Troubles cardiaques

192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteurs d'une dystrophie musculaire de Duchenne, ils reçoivent jusqu'à 510 injections sous-cutanées et des prélèvements de sang au sinus rétro-orbitaire, pour tester une immunothérapie peptidique. Le porteur décrit une maladie évolutive, avec perte de masse musculaire, faiblesse et défaillance cardiorespiratoire conduisant à une "euthanasie compassionnelle" entre six et treize mois. Il annonce, en cas de succès, un passage aux chiens dystrophiques puis aux enfants, et présente le rat comme un modèle "plus fidèle" que la souris.

Objectifs

La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie rare, rapidement invalidante, causée par des mutations dans le gène de la dystrophine (porté par le chromosome X). La dystrophine est une proteine clé dans le fonctionement et la survie des cellules musculaires. Le déficit en dystrophine induit donc une perte progressive de force dans les muscles, menant à la perte de la marche à un âge médian de 10 ans. L'atteinte des muscles de la ventilation et du muscle cardiaque produit une insuffisance cardiorespiratoire irrémédiablement fatale à l'âge médian de 20 ans. Il n'existe à ce jour aucune solution de guérison. Cependant, le traitement par les glucocorticoïdes, anti-inflammatoires puissants, largement répandu chez les enfants, permet de retarder significativement la perte de la marche et le décès d'environ 2 à 8 ans, mais avec le désavantage de provoquer parfois des effets indésirables qui dégradent la qualité de vie des patients. Depuis 5 ans, on assiste à une accélération de propositions de solutions therapeutiques (thérapies géniques ou molecules pharmacologiques) et on dénombre une cinquantaine d'essais cliniques en cours. Les mutations aboutissent à l'absence de dystrophine dans les cellules musculaires (en particulier cardiaque). Cette absence aboutit à une fragilité de ces cellules, ce qui se traduit tôt ou tard par une rupture de leur membranes, soumises aux forces latérales lors des cycles de contraction/relâchement. Il s'ensuit une mort des fibres musculaires à l'origine de la perte de force musculaire et une série de mécanismes secondaires délétères tels que l'inflammation chronique et la fibrose. Cette combinaison empêche les cellules souches musculaires de réparer durablement le muscle qui entre alors en sénescence (arrêt des cycles cellulaires qui aboutit à la mort). Dans ce contexte, notre objectif scientifique est de proposer une alternative aux traitements existants en apportant la preuve de principe préclinique de l'efficacité d'une immunothérapie innovante. Nous posons l'hypothèse que notre immunothérapie ciblant une protéine clé de l'inflammation est capable de ralentir la progression de la DMD, en luttant pour la première fois contre l'ensemble des mécanismes néfastes induits de sorte que les cellules souches du muscle échapperont à la sénescence précoce et poursuivront ainsi plus durablement leur contribution réparatrice.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet vise à obtenir des données robustes démontrant le bénéfice de l'immunothérapie innovante ciblant une proteine clé de l'inflammation sur le modèle original et pertinent du rat DMD développé au laboratoire qui reproduit plus fidèlement la maladie que les modeles classiques de souris. Le traitement testé permet de bénéficier simultanément de propriétés anti-sénescentes et anti-inflammatoires, sans les effets indésirables des corticoïdes actuellement utilisés dans le traitement de la DMD pour contrer l’inflammation. Le traitement testé devrait de surcroît améliorer la contribution des cellules souches à la réparation musculaire. À moyen terme et en cas de succès de cette immunotherapie sur le rat DMD, un essai sera ultérieurement programmé sur un nombre restreint de chiens DMD. Notre équipe dispose d'une expertise, d'une compétence et d'une base précieuse de données sur ces chiens, acquises antérieurement lors de l'évaluation d'autres stratégies thérapeutiques. Nous pourrons alors établir le potentiel de l'immunothérapie sur ce second modèle translationnel, hautement prédictif du succès d'un essai clinique chez l'humain. En cas de bénéfice évident chez les rats et les chiens, nous aurons contribué à produire des données précliniques robustes qui seront un argument fort pour accélérer le financement des essais cliniques chez les enfants atteints de DMD. À long terme, le bénéfice attendu est une amélioration de la qualité et de l'espérance de vie des enfants atteints de DMD. Notre immunothérapie est conçue en particulier pour remplacer les glucocorticoïdes en récapitulant voire en augmentant leurs effets bénéfiques, tout en annulant leurs effets secondaires.

Procédures

Les animaux reçoivent le candidat médicament par une injection quotidienne sous cutanée. Cela correspond à un nombre d'injections compris entre 21 (procédures 1, 2 et 3) et 510 (procédures 4 et 5). Les animaux seront prélevés au sinus rétro-orbitaire, 4 fois en un mois ou 7 fois en 17 mois selon les procédures. Chaque prélèvement dure moins de 2 minutes, réalisé par une personne très expérimentée. Avant ce prélèvement, l'animal est anesthésié par voie générale et locale et reçoit en plus une analgésie. L'évaluaton fonctionnelle privilégie les méthodes non invasives. Seule la mesure de force nécessite une anesthésie injectable, réalisée 1 fois pour les animaux des procédures 1 à 3 et 3 fois en 6 mois pour les procédures 4 et 5. Il n'y a pas de chirurgie prévue.

Impact sur les animaux

Il n'est attendu aucun effet indésirable majeur à la suite de l'injection du peptide NC-P7, y compris pour les doses élevées. L'immunothérapie par peptide présente l'intérêt majeur de ne pas produire de toxicité. En revanche, les rats R-DMDdel52 développent spontanément une dystrophie musculaire caractérisée par une perte significative et progressive de masse corporelle à partir de l'âge de 4 semaines. La perte de masse musculaire cause une faiblesse musculaire et une difficulté croissante à se mouvoir. Le fonctionnement du cœur et du diaphragme, principal acteur de la ventilation de repos, est également progressivement altéré, ce qui conduit à une déficience cardiorespiratoire progressive. Combinées, ces défaillances conduisent à la nécessité d'une euthanasie compassionnelle entre 6 et 13 mois d'âge. On assiste par ailleurs à un comportement de "freezing" chez les animaux, caractérisé par une absence de mouvements chez les animaux qui semblent se reposer plus que leurs congénères non atteints. Ce "freezing" survient par exemple lorsqu'on prend un animal dans les mains et qu'on le remet dans sa cage. Nous connaissons bien cette évolution de la maladie et ces comportements parfois atypiques, ce qui nous permet de les repérer immédiatement quand ils surviennent. Cela garantit une surveillance très rigoureuse et rapprochée des animaux. Une zootechnicienne est dédiée à cette surveillance. Par expérience des derniers mois, nous n'avons pas à intervenir sur des animaux avant l'âge de 6 mois. Les procédures 1, 2 et 3 de ce projet incluent des animaux jeunes chez lesquels les nuisances de l'évolution spontanée de la maladie sont faibles et ne semblent pas, en milieu confiné, poser de problèmes particuliers, facilement gérables. Les procédures 4 et 5 de ce projet incluent des animaux au-delà de 6 mois. Nous porterons une attention particulière à ces animaux.

Devenir

À l'issue des cinq procédures, tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques permettant d'évaluer à l'échelle microscopique l'efficacité du traitement sur les muscles prélevés (muscles des membres, diaphragme, cœur). Il est également essentiel de prélever les organes sentinelles d'une éventuelle toxicité (reins, foie, rate, poumons) et de les soumettre à une expertise anatomopathologique. La méthode précise de mise à mort des animaux est décrite dans le chapitre 3.3.3. Il est attendu que l'immunothérapie testée améliorera grandement l'état de santé des animaux et retardera la survenue des signes cliniques les plus sévères. Mais administrée seule dans un premier temps, l'immunothérapie n'empêchera pas totalement la nécrose des fibres musculaires. Les animaux vieillissants nécessiteront donc toujours une surveillance rapprochée et des compétences médicales pour décider du niveau de l'atteinte générale de l'animal et du recours à une euthanasie compassionnelle, par exemple en cas de décompensation cardiorespiratoire. Dans ce cas, l'euthanasie interviendra en anticipation de la mise à mort programmée des rats de l'étude. Les organes seront néanmoins récupérés sur les animaux euthanasiés, de sorte que tous les animaux, même morts précocement au cours de la procédure, pourront être inclus dans les analyses histologiques et anatomopathologiques.

Remplacement

L'expression de la cible CD38 dans le système immunitaire (monocytes, macrophages, lymphocytes T et B), le muscle, le système nerveux central, le tissu conjonctif a déjà été confirmée par de nombreuses expériences réalisées sur cellules, in vitro. Le ciblage de CD38 dans les maladies inflammatoires, cardiovasculaires, neurodégénératives, immunitaires ainsi que dans la lutte contre les effets indésirables du vieillissement a également été largement documenté. Les effets bénéfiques de la modulation spécifique de CD38 par l'immunothérapie brevetée par ENCEFA via le NAD, le cADPR et le NAADP boosting sur la réduction de l'inflammation (NAD), l'accroissement de la contractilité du cœur et des muscles et de leur métabolisme (cADPR) et la stimulation du flux autophagique (NAADP) ont également été mis en évidence sur de nombreux modèles cellulaires, puis sur des modèles de souris. Sur ces bases mécanistiques très robustes, nous souhaitons avec ce projet répondre à deux questions qui ne peuvent être obtenues que chez l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes en interrelation constante : quelle dose de NC-P7 faut-il injecter pour obtenir un engagement optimal de la cible CD38 dans le muscle (PK-PD) et quels effets bénéfiques sur l'éventail de mécanismes pathogènes ouvert par le processus dystrophique peut-on attendre d'un traitement précoce ou tardif, court ou long sur un modèle animal de dystrophie musculaire de Duchenne.

Réduction

Nous avons accumulé beaucoup d'expérience sur les lots de rats R-DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Pour certaines de ces études, nous sommes en train de rédiger les conclusions et avons déjà réalisé les analyses statistiques. Il apparaît que pour chacun des groupes, traiter 5 rats permet d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution fatale de la maladie. Le problème majeur auquel nous avons été confrontés est la sensibilité des animaux à l'anesthésie. Malgré nos soins, nous avons déploré l'absence de réveil chez quelques animaux. Il faut donc prévoir un animal supplémentaire par groupe de sorte qu'en cas d'accident anesthésique (essentiellement), on puisse traiter les données de 5 animaux arrivés au terme de la procédure. Par ailleurs, en raison de ce nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wildtype, WT) et R-DMD traités avec l'excipient, nous avons accumulé des données nombreuses qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages. Il est donc possible de réduire les cohortes de ces animaux et en cas de mort de l'un d'eux, de ne pas le remplacer. Au bilan, chacun des groupes a pu être réduit à 6 animaux. Nous avons pu réduire ce nombre à 4 pour la procédure 1 car l’intensité de la variation d'un biomarqueur tel que la créatine kinase qui présage de l’efficacité du traitement (et qui sera privilégié dans le cas de la procédure 1) est beaucoup plus forte.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Depuis janvier 2021, la température dans nos nouveaux locaux a été très bien maintenue dans la fenêtre 22 ± 2 °C, sauf lors de périodes courtes de réglages ou de pannes corrigées dans un délai court. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se lever. Les cages XL ont une surface de 2080 cm2 et une hauteur de 23 cm sur une moitié de la surface, soit 5 cm de plus que la réglementation. Nous sommes le premier laboratoire académique à utiliser ces cages. L'observation des animaux nous conforte dans la pertinence de ce choix : les animaux profitent pleinement de la hauteur pour se lever fréquemment sur leurs pattes arrière. Sur le plan fonctionnel, cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12 h par jour (5 h-17 h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage au début (3-4 semaines, animaux de 100 g ; nous préférons rester sous le seuil réglementaire de 10 pour des raisons de confort des animaux). Puis nous réduisons ce nombre progressivement jusqu'à atteindre 3 rats par cage pour les animaux de plus de 600 g (animaux WT au-delà de 5 mois, les R-DMD non traités n'atteignent jamais cette masse corporelle). L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft et des bâtons de bois à ronger ou des carrés de coton compacté. À tour de rôle, les groupes font également des séjours de quelques heures dans une grande cage de type "cage à furet" (Savic suite royale 95 double®). Cette cage de 6000 cm2 (le triple de leur cage habituelle) mesure 159 cm de hauteur. Elle est organisée en 3 niveaux, les deux plus haut accessibles via des échelles. Nous avons constaté que les rats s'y plaisent beaucoup et pratiquent une intense exploration du volume selon leurs capacités. Nous les filmons et mettons actuellement au point une méthode de quantification de ces mouvements spontanés, réduisant ainsi à terme la nécessité de les contraindre à des exercices imposés. Une fois validée, cette méthode permettra de réduire le nombre de tests fonctionnels, réservés aux mesures de force ou d'endurance par exemple.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat R-DMDdel52 mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle emblématique de la souris Mdx, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle canin GRMD. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format). Comme indiqué ci-dessus nous utiliserons : 1) des jeunes animaux sevrés reçus dans notre EU à l'âge de 3 semaines et après la semaine d'acclimatation, inclus dans nos cohortes d'étude à partir de 4 semaines pour les Procédures 1, 2 et 4 et à partir de 5 mois d'âge pour les Procédures 3 et 5. Les animaux âgés de 4 semaines sont choisis parce qu'ils correspondent au stade post-sevrage le plus précoce pour initier un traitement précoce dans la phase asymptomatique de la maladie. Les animaux âgés de 5 mois expriment déjà les signes cliniques de la maladie et sans traitement, devront être euthanasiés dans les 2 à 8 mois suivants. En cas d'efficacité du traitement durable chez ces animaux, il est attendu qu'ils récupèrent en partie de la maladie et le cas échéant, qu'ils survivent au-delà de l'âge de l'euthanasie habituel pour le groupe des rats DMD non traités (6 à 13 mois). Une réussite de ce traitement durable augurera d'une possibilité de proposer des essais cliniques avec cette immunothérapie.​

16 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées sévères. Chaque animal subit une première chirurgie de cinq heures pour créer un anévrisme de l'aorte abdominale, un scanner, puis une réparation endovasculaire de quatre heures avec pose d'endoprothèse, avant d'être euthanasié pour l'examen des stents. Le porteur énumère parmi les effets possibles douleur abdominale, infection, hernie, occlusion intestinale, paraplégie et hémorragie. Il compare un stent innovant au dispositif utilisé chez l'humain et reconnaît qu'un modèle 3D in vitro existe, tout en affirmant qu'il ne permet pas de tester le dispositif dans des conditions réelles.

Objectifs

Les anévrismes de l’aorte abdominale représentent une maladie fréquente de la population de plus de 65 ans, dont l’évolution, en l’absence de traitement, est la rupture d'anévrisme qui s’avère le plus souvent fatale. Lorsqu’un anévrisme atteint le segment viscéral de l’aorte, le traitement endovascualire de cette pathologie implique le recours à des endoprothèses fenêtrées qui sont fabriquées sur mesure pour s’adapter à l’anatomie du patient. Pour permettre aux organes viscéraux de rester perfusés tout en excluant l’anévrisme, nous avons recours à de stents couverts que l'on place en regard des trous (fenestrations) positionnés en face des branches artérielles majeures (reins et autres organes intra-abdominaux) afin de faire un pont entre l’endoprothèse et ces artères. L'objectif de l'étude est d'évaluer comparativement un stent novateur qui permet d'obtenir une parfaite étanchéité et permeabilité des branches artérielles cibles tout en limitant le nombre de geste endovasculaire au stent qui est actuellement utilisé chez l’Homme

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus par ce projet sont multiples. Premièrement, le design du nouveau stent est innovant et ce projet étudie ses performances in vivo. Les anévrysmes de l’aorte sont une maladie mortelle et difficile à traiter à l’étage para-rénal. L’innovation proposée par ce stent est de nature à simplifier grandement la procédure classique réalisée chez l’humain et donc d’améliorer significativement les résultats de la chirurgie. Ensuite, ce projet permet de mettre au point un nouveau modèle in vivo d’anévrysme para-rénal pour l’évaluation pré-clinique un dispositif médical implantable lors d’une procédure FEVAR (Exclusion endovasculaire d’un anévrysme de l’aorte à l’aide d’une endoprothèse sur mesure). Aucun modèle semblable n’a été décrit et il s’agit donc d’une avancée majeure dans le domaine de la recherche pré-clinique concernant les dispositifs médicaux en chirurgie vasculaire.

Procédures

Les animaux sont soumis à deux interventions. Création d'un anévrisme de l'aorte abdominale au niveau para-rénale (5H sous anesthésie générale) - un CT-scanner injecté sera réalisé avant et après la réalisation de l'anévrisme pour contrôler le geste et permettre la production d’une endoprothèse sur mesure. La seconde intervention consiste à réparer de manière endovasculaire, à l'aide d'une endoprothèse fenêtrée et de stents de jonction, l'anévrisme (4 H sous anesthésie générale).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables principaux attendus sur les animaux suivant la première procédure (création de l’anévrysme sont ceux d’une chirurgie majeure de l’espace rétro-péritonéal, à savoir : -Douleur abdominale les jours suivant l’opération (fréquent mais pris en charge médicalement) -Infection de site opératoire / Lymphocèle / Désunion de cicatrice (moyennement fréquent, mais prévention méicamenteuse) -Hernie Abdominale (moyennement fréquent) -Occlusion intestinale / Perte de poids (rare) -Paraplégie (très rare) -Hémorragie majeure / Rupture d’anévrysme (très rare) La seconde procédure (Réparation endovasculaire de l’anévrysme), consiste en un abord de l’artère iliaque droite puis d’une réparation endovasculaire de l’anévrysme. Les principaux risques attendus sont les suivants : -Douleur abdominale les jours suivant l’opération (fréquent mais pris en charge médicalement) -Hématome sous-capsulaire du rein (rare) -Occlusion / Dissection de l’artère rénale (rare) -Occlusion / Sténose / Dissection de l’artère iliaque droite (rare) -Infection de site opératoire (très rare).

Devenir

Les animaux seront gardés en vie à l'issue des procédures de création et de traitement endovasculaire de l'anévrisme abdominale péri-rénale afin de pouvoir faire l'évaluation comparative de la performance des tents périphériques BGF et BGP. A l'issue de la troisième intervention, qui consiste en l'avaluation du traitement endovasculaire de l'anévrisme, les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir faire une évaluation anatomopathologique de ces stents dans la prothèse et dans les artères rénales.

Remplacement

Dans le cadre de cette évaluation pré-clinique, nous effectuons également des tests in vitro du dispositif sur modèle 3D d’anévrysme aortique patient-spécifique. Cette approche pourrait constituer une alternative à l’utilisation d’animaux, mais elle ne permet pas de tester le dispositif dans des conditions réelles d’utilisation. Cette approche permet néammoins de limiter le nombre d’animaux nécessaires à l’évaluation pré-clinique in vivo, car différents tests de conformabilité à l’anatomie seront réalisés sur les modèles 3D. En revanche l’étude des fuites ainsi que la réaction des artères à la mise en place du dispositif par exemple, ne peuvent être testées uniquement sur un large modèle animal.

Réduction

En faisant l’hypothèse d’une fréquence d’effets indésirables de 10% par groupe, il est nécessaire d’inclure 12 porcs (pour une puissance de 99% et un risque alpha de 3%) pour obtenir un nombre de sujets mimum. D’après les résultats de la littérature sur les modèles animaux d’anévrysme et compte tenu des résultats de la première phase de l’étude, un ou deux décès sont attendus au cours du suivi. En conséquence le nombre d’animaux devant subir la création de la pathologie doit-être incrémenté de deux porcs. Toutefois, dès que le nombre de 12 animaux sera atteinte, les inclusions seront stoppées. En conséquence, un total de 14 animaux maximum est pressenti pour cette étude. Les tests de faisabilité ayant été réalisés lors de la première phase de l’étude, aucun animal supplémentaire n’est nécessaire.

Raffinement

Période d’acclimatation d’une semaine minimum entre l’arrivée à l’animalerie du laboratoire et l’inclusion dans le protocole de recherche. Hébergement en groupe pour favoriser le contact régulier entre congénères. Environnement adapté à chaque phase de l’expérimentation pour réduire l’angoisse des animaux (accompagnement et anxiolyse durant le transfert depuis l’animalerie jusqu’en salle d’intervention). L'environnement est enrichi (activité de fouissement encouragée, medecine ball, jeux dans le couloir, pesée sous forme de jeux avec récompense, planche à gratter, distributeur d’aliment). Contrôle quotidien par un animalier. Lors de ce contrôle, des observations basées sur l’apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales attendues aux stimuli externes (peu enclins aux manipulations, tentative de fuite) seront réalisées. Ces contrôles permettront de repérer tout animal malade ou blessé et de prendre les mesures appropriées. Avant l'anesthésie générale, les animaux auront une injection intra musculaire afin d’obtenir une sédation vigile et une anxiolyse. L'ensemble des procédures expérimentales sont réalisées sous anesthésie générale balancée (narcose, analgésie et curarisation).

Choix des espèces

Le niveau de chirurgie complexe ne permet pas d’utiliser de petits animaux, et le matériel endovasculaire n’est pas évaluable dans de petites dimensions car les phénomènes d’écoulement de fluies sanguin ne seraient pas réalisables sur petit animal. De plus, notre projet est une étude de l’efficacité d’un stent avant son application chez l’humain. De ce fait, ce projet doit être réalisé sur une espèce animale présentant des caractéristiques anatomiques et physiologiques comparables à l’humain. Parmi les différentes espèces animales, le porc a des paramètres physiologiques comparables à l’humain. Les animaux utilisés seront de jeunes mâles adultes (65-80 kgs). L’utilisation de porcs de cette envergure permettra de s’affranchir des modifications de taille au cours du suivi qui pourraient modifier les dimensions de l’aorte dans laquelle nous aurions déployé l’endoprothèse et les stents. Une telle éventualité compromettrait artificiellement l’efficacité de la procédure endovasculaire et donc fausserait les résultats.

380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les expérimentateurs percent leur tube digestif sous anesthésie pour déverser les selles dans l'abdomen et provoquer une péritonite, puis suivent la défaillance cardiaque par échographie avant de prélever le cœur. Le porteur indique que l'infection peut provoquer stress, perte de poids et baisse de mobilité, et estime que garder ces souris en vie ne serait pas éthique vu la sévérité des procédures. Sur le remplacement, il affirme qu'étudier le tissu cardiaque lui-même est "indispensable" et que ni les essais en tube à essai ni la modélisation informatique ne peuvent mimer l'infection de façon fiable, ce qui rendrait "nécessaire" le recours à la souris.

Objectifs

Les infections sont des maladies extrêmement fréquentes et potentiellement graves. Dans leur forme la plus sévère (sepsis), l’inflammation provoquée par l’infection touche le corps entier et peut nuire au fonctionnement des différents organes, dont le cœur. Ce mauvais fonctionnement du cœur ne répond pas toujours au traitement par antibiotique. Il n’existe pas de traitement à ce jour qui traite spécifiquement l’inflammation responsable de la dysfonction du cœur au cours d’une infection sévère. Notre premier objectif est d’étudier cette dysfonction cardiaque induite par le sepsis. Pour cela, nous utiliserons un modèle d’infection sévère chez la souris. Les souris seront opérées sous anesthésie générale (elles seront endormies) afin de créer un petit trou dans leur tube digestif qui permettra aux selles de se déverser dans l’abdomen provoquant ainsi une infection appelée péritonite. Les souris ainsi infectées recoivent des anti-douleurs, et du liquide pour maintenir leur pression arterielle. Ce modèle a déjà été utilisé par plusieurs équipes et l’inflammation qu’il engendre provoque une dysfonction cardiaque similaire à celle observée chez l’homme. Nous pourrons ensuite caractériser le fonctionnement du cœur par échographie. Notre second objectif est d’étudier les paramètres de l’inflammation responsables de la dysfonction du cœur. Pour cela, les cœurs des souris infectées comme précédemment décrit seront prélevés et analysés après le décès de la souris et nous déterminerons quelles sont les protéines de l’inflammation qui sont exprimées à l’intérieur du cœur au cours de l’infection. Enfin, notre troisième objectif est de tester des traitements ciblant les protéines de l’inflammation qui auront été trouvées dans les cœurs des souris infectées. Nous injecterons aux souris infectées ces traitements par une piqure sous la peau et comparerons à des souris infectées traitées par placébo. Les points de comparaison reposeront sur l’analyse par échographie de la fonction du cœur et sur la survie des souris à l’infection.

Bénéfices attendus

Les infections sont très fréquentes en santé humaine et potentiellement graves avec un taux de décès élevé. Le décès peut être en lien avec des organes qui ne fonctionnent plus, dont le cœur, à cause de l’inflammation qui s’est propagée dans tout le corps et ce malgré un traitement antibiotique. A ce jour, aucun traitement spécifique n’existe pour soigner ce mauvais fonctionnement du cœur dû à l’infection. Notre travail permettra de mieux décrire cette dysfonction du cœur au cours de l’infection, de comprendre à quoi elle est due précisément et d’évaluer finement l’efficacité sur cette atteinte du coeur de traitements contre l’inflammation. En cas de résultats encourageants, notre étude ouvrira la porte à des études de ces traitements chez l’Homme

Procédures

Les souris sont opérées sous anesthésie générale. Elles sont endormies grâce à un gaz anesthésiant. La durée de la chirurgie est d’une dizaine de minutes. Une injection dans le ventre (intra-péritonéale) de médicament contre la douleur est réalisée avant la chirurgie et répétée toutes les 12 heures après pour les souris encore en vie. Dans la procédure qui teste les traitements, les souris les reçoivent soit par une injection dans le ventre soit par une prise orale, selon le mode de fonctionnement du médicament.

Impact sur les animaux

Les souris pourront ressentir une douleur après la chirurgie liée à l’ouverture du ventre. Celle-ci est prévenue par des médicaments contre la douleur qui sont systématiquement donnés. L’infection peut provoquer un stress, une perte de poids, une diminution ou augmentation de la température corporelle, une diminution de la mobilité des souris ou un défaut de leur toilettage. Les traitements seront administrés par injection dans le ventre ou sous la peau ou par la bouche. Les souris pourront ressentir un stress lié à la contention et une douleur liée à la piqûre.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure. En effet, il s’agit de procédures sévères, il ne serait donc pas éthique pour le bien être animal de les garder en vie.

Remplacement

L’étude de la fonction du cœur chez l’Homme au cours des infections sévères a été déjà réalisée de manière aussi complète que possible avec des analyses non-invasives. Cependant, pour aller plus loin dans la compréhension de ce phénomène, il est indispensable d’étudier le tissu du cœur en lui-même, or cela n’est pas possible chez l’Homme. Il n’existe pas à ce jour d’expérience dans les tubes à essais ou de modélisations sur l’ordinateur qui pourraient mimer l’infection de manière fiable car celle-ci a plusieurs causes et se propage dans tous le corps mettant donc en jeu des mécanismes complexes. De plus, il n’est pas éthique de tester des médicaments directement chez l’Homme. Ces raisons rendent nécessaire le recours à des modèles animaux.

Réduction

L’ensemble des études déjà réalisées sur le sujet dans le monde sera étudié avant de débuter les expérimentations animales. Ainsi, tous les traitements déjà essayés et non-efficaces ne le seront pas à nouveau ce qui permettra de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Nous n’étudierons que les animaux mâles car il a été montré que la mauvaise fonction du cœur au cours de l’infection était plus fréquente chez eux. Ainsi, cela permettra de ne pas inclure des femelles qui pourraient ne pas présenter de dysfonction du cœur et donc ne pas être analysées dans la suite du travail. L’étude de la fonction du cœur se fait par échographie ce qui est non-invasif pour la souris. Ainsi, les échographies peuvent être répétées chez une même souris au cours du temps sans avoir besoin de la mise à mort ce qui permet également de réduire le nombre d’animaux. L’analyse de l’expression des protéines de l’inflammation dans le cœur lui-même est une technique performante qui détecte un grand nombre de protéines en utilisant un nombre très faible d’animaux. L’analyse préalable de ces protéines guidera les traitements qui seront ensuite testés : seuls les traitements dirigés contre les protéines exprimées dans le cœur des souris au cours de l’infection seront testés. Grâce à une analyse statistique, nous réduisons au minimum le nombre de souris utilisées tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs c'est à dire qui nous permettent de conclure de manière fiable sur le plan mathématique. Nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d’analyses possibles à partir d’un même animal. Tous les organes prélevés sont congelés pour pouvoir les réanalyser au besoin ultérieurement.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi c'est à dire avec des cotons pour jouer par exemple, avec une semaine d’adaptation avant l’expérimentation. Un suivi quotidien sera réalisé avant le début de l’expérimentation puis toutes les six heures dès que celle-ci aura commencé. La chirurgie est réalisée sur une souris anesthésiée.. La douleur post opératoire est systématiquement prévenue par l’administration d’un médicament contre la douleur avant la chirurgie et au bout de 12 heures. Les souris seront mises à mort si leur état se dégrade brusquement ou si elles présentent un état de souffrance. Une grille de score est prévue à cet effet qui sera également remplie toutes les heures dès le début de l’expérimentation.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme espèce animale pour réaliser les expériences de ce projet est pertinent car l’infection sévère chez la souris est très proche de celle chez l’Homme. Ce modèle est utilisé depuis de nombreuses années dans la littérature scientifique. Les souris utilisées seront des souris mâles car le mauvais fonctionnement du cœur au cours de l’infection sévère est plus fréquent chez les souris mâles. Ces souris seront des souris adultes de 8 à 12 semaines car nous nous intéressons à l’infection sévère chez les humains adultes