Troubles cardiaques

154 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 114 tués à l'issue et 40 reproducteurs maintenus en vie pour l'élevage. Modèles de la myopathie de Duchenne, ils reçoivent des injections intracardiaques ou intramusculaires de cellules souches humaines et un traitement immunosuppresseur, et subissent des prélèvements sanguins, des échographies et des tests musculaires, avant la mise à mort de la plupart pour prélever muscles et organes. Le porteur affirme n'attendre pas d'effets indésirables majeurs de ces injections, en s'appuyant sur des essais antérieurs chez le chien. Il justifie le rat dystrophique par les limites du modèle souris et le coût du modèle chien.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne est la plus fréquente des dystrophies musculaires avec un garçon nouveau-né sur 3500. C’est une maladie génétique caractérisée par une mutation du gène codant une protéine musculaire : la dystrophine et entrainant son absence dans les fibres musculaires. Ceci entraîne une destruction des fibres puis le remplacement du muscle par du tissu fibreux et graisseux. Cliniquement, une réduction de la masse musculaire et une faiblesse musculaire sont observées conduisant au décès des patients vers l’âge de 20-30 ans. Il n’existe aucun traitement de la maladie à ce jour. L’injection de cellules saines fait partie des orientations thérapeutiques prometteuses. L’identification de populations de cellules souches au sein de tissus adultes ces dernières années et la démonstration de leur potentiel myogénique (capacité à régénérer des fibres musculaires, à en former de nouvelles ou des progéniteurs myogéniques de réserve) offrent des perspectives intéressantes. Notre équipe a isolé une population de cellules souches dérivées du muscle squelettique (cellules MuStem) et démontré son efficacité chez le chien malade en montrant des propriétés phénotypiques (propriétés à exprimer un ensemble de marqueurs de lignées cellulaires) et comportementales similaires à celles décrites pour la population canine. L’objectif du projet est de poursuivre la caractérisation des potentialités de la population hMuStem pour renseigner si celle-ci peut être présentée comme un support de biothérapie innovante pour les dystrophies musculaires. Pour cela, nous souhaitons déterminer l’innocuité (absence de caractère nuisible) et l’efficacité de son administration dans la circulation sanguine chez le rat dystrophique (DMDmdx). Ce modèle se révèle être un très bon modèle animal de la DMD pour réaliser les 1ères phases d’évaluation de nouveaux produits thérapeutiques. C’est la raison pour laquelle l’étude de biodistribution (dissémination au sein de l’organisme avec étude du comportement de l’agent à coloniser les tissus musculaires et/ou s’accumuler dans les organes filtres comme le poumon, le foie ou encore le rein) et d’impact de la population hMuStem sur la fonction et la reconstruction du muscle a été définie dans ce modèle.

Bénéfices attendus

Le projet décrit ici repose sur un ensemble conséquent de résultats in vitro et in vivo (chien, rongeurs, primate-non-humain) acquis progressivement ces 12 dernières années et qui tendent à montrer un potentiel thérapeutique des cellules MuStem dans le cadre de la prise en charge des affections musculaires et en particulier de la DMD. Pour progresser sur la qualification de cet agent dans le but de statuer sur son positionnement ou non comme médicament innovant, des données in vivo sur sa biodistribution et son efficacité de réparation musculaire (fonction et tissu) en contexte dystrophique sont fondamentales à ce stade du programme de recherche et pourraient permettre de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique pour une pathologie musculaire qui reste à ce jour sans traitement curatif.

Procédures

Partie I : (i) Les animaux recevront les cellules hMuStem par injection intracardiaque (IC) unique, sous anesthésie générale et analgésie, plus contrôle échographique. Durée : 2 min. (ii)3 prises de sang en ante mortem, sous anesthésie, au niveau de la veine cave. Durée : 1 min. (iii)4 animaux supplémentaires auront une injection intraveineuse de produit de contraste afin de calibrer le protocole d’administration par voie IC sous contrôle échographique, pendant l’anesthésie générale préalablement au sacrifice. Durée : 1 min. Partie II : (i) Les animaux recevront les cellules hMuStem, en une seule fois, par injection intramusculaire (2 injections sur 3 muscles différents d’un membre), sous anesthésie générale et analgésie. Le même protocole d’injection sera mené sur le membre opposé avec du sérum physiologique. Durée : 10min (ii)3 jours au préalable, un traitement immunosuppresseur sera administré par voie sous-cutanée (SC) sur animaux vigiles ou sous légère tranquillisation, à raison de 4 injections à 10 jours d’intervalle. Durée : 3min (iii)5 prises de sang sur animal tranquillisé, à la veine jugulaire ou sous anesthésie avant sacrifice, au niveau de la veine cave. Durée : 1 min. Partie III A : (i) Les animaux recevront les cellules hMuStem ou du sérum physiologique sous forme de 3 IC espacées de 6 à 9 jours, sous anesthésie générale et analgésie. Durée : 2 min. (ii)un traitement immunosuppresseur identique à la Partie II (iii)prises de sang : n= 6 pour les suivis 2 mois, n=8- pour les suivis 4 mois. (iv) Un électrocardiogramme (ECG) et une échocardiographie en pré- injection, et avant sacrifice. Durée : 2 min (v)Une évaluation musculaire : 2 tests d’exploration fonctionnelle (test d’agrippement et test d’endurance) et un test d’évaluation motrice (test d’actimétrie) seront réalisés sur chaque animal à raison d’une fois au cours de son suivi . Durée : 25 min. Partie IIIB : Même protocole que la partie IIIA, mais avec un suivi des animaux de 7mois post injection. Les interventions seront donc identiques mais en nombre plus élevés : (i) prise de sang : n=11 (ii) 4 ECG et 4 échocardiographies en pré-injection, J60, J120 et J210 (iii) 3 évaluations musculaires (motrices et fonctionnelles) à J60, J120 et J210

Impact sur les animaux

L’administration par voie intra-cardiaque des cellules hMuStem ne devrait pas occasionner d’effets indésirables si on s’en réfère aux résultats que nous avons obtenus précédemment avec ce type cellulaire dans le cadre de protocoles d'injection systémique (intra-artérielle et intraveineux) chez le chien dystrophique. Néanmoins, nous serons attentifs à la formation d’agrégats cellulaires comme cela a été relaté pour d’autres types cellulaires, lesquels peuvent être à l’origine de troubles de la circulation sanguine. L’administration intra-musculaire des cellules hMuStem induira un dommage local avec le passage de l’aiguille. La mise en place du traitement immunosuppressif par voie sous cutanée ne devrait pas non plus occasionner d’effets indésirables majeurs mais un point de vigilance sera porté sur l’apparition d’éventuels dérèglements biochimiques et/ou hématologiques. L’échocardiographie et l’électrocardiogramme, les tests de force et d’endurance et le test d’actimétrie sont des techniques d’abord non invasives pour lesquelles il n’est pas identifié d’effet indésirable.

Devenir

A l'issue des procédures décrites dans ce projet, tous les animaux inclus dans cette étude (n=114 maximum) seront euthanasiés afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses qui ne peuvent pas se faire du vivant de l'animal. Les prélèvements concerneront certains muscles squelettiques, diaphragme, coeur et organes filtres correspondant au poumon, foie, rein et rate, et comporteront au moins 4 fragments par tissu. Seuls les animaux reproducteurs, au nombre de 40, seront maintenus en vie pour maintenir la production de l'élevage de rats DMDmdx.

Remplacement

Il ne sera pas possible dans cette étude dans la mesure où il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pertinente et robuste pour tester l’effet d’un traitement de médecine régénérative in vivo. L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact de cette thérapie dans différents organes et sur le phénotype de l’animal malade.

Réduction

Le nombre d’animaux qui a été fixé par groupe dans les 3 parties du projet repose sur notre expérience précédente dans la mise en place de protocoles de médecine régénérative lors desquels nous avons pu obtenir des résultats cohérents et reproductibles. Ainsi, ces nombres, validés par un agent agrégé en biostatistiques, sont minimaux et permettent d’assurer la robustesse (au sens de l’analyse statistique) des résultats sans être excessif en termes d’animaux à inclure. Les jeux de données acquis seront analysés selon des modèles linéaires généralisés qui pourront être complétés par des analyses multivariées type « analyse factorielle multiple - AFM. Par ailleurs, le projet a été structuré en 3 parties séquentielles afin de réduire au maximum l’utilisation d’animaux dans le sens où les parties I (biodistribution) et II (preuve de concept) seront déterminantes pour la suite du projet.

Raffinement

En ce qui concerne le raffinement (3R), le bien-être animal passera par : - de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation avec enrichissement du milieu (tunnels en cartons ou PVC, frisottis de papier, bûchettes de bois et hébergement à deux animaux). - un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement), - l'instauration de points limites pertinents avec mise en place de mesures adaptées (anesthésies, analgésie ou euthanasie), - une réactivité accrue du personnel animalier avec mise en place d’une grille d'évaluation de la douleur par une liste de comportements /constatations à évaluer dès que nécessaire pour détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates - la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions (anesthésie et analgésie).

Choix des espèces

Les modèles animaux de la DMD les plus souvent utilisés sont des modèles rongeurs et plus spécifiquement le modèle de la souris mdx. Ce modèle souffre néanmoins de sérieuses limitations, notamment la mise en place de mécanismes de compensation aboutissant à des lésions musculaires très limitées et une faiblesse musculaire quasiment inexistante. Ces éléments limitent grandement la transposition des résultats obtenus sur ce modèle à l’Homme. Le chien Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD) présente des lésions tissulaires proches de celles retrouvées chez les patients DMD, mais reste un modèle de gros animal coûteux et lourd à manipuler. Ainsi, le choix du modèle de rat DMDmdx s’avère pertinent dans le sens où ce dernier présente un phénotype fonctionnel et tissulaire proche de celui décrit chez le patient DMD, caractérisé par une nécrose des fibres musculaires, une fibrose, une adipose ainsi qu’une faiblesse musculaire et une cardiomyopathie dilatée. Les rats seront inclus à l’âge 2 mois afin de se placer dans un contexte de lésion musculaire suffisamment avancé pour pouvoir détecter un éventuel effet sur la fonction musculaire et/ou le remodelage tissulaire. Par ailleurs, la mortalité des rats DMDmdx étant observée particulièrement à partir de 8 mois d’âge, il était important que l’inclusion des animaux se fasse précocement pour être en mesure d’avoir un suivi de l’impact éventuel sur une période satisfaisante mais aussi de possiblement observer une répercussion sur la durée de vie des animaux traités.

338 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur cœur est irradié à des doses faibles à modérées, puis leur fonction cardiaque est suivie par échographie, électrocardiogramme et stimulation transœsophagienne sous anesthésie, sur une durée pouvant atteindre quinze mois. Le projet cherche à comprendre les troubles du rythme observés après radiothérapie du sein droit chez les femmes. Le porteur affirme que l'irradiation à faibles doses n'entraîne ni douleur ni brûlure et fixe un point limite de mise à mort à 20 % de perte de poids.

Objectifs

Après une exposition du cœur à des rayons X (comme dans le cas de la radiothérapie pour les cancers du sein), des problèmes cardiaques (troubles du rythme, insuffisance cardiaque) peuvent être observés. Notre hypothèse est que le développement de ces troubles cardiaques est lié à l’irradiation par des doses faibles à modérées de petites structures du cœur. L’objectif du projet est d’obtenir de nouvelles connaissances sur l’effet d’une exposition de doses faibles à modérées d’irradiation et de constater de façons fonctionnelle, cellulaire et moléculaire les effets de cette irradiation sur le système nerveux sympathique cardiaque et sur le développement de troubles du rythme radio-induite à long terme ; afin d’améliorer et d’actualiser les connaissances en radioprotection.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’un projet multi-site se déroulant sur 2 EU différents. Ce projet permettra d’obtenir de nouvelles connaissances d’un point de vue mécanistique sur l’effet d’une exposition de doses faibles à modérées d’irradiation du système nerveux sympathique cardiaque et sur le développement de troubles du rythme radio-induite afin d’améliorer et d’actualiser les connaissances en radioprotection et plus particulièrement chez des patientes cancer du sein : 1) Confirmer les données épidémiologiques de développement de trouble du rythme post-irradiation du sein droit. 2) Obtenir des données de caractérisation structurale, cellulaire, moléculaire ainsi que des mécanismes impliqués dans le remodelage du tissu cardiaque à des doses faibles à modérées d’irradiation pouvant conduire à des maladies cardiaques et surtout des problèmes de rythme cardiaque. 3) Définir un seuil dose/effets sur le développement d’un trouble du rythme dans ce modèle expérimental avec l'utilisation d'une gamme de doses allant de 250 à 2000 mGy, Tous ces résultats permettront d’améliorer, d’actualiser les connaissances sur les effets de la radiothérapie sur les femmes traitées pour un cancer du sein droit.

Procédures

Plusieurs interventions seront réalisées sur les souris notamment une irradiation localisée sous anesthésie. L’irradiation à de faibles doses n’entraine pas de douleur ni de brulure aux animaux, seules des modulations d’expression protéique et une légère diminution de la fonction cardiaque a été observée à long terme. Les animaux seront suivis par échographie doppler sous anesthésie pour contrôler leur fonction cardiaque, leur rythme cardiaque (ECG) et enfin une mesure de stimulation transoesophagienne sous anesthésie sera également réalisée pour se rendre compte d’un potentiel trouble du rythme.

Impact sur les animaux

L’irradiation à de faibles doses n’entraine ni douleur ni brulure pour les animaux que ce soit pendant l’irradiation ou après. Seules des modulations d’expression protéique et une légère diminution de la fonction cardiaque ont été observée à long terme. Les anesthésies sont réalisées pour chaque intervention sous isoflurane, sauf la stimulation transoesophagienne qui nécessite une injection d’anesthésique. Les anesthésies sont répétées mais éloignées dans le temps évitant l’apparition d’effets secondaire indésirable chez les souris.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés en fin de procédure afin de pouvoir réaliser des prélèvements sanguins et des analyses tissulaires, cellulaires et moléculaires.

Remplacement

Pour mimer des modèles d’irradiations localisées au niveau cardiaque comme lors des cancers du sein, il est nécessaire d’avoir recours à un modèle intégré pour comprendre la réponse des doses faibles à modérées sur le développement des troubles du rythme post-irradiation à long terme. L’évaluation de la fonction cardiaque par échodoppler, nécessite des modèles murins. De plus, les études in vitro présentent des limites pour l’évaluation des mécanismes au niveau cellulaire après une exposition à des doses faibles à modérées et ne permettent pas d’identifier des processus de développement de la maladie. En effet, il est très difficile de maintenir des cultures cellulaires au-delà de 3 semaines dû au vieillissement cellulaire et aux cycles limités des cellules.

Réduction

Au total, 338 animaux seront utilisés dans ce projet. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé en utilisant un logiciel « GPower » qui calcul le nombre d’animaux suffisant pour obtenir la meilleure puissance statistique avec le nombre minimum d’animaux. L’analyse indique que 8 animaux/groupe pour les mesures de stimulation électrique de la partie haute du cœur et l’étude de la fonction cardiaque par Echographie doppler pour observer les effets attendus. Néanmoins si on considère une mortalité possible due à la longévité des souris pour nos groupes qui seront gardés pendant 15 mois post-irradiation, on constituera des groupes de 10 animaux pour conserver un nombre d’animaux suffisant pour nos analyses statistiques

Raffinement

Tout signe de prostration de l’animal, de blessures importantes dues aux bagarres entrainera l’euthanasie anticipée. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne sera effectuée par les zootechniciens et hebdomadaire par le porteur de projet. Si le comportement d'un animal est altéré, il sera pesé avec un point limite à 20% de perte de poids constituent un point limite, ainsi que l’observation des certains signes d’atteinte de l’état général.

Choix des espèces

Pour mimer des modèles d’irradiations localisées au niveau cardiaque comme lors des cancers du sein, il est nécessaire d’avoir recours à un modèle intégré pour comprendre la réponse des doses faibles à modérées sur le développement des troubles du rythme post-irradiation à long terme. Notamment l’évaluation de la fonction cardiaque par écho-doppler nécessite des modèles animaux. Les souris seront âgées de 2 mois (8 semaines) au moment de l’irradiation car à cet âge leur système nerveux sympathique cardiaque est mature. Les animaux arriveront entre 4-6 semaines pour limiter les bagarres. Le sexe des animaux doit être justifié, en particulier si un seul des deux sexes est sélectionné. Des souris C57BL/6J femelle seront utilisées pour mimer les femmes traitées par radiothérapie dans les cas de cancer du sein.

150 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Répartis en cinquante protocoles de trois animaux, ils reçoivent une injection sous-cutanée d'antigène couplé à l'adjuvant complet de Freund puis trois prélèvements de sang, avant mise à mort à dix jours, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur reconnaît que l'injection peut provoquer des ulcérations au point d'injection, de la fièvre et un inconfort. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est aussi efficace et présente la production sur animal vivant comme "indispensable", au service d'une activité commerciale répondant aux "besoins" des laboratoires.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole envisagé est particulier, car il vise à récupérer uniquement les anticorps générés lors d'une réponse primaire. Par conséquent, la procédure expérimentale est plus courte que des protocoles classiques d'obtention d'anticorps polyclonaux et ne nécessitera qu'une seule injection. Les anticorps seront récupérés à l'aide de prélèvement d'échantillons de sang, dont les volumes seront adaptés au poids de l'animal en suivant des recommandations. Le protocole durera 10 jours, ce qui est plus court que les protocoles classiques de 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation d’une subtsance médicamenteuse. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe. Afin de répondre aux besoins exprimés par différentes équipes de recherche, 50 protocoles sont envisagés.

Procédures

1 injection en sous cutanée de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) 3 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en sous-cutanée couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 2% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J10.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (3 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'acépromazine, qui possède un effet tranquilisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

390 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une microchirurgie de 45 minutes, avec ablation d'un rein puis clampage de l'artère et de la veine du rein restant pendant 30 minutes pour provoquer une ischémie, suivie de prélèvements sanguins et de traitements quotidiens pendant sept jours. Le porteur indique que la chirurgie peut entraîner des douleurs, une perte de poids et la mort sous anesthésie chez les animaux âgés, les souris perdant plus de 20 % de leur poids étant mises à mort. Il affirme que la complexité physiologique ne peut être reproduite in vitro et présente ce modèle comme un moyen de réduire l'échec des candidats médicaments en clinique.

Objectifs

10% de la population mondiale est atteinte de maladie rénale chronique (CKD). Cette condition pathologique caractérisée par de nombreuses atteintes tissulaires au niveau rénale conduisent à la perte de fonction de l’organe et des décès prématurés due à des problèmes cardiovasculaires. Cependant, les mécanismes et facteurs impliqués dans l’accélération de la maladie sont encore mal identifiés. A ce jour, il n’existe encore aucune thérapie permettant de soigner ou de limiter l’avancement des maladies rénales chroniques. Malgré une intensification des efforts de recherche dans le développement de nouveaux médicaments, les industriels pharmaceutiques font face à un taux très important d’échec dans les phases de tests cliniques sur l’Homme. Une raison avancée à ces taux d’échec clinique élevés est une faible pertinence des modèles expérimentaux utilisés lors des phases précliniques. En effet, les modèles utilisés couramment ne permettent pas de reproduire les conditions observées chez l’Homme et manque de pertinence physiologique. L'objectif de ce projet est de mettre en place un nouveau modèle expérimental de souris afin d'évaluer l'efficacité de médicaments ciblant les lésions rénales aïgues. Le modèle de souris développé dans ce projet permettra d'améliorer la prédiction d'efficacité de nouveaux candidats médicaments afin de limiter la progression des maladies rénales chez l'Homme.

Bénéfices attendus

La mise en place et le succès de ce projet permettra de proposer un nouveau modèle expérimental in vivo qui exprime une série de désordres physiologiques retrouvés chez l’Homme. Ainsi les tests précliniques d’efficacité de nouveaux candidats médicaments pour le traitement des maladies rénales, pourront être réalisés sur un modèle pertinent d’un point de vue physio-pathologique avec le but de réduire le taux d’échec d’efficacité des candidats médicaments pendant les phases cliniques.

Procédures

Chaque animal subira : - 1 seule procédure de microchirurgie d'une durée totale d'environ 45 min: Laparotomie, ablation du rein droit, puis clampage de l'artère et de la veine rénale du rein gauche pendant 30 minutes (ischémie). Déclampage puis suture de l'abdomen (muscle et peau). - prélèvements sanguin quotidien (sur 7 jours) de 20 à 100 ul de sang par légère incision au niveau de la queue ou via une ponction de la veine faciale (durèe environ 1 min par animal). - traitements quotidien par les candidats médicaments pendant 7 jours consécutifs (durèe inférieure à 1 min par animal).

Impact sur les animaux

Les animaux qui interviendront dans ce projet subiront des effets indésirables liés à la procédure de microchirurgie. Ces effets indésirables ont été classés par ordre décroissant de gravité et de probabilité : - Lésions du rein ayant subit la procédure d’ischémie reperfusion. La conséquence est une réduction significative de la fonction de ce rein après quelques semaines. - Douleurs liées à la microchirurgie, notamment à l’incision cutanée et musculaire pour l’accès au rein à clamper - Anesthésie profonde pouvant entraîner la mort chez les animaux âgés - Perte de poids après chirurgie - Lésions vasculaires au niveau du clamp pouvant entraîner une mauvaise reperfusion de l’organe

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort et disséqués afin de collecter le rein pour des analyses histologiques.

Remplacement

En parallèle des modèles expérimentaux basés sur l'utilisation d'animaux (rongeurs), nous travaillons au développement de modèles in vitro basés sur la culture de cellules rénales humaines. Cependant, ces modèles in vitro ne peuvent pas substituer l'importance des observations réalisées par les tests sur animaux. En effet, la complexité physiologique et les réponses systémiques aux candidats médicaments ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Réduction

Les procédures chirurgicales et expérimentales seront basées sur les protocoles détaillés dans la littérature. Sur la phase de test de produits pharmaceutiques, un nombre de 13 souris par groupe de composé testé sera utilisé. Ce nombre a été déterminé en fonction du risque de perte lors de la procédure chirurgicale, et de l'efficacité hétérogène des interventions chirurgicale. Celui-ci est estimé à 30% de perte ou absence de réponse. De ce fait, avec 13 souris par groupe au départ, nous pourrions envisager un nombre de 9 souris par groupe en fin de procédure de traitement. Ce nombre sera suffisant pour effectuer des observations scientifiquement et statistiquement pertinentes. Les effets des candidats médicaments seront évalués par comparaison avec les groupes traités par le solvant seul. Les données enregistrées seront analysées par des tests statistiques appropriés : - Pour des données uniques en fin d'expérimentation, il seront analysés par ANOVA 1-way ou par le test de Kruskal-Wallis (en fonction de l'analyse des variances). - Pour des données enregistrées en longitudinales, celles-ci seront analysées par ANOVA 2-way + Bonferonni’s post-test.

Raffinement

Afin de réduire au maximum les douleurs et l'inconfort aux animaux, un manipulateur expérimenté en microchirurgie sur rongeurs sera responsable de la procédure chirurgicale. De plus, les procédures de microchirurgies seront réalisées sous anesthésie générale (Kétamine 100mg/kg +Xylasine 10mg/kg) en IP. L’animal recevra aussi une dose d’analgésique Buprénorphine (1mg/Kg) pour réduire les douleurs au réveil. Un control quotidien avant, pendant et jusqu'au terme de l'experimentation sera effectué par les expérimentateurs afin de garantir la propreté des cages, des quantités suffisantes d'eau et de nourriture ainsi qu'un enrichissement adéquat dans les cages d'hébergement (igloo polycarbonates autoclavables et réutilisables + carton) . Pendant les périodes de traitement par les candidats médicaments, les expérimentateurs conduiront un suivi quotidien du poids corporel, de la comsommation d'eau et de nourriture ainsi que de l'état général des animaux. Ces observations seront enregistrées et analysées. Les animaux qui auront perdu plus de 20% de leur poids initial ou dont l'état général est dégradé (isolement, baisse d'activité, entretien de la fourrure, perte de poils, respiration anormale) sur 2 jours consécutifs seront retirés de l'expérimentation et mis à mort. A noter que les candidats médicaments qui seront testés pour leur efficacité auront déjà été évalués pour leur toxicité au préalable, et que le risque d'effets secondaires liés au traitement est minime. De plus, l'étude sera conduite par des personnels qualifiés et formés au respect des conditions du bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée par la communauté scientifique dans le cadre de l’étude de la fonction rénale après une ischémie-reperfusion. L’avantage de ce type d’animal est qu’il répond très bien à la procédure d’uninephrectomie + ischémie-reperfusion et constitue un excellent mime pathophysiologique des conditions retrouvées chez l’Homme. De plus, grâce à leur système immunitaire spécifique, les souris ne présentent pas de risque d’infection post-opératoire. La procédure sera réalisée sur des animaux disponibles auprès d’élevages agrées (Charles River). Les animaux utilisés auront atteint l'age adulte, c'est à dire plus de 8 semaines