de l’infarctus. Les rats seront utilisés à l’âge de 7-8 semaines auquel les animaux sont considérés comme adultes.
Effet du traitement de l’activateur de Sirt1 sur la pathologie CblG dans 2 lignées de souris ayant chacune une déficience en Méthionine synthase dans une organe cible (cerveau et cœur). EU1/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
324 souris seront tuées et 36 gardées pour entretenir les lignées, dans un projet qui teste le resvératrol contre une maladie génétique rare, la maladie CblG, à un niveau de souffrance modéré. Le gavage commence avant leur naissance, sur les mères gestantes, et se poursuit jusqu'au sevrage. Les souriceaux passent ensuite un examen d'imagerie sous anesthésie ou des tests comportementaux que le porteur qualifie de non douloureux, parmi lesquels un test de suspension, un test d'acuité visuelle et un labyrinthe aquatique. Les mises à mort sont programmées à 21 jours, 8 semaines et 6 mois, et les souris surnuméraires dépourvues de la mutation sont tuées dès le sevrage ou utilisées pour des dissections de formation.
Objectifs
La maladie CblG (Cobalamine G) est une maladie rare, moins d’un enfant sur 1.000.000 de naissances est atteint. La maladie se manifeste en général dès la naissance, mais des formes tardives (adolescence ou âge adulte) ont été décrites. Dans la plupart des cas, les patients présentent un retard du développement, des manifestations neurologiques (crises convulsives, encéphalopathie, hypotonie, troubles psychiatriques), anémie, mais les patients peuvent présenter des anomalies dans d’autres organes comme le cœur (malformation) ou le foie. La maladie peut être diagnostiquée dès la naissance grâce à la détection dans le sang d’une concentration élevée de la molécule nommée l’homocystéine et une diminution de la molécule nommée méthionine. Actuellement, le traitement est basé sur des injections quotidiennes de vitamine B12 associées à une supplémentation en méthionine afin de réduire la concentration d’Homocystéine et augmenter celle de la méthionine. Bien que ces traitements permettent l’amélioration des symptômes cliniques, ils sont inefficaces en qui concerne les troubles neurologiques. Un nouveau traitement impliquant la sirtuine Sirt1 pourrait être une nouvelle piste. Sirt1 est une protéine qui participe au bon fonctionnement de l'organisme (notamment le métabolisme central) dans plusieurs organes dont le cœur et le cerveau, elle exerce des effets protecteurs contre le stress cellulaire et l'inflammation. L’objectif de ce projet est de démontrer, sur le cœur ou le cerveau, l’efficacité du traitement avec un activateur de Sirt1 (resvératrol) chez un modèle de souris reproduisant cette maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer si l’utilisation de Resvératrol comme activateur de Sirt1 est efficace dans la prévention et le traitement des manifestations neurologiques et cardiaques de la maladie CblG. De plus, ce projet de recherche permettra une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans chaque organe atteint, coeur ou cerveau, grâce à l’utilisation de 2 types de souris génétiquement modifiées, ayant une protéine MTR déficiente (cause de la maladie) spécifiquement au niveau du coeur ou du cerveau.
Procédures
Les souris femelles gestantes seront traitées quotidiennement par gavage avec le Resvératrol ou le placebo dès le 8ème jour de gestation jusqu’au sevrage : un tiers des souriceaux subira un examen d’imagerie non invasif à l'âge de 20 jours, un autre tiers à 6 mois tandis que le dernier tiers sera soumis à des tests comportementaux non douloureux (3x16 animaux). Pour évaluer la fonction cardiaque nous testerons la force, l'agilité et le niveau d’exploration libre des souris par un test de suspension et un test du champ ouvert. Et pour l’étude du cerveau, nous réaliserons un test d’acuité visuelle, de tests de reconnaissance d'odeur et un labyrinthe aquatique pour tester les capacités de mémorisation.
Impact sur les animaux
Bien qu’elle ne soit pas douloureuse, la procédure de gavage est désagréable pour les souris. Elle peut entrainer un léger stress physique lié à la contention de l'animal. Ce stress va inéluctablement diminuer suite à l'habituation des souris, sur les manipulations répétées par le manipulateur. L'inconfort à l'introduction de la sonde se verra lui aussi diminuer de jour en jour au fil du protocole. Ce geste technique sera effectué par un zootechnicien expérimenté qui prend toutes les mesures nécessaires pour limiter la souffrance animale en pratiquant un geste rapide et sûr. De plus, la prise de poids étant effectuée 3 fois par semaine, les pertes de poids éventuelles, mais peu probables, seront un indicateur de signe de mal-être chez les animaux. La procédure de TEP sera intégralement réalisée par une équipe technique qualifiée dans un environ dédiée à ce type d’analyse, et les animaux seront plongés sous anesthésie durant toute la procédure. Malgré cela, cette étape pourrait déclencher un stress post-anesthésie.
Devenir
Maintien : Les souris surnuméraires présentant la modification génétique d'intérêt pour le maintien de la lignée seront conservées dès le sevrage. Mise à mort : A la fin de l’ensemble des procédures, toutes souris soumises à l'imagerie médicale ou aux tests comportementaux seront mises à mort à l’âge de 21 jours (48 souris), 8 semaines (48 souris) ou 6 mois (48 souris). De même, les souris génétiquement modifiées surnuméraires présentant d'intérêt pour la recherche seront également mises à mort à l'âge de 6 mois pour dissection et analyses biochimiques et histopathologiques. Les souris surnuméraires ne présentant pas la modification génétique pour le maintien de la lignée seront mises à mort dès le sevrage ou pourront servir à des formations internes (dissections et microdissections).
Remplacement
tôt dans la vie, laissant penser qu’un traitement précoce chez le nouveau-né ou même pendant la grossesse pourrait diminuer les manifestations cliniques chez le nouveau-né. Des études in-vitro ont déjà été menées sur des biopsies de la peau des patients, démontrant l’efficacité des activateurs de la protéine SIRT1 pour palier à la déficience de la protéine MTR. Cependant, ces études sont faites sur des sur biopsie de la peau de patients atteints par la maladie. Cependant les cellules de la peau ne reflètent pas la spécificité des organes atteints. C’est pourquoi, afin de valider l’efficacité du traitement par resvératrol, il est indispensable tester les effets sur les organes atteints par la maladie, nous souhaitons utiliser des animaux avec une déficience de la protéine MTR dans le cerveau et cœur (mère et progéniture). Pendant cette étude, des expérimentations non invasives seront réalisées chez la progéniture (imagerie cardiaque) pour mieux comprendre les conséquences de la carence en vitamine B12 dans chaque organe étudié, et une épreuve d’effort pour comprendre pourquoi les souris meurent à un âge précoce si la défaut est au niveau du cœur, et des tests comportementaux d'observation et non douloureux seront menés en parallèle pour savoir si un traitement réduit les manifestations neurologiques. L’ensemble des résultats sera étudié par informatique pour créer un modèle de « souris personnalisée » capable de prédire ce qui se passe dans l’organisme de la souris en cas de dérégulation ou de traitement, permettant ainsi de remplacer toute autre utilisation de souris dans certaines expérimentations, ou de limiter le nombre d’expérimentations grâce à ce modèle.
Réduction
Pour évaluer l’efficacité du Resvératrol sur la protéine Sirt-1 chez les patients CblG qui ont des troubles sévères dans différents organes essentiels tels que le cerveau ou le cœur, nous souhaitons utiliser 2 lignées de souris transgéniques qui expriment la maladie dans ces 2 organes cibles, et les étudier à 3 périodes différentes de la vie (sevrage à 21 jours, maturité sexuelle à 8 semaines et début du vieillissement à 6 mois). Afin d’assurer une étude statistique fiable nous inclurons 16 animaux par groupe d’étude, pour chaque tranche d’âge. Ces souris transgéniques seront traitées quotidiennement avec le médicament (ou placebo) par gavage durant la gestation jusqu’à la veille de la mise à mort, puis durant la lactation à partir de 2 jours post-naissance et jusqu’à l’âge de 21 jours. Ce projet nécessitera 72 femelles dont la moitié sera accouplée à 12 mâles portant la mutation au cerveau, et l’autre moitié à 12 mâles porteurs de la mutation au cœur Ce nombre d’accouplements est suffisant pour produire tous les animaux descendants nécessaires à la poursuite du projet. 360 animaux descendants seront nécessaires car l’étude est divisée en 3 groupes d’animaux traités avec le médicament ou son placebo et analysés à plusieurs stades du développement : - Groupe malade au niveau du cœur : 96 souris dont 48 sont traitées avec le médicament et 48 avec le placebo, et maintenues 21 jours, 8 semaines ou 6 mois. - Groupe malade au niveau du cerveau : 96 souris, distribuées de la même manière que les souris malades au niveau du coeur. - Groupe témoin non malade : 96 souris traitées avec le placebo et maintenues 21 jours, 8 semaines ou 6 mois, et dont la moitié sera utilisée comme groupe témoin “Cœur” et l’autre moitié comme groupe témoin “cerveau” Étant donné le type de données (variables continues), les effectifs (N>5), le nombre de groupes comparés (n>2) et l'indépendance des échantillons, nous aurons le nombre indispensable de souris qui nous permettra faire des statistiques et arriver à avoir de conclusions de notre travail. Par ailleurs, toutes les données issues de nos expérimentations seront modélisées en tenant en compte du phénotype, des résultats des études fonctionnelles et du traitement. Cette modélisation nous permettra d’aborder l’ensemble de résultats obtenus et de réduire au maximum le nombre de souris étudiées.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans une animalerie conventionnelle agréée respectant les paramètres pour les conditions de vie des souris (hygrométrie, température…). Les souris seront hébergées en groupe dans la même cage (4/cage), auront un accès illimité à l’eau et à la nourriture, et bénéficieront d’objets pour l’enrichissement (bouts de bois, carton, mouchoir…). Toutes les procédures seront réalisées par des personnels entraînés et qualifiés pour ce type d’étude. Une procédure d’estimation et suppression de la douleur est mise en place : différents éléments visuels chez l’animal sont évalués afin d’établir un score qui permet d’anticiper et d’éviter d’atteindre les points limites déterminés au préalable, et qui tient compte des signes éventuels de mal-être (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, yeux et abdomen creux). En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et des organes prélevés pour permettre des analyses biochimiques, enzymologiques et anatomopathologiques.
Choix des espèces
La souris génétiquement modifiée est le seul modèle disponible de mutation tissu-spécifique permettant l'étude de cette maladie génétique, et il mime parfaitement la pathologie car nous observons chez la souris les mêmes symptômes que ceux rencontrés chez l'homme. Il n'existe pas de modèle animal autre que la souris génétiquement modifiée permettant l'étude de cette maladie. Les animaux impliqués dans ce projet seront étudiés à plusieurs périodes de la vie telles que le sevrage (21 jours), la maturité sexuelle (8 semaines) et le début du vieillissement (6 mois) car ce sont des périodes charnières dans le déclenchement de la maladie CblG chez l’homme. Le traitement par Resvératrol sera effectué quotidiennement par gavage de la mère gestante (40 mg/kg/j) à partir de 9 jours après le début de la gestation (E9) jusqu’au sevrage. Différentes procédures expérimentales seront mises en œuvre (tests comportementaux, tests d’effort, imagerie à J20 ou 6 mois). A l’issue de chaque période clé du protocole, une partie des animaux sera mise à mort pour procéder aux analyses biochimiques et histopathologiques.
Evaluation de phénotype dommageable lors de la création par croisement ou de la réception de lignées de souris sur le plateau d’élevage. Elevage de lignées de souris génétiquement modifiées.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
122 000 souris vont être utilisées dans un projet d'élevage de lignées génétiquement modifiées, 12 000 d'entre elles dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. L'activité déclarée tient en une biopsie d'oreille pour génotypage et en la surveillance des lignées dont la modification génétique altère la santé, par exemple par une susceptibilité accrue aux tumeurs. Environ 107 800 souris seront tuées, 12 200 gardées pour la reproduction et 2 000 réutilisées, le porteur indiquant que les souris au génotype sans intérêt sont mises à mort quand aucun autre projet ne peut les prendre. Sur les 122 000 déclarées, la très grande majorité n'existe donc que pour faire naître les quelques individus porteurs du bon génotype.
Objectifs
Il s'agit de définir et de détecter des lignées de souris pouvant altérer leur bien-être dans un élevage de souris génétiquement modifiées et de produire des souris génétiquement modifiées nécessitant une caractérisation génétique.
Bénéfices attendus
Ceci permet de produire et de maintenir des lignées murines génétiquement modifiées nécessaires à des projets de recherche en raffinant les techniques d'élevage de ces lignées. Ceci permet à la fois de détecter et de prendre en charge l'apparition de caractères dommageables. Ce projet permet d'anticiper la prise en charge des signes nécessitant des soins et de permettre une réaction immédiate en cas d'apparition de ces signes.
Procédures
Identification et prélèvements pour caractérisation des souris (moins d'une minute). Biopsie pour génotypage qui concerne les souris du projet. Conditions d'élevage spécifique des modèles adaptés en fonction de l'évaluation de l'impact du modèle sur le bien-être animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont liés au caractère dommageable des lignées entretenues : par exemple, une susceptibilité plus grande à l'apparition de tumeurs... La biopsie pour génotypage qui sera faite à l’oreille.
Devenir
Les animaux d'intérêt sont utilisés dans des procédures expérimentales dans d'autres établissements utilisateurs ou peuvent servir en tant que reproducteur. Les animaux dont le génotype n’a pas d’intérêt pour les projets expérimentaux initiaux sont soit utilisés pour d’autres projets expérimentaux dans d'autres établissements utilisateurs quand c’est possible, soit euthanasiés s’il n’y a pas de possibilité de les utiliser dans d’autres procédures.
Remplacement
Différentes stratégies de remplacement peuvent être appliquées par les chercheurs en amont de l'élevage des souris (expériences préparatoires in vitro, modélisations, veille scientifique) ou en aval des expérimentations (modélisation, raffinement des méthodes statistiques).
Réduction
La production sera rationnalisée par l’établissement de programmes d’élevage afin de ne pas produire plus d'animaux que nécessaire (d'une part pour l'évaluation du phénotype dommageable et d'autre part la production de lots expérimentaux). La réduction en pratique d'élevage nécessite une optimisation de l'âge des animaux géniteurs afin d'obtenir la plus grande descendance avec un minimum de cages d'accouplement. Elle nécessite aussi un choix approprié des génotypes des géniteurs (choix du mâle vs femelle; utilisation hétéro/homozygote, etc).
Raffinement
Le raffinement concernant l'évaluation et l'entretien de lignées à phénotype dommageable ou potentiellement dommageable est obtenu en appliquant scrupuleusement les consignes des chercheurs concernant l'apparition des signes attendus ou supposés pour chaque lignée considérée. Le raffinement des conditions d'élevage se traduit par un enrichissement des cages de production et de stabulation des animaux (frisottis, batonnet de coton, maison en carton si besoin, mise à disposition si besoin de l'aliment et/ou de la source hydratée sur la litière, etc... adaptation du nombre d'animaux / Cage au phénotype). Les conditions sanitairess sont élevées afin de réduire le risque de caractère dommageable lié au statut sanitaire. La biopsie pour le génotypage se fait à l'oreille.
Choix des espèces
Souris, car on peut facilement créer et produire de nouveaux modèles pour répondre à une question scientifique. Tout âge : animaux jeunes à âgés selon le type de procédures expérimentales dans lesquelles ces animaux sont par la suite utilisés en utilisation continue.
Prélèvement de tissus pour la caractérisation d’animaux génétiquement modifiés dans notre institut
- Conservation des espèces
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Gardés vivants à l'issue de la procédure, 20 000 rats vont subir une biopsie de l'oreille dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, leur devenir étant ensuite décidé par le chercheur en charge de la lignée. Chaque animal reçoit une bague à une oreille et un poinçon de 1,5 mm à l'autre, entre 12 et 15 jours de vie, avant le sevrage, pour permettre le génotypage. Le porteur justifie ce calendrier par l'organisation de l'animalerie, un gain "de temps, de place et de travail" et une capacité d'hébergement limitée. Ces 20 000 interventions accompagnent la gestion d'un élevage de lignées transgéniques créées sur commande, activité que l'établissement décrit comme une prestation.
Objectifs
Réaliser une biopsie d'oreille sur les rats génétiquement modifiés afin de pouvoir génotyper les animaux d'intérêt (Fondateurs, maintien de lignées, ou validation de cryoconservation des modèles).
Bénéfices attendus
Caracérisation génétique des lignées commandées pour les projets scientifiques des chercheurs et optimisation de la gestion des élevages. Il est important de réaliser le génotypage des animaux tôt, afin d'avoir les résultats si possible avant le sevrage, pour constituer les cagées directement. Cela permet un gain de temps, de place et de travail dans l'animalerie.
Procédures
Nous identifions les animaux par la pose d'une bague d'oreille et nous génotypons les animaux par une biopsie de 1.5mm de diamètre sur l'autre oreille à l'aide d'une pince spécialement dédiée. Cette procédure est réalisée une seule fois par animal. L'acte de biopsie et identification est très rapide (maximum 20 secondes pour les 2 actes d'identification et de biopsie). L'animal est donc contenu durant quelques secondes seulement et remis immédiatement à la mère.
Impact sur les animaux
Le poinçon peut entrainer douleur légère et de courte durée au site de prélèvement
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie à la suite de cette procédure peu invasive. La biopsie permettra de déterminer le génotype de l'animal. Le chercheur en charge de la lignée déterminera son devenir en fonction des projets qu'il mène.
Remplacement
Pas d’autre possibilité que le recours à l’animal vivant pour le prélèvement de tissus.
Réduction
La réduction du nombre d'animaux utilisés et leur bien-être est une préoccupation permanente. Le raffinement de nos techniques de transgénèse, de procréation médicalement assistée et de cryoconservation permet de générer de moins en moins d'animaux pour l'ensemble des prestations de l'institut, ce qui permet de réduire de manière importante la quantité d'animaux générés et donc biopsiés. De plus, nous utiliserons dès que possible, de schémas d’accouplement optimisés ne nécessitant pas ou peu de génotypage, afin de produire un maximum d’animaux « utiles »
Raffinement
La méthode de poinçon à l'oreille est éprouvée, précise, rapide et standardisée ce qui limite les effets indésirables stress/douleurs sur les animaux. De plus, les animaux sont surveillés quotidiennement ce qui permet de faire un suivi de la cicatrisation dans le temps. Nos rats sont hébergés en cages ventilées, en groupe, avec de multiples enrichissements : bâton de bois à ronger, balles de bois à ronger, nids, croquettes de nourriture au fond de la cage.
Choix des espèces
Le rat, comme la souris , est un très bon modèle d'expérimentation animale car il est de petite taille, son génome est parfaitement connu et il a un taux de reproduction très rapide. Il est couramment utilisé par les chercheurs qui nous commandent des prestations de création de lignées transgéniques Les rats seront prélevés entre 12 et 15j de vie, avant le sevrage. Cet âge a été judicieusement choisi car avant 12j, l'oreille ne s'est pas assez développée et ce n'est qu'un bourgeon sur lequel il est difficile de réaliser une biopsie. et après 15j, nous n'aurions pas les résultats de génotypage avant le sevrage (3 semaines), ce qui ne nous permet pas de faire les cagées définitives. Notre capacité d'hébergement est limitée et il nous faut donc optimiser la place constamment. Ce fonctionnement nous permet d'économiser du temps, des ressources et de la manutention pour les animaliers.
Implication du RAGE dans le vieillissement accéléré post septique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
Rendues septiques par l'injection dans l'abdomen d'un mélange de selles, 2 464 souris subissent cinq jours de réanimation puis des tests d'activité physique, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Le porteur indique que les souris septiques présentent des signes de douleur modérée à sévère, et utilise un score clinique validé comme "substitut de mortalité", ce qui revient à fixer des points limites en deçà de la mort. L'objectif déclaré est de démontrer l'implication d'un récepteur dans la faiblesse musculaire qui persiste après un sepsis, en suivant les animaux jusqu'à trois mois. Le porteur mentionne des organoïdes musculaires issus de biopsies de patients, qu'il juge insuffisants à ce jour pour reproduire le vieillissement post-septique.
Objectifs
Les objectifs scientifiques du projet sont de démontrer l'implication du récepteur aux Advanced Glycation End Product (RAGE) dans le vieillissement du muscle après une infection bactérienne grave (sepsis), en utilisant des souris n'ayant pas ce récepteur ou en utilisant des médicaments bloquant ce récepteur. A terme, l'objectif est de prévenir le vieillissement musculaire provoqué par une infection bactérienne.
Bénéfices attendus
Les patients ayant séjourné en réanimation pour une infection bactérienne grave, appelée sepsis, présentent des séquelles persistantes dans le temps, parmi lesquelles une faiblesse de la force musculaire comme observée au cours du vieillissement. Les mécanismes sous-jacents sont mal compris et il n’existe aucun médicament permettant d’améliorer ces atteintes musculaires. Notre modèle animal va reproduire l'infection bactérienne et sa prise en sa prise en charge clinique afin de se rapprocher le plus possible de la maladie humaine. Nos premières données ont pu valider le modèle utilisé puisqu’il reproduit la faiblesse musculaire et une incapacité des muscles à produire de l'énergie jusqu’à 10 jours après le début de la maladie. Cette nouvelle étude va nous permettre de déterminer si ces altérations perdurent dans le temps (jusque 3 mois après l'infection chez la souris), et d’en comprendre les mécanismes sous-jacents. Les données chez l’Homme indiquent l’importance du RAGE, un récepteur des cellules connu pour jouer un rôle dans le vieillissement, et des voies associées dans cette atteinte induite par l'infection bactérienne (sepsis). Nous allons explorer plus en détail comment ce récepteur participe au développement de la maladie en utilisant des souris n’exprimant pas ce récepteur ou des souris sauvages qui seront injectées par des inhibiteurs pharmacologiques de RAGE. A terme, nous espérons montrer que l'inhibition du RAGE empêche la perte de force musculaire provoquée par l'infection bactérienne chez la souris, pour ensuite initier une étude chez l’Homme.
Procédures
Les animaux subiront des injections d’un mélange de selles pour induire le sepsis sous forme d’une injection intrapéritonéale puis une période de réanimation pendant 5 jours. Pour certaines interventions, une anesthésie sera nécessaire pour l’analyse en IRM. Les animaux seront également soumis à des tests d’activité physique. Le niveau d’activité spontanée des animaux et leur respiration seront aussi analysés. Les animaux qui seront injectés pour des molécules pharmacologiques subiront un prélèvement sanguin pour analyse.
Impact sur les animaux
Les souris sont soumises à différentes injections et peuvent développer des douleurs légères liées à ces piqures. Les souris septiques présentent des signes de douleur modérée à sévère. Une injection d’analgésie sera mise en place pour palier à ces douleurs. Des pertes de poids et d'activité modérées sont attendues.
Devenir
L’ensemble des animaux prévus sera utilisé pour le projet. Aucun animal ne sera maintenu en vie à la fin du projet afin de collecter les tissus sans avoir à réserver un lot de souris à cette fin. Cela permet de réduire le nombre d'animaux et de les réutiliser.
Remplacement
Nous utilisons des approches complémentaires à l’expérimentation animale de type organoïdes musculaires obtenus par des biopsies musculaires de patients contrôle et admis en réanimation pour un sepsis à l’hôpital. Néanmoins, cette nouvelle approche ne suffit pas à reproduire la complexité du vivant à l’heure actuelle, notamment à reproduire pleinement les caractéristiques du vieillissement accéléré post-septique. En effet, le sepsis est définie par une dysfonction d'organes menaçant le pronostic vital en raison d’une réponse immunitaire inappropriée de l’hôte. La pathogénie des dysfonctions d’organes implique des interactions complexes entre les organes du corps entier. Ainsi, à ce jour, il n’existe pas de modèles cellulaires satisfaisants pour étudier les mécanismes de vieillissement post-septique. Seuls les mammifères ont été validés comme des modèles expérimentaux de sepsis.
Réduction
Des calculs statistiques détaillés ont été effectués pour déterminer le nombre approprié d'animaux pour ce projet. Le nombre d’animaux est cohérent avec la littérature. Ce nombre d'animaux permettra de générer des données scientifiquement solides permettant de les analyser statistiquement. Chaque animal sera soumis à plusieurs tests plutôt que d'utiliser des animaux différents pour chaque test, afin d'obtenir un maximum de données de chaque animal. Cela permet de réduire le nombre total d'animaux nécessaires. En outre, des analyses post mortem seront effectuées sur les tissus (muscles squelettiques, cœur, foie, reins, poumons, vaisseaux, tissus adipeux) de tous les animaux afin de garantir la collecte d'un maximum d'informations sur chaque animal. Le nombre d'animaux et la conception expérimentale de ce projet ont également été revus et approuvés par un biostatisticien expérimenté.
Raffinement
Les souris seront manipulées de manière appropriée et les interactions avec elles seront fréquentes, ce qui réduira le niveau de stress pendant les procédures. Lorsque nécessaire, les animaux recevront une analgésie et/ou une sédation afin de minimiser la douleur et la souffrance. Afin de garantir le bien-être des animaux, ceux-ci seront surveillés et notés fréquemment à l'aide de score de gravité et de bien-être animal, afin de s'assurer qu'aucun animal ne dépasse un niveau de détresse strictement prédéterminé, et des mesures finales sans cruauté seront mises en œuvre immédiatement si un animal présente des effets indésirables inattendus. -Surveillance : poids, température, score de gravité de l’état général (Murine Sepsis Score, MMS) validé dans la littérature comme substitut de mortalité, bien-être biquotidienne initialement puis selon le niveau de gravité. -Analgésie : toutes les 12 heures tant que le score de gravité murin (MSS) est supérieur à 3/28. -Sédation par inhalation de gaz pour tout examen stressant de classe de gravité légère avec réveil (IRM musculaire). -Sédation et analgésie pour tout examen stressant et invasif de classe sans réveil : sédation par inhalation de gaz et analgésie par injection intrapéritonéale. Des doses supplémentaires d’analgésie seront injectées si nécessaire selon la durée de l’expérience. Les possibilités d’améliorer les procédures seront continuellement explorées (veille de la littérature) et mises en œuvre autant que possible. Le groupe de recherche maintiendra une interaction forte avec les animaliers et le bureau du bien-être animal, afin de permettre une surveillance optimale des animaux et rechercher un enrichissement de leur environnement.
Choix des espèces
L’injection dans le ventre d’un mélange de selles est validée chez les souris, les rats, les brebis et les cochons comme modèle d'infection bactérienne (sepsis) et reproduit en grande partie ce qui est retrouvé chez l'Homme. Ce modèle est publié dans la littérature. L’utilisation de la souris permet la réalisation de tests sur leur motricité et leur respiration en parallèle sur notre site. Cette espèce permet également d'avoir des animaux qui n'expriment plus le récepteur RAGE que l'on pense être impliqué dans la faiblesse musculaire provoquée par l'infection bactérienne. Enfin, il existe des scores cliniques pour évaluer la gravité et la douleur, ainsi que des protocoles d’analgésie bien validés dans ce modèle de souris. Enfin, des points limites ont été proposés dans ce modèle comme substituts de la mortalité. Le but de ce projet est d’étudier les mécanismes impliqués la faiblesse musculaire, qui ressemble à celle observée dans le vieillissement, provoquée par une infection bactérienne. Nous utiliserons des souris âgées de 17 à 30 semaines mâles et femelles. Cet âge correspond chez l'Homme à des individus âgés de 25 à 35 ans.
Hydrogénothérapie et mesure de la biodistribution chez le rat
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
200 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque rat subit une chirurgie unique pouvant durer jusqu'à trois heures, avec l'implantation de sondes destinées à mesurer la répartition du dihydrogène dans les organes, et le porteur signale des risques de détresse respiratoire et d'hémorragie. Le projet cherche à décrire la distribution et l'élimination du H2 selon la voie d'administration, présenté comme un candidat médicament. Le porteur affirme qu'aucun modèle sans animaux ne peut remplacer la complexité du corps et qualifie cette étape d'"incontournable".
Objectifs
Le dihydrogène (H2) est un candidat médicament très intéressant de par ses effets bénéfiques dans le traitement des maladies cardiovasculaires, maladies neurodégénératives, troubles métaboliques ou encore du cancer. La petite taille de l'H2 lui permet de diffuser facilement dans les tissus et les organes. Lors de précédentes études, l'évolution de la concentration en H2 dans le coeur et dans le sang, pendant une administration par inhalation, a été explorée chez le rat. Au cours de ce projet, l'évolution de la concentration en H2 sera mesurée grâce à une sonde implantée dans différents tissus cibles. La présente étude permettra de déterminer la distribution et la vitesse d'élimination de l'H2 dans les différents organes suite à son administration par différentes voies et de qualifier chaque voie d'administration sur un plan qualitatif et quantitatif.
Bénéfices attendus
Ce projet est une étape incontournable pour la mise au point de nouvelles thérapies basées sur l'H2 qui permettront de soigner des maladies cardiovasculaires, maladies neurodégénératives, troubles métaboliques ou encore le cancer.
Procédures
Chaque animal subira une intervention chirurgicale unique d'une durée maximale de 3 heures. Un même animal sera soumis à une anesthésie complémentée avec une analgésie, suivie d'une administration d'H2 par différentes voies possibles. La quantité d'H2 distribuée dans différents tissus sera mesurée à l'aide d'une sonde. Au terme de la mesure ou des trois heures, l'animal sera mis à mort sans réveil préalable.
Impact sur les animaux
Certains animaux peuvent présenter des signes de détresse respiratoire ou des hémorragies.
Devenir
La procédure proposée est en classe "sans réveil", la mise à mort des animaux est donc incluse dans cette procédure et inévitable du fait du caractère lésionnel des abords chirurgicaux et de l'utilisation des sondes de mesure.
Remplacement
La présente étude a pour objectif de caractériser précisemment la distribution de l'H2 dans les différents organes et son élimination suite à un traitement à l'H2. Actuellement, il n'est pas possible de remplacer la complexité du corps humain par des modèles n'utilisant pas d'animaux, d'où la nécessité de leur utilisation dans ce projet.
Réduction
Un maximum de 200 rats sera utilisé dans ce protocole. Afin de réduire le nombre d'animaux il est prévu d'effectuer les mesures d'H2 dans plusieurs organes par animal car nous disposons de plusieurs sondes. Il est envisagé qu'une dizaine de modes d'administration d'H2 seront testés, chaque groupe expérimental sera constitué de 20 animaux (10 contrôles et 10 traités ; prenant en compte une éventuelle mortalité due à l'opération d'environ 10%). Ce nombre d'animaux permettra de réaliser un test statistique afin de valider nos résultats. De plus, des animaux venant d'autres protocoles de contrainte légère à modérée pourront être utilisés.
Raffinement
Le projet est mis en oeuvre dans un établissement utilisateur agréé. L'ensemble des personnels impliqués est à jour des formations réglementaires exigibles pour les manipulations sur des animaux vivants. Le rat correspond à l'espèce animale la plus pertinente dans ce type d'étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi contrôlé et observés régulièrement afin d'anticiper l'apparition des points limites fixés. L'intégralité des gestes sera réalisée sous anesthésie générale complémentée par une analgésie.
Choix des espèces
Les similitudes d'anatomie et de physiologie entre le rongeur et l'Homme permettront d'obtenir une comparaison fiable des données obtenues et une meilleure compréhension de la distribution de l'H2 dans l'organisme. De plus, le diamètre des sondes utilisées (1,1-1,6 mm) est compatible avec la dimension des organes cibles de l'étude. Nous utiliserons des rats adultes de minimum 7 semaines pour les mâles et 10 semaines pour les femelles (d'un poids corporel supérieur à 300g). Ce sont les animaux les plus couramment utilisés en pharmacologie de sécurité.
Etude de la réponse physiologique chez une souris génétiquement modifiée pour un gène d’intérêt lors d’une altération pharmacologique de la fonction cardiaque
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une mini-pompe implantée sous la peau du dos sous anesthésie, subissent des échographies cardiaques répétées et une induction pharmacologique d'hypertension qui peut entraîner une mortalité dans les jours suivants. Le projet étudie le rôle d'un gène dont l'inactivation altère la fonction cardiaque, dans un contexte d'hypertension, et teste un traitement. Le porteur affirme qu'aucune autre approche ne permet d'étudier ce gène dans un organisme vivant et que la souris est la "meilleure approche disponible".
Objectifs
Nous souhaitons étudier le rôle d'un gène d’intérêt dont l'inactivation entraîne une anomalie de la fonction cardiaque. Plus particulièrement, nous souhaitons étudier le rôle de ce gène dans le cadre d'une hypertension. Ce projet vise ainsi à comprendre si la suppression de ce gène pourrait modifier les réponses du système cardiaque lors d'une hypertension. Ces travaux sont une étape nécessaire dans le développement de traitements potentiels des troubles cardiaques observés chez les patients souffrant d'insuffisance cardiaque ou d'hypertension. Dans ce projet, nous prévoyons donc d'analyser des animaux génétiquement modifiés, porteurs d'une délétion totale du gène d’intérêt. Afin de déterminer l'impact de l’inactivation du gène d’intérêt sur la fonction cardiaque, dans un contexte d'hypertension nous utiliserons un modèle pharmacologique. De plus, nous testerons l’effet d’un traitement qui a pour but de réduire l’hypertension. Ainsi, nous tenterons de comprendre d’une part le rôle de la mutation dans la réaction à l'hypertension d'origine cardiaque et d’autre part l’effet du traitement sur cette hypertension.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de progresser dans la connaissance que nous avons sur le gène étudié, en recherche préclinique. Les données générées nous permettront de mettre en évidence des pistes thérapeutiques potentielles qui seront utilisées pour le développement de nouveaux médicaments dans le cadre des troubles cardiaques observés chez les patients souffrant d'insuffisance cardiaque ou d'hypertension.
Procédures
3 prélèvements sanguins qui durent quelques minutes. 4 injections intrapéritonéales ( uniquement pour les groupes avec traitement) qui durent environ moins d'1 minute. 3 évaluations cardiaques avec une anesthésie gazeuse de 45 minutes environ. 1 implantation sous-cutanée de mini-pompe avec une anesthésie gazeuse d'une durée de 30 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une implantation sous-cutanée au niveau du dos de mini-pompes sous anesthésie gazeuse. Cette implantation entrainera une douleur locale post-opératoire qui sera couverte par des antalgiques. Suite à cette implantation, les animaux subiront une anesthésie gazeuse pour effectuer des échographies cardiaques. Celle-ci dure environ 45 minutes et les animaux se réveillent spontanément. Une mortalité peut se présenter dans les jours suivant la mise en place de l'hypertension. Des points limites adaptés permettent d'anticiper ce risque pour éviter toute souffrance animale
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses histologiques.
Remplacement
Nous ne disposons pas d'une autre possibilité d'étudier la fonction de ce gène dans un organisme vivant. Cette étude in vivo est nécessaire pour permettre les analyses physiologiques qui nécessitent des interactions entre plusieurs organes. Dans le cadre d'atteintes de la fonction cardiaque et en particulier dans la mise en place d’une hypertension, le modèle souris constitue la meilleure approche disponible à ce jour pour cela.
Réduction
Chaque groupe expérimental sera constitué de 12 animaux, cet effectif a été calculé par étude de puissance et est suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables dans les protocoles d'analyse prévus (échographie cardiaque et électrocardiogramme). De plus d’après nos connaissances sur le modèle d’induction d’hypertension des groupes de 12 animaux sont nécessaires. Nous souhaitons donc employer un total de 144 souris pour ce protocole, correspondant à 12 groupes de 12 animaux. Le projet vise à définir les paramètres régissant la réponse au test pharmacologique, en comparant des animaux exprimant ou non le gène d'intérêt, dans des conditions physiologiques ou avec le protocole d'hypertension, traités ou non avec l’anticorps et chez les deux sexes (12 conditions au total).
Raffinement
Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal dominé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Les animaux seront maintenus en groupes, dans des conditions d'animalerie optimales. Ils disposeront sans limitation de nourriture, boisson et d'un milieu enrichi. Le cas échéant, des soins locaux seront appliqués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés et observés toutes les semaines en plus du suivi quotidien habituel. Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. Le suivi post-implantatoire des pompes osmotiques délivrant le traitement pharmacologique déclenchant l'hypertension comprendra une surveillance de l'incision, du poids de l'animal, de son état général. Un tapis chauffant permettra aux animaux de maintenir leur température corporelle durant l'anesthésie. Les pompes osmotiques sont mises en place pour réduire la douleur et le stress sur le long terme en évitant des injections et des manipulations nombreuses et répétées Durant la pose des minipompes, ainsi que les échographies, les animaux seront anesthésiés et recevront une couverture analgésique appropriée.
Choix des espèces
La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons justement du modèle porteur de la modification génétique sur le gène d'intérêt, ce qui en fait un modèle de choix. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Enfin, dans le cadre d'atteintes de la fonction cardiaque, le modèle souris constitue la meilleure approche disponible à ce jour. Les animaux démarreront leur protocole en tant que jeune adulte, à partir de 7 semaines. A cet âge la fonction cardiaque est bien développée.
Évaluation par imagerie par résonance magnétique d’une stratégie thérapeutique à base d’apeline 13 dans un modèle d’ischémie cérébrale murin
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'au sévère. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par occlusion d'une artère du cerveau, suivi d'injections, de prélèvements sanguins répétés et de plusieurs IRM sous anesthésie. Le porteur indique que la chirurgie entraîne une perte de mobilité, des troubles de la déglutition pouvant conduire à une fausse route et au décès, et une perte de poids. Il teste des injections répétées d'apeline-13, approche qu'il présente comme jamais rapportée, et affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la physiopathologie de l'AVC.
Objectifs
L’Accident Vasculaire Cérébral (AVC) constitue la première cause de handicap acquis chez l’homme, la 2ème cause de démence et la 3ème cause de mortalité en France. Sa forme ischémique est causée par l’occlusion d’une artère cérébrale par un caillot de sang. L’occlusion de l’artère entraine une crise énergétique, par défaut d’apport en glucose et oxygène et provoque la destruction rapide et définitive d’une zone du cerveau. Malgré l’avancée des traitements de recanalisations (thrombolyse chimique et thrombectomie mécanique), 50% des patients traités gardent des séquelles. La plasticité vasculaire et neuronale constitue le pivot de la récupération post-AVC. En situation post-ischémique, différents mécanismes compensatoires de néovascularisation sont activés. Ces mécanismes physiologiques compensatoires peuvent s’avérer insuffisants pour assurer une reperfusion efficace lors d’épisodes ischémiques aigus, mais également chroniques. Plusieurs pistes expérimentales sont étudiées pour améliorer la récupération post-AVC (thérapies régénératives, agents neuroprotecteurs, entrainement physique + cognitif). L’Apeline et son récepteur APJ sont largement distribués dans différents tissus et organes. La littérature suggère un effet protecteur de l’Apeline sur la neurotoxicité, le stress oxydatif, l’apoptose neuronale et joue un rôle neuroprotecteur après une lésion aigue d’ischémie-reperfusion cérébrale. Cependant, dans ces études, une seule administration d’Apeline est faite le jour de l’ischémie. Par ailleurs, les bénéfices sont évalués à très court terme et l’expression d’APJ au-delà de J1 post-ischémie demeurent non documentés.
Bénéfices attendus
Notre projet a pour objectif d’évaluer le potentiel neuroprotecteur d'injections répétées d’Apeline-13 dans un contexte d’accident vasculaire cérébral chez un modèle murin. Ceci n’a jamais été rapporté dans la littérature à ce jour. Les troubles cognitifs pouvant être associés à l’AVC ont des répercussions négatives sur la qualité de vie du patient, sur le taux de mortalité dans les 4 années suivant l’AVC, et représentent un impact médicosocial considérable pour la société. Il est donc essentiel de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le but de réduire ces troubles cognitifs. L’Apeline-13 est un peptide dont l’effet neuroprotecteur est décrit en per-opératoire. Dans ce modèle, les conséquences neurovasculaires de l’administration d’apeline sont encore très peu décrites. Dans ce projet l’objectif est de mettre en évidence l’intérêt d’un traitement répété sur une durée de traitement plus longue et d’évaluer l’impact de ce traitement sur la réduction des différents troubles moléculaires, moteurs et cognitifs après la survenue d’un AVC.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie (acte chirurgical d'environ 30 minutes) visant à induire l'ischémie cérébrale. Les animaux seront soumis à des injections dans le but de leur administrer le traitement (de 1 à 3 injections selon le groupe). Les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin à J-1, à 3 prélèvements sanguins à J1 (ante, per, post tMCAO) ainsi qu'un prélèvement à J3 avant la mise à mort. Ces prélèvements seront réalisés à la queue lorsque les souris seront endormies pour effectuer les IRM. La première IRM aura lieu pendant l'ischémie pour une durée d'environ 30 minutes. Suite à la reperfusion ainsi qu'à J1, J2 et J3, 4 autres IRM seront effectuées et devraient avoisiner 90 minutes chacunes. Des frottis vaginaux seront effectués à J0 et J3. Le cerveau sera finalement prélevé au terme du protocole.
Impact sur les animaux
Ce projet nécessite des prélèvements sanguins itératifs, de petits volumes, qui seront effectués grâce à une unique incision caudale. La chirurgie a pour conséquence de générer un infarctus cérébral conduisant à une perte de mobilité plus ou moins transitoire et d’intensité variable. Durant les premières heures, l'animal ne sera peut-être pas capable de boire ou manger, car il peut présenter des troubles de la déglutition, entrainant fausse route, asphyxie et décès. Une perte de poids peut être observée dans les jours suivants la chirurgie. L’anesthésie prolongée lors de la chirurgie et des imageries peut induire un risque d’hypothermie qui sera pris en charge par l’utilisation d’une plaque chauffante pour la chirurgie et d’une couverture chauffante compatible IRM pour l’imagerie in vivo. Plusieurs injections intraveineuses seront réalisées dans les sinus rétro-orbitaires.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort au terme de la procédure permettant le prélèvement des tissus cérébraux.
Remplacement
Diverses approches peuvent être utilisées pour étudier la physiopathologie de l’AVC. Parmi elles, l’in vitro, permettant d’étudier les effets de l’hypoxie sur différents types cellulaires, régulièrement indépendamment les uns des autres. Néanmoins, la physiopathologie de l’ischémie cérébrale, bien que de mieux en mieux décrite, reste complexe. En effet, celle-ci se compose de différents mécanismes spontanés s’influençant mutuellement sur la durée. Ces mécanismes mettent en jeu différents types cellulaires et évoluent au cours du temps. Pour caractériser l’évolution temporelle de ces divers processus en réponse à un traitement pharmacologique, il est nécessaire d’utiliser un modèle expérimental permettant l’interaction de ces mécanismes complexes, indissociables les uns des autres. Par ailleurs, l’AVC étant à l’origine de troubles moteurs comme cognitifs, notre étude vise également à investiguer les bénéfices neuro-comportementaux de notre traitement, d'autant plus que la souris se présente comme une alternative intéressante du fait des nombreuses similitudes observées entre cette espèce et l’Homme en ce qui concerne les grandes artères cérébrales. De plus, le modèle tMCAO murin est un modèle excessivement bien documenté dans la littérature. Enfin, il pourrait néanmoins être utile d’implémenter notre étude de modèles in vitro pour déterminer précisément les mécanismes d’action et les voies moléculaires impliquées au sein des différentes populations cellulaires indépendamment les unes des autres.
Réduction
En l’absence de données dans la littérature, cette étude nous permettra d’évaluer s’il existe ou non, un effet du traitement répété à l’apeline 13 sur la réduction du volume final de l’infarctus/ réduction des troubles cognitifs dû à la survenue d’un AVC. Nous prévoyons un maximum de 60 souris pour cette procédure. La variabilité importante (environ 20%) de la taille de l’infarctus final généré par l’occlusion artérielle justifie que le critère d’évaluation principal (volume de la lésion) soit normalisé au volume d’hypoperfusion, évalué par IRM durant la phase d’occlusion. Cette normalisation doit permettre de limiter la variabilité interindividuelle des mesures et réduire ainsi le nombre d’animaux nécessaires. Les animaux utilisés dans la partie 1 permettront à la fois d’évaluer la perfusion cérébrale après traitement sans et avec ischémie cérébrale. Pour évaluer le modèle ischémie cérébrale transitoire chez la souris au cours du temps nous utiliserons l’IRM, technique permettant des études non invasives, longitudinales, multiparamétriques et quantitatives, ce qui permet de minimiser le nombre d’animaux nécessaire. Le modèle d'AVC chez le rongeur a des impacts physiologiques et fonctionnels interindividuels très variés. Les études déjà publiées chez la souris utilisent des nombres de souris très variables allant de n=6 à n>20. Dans notre étude nous évaluerons les effets d’un traitement précoce d’apeline-13 sur 3 jours. Il n’existe pas d’études chez la souris, nous nous baserons sur notre expérience du modèle chez le rat pour déterminer le nombre d’animaux nécessaire. Nous avons donc choisi d'avoir des groupes de 12 animaux pour nous permettre une évaluation statistique fiable à la fin de l'étude (test non paramétrique de wilcoxon pour les comparaisons entre 2 groupes). Ce nombre est suffisant pour prendre en compte la variabilité interindividuelle et permettre de déterminer la meilleure fenêtre d’imagerie pour chaque traceur dans notre modèle.
Raffinement
Les chirurgies, prélèvements sanguins, les injections IV et les séances d’imagerie se feront sous anesthésie générale gazeuse, ce qui permettra de minimiser le stress et la douleur et un réveil rapide de l’animal. Les souris anesthésiées seront toujours placées sur un tapis ou lit chauffant avec contrôle de la température pour éviter tout risque d’hypothermie. Les expérimentations douloureuses seront toujours accompagnées, en plus de l’anesthésie générale, d’une analgésie locale (ropivacaïne) et/ou générale par injection en s.c de morphinique (buprénorphine). Pendant une heure après la chirurgie une surveillance accrue des animaux sera mise en place, pour éviter toutes complications post-opératoires. L’accès à la nourriture et à l’eau ne sera permis qu’une fois que l’animal sera parfaitement réveillé pour éviter les problèmes de fausse route. Le bien-être des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel qualifié, ce qui nous permettra d’intervenir rapidement dès le moindre signe éventuel de souffrance pour la prendre en charge. Tout signe et/ou comportement anormal : difficultés à respirer, souris prostrée, en retrait, ou une perte de poids, par exemple, sera signalé et pris en charge par des compléments alimentaires ou une médication adaptée. Si les signes cliniques ne s’améliorent pas ou que la perte de poids est supérieure à 20% du poids initial l’animal sera sorti du protocole et mis à mort sans délai pour éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Le modèle d’ischémie cérébrale transitoire chez la souris est bien décrit dans la littérature. Cette technique d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (tMCAO) par un filament de nylon introduit dans l'artère carotide commune via l’artère carotide interne pour occlure l’artère cérébrale moyenne reproduit l’accident vasculaire cérébral ischémique le plus fréquent chez l’humain (par occlusion de l’artère cérébrale moyenne) et il est le plus décrit dans la littérature. Les animaux seront au stade adulte entre 3 et 4 mois conformément au modèle décrit dans la littérature. Après réception, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’au minimum 7 jours avant le début du protocole expérimental.
Rôle de l’axe IL33/ST2 dans le cross talk pathologique cardio-rénal.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'au sévère. Elles reçoivent cinq injections pour induire une modification génétique, subissent une chirurgie cardiaque d'une heure provoquant un infarctus, puis une mesure de la fonction rénale de deux heures, avant une mise à mort échelonnée à un, sept ou vingt-huit jours. Le porteur indique des douleurs post-opératoires et présente l'axe IL33/ST2 comme une cible thérapeutique déjà accessible via des anticorps. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le dialogue entre le cœur et le rein et juge le modèle animal "indispensable".
Objectifs
Le syndrome cardio-rénal est un état de santé où une maladie du cœur ou des reins affecte négativement l'autre organe. C'est un phénomène complexe et nous n'avons pas encore une compréhension complète de comment les deux organes interagissent en cas de maladie. Certains progrès ont été faits pour comprendre cela. Par exemple, des recherches récentes ont mis en lumière certaines voies de communication entre le cœur et les reins en cas de maladie. Une molécule appelée Galectin-3 semble jouer un rôle important lorsqu'il y a une maladie rénale qui affecte le cœur, et cette molécule a été associée à un risque accru de maladie et de décès chez les patients atteints d'insuffisance cardiaque. Une autre découverte récente concerne une molécule appelée IL33 et son récepteur, ST2. Cette molécule semble jouer un rôle important lorsque les reins sont malades et affectent le cœur, mais de manière surprenante, elle semble avoir un effet néfaste sur le cœur, ce qui est contraire à ce que d'autres études avaient suggéré auparavant. Ces découvertes montrent qu'il existe un lien complexe entre le cœur et les reins lorsqu'une maladie se produit, et que comprendre ce lien pourrait être la clé pour traiter ces maladies plus efficacement. Ainsi, l'objectif de ce travail est d'évaluer l'impact d'une crise cardiaque sur la santé des reins à long terme, et d'étudier plus précisément comment la molécule IL33 et son récepteur ST2 jouent un rôle dans les changements que subissent le cœur et les reins en cas de maladie.
Bénéfices attendus
Dans nos précédents travaux, nous avons mis en évidence que l’axe IL33/ST2 était un axe central dans la survenue de remodelage cardiaque à distance d’une agression rénale aiguë. Ce projet permettra d’une part de caractériser les modifications architecturales qui surviennent au niveau rénal après la maladie coronaire aiguë et de mesure l’impact de cet axe sur ces modifications. Il existe déjà un certain nombre de thérapeutiques déjà disponibles pour la modulation de cet axe (anticorps monoclonaux anti-IL33 ou anti-ST2). L’application clinique et son bénéfice pourront donc rapidement être évalués si les hypothèses de travail sont concluantes. Le pool de patient potentiellement traitables est énorme car il s’agit d’un des problèmes de santé publique le plus important et la cause de morbi-mortalité la plus importante de nos sociétés occidentales.
Procédures
Les animaux seront soumis à 5 injections de substance nécessaire à l'obtention du modèle génétiquement modifié d'une minute 5 jours de suite. Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale d’une durée d’une heure. Les animaux seront soumis à une mesure du débit de filtration glomérulaire (fonction de filtration du rein) d’une durée de 2 heures. Les souris recevant le tamoxifène auront un intervalle libre entre la dernière injection et la chirurgie d'une semaine. Certains animaux subiront une micro-puncture de l'oreille vers J6 pour déterminer leur génotype.
Impact sur les animaux
Durant l’ischémie reperfusion, les nuisances sont une inflammation au niveau des points d'incision pour la thoracotomie et de la douleur à ces mêmes endroits. Les nuisances liées à l'infarctus du myocarde sont essentiellement marquées par les douleurs post opératoires, le modèle n'étant pas un modèle d'insuffisance cardiaque sévère. Pas de nuisances liées à l'atteinte rénale potentielle. Durant l'injection de la substance pour la recombinaison génétique, on peut avoir une douleur au point d'injection et une irritation abdominale transitoire. La procédure de mesure de la fonction rénale n'est pas source de nuisance en soit sinon une gène pour l'animal de porter le dispositif sur le dos pendant la mesure. Durant la puncture pour le génotypage, la nuisance liée à la puncture est de très courte durée et très peu douloureuse.
Devenir
Les animaux sont tous mis à mort à l’issue de la procédure afin de réaliser des prélèvements d'organes et de plasma pour analyse. Le temps de mise à mort varie selon le groupe entre J+1, J+7 et J+28.
Remplacement
Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro permettant d’évaluer le dialogue entre le cœur et le rein, puisque par essence, il s’agit d’un modèle physiologique intégré. Par ailleurs, l’utilisation d’animaux permet d’étudier des mécanismes cellulaires plus complexes qui ne peuvent pas être étudiés sur des modèles ex vivo ou in silico. Par conséquent, l’utilisation du modèle animal apparait comme indispensable à la réalisation de ce protocole. Néanmoins, le laboratoire travail en parallèle sur des modèles cellulaires permettant de mimmer ces conditions et à terme remplacer l'utilisation d'animaux, néanmoins ces modèles n'ont à ce jour pas démontré de résultats satisfaisants.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé dans le projet a été calculé pour permette d'obtenir des résultats fiables et robustes. Ceci, plus notre expérience préalable dans le domaine nous ont permis de déterminer le nombre minimal d’animaux pour ces expérimentations protocole, l’avantage d’utiliser un processus non invasif de mesure de la fonction rénale permet de limiter le recours extensif à un nombre important d’animaux.
Raffinement
La procédure de raffinement a été établie et discutée avec le responsable du bien-être des animaux au sein de notre unité. Les animaux sont stabulés dix jours après leur arrivée, avant toute procédure, afin de s’acclimater à leurs conditions d’hébergement. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les souris sont hébergées en cages de 5 individus avec un enrichissement du milieu (tubes, coton, bâtons à ronger). Les animaux sont contrôlés quotidiennement par un animalier formé (afin de s’assurer de leur bien-être), à l’aide d’une fiche intégrant les différents points limites. Lors de la procédure, les animaux sont anesthésiés et une analgésie avant l’intervention sera réalisée pour limiter un peu plus les risques de douleurs ressenties. La phase de réveil se fait dans un incubateur à 37°C pendant toute la nuit. Des points limites clairs ont été établies afin de soustraitre les animaux à la souffrance.
Choix des espèces
Notre équipe a développé les différents modèles d’ischémie-reperfusion sur la souris afin d’éviter de réaliser des expérimentations sur des gros animaux et pour avoir la possibilité de réaliser le modèle sur des souris transgéniques. Les souris utilisées seront âgées de 8 à 10 semaines afin d’obtenir un poids de 20-25 grammes.
Prélèvements ponctuels sous anesthésie pour les mises au point, la calibration de techniques ou la réalisation de tests préliminaires in vitro chez le primate non humain
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
40 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans d'autres études après une période de repos. Sous anesthésie générale, chaque animal peut subir jusqu'à cinq fois sur deux ans des prélèvements de moelle osseuse, de liquide cérébrospinal, des lavages broncho-alvéolaires ou des prises de sang. L'objectif est de fournir du matériel biologique de primate pour mettre au point des techniques d'analyse. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal, la proximité des primates avec l'humain étant présentée comme sans équivalent.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mettre à disposition de la communauté scientifique du matériel biologique de primate (liquide cérébrospinal, échantillons pulmonaires ou de moelle osseuse, accompagnés ou non de prélèvement sanguin), qui ne peut être collecté que sous anesthésie générale des animaux. Ces prélèvements sont nécessaires à la mise au point de techniques d'analyses sur ces échantillons, à la sélection d'animaux sur certains critères physiologiques, ou encore à la réalisation de test in vitro afin d’appréhender la toxicité ou l'efficacité d’un produit, au lieu de ou avant de le tester chez l’animal. Ce projet vise donc à pouvoir prélever certains échantillons biologiques de primate sous anesthésie, dans le but de réaliser des tests préliminaires ou en remplacement d'études in vivo sur cette espèce.
Bénéfices attendus
Tout test de matériel biologique obtenu lors de protocoles expérimentaux utilisant l'animal nécessite au préalable d'être mis au point, affiné, voir validé selon un certain cadre réglementaire. Ces mises au point nécessitent elles-mêmes l'utilisation de matériel biologique, qui doit être obtenu sur la même espèce. Beaucoup de tests sont basés sur des produits sanguins, mais certains nécessitent d'autres matrices biologiques plus difficile d'accès, comme la moelle osseuse, le liquide cérébrospinal ou les lavages pulmonaires. La moelle osseuse pourrait par exemple être utilisée dans le cadre de la mise au point d'un test visant à caractériser les cellules progénitrices du sang, pour le développement d'une thérapie contre des maladies héréditaires. Le liquide cérébrospinal pourrait être utilisé pour mettre au point une méthode de mesure d'un produit injecté dans le sang d'un patient, pour évaluer sa capacité à passer dans le cerveau. Cela peut avoir des implications pour évaluer la potentielle neurotoxicité d'un produit, ou au contraire sa capacité à atteindre le cerveau pour lutter contre des maladies neurodégénératives. Finalement, les lavages pulmonaires permettent d'avoir accès à du liquide et à des cellules de poumons, sans pour autant sacrifier l'animal : cela permettrait d'étudier le microbiote pulmonaire d'animaux, ou encore d'utiliser ces échantillons pour mettre au point des méthodes d'investigation de virus pulmonaires comme le SARS-CoV-2 (ex: PCR). Ces prélèvements sous anesthésie de matrices biologiques spécifiques pourront potentiellement être accompagnés de prélèvements sanguins dans la limite des recommandations de volume et fréquence pour l'espèce. Ces prélèvements de sang pourront être réalisés seulement s'il est jugé scientifiquement ou éthiquement pertinent de les faire sur le même animal plutôt que sur une cohorte différente. Dans certains cas, ces échantillons pourraient être utilisés pour réaliser des tests in vitro remplaçant l'utilisation de l'animal, comme par exemple dans le cadre de tests de toxicité d'un produit sur les cellules progénitrices de la moelle. Dans ce contexte, les différents prélèvements réalisés sont nécessaires pour mettre au point ou améliorer des méthodes d'analyses existantes. Ce projet contribuera donc à réduire le nombre d’animaux utilisés en étude, en permettant le développement de méthodes d'analyses plus fines ou de test in vitro remplaçant l'animal lors de phases expérimentales précoces.
Procédures
Les animaux seront manipulés afin de réaliser une injection d’anesthésique. Les procédures se déroulent entièrement sous anesthésie générale. Les animaux pourront être soumis à une parmi les 4 procédures différentes, chacune nécessitant entre moins d’une minute et trois minutes . Les prélèvements possibles seront : prélèvement de moelle osseuse, prélèvement de liquide cérébrospinal, lavage broncho-alvéolaire et prélèvements sanguins. Le temps entre l’induction de l’anesthésie de l’animal et son réveil est d’environ 1h.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de liquide cérébro-spinal est réalisé sous anesthésie. Une légère gêne au lieu de ponction peut être ressentie au réveil par l’animal. Le lavage broncho-alvéolaire peut provoquer une gêne chez l'animal suite à l'administration de liquide dans les poumons. De plus, dans le cadre de ce protocole, les prélèvements seront par définition ponctuels et donc non répétés dans le temps. Le prélèvement de moelle osseuse peut quant à lui provoquer des douleurs au niveau de la zone de prélèvement. ire un hématome sur la zone de prélèvement.
Devenir
Après une période de repos adéquate, les animaux seront disponibles pour intégrer d'autres études, sur avis vétérinaire.
Remplacement
Il n'est pas possible de remplacer l'animal dans le cadre de ce projet. L'utilisation de celui-ci est indispensable afin d'obtenir le matériel biologique nécessaire à la mise au point, la calibration et la validation de méthodes d'analyses biologiques. Ces méthodes visent en effet directement les cellules de l'espèce animale concernée (cytométrie en flux, tests de stimulation de cellules immunitaires, caractérisation de l'expression de certains gènes…), ou peuvent être fortement influencées par le milieu biologique dans lequel elles sont réalisées (mesure de la quantité d'un anticorps ou d'une protéine exogène par ELISA ou spectroscopie de masse). Le raffinement de ces méthodes d'analyses sert d'une part à transférer des protocoles d'analyses d'une espèce à l'autre, et à améliorer leurs sensibilité et spécificité, réduisant ainsi potentiellement le nombre d'animaux nécessaires lors d'études subséquentes. De plus, la disponibilité de matériel biologique permet de la réalisation d'étude d'efficacité ou de toxicité in vivo, qui pourront potentiellement permettre de remplacer ou réduire le besoin d'études in vivo.
Réduction
Afin de ne pas surestimer le nombre d'animaux utilisés, le nombre d’animaux pour ce projet a été défini par une analyse rétrospective des prélèvements de liquide cérébrospinal et de prélèvements pulmonaires fait au sein de l’entreprise au cours des dernières années, modulée par la trajectoire de croissance de notre activité . Afin d’assurer un nombre minimum d’animaux, les animaux pourront être prélevé un maximum de 5 fois sur une période de 2 ans dans le cadre de cette DAP.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux (mâles et femelles hébergés séparément) sur de la litière pour leur permettre de fourrager. Des jouets sont mis à leur disposition (rotation des jouets une fois par semaine). Des friandises sont distribuées quotidiennement aux animaux (après les manipulations et fin de journée) dans la litière et dans des dispositifs à friandises (tube, jouets...). Les fruits et légumes frais qui leurs seront fournis seront variés d'un jour à l'autre, tout comme la façon de les préparer, afin de stimuler les animaux. Un fond musical sera diffusé dans l'animalerie tout au long de la journée afin d'habitue les animaux à la voix humaine et de masquer les sons liés à l'utilisation quotidienne de l'animalerie. Toutes les procédures décrites dans ce protocole auront lieux sous anesthésie, accompagnées de mesures de soutien en fonction de la procédure en question. Par exemple, les prélèvements de moelle osseuse ou de liquide cérébrospinal seront précédés d'injection d'analgésique, les prélèvements pulmonaires seront accompagnés de monitoring dédié et de supplémentation en oxygène. Les animaux seront gardés sur coussin chauffant durant la procédure afin de ne pas occasionner d'hypothermie. Les volumes maximum de matrice biologique à prélever sont basés sur une analyse de la littérature disponible, ou sur les pratiques utilisées en clinique humaine le cas échéant. L'animal sera suivi par le personnel d’étude tout au long de l'anesthésie et surveillé au moment de son réveil ainsi que durant les heures suivantes. Un suivi clinique quotidien ainsi que la mise en place de points limites spécifique à chaque procédure permet d’évaluer quotidiennement le bien-être de l’animal. En fonction de la procédure réalisée, un score neurologique pourra aussi être réalisé, si nécessaire, les jours suivant les prélèvements afin d’assurer qu’il n’y ait pas de dommage neurologique.
Choix des espèces
Par leur origine phylogénétique, les primates non humains présentent une forte proximité avec les humains en termes de patrimoine génétique, de processus épigénétiques, d’organisation fonctionnelle de leur système nerveux et immunitaire, et de leurs principales caractéristiques physiologiques, cognitives et comportementales. Cette proximité permet de les utiliser dans le cadre de développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et/ou prophylactiques. Cette espèce est donc particulièrement utilisée pour tester l'efficacité ou la toxicité de drogues visant des processus biologiques spécifiques à l'homme ou aux espèces proches. Ces études peuvent couvrir les thérapies géniques ou cellulaires visant à corriger l'expression de gènes défectueux, les études infectieuses sur des virus n'infectant que l'homme ou certains primates, ou encore les thérapies visant le système nerveux central (la barrière hémato-encéphalique de l'humain étant très proche de celle du singe). Ce type d'étude nécessites la mise au point de méthodes d'analyses dédiées, pour lesquelles l'accès au matériel biologique de l'espèce cible est nécessaire. Ainsi, des études visant des maladies génétiques ou des leucémies auront besoin d'analyser la moelle osseuse des animaux, les études infectieuses de virus respiratoire (le singe étant le modèle de référence pour l'infection au SARS-CoV-2) auront besoin d'échantillons pulmonaires, et les études visant le système nerveux auront besoin d'échantillons de liquide cérébrospinal pour mettre au point leur méthode de dosage. Les mises au point et/ou test préliminaires de ce projet concerneront des candidats médicaments humains. Les animaux pourront être des juvéniles à mature, en fonction des besoins de l’étude. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou des matures en fonction des objectifs des études. Par exemple, des prélèvements de moelle osseuse peuvent chercher certaines populations de cellules précurseurs plus fréquentes chez le juvénile que chez l'animal mature.