Troubles cardiaques
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Production in vivo d’un anticorps monoclonal dirigé contre un marqueur de l’hémostase destiné à l’industrie du diagnostic in vitro
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
34 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une injection de pristane puis d'hybridomes qui déclenchent une tumeur et une accumulation de liquide d'ascite dans l'abdomen, décrite comme source de détresse, avant un prélèvement terminal. Le projet produit in vivo un anticorps monoclonal destiné à des kits de diagnostic industriels, le porteur affirmant que la production in vitro n'a pas été validée et concluant à une "nécessité incontournable". Le recours à 34 000 souris pour produire un anticorps par la méthode d'ascite ressort comme l'élément marquant de ce projet.
Objectifs
L’objectif du projet est de produire in vivo chez la souris un anticorps monoclonal (Mab) ultra-spécifique d’un produit terminal de la dégradation de la fibrine. Ce Mab entre dans la composition d’outils de diagnostic biomédical utilisé par la majorité des hôpitaux et des laboratoires français, européens et américains pour le diagnostic de la CIVD (Coagulation Intra Vasculaire Disséminée), des thromboses veineuses des membres inférieurs (phlébites) et de l’exclusion de diagnostic de l’embolie pulmonaire. Ces dispositifs IVD exploitant ce Mab sont pleinement validés, au sens du marquage CE des dispositifs IVD, de la U.S. FDA et des divers organismes règlementaires internationaux. Les besoins de santé publique et la nécessité absolue de ces dispositifs IVD exploitant ce Mab et en l’absence de solution alternative, imposent le maintien de la production de ce réactif.
Bénéfices attendus
L’obtention in vivo de cet anticorps monoclonal permettra le maintien de la production de kits de diagnostic essentiels à la définition d’un statut clinique. Cet anticorps entre dans la composition d’outils de diagnostic biomédical utilisé par la majorité des hôpitaux et des laboratoires français, européens et américains pour le diagnostic de la CIVD (Coagulation Intra Vasculaire Disséminée), des thromboses veineuses des membres inférieurs (phlébites) et de l’exclusion de diagnostic de l’embolie pulmonaire. Ces dispositifs de diagnostic in vitro (IVD) exploitant ce Mab sont pleinement validés, au sens du marquage CE des dispositifs IVD, de la U.S. FDA et des divers organismes règlementaires internationaux. Les besoins de santé publique avec la nécessité absolue de ces dispositifs IVD exploitant ce Mab et en l’absence de solution alternative, imposent le maintien de la production de ce réactif. Il est à noter que ces kits, ont joué un rôle clé dans la crise sanitaire liée à la maladie à coronavirus (COVID-19). Les instances scientifiques ont permis de définir un lien entre le taux du produit de dégradation de la fibrine dosé par les kits dépendant de cet anticorps et la gravité de la maladie COVID-19 (mauvais pronostic pour le patient).
Procédures
Mise en quarantaine des souris dans une zone d’hébergement dédiée conforme à la règlementation Après respect d'une semaine de quarantaine, à J1 les souris reçoivent une injection d’un agent d’amorçage. Afin de minimiser la souffrance des animaux, l’injection de cet agent est précédée 30 minutes avant par l’injection en sous-cutanée d’un antalgique. A J22, après expansion clonale, les hybridomes sont injectés en IP unique à raison de 4.106 cellules/souris. En accord avec les discussions réalisées lors des réunions du bien-être animal, du comité d’éthique et des éléments évoqués avec la DDPP, un analgésique sera également distribué aux souris après inoculation des cellules dès l’apparition des premiers signes de douleur par injection. Suivi quotidien des animaux. Les animaux présentant des signes d’inconfort sont euthanasiés et ponctionnés de manière éthique. Récupération unique et terminale d’ascite par paracentèse dès apparition. Injection IP ou SC, durée de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Chez l'animal, une douleur et une détresse peuvent résulter de l'injection intrapéritonéale (IP) de l'amorce (pristane), de l'inoculation IP des cellules tumorales, et de la croissance des cellules tumorales dans la cavité abdominale (effets primaires) sous forme de plaques péritonéales qui s'infiltrent dans la paroi abdominale ou les organes abdominaux. Plus précisément, il semble que l'injection par voie IP produit un niveau de détresse modéré; on décrit que la production d'ascite et la croissance de tumeurs causent de la souffrance chez les patients humains. De plus, les changements pathophysiologiques et pathologiques complexes peuvent provoquer une détresse chez l'animal.
Devenir
Tous les animaux sont concernés, les souris sont toutes euthanasiées en fin de protocole. L’ensemble des animaux inclus dans un cycle de production sont euthanasiés avant paracentèse.
Remplacement
L’alternative la plus logique pour la production de cet anticorps serait une production in vitro. Malheureusement, à ce jour, l’anticorps n’a pu être caractérisé techniquement et validé cliniquement que sur des lots issus de production en condition in vivo. L’ensemble des résultats concernant la capacité de certains clones à produire in vitro les mêmes anticorps selon le même cahier des charges requis pour les dispositifs IVD concernés, démontre la nécessité incontournable de poursuivre la production de ce Mab en condition in vivo (incapacité des hybridomes à tolérer un transfert en extension d’échelles notamment de rendement de production et ou de qualité fonctionnelles des anticorps obtenus). Les besoins de santé publique de ces dispositifs IVD exploitant cet anticorps, et en l’absence de solution alternative, imposent le maintien de la production de ce réactif. La société nous demandant de réaliser des productions d'anticorps in vivo, est consciente de l’aspect éthique de l’expérimentation animale et s'engage à ne recourir à la production in vivo que dans des cas de stricte nécessité. En parallèle, de ce protocole, les essais de passage en in vitro se poursuivront notamment via la mise en œuvre d’essai de tris des clones présentant les taux de sécrétion d’immunoglobulines les plus élevés. Il est également à noter que pour les nouvelles versions de cette gamme de produit, les anticorps utilisés seront fabriqués avec des anticorps produits uniquement avec un process « in-vitro » (développement en cours)
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit au maximum, il s'agit de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire. Nous pourrons nous baser sur l’expérience acquise sur les anciens protocoles réalisés sur ces clones. L’utilisation de souris anciennes reproductrices permet également de ne pas utiliser d’animaux jeunes spécifiques au projet, mais d'utiliser des souris qui étaient vouées à être euthanasiées. Les expériences de sélection des clones possédant les meilleures capacités de sécrétion, devraient permettre à minima de réduire le nombre d’animaux engagés par protocole. La dernière demande d’autorisation concernait 21000 souris par an, la nouvelle demande impliquerait 17000 individus annuellement, soit une diminution d’environ 19%. A ce jour 1 souris permet la réalisation de 1400 tests.
Raffinement
Les recommandations (issue de CNREEA et parue le 28 juin 2017) sur la production d’anticorps par liquide d’ascite chez la souris seront appliquées. L’unique paracentèse sera réalisée après euthanasie de l’animal, afin de limiter les manipulations de l’animal toujours sources de stress. Afin de minimiser la souffrance des animaux, l’injection de l’agent d’amorçage est précédée 30 minutes avant par l’injection d’un antalgique. En accord avec les discussions réalisées lors des réunions du bien-être animal, du comité d’éthique et des éléments évoqués avec la DDPP, un analgésique sera également distribué aux souris après inoculation des cellules dès l’apparition des premiers signes de douleur par injection. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 2 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion…) et signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 3 niveaux : normal, souffrance légère mise en œuvre d’antalgies à envisager, souffrance sévère arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les animaux bénéficient d'un hébergement, d’un environnement, d'une certaine liberté de mouvement, de nourriture, d'eau et de soins appropriés à leur santé et à leur bien-être. Afin de faciliter la sociabilité des souris, elles ne sont pas isolées dans une cage et des objets d'enrichissement sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont euthanasiés et prélevés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore.
Choix des espèces
Les hybridomes concernés ont été obtenus par fusion de splénocytes de souris et de myélome de souris, selon la méthode de Milstein et al (1975). Les clones obtenus n’ont jamais pu être produits autrement que chez la souris. Le Mab obtenu et validé dans les dispositifs IVD concernés, est un Mab obtenu et produit chez la souris. Les souris doivent être de même souche (syngéniques) à la fois pour l'immunisation en vue de la création du clone d'hybridome et pour la production subséquente de Mab, de sorte que les tissus utilisés soient histocompatibles. Les souris Balb/c représentent le meilleur choix puisque les cellules myélomateuses parentales employées dans le processus de fusion proviennent de cette souche. Les souris utilisées préalablement pour la reproduction présentent l’avantage pour la production de l'ascite parce que leur musculature abdominale a déjà été étirée (Falkenburg, 1998). Les animaux utilisés sont de préférence des femelles adultes Balb/C (anciennes reproductrices), car elles présentent une prédisposition physiologique favorisant une dilatation de leur paroi abdominale en diminuant le risque de compression d‘organe (respect des 3R).
Reprise de la production des cellules sanguines après irradiation chez le porc Miniature (EU1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
36 cochons miniatures vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils sont soumis à une irradiation totale du corps sous anesthésie, à onze prises de sang jugulaire, à des prélèvements de moelle osseuse et à l'injection de cellules souches d'origine humaine, sous immunosuppresseurs administrés pendant plusieurs semaines. Le porteur situe ce projet dans la mise au point d'un traitement du syndrome aigu d'irradiation pour les militaires en opération ou les victimes d'accident nucléaire, et prévoit la mise à mort à J90 pour localiser les cellules greffées. Il affirme que le passage à la clinique "nécessite" des animaux de grande taille et que la physiopathologie du miniporc est proche de celle de l'humain.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de proposer un nouveau traitement du syndrome aigu d’irradiation (SAI), pour le militaire en opération ou la population victime lors d’une urgence radiologique, d’un accident nucléaire ou un acte de malveillance. Il est basé sur une technologie permettant de produire des cellules souches hématopoïétiques (CSH) obtenue à partir de cellules souches reprogrammées issues de cellules humaines. Ces cellules d’origine humaine sont nommées hiPSC et ont commencé à révolutionner les pratiques médicales. Le traitement en urgence de population nécessite de disposer de produits cellulaires pouvant être congelés, décongelés et injectés rapidement et permettant de traiter un groupe important d’individu. Ces banques de cellules souches dites « médicament » permettront de produire des cellules souches de différents types pour traiter les victimes. Des hiPSC issues de donneurs « universels » sont déjà disponibles. Le projet a pour ambition de démontrer que cette stratégie d’utilisation des hiPSC est la réponse thérapeutique au traitement en masse du syndrome aigu d’irradiation. Ce projet est en synergie avec les nouvelles stratégies internationales en termes de santé et de médecine régénérative, à savoir la constitution de banques d’hiPSC de grade clinique (à savoir excellente viabilité et absence d’anomalie chromosomique) et la dérivation de produits cellulaires de qualité. L’objectif est la validation après la destruction des cellules de la moelle osseuse par l’irradiation de la reprise de l’hématopoïèse chez le cochon par une injection de cellules souches humaines hématopoïétiques issues d’hiPSC. Ce projet permettra de démontrer l’efficacité d’un greffon provenant iPSC sans induire de toxicité aigüe et chronique.
Bénéfices attendus
La preuve de concept de la possibilité de générer un tissu sanguin fonctionnel (l’ensemble des cellules du sang) à long terme à partir d’un tout nouveau type cellulaire appelé « hiPSC » a été établie chez le petit animal. Cette nouvelle technologie permet de produire les cellules à l’origine de la production du sang. Le traitement en urgence de populations nécessite de disposer de produits congelables afin de traiter un groupe d’individus. Des banques de cellules souches obtenues à partir d’hiPSC de grade clinique permettront de produire des cellules souches de différents types pour traiter les victimes. Des hiPSC issues de donneurs « universels » sont déjà disponibles et transposable à une échelle industrielle. L’objectif de ce projet est de progresser vers les essais cliniques par la reconstitution hématopoïétique lors d’un syndrome hématopoïétique. Pour le passage en clinique, nous sommes dans l’obligation d’utiliser des modèles in vivo, plus particulièrement des animaux de grande taille et dont la physio-pathologie du SAI est proche de l’homme. La validation de la reprise d’hématopoïèse humaine xénogénique chez le cochon par une greffe de cellules souches hématopoïétique issues hiPSC et également de la sous population de cellules triée à partir de ces hiPSC (la sous population à capacité de reconstituer l’hématopoïèse) permettra de démontrer l’efficacité d’un greffon provenant iPSC sans induire de toxicité aigüe et chronique. Le bénéfice de ce projet est de progresser vers les essais cliniques par la reconstitution hématopoïétique lors d’un syndrome hématopoïétique chez l’homme.
Procédures
Une prise de sang sera effectuée à J-4 et J0 avant l’irradiation et à J3, 7, 10, 35 ,38, 45, 52, 59 et 90 sous anesthésie générale pour un prélèvement à la veine jugulaire de 5ml (temps de prélévement entre 5 et 10 min). A J45 et J90, au cours de cette même anesthésie et associée à une anesthésie locale, sont également prélevés 5 mL de moelle osseuse dans l'humérus (2 min). Les procédures d’irradiation sont réalisées en une seule fois pour une durée de 5 min sous masque et isoflurane après une anesthésie générale. Les injections de cellules sont effectuées en une seule fois sous anesthésie à la veine de l’oreille par un système de perfusion et sous monitoring cardiaque et respiratoire, la durée de l’injection étant de 10 min. Pour éviter tout rejet des cellules humaines les animaux sont traités par des immunosuppresseurs (une première molécule 1 fois par jour de J-3 à J30 soit 34 administrations orales, une deuxième molécule de J-3 à J60 soit 64 administrations par voie orale, une 3ième moécule de J-3 à J60 soit 64 administrations par voie orale, toutes en prise spontanée dans la nourriture), et une injection unique intra-musculaire d'une 4ième molécule. Afin de palier à tout risque d’infection lié aux prises de sang et moelle osseuse les cochons reçoivent un antibiotique par voie intramusculaire à chaque intervention sur l'animal soit maximum 11injections intra-musculaires.
Impact sur les animaux
Selon la littérature, ce syndrome est caractérisé par une diminution du nombre de globules blancs dans les 48h premières heures suivie d’une remontée puis de nouveau une chute des neutrophiles de 10 à 22 jours et d’une diminution des plaquettes (avec le taux le plus bas atteint entre 9-17 jours, sur une durée de 2 semaines et récupération à 3-4 semaines et complète à 2 mois post-irradiation). Une chute des globules rouges est notée à J14. La récupération à des valeurs proches de la normalité des cellules du sang se situe à 6 semaines. Aucune perte de poids n’est attendue suite à l’irradiation à faible dose. La survenu transitoire de quelques pétéchies entre J10 et J14 post-irradiation est observée chez quelques animaux. Afin de palier à tout risque d’infection lié aux prises de sang et moelle osseuse les cochons reçoivent un antibiotique du Shotapen à 0,1ml/kg (association de streptomycine et de pénicilline d’une durée d'action de 3 à 5 jours) par voie intramusculaire à chaque intervention sur l'animal si espacée de 72 heures minimum (à l'occasion de prises de sang notamment).
Devenir
Tous les porcs sont mis à mort à la fin du protocole à J90 post-irradiation pour des prélèvements tissulaires post-mortem de poumon, foie, rate, thymus, amygdale, os, intestin afin de localiser la présence des cellules humains greffées.
Remplacement
Le passage à la clinique nécessite des animaux de grande taille. Il a été montré que la physiopathologie du syndrome hématopoïétique sur le porc de taille réduite (de type miniporc) est similaire à celle observée chez l’homme. De plus étant donné que la production de cellules souches reprogrammées et issues de cellules humaines adultes différenciées (hiPSC) en quantité importante est un paramètre limitant, le choix s’est porté sur le miniporc qui est un porc de taille réduite permettant l’injection de cellules en concentration compatible avec leur production.
Réduction
Pour obtenir des valeurs statistiques, les groupes des miniporcs irradiés et traités par les cellules souches sont classiquement constitués de 8 individus pour pallier les variabilités inter-individus des animaux et également du greffon injecté et pour éviter ainsi d’avoir à renouveler plusieurs fois l’expérimentation. Le nombre d’animaux choisi pour ce protocole est nécessaire et suffisant pour exploiter d’un point de vue statistique les résultats obtenus.
Raffinement
Dans le contexte du bien-être animal, les cages d’hébergement seront enrichies en objets (balles) favorisant le bien-être de l’animal. Les animaux disposent d’espace d’hébergement adapté pour 5 cochons de 5 à 10 kg. De plus, le raffinement est renforcé par le fait que ces animaux seront anesthésiés pour toutes interventions (irradiation, prélèvements sanguins) et mise à mort selon la réglementation en vigueur. Des points limites sont définis et seront appliqués pour mettre fin dans les délais les plus brefs à toute anomalie ou à toute douleur, toute souffrance, toute angoisse ou tous dommages durables constatés qui pourraient être évités tout au long des procédures expérimentales. Les animaux seront acclimatés pendant 2 semaines. Le transport des animaux au site d’irradiation sera effectué par le véhicule climatisé dédié à ce transport. Pour la procédure d’irradiation les animaux sont anesthésiés et surveillés pendant la durée de l’irradiation, ainsi que pendant la phase de réveil. Une surveillance quotidienne pendant toute la durée de l’expérimentation sera effectuée par les techniciens animaliers compétents et basée sur la prise alimentaire, la présence des troubles digestifs (diarrhée transitoire), de la posture et du comportement (animal prostré) : - Pesée des animaux au début de l’étude, puis toutes les semaines pendant la durée de l’expérimentation - Les signes de douleur/stress sont définis comme une réduction de la consommation alimentaire et/ou troubles digestifs et déshydratation, modification des signes locomoteurs (prostration, ne pas remuer la queue, manque de curiosité normale, changement dans le schéma de vocalisation normal au toucher). Une grille de score sera établie pour chaque animal. Si au cours de l’expérience un animal montre des signes caractéristiques de souffrance, il sera retiré de l’expérimentation et une mise à mort compassionnelle sera éffectuée selon les méthodes approuvées en limitant le plus possible la douleur, la souffrance et l'angoisse des cochons, par une personne compétente de l'établissement hébergeur.
Choix des espèces
Le passage à l’étape clinique nécessite des animaux de grande taille. Il a été montré que la physiopathologie du syndrome hématopoïétique sur le porc de taille réduite (de type miniporc) est similaire à celle observée chez l’homme. De plus étant donné que la production de cellules hiPSC en quantité importante est un paramètre limitant, le choix s’est porté sur le miniporc de 8 semaines qui est un porc de taille et de poids réduite permettant l’administration de cellules en concentration compatible avec leur production limitée à l’heure actuelle. Les porcs seront des femelles afin d’éviter des conflits et donc risques de blessure, qui sont plus fréquents chez les mâles. Le risque de blessure doit être absolument évité chez ces animaux qui auront un système immunitaire et de coagulation affaibli après irradiation et par conséquent un risque de mortalité augmenté.
Projet d’innovation dans la Fermeture de Foramen Ovale Perméable par le biais de dispositifs médicaux sans métal, sur le modèle porcin
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
36 cochons vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chacun subit une chirurgie cardiaque de deux à trois heures pour l'implantation d'un dispositif de fermeture du foramen ovale sans métal, puis est mis à mort une fois l'implant filmé sous tous les angles. Le projet vise à sélectionner la formulation la plus efficace en vue de constituer les dossiers réglementaires pour un passage en clinique, un objectif industriel autant que médical. Le porteur affirme que les performances du dispositif sur cœur battant ne peuvent être reproduites in vitro et que l'approche in vivo sur gros animaux est "inévitable", des cochons de plus de 90 kg étant choisis pour leur cœur proche de celui de l'humain.
Objectifs
Pendant la gestation, l’oxygénation de l’embryon se fait via le sang de la mère. Non fonctionnels les poumons sont contournés grâce à une perforation créée naturellement au niveau du septum interauriculaire, appelé foramen ovale perméable (FOP). Une fois que le bébé est né et s’oxygène naturellement, la pression créée dans l'oreillette gauche combinée à des signaux cellulaires spécifiques permet la fermeture du FOP dans un délai de 2 ans. Cependant, chez 1 individu sur 4, le foramen ovale ne se ferme pas. Le FOP pourrait être asymptomatique, cependant, de fortes corrélations ont été rapportées avec certains accidents vasculaires cérébraux (AVC). En effet, un FOP fournit un portail entre le côté droit et le côté gauche du cœur, ce qui peut permettre à un thrombus de passer sur le côté gauche de la circulation. Des dispositifs de fermeture métallique ont été développés et commercialisés au cours des 20 dernières années et ont prouvé l’efficacité de la fermeture du FOP sur la récidive d'AVC. Néanmoins, des événements indésirables tels que thrombose, embolie particulaire ou encore de la fibrillation auriculaire ont été rapportés dus à l'érosion du métal, dislocation, mal-positionnement de l'appareil. Pour contourner ces événements indésirables, notre projet propose un implant à base de sutures et sans métal aux propriétés biocompatibles. Notre batterie de tests mécaniques in vitro (e.g. test de déploiement, de ponction, de flexibilité, de résistance à la traction) nous ont permis de sélectionner les versions les plus optimales de notre dispositif médical, mais nous limitent à la compréhension de l'interaction de notre implant avec des modèles non physiologiques d’un côté et de l’efficacité de notre système de pose sans contrainte vasculaire de l’autre. Nous souhaitons aujourd'hui tester nos meilleurs candidats chez l'animal pour confirmer nos précédents tests sur cœur battant, plus particulièrement chez le porc (non modifié génétiquement), un modèle animal fortement utilisé en recherche cardiovasculaire, en raison de leur étroite corrélation avec l'anatomie et la physiologie humaines. Pour ce projet, nous proposons d'utiliser le modèle connu de défaut septal artificiel (perforation septale suivie d’une dilatation par ballonnet). En effet, étant donné la faible prévalence de FOP chez ce modèle (1 sur 10 animaux) il s'est avéré judicieux de choisir un modèle artificiel de défaut septal aigu plutôt que de pré-diagnostiquer un grand nombre d'animaux.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ce projet permettront de tester, valider et confirmer la formulation la plus optimale pour réaliser une fermeture de FOP efficacement. Ces résultats serviront à l'établissement d'un futur projet sur le long terme afin d'étudier la compatibilité systémique de l'implant, la durabilité de l'implantation, l'endothélialisation de l’implant. Ces résultats participeront à la constitution des dossiers auprès des autorités compétentes pour autoriser la phase clinique du dispositif final. Les bénéfices susceptibles d’une telle étude pourront être également (i) d’améliorer la fermeture de FOP avec un dispositif non métallique dont les propriétés physiques et techniques permettent de maintenir un environnement physiologique normal et d’envisager de futures interventions dans l’oreillette gauche, et (ii) d’apporter à la communauté scientifique et médicale une meilleure compréhension des différences cardiaques anatomiques et conductrices entre l’homme et l’espèce porcine.
Procédures
Tous les animaux (36 au total sur 24 mois) seront soumis une seule fois à la procédure chirurgicale décrite qui inclue une prémédication analgésique par voie intramusculaire dont la durée est estimée entre 30minutes et 1heure avant la mise sous anesthésie générale par voie intraveineuse de l'animal dont la durée est estimée entre 2 et 3 heures. Les animaux seront maintenus anesthésiés pendant toute la procédure chirurgicale, la procédure d'implantation, et quelques minutes après implantation pour permettre de visualiser et d'enregistrer l'implant sous tous les angles par fluoroscopie et echocardiographie, puis les animaux seront directement mis à mort.
Impact sur les animaux
Une potentielle ponction au travers du système de conduction présent dans le voisinage du FOP peut être un effet indésirable et pourrait être à l’origine de fibrillation atriale non désirée. Cette étude étant aigue, si une persistance de telle fibrillation est constatée lors de l’intervention, l’animal sera mis à mort.
Devenir
Le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure d’implantation est la mise à mort.
Remplacement
Malgré une batterie de tests mécaniques et l’évaluation de fonctionnalité in vitro sur cœurs explantés, la procédure qui permet d’évaluer les performances du système de pose et les propriétés mécaniques de l’implant en conditions physiologiques et sur cœur battant, ne peuvent être reproduites in vitro, ni sur organe explanté. Tester les diverses itérations de notre dispositif médical nécessite inévitablement l’approche in vivo sur gros animaux.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux impliqués dans ce projet, nous avons présélectionné grâce à une batterie de tests mécaniques et grâce à l’évaluation de fonctionnalité in vitro sur cœurs explantés, les itérations du système de pose et d’implants les plus optimales. De plus, afin de réduire le nombre d’animaux, nous avons choisi d’utiliser le modèle de défaut septal artificiel car la prévalence de FOP naturellement chez le porc étant d’environ 1 sur 10, ce projet nous aurait demandé un nombre d’animaux conséquent à pré-diagnostiquer. Les procédures expérimentales de ce projet ont été consciencieusement pensées et élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats satisfaisants et répétables : par campagne de test, trois versions du système de pose seront testées en combinaisons avec deux versions d’implant sur six porcs au total (qui seront mis à mort en fin de tests). Trois campagnes de tests seront planifiées par an, soit un total de trente-six porcs sur l'ensemble du projet. L’aspect statistique n’est pas abordé ici car (i) il nécessiterait une cohorte bien plus grande que celle prévue, et (ii) cette étude se limite à identifier le concept et l’implant les plus fiables et fonctionnels des concepts et implants testés. Enfin, les animaux seront sélectionnés sans distinction de sexe mais de poids (>90kg) pour une meilleure corrélation de taille de cœur avec l'homme.
Raffinement
Les procédures expérimentales de ce projet ont été consciencieusement pensées et élaborées pour réduire au maximum la souffrance des animaux, et maximiser leur bien-être pendant leur hébergement et les procédures chirurgicales. En effet, un suivi quotidien des animaux sera réalisé dès leur arrivée : une évaluation de l’état de santé sera faite selon des points limites bien définis (liés à leur comportement, leur nutrition, leur poids et leurs déjections) puis enregistrée dans un registre de suivi. Un suivi vétérinaire sera réalisé une fois par semaine. En préparation des procédures chirurgicales, les animaux seront anesthésiés sous anesthésie générale et une prophylaxie antalgique et analgésique leur sera appliquée avant et pendant tout acte chirurgical. Au cours des procédures chirurgicales, les animaux seront constamment monitorés et leur état de santé sera évalué selon des points limites bien définis (liés à leurs fréquences cardiaques et respiratoires, leurs pressions artérielles, l’oxymétrie, et leur température).
Choix des espèces
Le modèle porcin est un modèle animal bien connu dans la recherche translationnelle en chirurgie cardiovasculaire en raison de leur étroite corrélation avec l'anatomie et la physiologie humaines. Des animaux adultes de plus de 90kg seront sélectionnés. En effet, un pre-diagnostic par CT-scan de porcs réalisé précédemment, nous a permis de réaliser que des animaux de poids supérieur à 90kg (équivalent à 6 mois d'âge pour les porcs) possédaient un cœur aux dimensions proches d'un cœur humain.
Test de l’efficacité de 4 médicaments sur un modèle souris du syndrome de Barth (1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles musculosquelettiques
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles du syndrome de Barth, elles présentent dès la naissance un déficit de poids et un défaut cardiaque, et reçoivent un gavage deux fois par jour pendant cinq mois ainsi que des prélèvements de sang rétro-orbitaux, pour tester le repositionnement de quatre médicaments déjà commercialisés. La moitié est tuée pour prélèvements d'organes, l'autre moitié transférée vers une autre animalerie pour des analyses cardiaques puis tuée également. Le porteur affirme que le modèle cellulaire reste incomplet pour un "organisme tout entier" et conclut à la "nécessité" du modèle animal avant le passage à l'Homme.
Objectifs
Le syndrome de Barth est une maladie liée à des déficiences mitochondriales et pricipalement caractérisée par une cardiomyopathie. Il existe pour l'heure aucun traitement curatif. Différents criblages sur des modèles cellulaires levure et humain du syndrome de Barth ont permis l'identification de composés actifs. Les composés testés sont déjà utilisés sur le marché pour le traitement d'autres maladies. Notre objectif principal pour ce projet est de valider chez le modèle murin l'efficacité des composés identifiés comme actifs dans des modèles cellulaires du syndrome de Barth. Notre approche est donc celle d'un reposotionnement thérapeutique. Le test chez la souris est un requis obligatoire avant le passage à l'homme. Si l'objectif est atteint, des tests cliniques chez l'homme pourront rapidement être mis en place et à plus long terme des traitements curatifs pour les patients pourront voir le jour.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont l'identification de candidats médicaments efficaces pour le traitement du syndrome de Barth pour lequel il n'existe toujours pas de traitement à l'heure actuelle.
Procédures
Les seuls gestes invasifs qui se feront sur animaux vigiles sont le gavage (2 fois par jour pendant 5 mois maximum; quelques secondes pour chaque geste) et les prélèvements de sang rétro-orbitaux (5 minutes maximum pour chaque geste). Si la procédure de gavage pose problème, comme des irritations, il pourrait y avoir éventuellement la pose de mini pompes 1 fois par/mois pendant 4 mois (de l'âge de 2 mois à 6 mois) où chaque intervention n'exéderait pas 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les demandes d'autorisation de projet (DAPs) précédentes nous ont permis de décrire de façon détaillée les caractéristiques du phénotype dommageable du modèle souris du syndrome de Barth : A l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents est observé dès la naissance et un défaut cardiaque (echocardiographie) et musculaire (course sur tapis (treadmill)) est observé à partir de l'âge de 5 mois. Par ailleurs, il est à noter que les souris mâles modèles du syndrome de Barth sont stériles, qu'elles naissent avec un ratio non mendélien (10-12 pourcents au lieu des 25 pourcents attendus) mais qu'elles vivent comme les souris contrôles jusqu'à 8 mois (pas testé plus longtemps). Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. Les prélèvements sanguins rétro-orbitaux sur souris vivantes nécessitent une anesthésie mais n'induisent pas de conséquence sur le bien être de l'animal. Le prélèvement se fera dans un oeil différent d'une fois sur l'autre. Le gavage 2 fois par jour pourra à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal . Les mises au points de gavage 2 fois par jour durant 3 mois lors d'une précédente DAP n'ont pas révélé de nuisances particulières.
Devenir
Euthanasie de 180 animaux (la moitié du nombre total d'animaux) pour prélèvements de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de déterminer l'efficacité du médicament à supprimer certains déficits mis en évidences dans les demandes d'autorisation de projet (DAP) précédentes. L'autre moitié (180 animaux) sera transféréé dans une autre animalerie (autre DAP acceptée) pour analyse par echocardiographie et course sur tapis (treadmill) et sera également euthanasiée afin de récupérer les organes pour analyses.
Remplacement
Nous utilisons des modèles cellulaires pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome de Barth, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour procéder aux essais cliniques chez l'homme.
Réduction
Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8-10 animaux par groupe. Une analyse statistique adaptée des résultats sera réalisée.
Raffinement
Les demandes d'autorisation de projet (DAPs) précédentes nous ont permis la mise en place des conditions optimales pour le bien-être des animaux. Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure chargée du Bien Etre des Animaux (SBEA), les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 3 fois par semaine. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre (hors point limite), des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine, isolement si nécessaire jusqu'à ce qu'une amélioration soit observée. Si au bout de 48 heures aucune amélioration n'est constatée alors l'animal sera mis à mort. Points limites attendus: - poids des animaux modèles de la maladie (KO TAZ) inférieur de 20 à 30 pourcents dès la naissance : si on dépasse les 25 pourcents d'écart l'animal sera euthanasié - défauts ventriculaires: si on observe une tachycardie, une bradycardie, une arythmie ou une fréquence respiratoire anormale, l'animal sera euthanasié par la dislocation cervicale pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. - points limites spécifiques à chaque geste développés dans chaque procédure. Pour les animaux KO TAZ, plus petits, de la nourriture sera posée au sol et les animaux contrôles, non malades (WT) seront séparés des KO dans les cages.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. - le modèle souris du syndrome de Barth récapitule parfaitement les défauts observés chez les patients atteints de la maladie Les animaux seront utilisés dès le sevrage. jusqu'à l'âge d'environ 6-8 mois. Le déficit de poids se voit dès la naissance, il est donc intéréssant de pouvoir commencer le gavage des candidats médicaments au plus tôt. Notre demande d'autorisation de projet précédente a montré qu'on pouvait gaver au plus tôt sans problème dès le sevrage.
Implantation en tant que pontage artérioveineux chez le gros animal d’un vaisseau sanguin allogénique obtenu par tissage de fils de matrice extracellulaire
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
13 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de trois à quatre heures pour l'implantation d'un substitut vasculaire tissé posé en pontage entre carotide et jugulaire, puis des contrôles échographiques répétés sous anesthésie et une ponction à l'aiguille simulant l'hémodialyse. Le porteur mentionne parmi les nuisances l'absence de traitement anti-inflammatoire, un risque d'hémorragie et de déchirement du greffon, et prévoit la mise à mort à quatre et huit semaines pour prélever le vaisseau. Il affirme qu'une implantation "chez le gros animal" est "indispensable" et que la brebis est la seule espèce dont les cellules produisent les feuillets recherchés.
Objectifs
Les substituts vasculaires entièrement biologiques d’origine humaine issus d’une approche basée sur la synthèse de matrice par les cellules in vitro dite de « Cell-Assembled extracellular Matrix-CAM » ont été implantés chez l'Homme avec succès. Pour pallier les limites des prothèses vasculaires synthétiques, l’approche CAM permet la production de feuillets entièrement biologiques grâce à des cellules extraites à partir de peau humaine adulte saine. Des greffons de vaisseaux sanguins obtenus par roulage de ces feuillets ont été implantés avec succès chez des patients montrant une remarquable biocompatibilité. Cependant, leur méthode d’assemblage est longue pour permettre la fusion des différentes couches du vaisseau. Pour réduire le temps de production, ces feuillets sont transformés en fils qui, une fois montés sur un métier à tisser, permettent l’obtention d’un substitut vasculaire par tissage. Une implantation dans un modèle de gros animal ayant une anatomie proche de celle de l’humain est indispensable pour évaluer le comportement mécanique des produits d’ingénierie tissulaire tissés issus de l’approche CAM. Ainsi, l’objectif de ce projet est d’étudier le comportement mécanique ainsi que le remodelage in vivo de nos substituts vasculaires biologiques tissés à partir de fils de CAM face à une hémodynamique propre à l’hémodialyse, un contexte clinique pertinent, et ce dans un contexte de greffe allogénique, c’est-à-dire dans un contexte où un tissu d’un individu d’une espèce est implanté chez un autre individu d’une même espèce. Cela permettra d’étudier les réactions immunitaires innées et adaptatives, et de mettre en évidence que notre substitut peut être implanté en tant qu’accès vasculaire artérioveineux et subir/s’adapter à une hémodynamique importante et subir un remodelage adapté. Cela permettra également de mettre en évidence la faible réponse immunitaire à court terme de l’hôte suite à l’implantation. Ces résultats permettront d’envisager la réalisation d’une étude à plus long terme (jusqu’à 1 an) pour évaluer la viabilité à long terme du greffon et ce à terme pour utiliser cette technique chez les patients.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont multiples. Ce projet permettra de mettre en avant la possibilité d’utiliser des substituts vasculaires tissés à partir de CAM allogénique. En effet, ce projet permettra de mettre en avant la faible réponse immunitaire de l’hôte à notre substitut allogénique. Ces réponses supporteront l’idée que des vaisseaux allogéniques tissés dévitalisés peuvent être utilisés avec efficacité et peuvent pallier à la limite des substituts autologues. Également, les études du comportement mécanique et du remodelage du substitut apporteront des réponses essentielles qui permettront de modifier les paramètres de tissage des substituts afin d’adapter leurs propriétés mécaniques et structurelles de l'organisme. Les adaptations mises en place suite à ces résultats permettront ainsi d’obtenir un substitut dont les propriétés répondront au mieux à une situation clinique donnée.
Procédures
Toutes les interventions dans cette étude seront faites sur des animaux anesthésiés. Premièrement, les implantations d’un substitut vasculaire tissé ainsi que d’un contrôle avec une prothèse synthétique commercialisé et actuellement utilisée en clinique, seront effectués dans un modèle bilatéral sur chacune des huit brebis, après anesthésie et avec des protocoles pré, per et post opératoires adaptés. Cette procédure chirurgicale est prévue une fois par animale pour une durée estimée à 3 à 4 heures. Les animaux seront soumis à des contrôles échographiques post-implantation et à des temps de 2 et 4 semaines (pour le groupe de 4 semaines), et post- implantation et à des temps de 2, 4, 6 et 8 semaines (pour le groupe 8 semaines). Chaque échographie sera réalisée sur animal anesthésiée pour réduire le stress des animaux. Chaque échographie ne durera pas plus d’une heure et chaque animal sera anesthésié pour une durée maximale d’une heure. Pour le groupe de 8 semaines, une ponction de l’abord vasculaire sera effectuée avec une aiguille 16G afin de simuler un contexte d’hémodialyse. Cette ponction sera réalisée à 4 semaines, lors de l’échographie de contrôle, sur animal anesthésié. La ponction et l’échographie ne dureront pas plus d’une heure et chaque animal sera anesthésié pour une durée maximale d’une heure.
Impact sur les animaux
La phase déterminante pour le bien-être de l’animal repose sur un temps d’intervention court. En effet, chaque brebis sera sous anesthésie générale pour effectuer la chirurgie d’implantation du greffon. Plus le temps passé sous anesthésie est court, mieux c’est pour le bien-être de l’animal et la réduction des effets indésirables de l’anesthésie. Nous estimons la durée de la chirurgie de 3 à 4 heures. Une fois implanté, des effets indésirables liés au greffon pourraient apparaître. Si des problèmes d’hémorragie ou d’écoulement à travers le greffon apparaissent, le protocole d’anticoagulation pourra être revu et adapté. Un autre effet indésirable potentiel est le déchirement du greffon, suite à un mouvement brusque de la brebis ou un coup porté sur l’implant par un autre animal. Si un déchirement est observé et est attribué directement au greffon, le design de ce dernier pourra être adapté pour les brebis suivantes. Afin de gérer le stress des animaux et d’éviter un endommagement du greffon et/ou une blessure de l’animal, les contrôles échographiques se feront sous anesthésie générale. De plus, cela permettra d’analyser le greffon avec plus de précision que si la brebis est vigile et en mouvement. Ces contrôles et l’anesthésie générale dureront une heure maximum. Une des nuisances pour l’animal au sein de cette étude est également l’absence de traitement anti-inflammatoire en post-opératoire. En effet, ce projet repose sur l’étude de la réaction inflammatoire de l’hôte suite à l’implantation des substituts vasculaires. Ainsi, aucun traitement anti-inflammatoire ne sera administré suite à l’implantation Au cours de cette étude, un protocole précis de prémédication, d’analgésie et d’anesthésie sera mis en place et le bien-être des animaux sera suivi constamment par le personnel dédié.
Devenir
A l’issu des contrôles terminaux, tous les animaux seront mis à mort aux différents temps définis (4 et 8 semaines). En effet, nous étudierons la réponse immunitaire ainsi que le remodelage des allogreffes par les cellules ; cette étape nécessitant le prélèvement du substitut vasculaire préalablement implanté entre la carotide et la veine jugulaire, la mise à mort de celui-ci est inévitable.
Remplacement
Un modèle de vaisseau humain peut être largement étudié in vitro d’un point de vue mécanique grâce à des bancs d’essais. Cependant, ces plateformes de tests ne permettent pas d’étudier la réponse immunitaire ou l’intégration d’un greffon dans des conditions réelles d’utilisation. Il ne sera donc pas possible de remplacer l’utilisation d’animaux. Ainsi l’utilisation d’un modèle animal de grande taille possédant un système cardiovasculaire proche de l’homme (porcin, ovin, canin ou primate) est souhaitable pour ce projet. En effet, l’objectif du projet est d’évaluer la fonctionnalité, la réponse immunitaire et l’intégration du substitut vasculaire dans l’organisme vivant et entier et ce, dans un contexte clinique pertinent (pontage artérioveineux), afin d’envisager à terme une utilisation chez les patients.
Réduction
Ces expérimentations sont conçues pour avoir recours à un nombre minimal d’animaux permettant l’obtention de résultats exploitables sur le plan statistique. Huit brebis seront implantées avec le même nombre de conditions expérimentales. Un modèle bilatéral sera utilisé ; ainsi, chaque animal sera son propre contrôle, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux impliqués dans l’expérimentation.
Raffinement
Le raffinement sera pris en compte tout au long du projet. Le projet sera mis en place dans des locaux agréés avec du personnel dédié et expérimenté. De l’enrichissement sera mis en place pour répondre au besoin des animaux (pierre à sel, foin, hébergement en groupe sociaux, paille). Un protocole précis de prémédication, d’analgésie et d’anesthésie sera mis en place lors des différentes phases et le bien-être des animaux sera suivi constamment par le personnel dédié et formé à l’espèce étudiée. Si nécessaire, des actions adaptées seront appliquées et le vétérinaire désigné de l’établissement sera sollicité.
Choix des espèces
Ces expérimentations chez le gros animal sont nécessaires pour évaluer la faisabilité et la durabilité de greffons vasculaires de diamètres qui correspondent à ceux utilisés en clinique, notamment en pontage artérioveineux. Le modèle ovin a été choisi car il fait partie des modèles animaux couramment utilisés dans le domaine vasculaire (comme le modèle canin et le modèle porcin). En revanche, d’après nos études menées au laboratoire, ce modèle est le seul dont les cellules permettent la production de feuillets de CAM qui ressemblent à ceux produits avec des cellules humaines. Les animaux seront implantés à partir de 13 mois d’âge afin d’avoir des brebis adultes, à ce stade les brebis possèdent un système immunitaire et un système vasculaire mature.
Implication du canal potassique TREK1 dans la fonction cardiaque
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Invalidées pour le gène du canal TREK1, elles subissent des enregistrements ECG et des examens IRM sous anesthésie, avant d'être tuées pour prélèvement du cœur. Le porteur présente ces techniques comme non invasives et attend une meilleure compréhension du déclenchement des arythmies ventriculaires. Il affirme que cette étape "ne peut être remplacée" par un modèle sans animal.
Objectifs
Les canaux ioniques sont des protéines exprimées à la membrane des cellules, y compris des cardiomyocytes et dont certains sont responsables de l’activité électrique cardiaque étudiable via l’électrocardiogramme (ECG). Une altération acquise ou innée de leur fonction peut entrainer des arythmies. L'arythmie est une anomalie qui affecte la fréquence cardiaque normale. En présence d'arythmie, le cœur a tendance à battre trop lentement, trop vite ou de façon irrégulière. Ces anomalies peuvent influer sur la quantité de sang que le cœur arrive à pomper et provoquer de la fatigue, de l'essoufflement, des étourdissements pouvant aller jusqu'à la perte de conscience. Ce projet a pour objectif d'étudier les canaux ioniques impliqués dans ces dysfonctionnements caridaques afin de mieux les comprendre et de mieux les traiter. L’activité électrique cardiaque est assurée par l’ouverture et la fermeture extrêmement coordonnées de nombreux canaux ioniques. Ces canaux ioniques sont des protéines localisées au niveau de la membrane plasmique des cellules cardiaques ou cardiomyocytes. Leur ouverture permet le passage sélectif de certains ions (sodium, potassium, calcium et chlore) à travers la membrane plasmique qui confère l’activité électrique au cœur. Par conséquent, une meilleure connaissance des canaux ioniques impliqués dans l’activité électrique cardiaque permettra de mieux appréhender le mécanisme de déclenchement des arythmies et d’adopter des stratégies thérapeutiques plus efficaces. Dans ce projet, nous nous intéresserons à un canal potassique, TREK1 qui s’exprime dans le cœur humain, mais dont le(s) rôle(s) dans l’activité électrique cardiaque demeurent inconnus. Le but du projet est donc d’étudier le rôle de ce canal dans la fonction cardiaque en étudiant l’effet de l’invalidation du gène codant pour TREK1 chez des souris.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en évidence l’impact du canal TREK1 dans la fonction contractile et l’activité électrique cardiaque et plus particulièrement au niveau du ventricule droit, région du cœur dans laquelle il est fortement exprimé. La robustesse du projet est renforcée par une approche expérimentale multi-niveaux : - Celui de l’animal (ECG/IRM) - Celui de l’organe (cartographie optique) - Celui de la cellule cardiaque - Celui de la protéine/de l’ARNm Une meilleure compréhension du rôle du canal TREK1 permettra de mieux appréhender le mécanisme de déclenchement des arythmies ventriculaires suite à un étirement du myocarde qui peuvent se produire dans différents contextes qu’ils soient idiopathiques ou pathologiques et qui peuvent conduire à une mort subite. Des stratégies thérapeutiques visant TREK1 pourraient s’avérer efficaces dans ce contexte et seront étudiées dans ce projet.
Procédures
Les souris seront soumises à deux types d’interventions non invasives : - Examens d’imagerie IRM (environ 1h30) - Enregistrement ECG (environ 15 min)
Impact sur les animaux
Toutes les approches expérimentales réalisées dans ce projet sont de classe légère, sous anesthésie générale gazeuse, ce qui réduit les effets indésirables et ne devraient engendrer que des nuisances ou des effets indésirables légers sur les souris (le temps du réveil notamment). En effet, l’isoflurane est l’agent volatil le plus utilisé chez les animaux de laboratoire ; d’une part, il entraîne peu de conséquences au niveau du métabolisme, d’autre part, il interfère peu avec la pharmacodynamique et la pharmacocinétique des autres agents. De plus, l’induction et le réveil sont rapides, le contrôle de la profondeur d’anesthésie est aisé. Les effets indésirables tels que le stress surviendront notamment lors du transport des animaux entre les animaleries, lors de l’anesthésie ou de la manipulation des animaux. Le bien-être des souris sera surveillé lors du transport (durée de trajet réduit au minimum par du personnel formé, dans des cages de transport adaptées), de l’hébergement au sein des différentes animaleries (temps d'acclimatation, enrichissement adapté, suivi quotidien) et tout au long des expériences (anesthésie, suisvi des paramêtres, suivi du réveil) réalisées par du personnel compétent et formé à l’expérimentation animale sur rongeurs.
Devenir
Tous les animaux seront sacrifiés à la fin de la procédure et le cœur sera prélevé pour réaliser soit la cartographie optique sur cœur isolé soit les études électrophysiologiques sur cardiomyocytes isolés.
Remplacement
Compte tenu de l’expression du canal TREK1 dans le cœur humain et de son implication dans une arythmie cardiaque, la tachycardie ventriculaire, une meilleure compréhension du rôle de ce dernier passe par l’étude de modèles animaux. Cette étape est essentielle et ne peut être REMPLACEE.
Réduction
Dans un souci permanent de diminuer le nombre d'animaux utilisés, le caractère non invasif de l’ECG et de l’IRM in vivo permet de réaliser des méthodes d’analyse complémentaires sur les mêmes animaux (imagerie optique sur cœurs isolés, électrophysiologie cellulaire, biologie moléculaire). Des prélèvements post-mortem des artères pulmonaires seront également effectués sur ces souris pour un projet en collaboration aavec une autre équipe de recherche, qui étudie le rôle des canaux activés par l’étirement tels que TREK1 dans l’hypertension pulmonaire.
Raffinement
Les mesures de RAFFINEMENT sont mises en place à toutes les étapes du projet, notamment au cours de l’hébergement (cage collective, litière et enrichissement adapté). Afin d’éviter toute souffrance, les animaux seront anesthésiés quand nécessaire et des points limites seront déterminés afin d’interrompre le protocole en cas d’apparition de signes de détresse.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des espèces classiquement utilisées pour étudier les effets de l’invalidation d’un gène d’intérêt. Dans ce projet, il s’agit d’un modèle de souris TREK1 KO qui a l’avantage d’avoir été déjà utilisé à des fins de recherche scientifique (Kamatham et al., 2019 ; Abraham et al., 2018). Ce modèle de rongeurs KO va permettre de mettre en évidence le rôle du canal TREK1 dans la fonction cardiaque par ECG et IRM principalement. Ces deux techniques sont non invasives avec une possibilité de recherche translationnelle chez l’Homme. L’enregistrement d’ECG et plus particulièrement la mesure du QTc, qui est un très bon indicateur de l’activité électrique du ventricule, n’est réalisable qu’à partir de la douzième semaine chez la souris. Nous utiliserons donc des souris adultes C57BL/6J un peu plus âgées (14 semaines) pour ce projet.
Impact de deux solutions de cardioplegie sur la fonction cardiaque chez un modèle porcin d’ischémie-reperfusion EU1/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
20 cochons vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Le cœur de chaque animal est arrêté puis reperfusé au cours d'une chirurgie de deux heures sous circulation extra-corporelle, pour comparer deux solutions de cardioplégie déjà commercialisées. Le porteur reconnaît qu'aucune étude ne les a comparées et présente l'objectif comme la mesure de leur effet sur la viabilité des cellules cardiaques. Il affirme que ce modèle d'ischémie-reperfusion ne peut se faire que sur un "organisme dans son entier" et qu'un gros animal "s'impose" pour poser la circulation extra-corporelle.
Objectifs
L’objectif de cette étude est de comparer deux solutions de protection cardiaque (cardioplégie) chez un modèle porcin d’ischémie-reperfusion (arrêt volontaire du coeur pour permettre une opération chirurgicale puis reperfusion) pour mieux comprendre les pathologies sous-jacentes et développer des nouvelles approches de cardioprotection notamment dans la chirurgie cardiaque mini-invasive. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs, 2 demandes d'autorisation de projet ont été déposées conjointement.
Bénéfices attendus
A notre connaissance, il n’existe pas d’étude comparant les 2 solutions de cardioplégie disponibles sur le marché sur un cœur en ischémie-reperfusion. L’objectif de cette étude est de déterminer si une des 2 solutions est plus efficace sur la viabilité des cellules cardiaques.
Procédures
Les animaux auront tout d'abord une injection d'un calmant afin de réduire le stress dû à la manipulation (durée 2 minutes) dans l'établissement untilisateur n°1 puis une perfusion intraveineuse sera posée afin de permettre une anesthésie générale (2minutes). A partir de ce moment, les animaux seront sous anesthésie profonde et subiront une intervention chirurgicale qui durera 2h (opérations dans l'établissement n°2)
Impact sur les animaux
Nuisances attendues sur les animaux : stress durant le transport et l'hébergement, douleur lors de l'installation de l'animal (piqure). Effets secondaires possibles : perte de sang lors de la pose de la circulation extra-corporelle (CEC).
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure pour prélèvement en vue de l'étude histologique qui suivra.
Remplacement
La place de cette approche thérapeutique n'a jamais été évaluée. Une vraie étude comparative est nécessaire. Des manipulations cellulaires sont possibles pour explorer les mécanismes sous-jacents des effets protecteurs des deux cardioplégies. Néanmoins, cela n'aurait pas évité la partie in vivo sur animal maiselle ne pourrait concernée qu'un seul type cellulaire ne représentent pas la pléiotropie des cardioplégies. De plus, il n'y a pas de modèle existant d'ischémie-reperfusion cellulaires. Le modèle d’ischémie-reperfusion ne peut donc être effectué que sur un organisme dans son entier avec un impact sur les différentes fonctions.
Réduction
Modèle déjà en place dans notre structure permettant de réduire le nombre d’animaux à étudier, personnel formé à l’étude et la manipulation du modèle porcin. Le nombre d'animaux a été déterminé comme le nombre minimum d'animaux nécessaire afin d'obtenir des données statistiquements exploitables. La mise en place des appareillage (canules...) sera réalisée par des chirurgiens cardiaques expérimentés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes (au minimum 2 animaux) afin de limiter l’angoisse et le stress des animaux. Le milieu est enrichi avec des jouets adaptés (balles...). Une période de quarantaine d’au moins huit jours avant l’entrée des animaux dans le protocole est respectée permettant leur stabilisation physiologique et comportementale en réduisant le stress. Les animaux sont mis à jeun le jour de l’expérimentation et les cochons seront prémédiqués par l’injection intra-musculaire d’un produit anesthésique aux propriétés calmantes avec un produit psychotrope aux propriétés antidouleur. Les cochons seront ensuite sous anesthésie profonde pendant tout le protocole d'étude et avec un antidouleur en perfusion continue. Le cochon sera scopé en permanence, permettant de surveiller en continu la fréquence cardiaque, la fréquence respiratoire et la pression artérielle. Toute modification de ces paramètres entrainera une adaptation immédiate des médicaments afin d’assurer le confort de l’animal.
Choix des espèces
Le modèle animal de cochon (animal d’un poids entre 50 et 60 kgs, de morphologie cardiaque mature et avec un poids suffisant pour une cardioplégie) est utilisé pour sa similitude avérée, en termes d’anatomie cardiaque et d’hémodynamique, avec les processus physiologiques rencontrés en clinique. Le choix d’un modèle sur gros animal s’impose pour pouvoir implanter la CEC, nécessaire à notre projet. De plus, ce modèle est déjà connu de nos équipes.
Evaluation de la technique HIFU (ultrasons focalisés à haute intensité) pour le traitement des varices sur le modèle ovin
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
6 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leurs veines saphènes sont traitées par ultrasons focalisés de haute intensité sous anesthésie générale, avec un suivi échographique sur un à deux mois, pour évaluer une technique destinée à traiter les varices avant un premier essai chez l'homme. Le porteur rapporte des brûlures observées lors d'essais précédents, qu'il dit avoir corrigées par un refroidissement de la peau. Les brebis sont tuées après un ou deux mois pour prélever leurs veines.
Objectifs
Les objectifs de ce projet concernant le traitement HIFU en mode thermique sont : - de vérifier sa sécurité, en terme d'évaluation des effets tissulaires locaux; - de vérifier son efficacité, en terme d'occlusion veineuse. Il précède une première étude chez l'homme.
Bénéfices attendus
Les varices (dilatation anormale d'une veine) sont présentes chez 25% de la population des pays industrialisés et représentent un coût sociétal de ressources médicales pour ces pays. Les techniques mini-invasives développées ces dernières années permettent de traiter avec efficacité et peu de récidives cette maladie. La technique nouvellement développée et étudiée dans ce projet pourrait permettre d'obtenir d'aussi bons résultats que les autres techniques tout en diminuant les risques associés. Elle permettrait donc de continuer à améliorer le traitement de cette maladie.
Procédures
Les veines saphènes, situées sur la face interne des membres postérieurs des brebis, sont traitées par HIFU, ou par radiofréquence pour une veine de la première brebis. La veille du traitement, la zone à traiter est marquée et des mesures sont effectuées par échographie. Le traitement se fait sous anesthésie générale avec une anesthésie péri-veineuse de la zone à traiter. Un suivi échographique a ensuite lieu sept jours, quatorze jours puis un mois après le traitement. Si nécessaire, les animaux sont sédatés pour cet examen. Au bout d’un mois quatre brebis sont mises à mort pour prélever leurs veines saphènes dans le but de les analyser. Les deux dernières brebis ont une nouvelle échographie deux mois après le traitement avant d’être aussi mises à mort pour le prélèvement des veines traitées. Pendant la première semaine post-traitement la zone traitée est inspectée quotidiennement afin de détecter d’éventuelles lésions dues au traitement.
Impact sur les animaux
Dans les essais précédent des brûlures ont pu être observées au niveau des sites traités. Ce problème a été résolu par l'ajout d'un système déjà validé de refroidissement de la peau au niveau de la sonde.
Devenir
Les six brebis du projet seront mises à mort à la fin de l'étude afin de prélever leurs veines saphènes pour les analyser.
Remplacement
Il n'existe pas de modèle in vitro validés ou de modèle simulé par ordinateur qui puissent imiterles points finaux de ce projet. Il est donc nécessaire de travailler sur animal vivant.
Réduction
Une étude de preuve de concept sur des veines d'oreilles de lapin, ainsi qu'une étude de faisabilité sur trois brebis ont déjà été réalisées. Elles ont permis de déterminer les meilleurs conditions d'utilisation du traitement par HIFU et ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires dans la présente étude. De plus, le traitement est appliqué sur les deux veines saphènes des animaux, ce qui permet d'utiliser deux fois moins d'animaux pour obtenir le même nombre d'échantillons.
Raffinement
Les ovins étant des animaux grégaires, les brebis sont logées en groupe, sur une litière de paille afin de les occuper et auront accès à de l'eau et du foin ad libitum pour respecter leur fonctionnement de ruminents. De plus, le personnel animalier observe régulièrement le comportement des animaux afin de repérer d’éventuels signes de mal-être ou de souffrance. Ces signes inhabituels sont immédiatement signalés au responsable de l’expérimentation. Les animaux qui présenteraient des signes de mal-être ou de souffrance seront soignés et si jugé nécessaire par le vétérinaire traitant retirés de l’essai. Durant l’administration du traitement, les brebis sont placées sous anesthésie générale avec une association médicamenteuse permettant d’obtenir un effet anesthésique et analgésique. Afin d’éviter le dessèchement de leur cornée, une pommade ophtalmique est appliquée dans leurs yeux. Enfin, durant les examens angiologique, si les animaux présentent des signes de stress ou d’agitation, ils sont sédatés ou anesthésiés selon l'avis du vétérinaire.
Choix des espèces
Le mouton est recommandé dans la norme ISO 10993, partie 6 (2016) comme un animal approprié pour évaluer la performance et les effets tissulaires locaux des traitements vasculaires. En effet, la morphologie et la taille des veines saphènes du mouton sont similaires à celles de l'homme et ce modèle a été décrit dans la littérature comme un modèle approprié poour évaluer l'occlusion veineuse. Une fois rasés, ces animaux possèdent également une peau proche de celle de l'Homme ce qui permettra aux ultrasons d'atteindre la veine sans une trop forte absorption de ceux-ci. En outre, la faisabilité a été évaluée par le promoteur qui a pris les mesures des veines saphène du mouton. Les animaux seront adultes, car c'est à ce stade que l'anatomie de leurs veines saphènes est comparable à l'humain. De plus, l'étude durant plus de deux mois pour certains animaux, il n'est pas possible d'utiliser des animaux en croissance dont le développement pourrait interférer avec les effet du traitement.
Modèle de valvulopathies associées à la Filamine A chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
2475 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Dès le deuxième jour après la naissance et jusqu'à douze mois, ils subissent des séances répétées d'échographie, d'IRM et d'électrocardiogramme sous anesthésie, ainsi que des injections intrapéritonéales toutes les 72 heures, pour étudier une valvulopathie cardiaque reproduite par une lignée génétiquement modifiée. Un second axe repose sur une déplétion en macrophages, que le porteur reconnaît pouvoir provoquer infections, perte de poids et baisse de mobilité. Après chaque procédure, les rats sont tués pour analyser l'atteinte des valves, et le porteur décrit le recours au modèle animal comme "primordial".
Objectifs
Le prolapsus valvulaire mitral (PVM) est l’une des pathologies cardiovasculaires les plus fréquentes, et est associé à un haut taux de morbidité et de mortalité. A l’heure actuelle, aucun traitement pharmacologique n’est disponible pour les patients porteurs d’un PVM, la seule option étant la chirurgie valvulaire mitrale, une approche thérapeutique très invasive. Notre projet a pour objectif d'analyser et d’identifier les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la survenue du PVM, mais aussi de la cardiomyopathie associée à cette maladie valvulaire que nous avons récemment décrite chez les patients. Ce projet s’appuie sur l’étude du modèle unique de rat généré dans l’équipe : le rat KI FlnA-P637Q.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués dans le développement et la progression du PVM, ainsi que l’identification de potentielles cibles thérapeutiques pour traiter les patients.
Procédures
Des approches d’imagerie (échocardiographie et IRM) ainsi que des électrocardiogrammes de surface sont réalisés. Ces approches non invasives sont réalisées, sous anesthésie, dès le jour 2 après la naissance jusqu’à 12 mois (nombre maximal par animal = 8). Des injections répétées toutes les 72h en intrapéritonéal chez les rats sont réalisées : entre 7 jours post naissance et 13 semaines, ainsi qu’entre les semaines 26 et 39.
Impact sur les animaux
Aucune nuisance ou effet secondaire n’est attendu lors de la réalisation de l’Axe 1. La déplétion en macrophages (Axe 2) peut être associée à des effets indésirables de type infection, perte de poids, réduction de la mobilité ou changement de comportement des animaux, même si les données de la littérature restent rassurantes. Ces potentiels effets indésirables seront suivis quotidiennement, et les animaux présentant des point limites seront sacrifiés et le protocole adapté au besoin.
Devenir
Après chaque procédure, les animaux sont sacrifiés afin de caractériser l’atteinte valvulaire, par différentes approches complémentaires (histologie, cytométrie, RNA-seq sur cellules triées)
Remplacement
La modélisation in vitro ou in silico de la pathologie valvulaire cardiaque est limitée. En effet, les valves subissent à chaque cycle cardiaque des stress mécaniques multiples (tension, pression, flux) et répétitifs, qu’il est impossible de modéliser. De plus, le retentissement sur le myocarde de la pathologie, ne peut lui non plus être modélisé in vitro ou in silico. Une approche de physiologie et pathophysiologie intégrée est donc nécessaire pour répondre aux questions auxquelles nous faisons face.
Réduction
Des analyses intermédiaires (comparaison des animaux KI FLNA-P637Q et WT par t-test ou test de Mann-Whitney) seront réalisées et permettront selon les résultats obtenus de réduire le nombre d’animaux par conditions.
Raffinement
Les rats sont hébergés en cages ventilées enrichies en tunnel et frisottis, avec un accès à l’eau et la nourriture en continue. Les procédures d’imagerie et d’ECG proposées sont non invasives et permettent de suivre un même animal longitudinalement. Elles sont réalisées sous anesthésies à l’isoflurane. Pour ce qui est du protocole pharmacologique, un suivi quotidien durant la phase de traitement sera effectué afin de répertorier l’apparition de points limites. Cette approche permettra de modifier/raffiner le protocole expérimental.
Choix des espèces
De nombreux processus et systèmes biologiques inter-régulés et intégrés sont décrits dans le PVM. Il est donc impossible de substituer ou modéliser par des approches in vitro ou ion silico l’ensemble de ces processus. Le recours au modèle animal est donc primordial. De plus, les potentielles cibles thérapeutiques pourront être testées sur le rat FlnA-P637Q qui récapitule la complexité des processus physiopathologiques en jeu. Rappelons que le modèle de rat est particulièrement bien adapté à l’exploration des valves, qui sont des tissus très petits et difficiles à imager sur les souris. Nos données préliminaires suggèrent la présence de la pathologie valvulaire dès 7 jours post naissance. Nous devons déterminer le stade précis où la pathologie est présente afin d’étudier les mécanismes initiateurs. De plus, l’évolution de la pathologie a un intérêt thérapeutique. Nous allons donc utiliser les rats entre la naissance et l’âge de 12 mois.
Influence des mécanismes de contrôle qualité du génome mitochondrial sur le vieillissement pathologique cardiaque sur souris.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
634 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Vieillies jusqu'à vingt-quatre mois, elles subissent l'implantation chirurgicale d'une puce télémétrique sous la peau, un enregistrement cardiaque avec test de stress, puis des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant deux mois pour tester des molécules. Le porteur indique que ces injections répétées sur des souris âgées peuvent provoquer des douleurs, prises en charge par paliers d'antalgiques jusqu'à l'euthanasie au point limite. Il affirme que les organoïdes et les cardiomyocytes issus de cellules souches ne permettent pas d'étudier l'arythmie sur un cœur entier.
Objectifs
Au cours du vieillissement, on observe dans la population un nombre plus important de maladies du cœur, telles que les arythmies cardiaques, l’ensemble étant grevé d’un coût humain et sociétal majeur. Bien que le lien entre vieillissement et pathologies du système cardiovasculaire soit certainement multifactoriel, de nombreux travaux suggèrent l’implication d’une dysfonction des mitochondries. Ces organites cellulaires possèdent leur propre ADN, l’ADN mitochondrial (ADNmt) et jouent le rôle de centrale énergétique de nos cellules. Au cours du vieillissement, nos tissus contiennent quelques cellules présentant une perte d’activité des mitochondries, du fait de l’accumulation de mutations de l’ADNmt. A l’aide d’un modèle de souris qui accumule ces mutations de l’ADNmt de manière accélérée dans le cœur et les muscles squelettiques, nous avons pu montrer qu’au-delà d’un seuil critique, ces cellules déficientes ont un impact pathologique sur la fonction du cœur, générant des arythmies cardiaques. Le projet que nous souhaitons développer a deux objectifs principaux. Le premier est d’étudier l’influence de ces cellules déficientes en activité mitochondriale sur d’autres maladies cardiaques au cours du vieillissement. Le deuxième est de moduler deux mécanismes de contrôle qualité de l’ADNmt chez ces souris afin de ralentir l’accumulation de mutations de l’ADNmt et donc retarder voire prévenir la survenue de leurs troubles cardiaques, ouvrant ainsi la voie à des approches thérapeutiques qui seront peut-être applicables chez l’homme.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d’apporter de nouvelles connaissances sur l’influence des mitochondries sur le développement de troubles cardiaques au cours du vieillissement, qui sont un véritable problème de santé publique. De plus il devrait permettre de déterminer si l’utilisation de molécules destinées à moduler le contrôle-qualité de l'ADN mitochondrial peut s’avérer bénéfique pour la santé humaine en ce qui concerne les maladies cardiovasculaires, en conduisant à une meilleure santé des mitochondries, et donc en retardant l’apparition de troubles fonctionnels du cœur. Certaines des molécules que nous souhaitons tester sont déjà utilisées dans des études cliniques dans d’autres contextes, et de ce fait, si nous observons un effet positif sur la survenue de troubles cardiaques, l’utilisation de ces molécules pourrait être rapidement transférée à l’homme.
Procédures
Dans une première série d'expériences, les animaux vont subir une chirurgie sous anesthésie et analgésie pour implanter une puce télémétrique sous la peau (durée de l'intervention: 15 minutes) afin de mesurer l'électrocardiogramme (ECG). Sept jours après chirurgie, la mesure de l'ECG sera réalisée 24h en cage, puis 10 minutes pendant un test de stress. Dans une deuxième série d'expériences, les animaux vont subir une injection intrapéritonéale (durée de l'intervention: 1 minute) quotidiennement pendant 2 mois pour tester le potentiel de molécules sur les arythmies cardiaques.
Impact sur les animaux
Pour l’échocardiographie, aucune nuisance n’est à prévoir, les souris étant anesthésiées à l’isoflurane pendant la procédure. Pour la télémétrie, les souris vont subir une chirurgie, sous anesthésie (isoflurane) et analgésie (buprénorphine), placées sur un tapis chauffant (37°) pour éviter l’hypothermie. Un délai de 7 jours entre cette opération et les mesures d’ECG permettra aux souris de récupérer. Pendant cette période, les souris seront controlées deux fois par jour pour jauger une éventuelle douleur liée à l’opération ou une perte de poids. La mesure d’ECG de 24h en cage n’entrainera pas de nuisance. En revanche, les souris seront observées pendant les 10 minutes de test de stress, et seront retirées au moindre signe d’inconfort. Enfin, la répétition d’injections intrapéritonéales des molécules à tester sur 60 jours sur souris âgées (de 16 mois à 18 mois et 22 à 24 mois) pourrait entrainer des douleurs, que nous évaluerons par une grille se score. En cas de douleur légère, du paracetamol sera administré dans l’eau de boisson, en continu. Par ailleurs, si des signes comportementaux indiquent une douleur modérée, un anti-douleur plus puissant et à action plus longue sera administré en sous-cutané et du gel en contenant sera placé dans la cage pour la nuit. Enfin, si des signes comportementaux indiquent une douleur ou un inconfort important, la souris sera euthanasiée (point limite).
Devenir
Tous les animaux prévus dans le projet (634) seront euthanasiés en fin d'expérience.
Remplacement
Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle par un modèle in vitro, car nous voulons étudier l’influence physiologique de cellules déficientes en activité mitochondriale sur la fonction du cœur entier, et les modèles d’organoïdes 3D ou cardiomyocytes issus de cellules souches pluripotentes induites humaines ne permettent pas d’une part d’avoir un taux de mutations de l’ADN mitochondrial suffisant, du fait de l’élimination de ces mutations par contrôle qualité mitochondrial dans ces conditions. De plus, l’analyse de l’ECG par télémétrie requiert une phase de stress qui ne peut être reproduite in vitro. Enfin, la souris K320E-Twinkle est modèle de vieillissement tissulaire unique, le seul qui permette d'étudier l'impact des mosaïques tissulaires mitochondriales sur ce processus de manière tissu-spécifique.
Réduction
Nous réduisons au minimum le nombre d'animaux à utiliser pour obtenir des résultats exploitables au niveau statistique. De plus, seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Ainsi nous allons utiliser les mêmes souris pour les échocardiographies et la télémétrie et 192 souris seront utilisées sur deux protocoles expérimentaux. En raison de l'âge avancé des animaux au moment des expérimentations, nous savons par expérience sur notre projet précédent qu'un nombre non négligeable d'animaux doit être euthanasié en raison de points limites. Pour ne pas mettre en péril le projet, tout en restant sur un nombre minimal d'animaux par procédure, nous avons inclus 20% d'animaux en plus pour chaque groupe. Pour obtenir des résultats exploitables sur le plan statistique, nos expériences solides de ces méthodes Omics nous impose d'utiliser au minimum 15 souris/groupe expérimental pour la métabolomique.
Raffinement
Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la SBEA, les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel compétent. En cas de plaie décelée, du Dermaflon ou du Cothivet sont utilisés pour favoriser la cicatrisation. En cas de douleur légère décelée chez les animaux, du paracetamol sera administré dans l’eau de boisson, en continu. Par ailleurs, si des signes comportementaux indiquent une douleur modérée, un anti-douleur plus puissant et à action plus prolongée sera administré en sous-cutané et du gel en contenant sera placé dans la cage pour la nuit. Enfin, si des signes comportementaux indiquent une douleur ou un inconfort important, la souris sera euthanasiée (point limite).
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines et l’étude du vieillissement pathologique, car l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme. De plus, la disponibilité de souris génétiquement modifiées permet d'étudier finement les mécanismes sous-tendant la pathogenèse de ces maladies. Dans le présent projet, la souris K320E-Twinkle est modèle de vieillissement tissulaire unique, le seul qui permette d'étudier l'impact des mosaïques tissulaires mitochondriales sur ce processus de manière tissu-spécifique. Les animaux seront utilisés à des âges tardifs, car le développement des mosaïques mitochondriales dans le cœur est un processus qui prend des mois. Pour déterminer l'âge auquel les expériences seront réalisées, nous nous basons sur de précédentes publications. Nous avions observé les premières mosaïques mitochondriales à 12 mois et des arythmies cardiaques significatives à 18 mois. Ainsi les souris les plus jeunes utilisées le seront à 12 mois, et nous prévoyons des analyses sur des animaux allant jusqu’à 24 mois.
Evaluation chez le rat, en imagerie par résonance magnétique, d’une nouvelle stratégie de neuroprotection non-pharmacologique pour l’accident vasculaire cérébral
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
20 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit sous anesthésie une occlusion de l'artère cérébrale moyenne puis une ischémie de 90 minutes, suivie d'examens IRM, pour tester un traitement de l'AVC consistant à incliner le corps tête en bas. Le porteur indique que la lésion induit des déficits sensorimoteurs, dont une hémiplégie partielle et des difficultés à se nourrir, sans récupération attendue puisque le suivi s'arrête à 24 heures. Il présente le projet comme une réplication d'un effet neuroprotecteur déjà observé, avancée comme condition d'une future évaluation "chez l'homme".
Objectifs
L’objectif est d’évaluer un nouveau traitement pour l’accident vasculaire cérébral (AVC), ayant l’avantage d’être non pharmacologique et facile à mettre en place dès le transport du patient vers l’hôpital. Il s’agit d’une inclinaison prolongée du corps (tête en bas, angle de 15°), effectuée pendant l’AVC, avant l'arrivée à l'hôpital. Un effet protecteur a déjà été mis en évidence sur un modèle d’ischémie/reperfusion chez le rat. Dans ce projet réalisé sur le même modèle animal, un suivi par IRM permettra de montrer que des changements de perfusion cérébrale sont induits pendant l’inclinaison, et qu’ils sont associés à l’effet neuroprotecteur observé. Par rapport aux données existantes, le projet a donc une double valeur, réplicative d’une part, et mécanistique d’autre part.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre de répliquer de manière indépendante l’observation d’un effet neuroprotecteur : c’est une condition pour qu’il soit ensuite évalué chez l’homme. De plus, il apportera des données d’imagerie éclairant le mécanisme d’action et guidant la future évaluation clinique de ce traitement potentiel.
Procédures
Pour induire l'accident vasculaire cérébral, une chirurgie de 30 à 45 minutes est réalisée sous anesthésie générale. L’anesthésie est prolongée pendant la durée de l’ischémie (90 min), soit une durée totale entre 2h et 2h15. Un examen IRM est réalisé pendant l'ischémie. Un autre examen IRM (20 minutes) est réalisé le lendemain.
Impact sur les animaux
La lésion cérébrale (striatum et cortex sensori-moteur) induit des déficits sensorimoteurs (hémiplégie partielle, locomotion altérée, possible difficulté à se nourrir) dont la gravité est mesurée grâce à diverses échelles ou neuroscores. Il n’y a pas de récupération sensorimotrice notable attendue dans ce projet car le suivi post-AVC est volontairement limité à 24h.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure, après mesure du déficit neurofonctionnel et de la taille finale d’infarct final. Les cerveaux sont prélèvés post-mortem pour analyses immunohistochimiques.
Remplacement
L’inclinaison du corps comme stratégie de protection cérébrovasculaire nécessite une expérimentation animale. L’utilisation du modèle animal adéquat (permettant une ischémie et une reperfusion) conditionne la validité de l’évaluation des traitements et la possibilité de transfert en clinique. L’utilisation d’animaux est également justifiée par le rôle central de l’imagerie in vivo dans ces procédures. Le projet utilisera des rongeurs, plutôt que des animaux de plus grande taille (chats, primate) grâce à l’utilisation d’appareils d’imagerie dédiés aux petits animaux.
Réduction
L’imagerie in vivo permet un suivi longitudinal sans avoir à sacrifier les animaux à intervalles donnés pour faire la même observation. Chaque animal est son propre contrôle, ce qui permet d’augmenter la puissance statistique des résultats tout en limitant le nombre d’animaux.
Raffinement
Dans ce projet, l’imagerie permet également de sélectionner des animaux avec une occlusion artérielle correcte, et une lésion cérébrale significative. La variabilité du modèle est ainsi limitée. La chirurgie est réalisée sous traitement anti-douleur adapté (buprénorphine), avec thermorégulation continue, et hydratation intra-péritonéale. D’autre part, le suivi est volontairement limité à 24h post-AVC, car l’infarct est alors constitué, et la mesure d’un éventuel effet neuroprotecteur peut être réalisée. Une grille de score dédiée permet de juger objectivement les déficits sensori-moteurs, et le codage des expressions faciales permet de quantifier la souffrance post-opératoire afin de la traiter.
Choix des espèces
Le rat (souches Sprague-Dawley ou Wistar) est utilisé en première intention car c’est sur cette espèce qu’ont été décrites les techniques d’occlusion endoluminale (via un filament carotidien), ne nécessitant pas de craniotomie et permettant un excellent contrôle de la recanalisation et de la reperfuion par simple rétraction manuelle du filament. Le modèle a ensuite été adapté à la souris, mais les déficits sensori-moteurs sont plus difficilement mis en évidence et la taille du cerveau est plus petite, ce qui est pénalisant pour les techniques avancées d’imagerie (mesure de la perfusion notamment). Rats : jeunes adultes (poids de 250-300g). L’occlusion de l’artère cérébrale moyenne est réalisée via un filament dont le diamètre est calibré en fonction du poids de l’animal. Il est donc capital pour la réussite du modèle et l’inclusion des animaux que le poids soit strictement contrôlé. Les animaux jeunes sont préférés car la variabilité du modèle est moindre.
Évaluation du potentiel thérapeutique de la stimulation de la O-GlcNAcylation dans le choc septique induit par ligature ponction caecale (LPC) chez la souris C57BL/6J de 10-12 semaines.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
183 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une chirurgie de ligature et ponction du cæcum leur provoque un choc septique, avec mobilité fortement réduite, absence de réaction aux stimuli et baisse de la prise alimentaire, pour tester une molécule stimulant l'O-GlcNAcylation comme piste thérapeutique. Le porteur décrit un modèle dont la mortalité propre avoisine 30 % et intègre cette perte au calcul des effectifs, en transposant à la souris des résultats déjà obtenus chez le rat. Les retombées cliniques annoncées restent renvoyées au long terme, l'objectif immédiat étant de valider l'innocuité et la dose du composé.
Objectifs
Le choc septique (défaillance multi-viscérale survenant au cours d’une infection grave associée à un syndrome de réponse inflammatoire systémique ou SIRS) est un problème de santé publique majeur dont l’incidence augmente avec le vieillissement de la population et dont la mortalité est comprise entre 30 et 50%. Malheureusement il n’existe pas de traitement adapté au choc septique ou au SIRS, conduisant à la mort de plus de 45 000 personnes par an en France. Il devient donc urgent de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le SIRS caractérise par une libération, une expression anormalement élevée d’une multitude de composés de l'inflammation. La manifestation du SIRS chez l’adulte inclut au moins 2 des critères suivants : une altération de la respiration, une dérégulation de la température, une tachycardie et un état hyper ou hypo-inflammatoire. De façon générale, un patient est considéré en état de SIRS lorsqu’il présente deux critères ou plus. Nous avons développé en collaboration avec une équipe américaine une approche visant à stimuler l’O-GlcNAcylation dans le choc septique. L’O-GlcNAcylation est une modification post traductionnelle responsable de la survie cellulaire qui joue un rôle majeur dans la réponse au stress. Les approches développées par nos deux équipes visent à augmenter de manière très précoce les niveaux de O-GlcNAc, et sont associées à une réduction importante des marqueurs de stress, à une amélioration de la fonction cardiovasculaire et une forte réduction de la mortalité dans le choc septique. Nous démontrons que la stimulation de l’O- GlcNAcylation présente un potentiel thérapeutique important pour la survie des patients. Le but du projet est de 1) valider l’innocuité des molécules chez un modèle murin, 2) valider une cinétique et une dose d’administration et enfin 3) confirmer les résultats obtenus chez le rat chez une autre espèce.
Bénéfices attendus
Avec les différents résultats précédemment obtenus par l’équipe dans un modèle de ligature et ponction caecale chez le rat, les résultats attendus sont une amélioration de la réponse inflammatoire, une amélioration de la fonction cardiovasculaire et des différents marqueurs de stress des animaux traités et ceux à différents temps d’administration. Ces résultats seront objectivés par une étude in vivo de la fonction et du stress cardiovasculaire (pression artérielle, fréquence cardiaque), rénale (créatinine) et hépatique mais également par des tests biochimiques (RT-qPCR et Western Blot) validant l’effet de la molécule testée. Lors de cette étude, les paramètres précédemment cités seront comparés entre les différents groupes (Contrôle, malades, malades + traitement). Les retombées à plus long terme peuvent être majeures avec la mise en place d’une nouvelle stratégie thérapeutique en clinique.
Procédures
L’ensemble des animaux sera soumis à 4 interventions. La première intervention consiste en la chirurgie afin de développer le choc septique (uniquement la chirurgie pour le groupe contrôle). Cette intervention dure environ 20 à 30 minutes (sur la base des expériences précédemment menées sur le rat). La deuxième intervention consiste à une injection de buprénorphine 6h après la chirurgie (à 14h le jour de la chirurgie) sur un animal vigile. Cette intervention dure quelques secondes. La troisième intervention consiste à une injection de buprénorphine 12h après la chirurgie (à 20h le jour de la chirurgie) sur un animal vigile. Cette intervention dure quelques secondes. Enfin la quatrième et dernière intervention consiste à une chirurgie afin d’avoir accès aux valeurs hémodynamiques des animaux. L’intervention dure environ 5 à 10 minutes (sur la base des expériences précédemment menées sur le rat).
Impact sur les animaux
Le modèle de ligature et ponction caecale est un modèle représentant la symptomatologie du choc et de fait un modèle sévère. Au cours de ce protocole, l’état de santé des animaux va s’aggraver du fait du développement du choc septique avec une mobilité fortement réduite, une absence de réaction aux stimuli sonores et toucher mais également une diminution de la prise alimentaire, sans toutefois de réel impact sur le poids, le protocole n’ayant une durée que de 24h. Enfin, une douleur peut être associée à la chirurgie réalisée sur l’animal (laparotomie). L’apparition de ces effets indésirables est environ 2 à 3h après l’induction du choc et jusqu’au sacrifice.
Devenir
A la fin de la procédure 1 (procédure sévère), tous les animaux ne présentant pas de signes de souffrance trop important seront gardés en vie pour la procédure 2. Seuls les animaux démontrant des signes de souffrances trop importants seront euthanasiés en fin de procédure 1. A la fin de la procédure 2 (procédure sans réveil), tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes.
Remplacement
Le choc septique est une pathologie complexe faisant intervenir de nombreux mécanismes complexes et intégrés, nécessitant impérativement l’utilisation de modèles animaux. L’usage des animaux est justifié uniquement car ce modèle n’est pas remplaçable.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit de façon à obtenir des données statistiques suffisamment puissantes (dans la mesure du possible, les tests seront réalisés en aveugle afin d’augmenter la puissance de l’étude). Les animaux seront utilisés à un âge adulte. La taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux pour les groupes en choc septique est calculé de la façon suivante : un nombre d’animaux statistiquement viable est sélectionné (n=15). A cela s’ajoute la mortalité associée au modèle (environ 30%) mais également l’exclusion de certains animaux (entre 20% et 40% avec les résultats précédemment obtenus) soit entre 15/0.7*0.8 = 26,7 soit 27 animaux et 15/0,7*0,6= 35,7 soit 36 animaux. Les tests statistiques utilisés seront des tests Kruskall-Wallis avec post test de Dunn’s non corrigé.
Raffinement
Les différentes procédures expérimentales de la première étape (mise au point) seront réalisées sur des effectifs réduits afin de déterminer les conditions (i) de transposition du modèle du rat à la souris et (ii) d’utilisation optimales. Dans un second temps, lorsque la transposition à la souris et les conditions d'utilisation optimales auront été déterminées, les procédures seront réalisées sur un plus grand nombre d’animaux avec seulement les conditions sélectionnées dans la première étape. Afin de raffiner le modèle, des mesures seront mises en place afin de maximiser le confort des animaux par exemple avec la mise en place de scores et de points limites comprenant des critères morphologiques (aspect, comportement) et physiologiques (température, fréquence respiratoire), l’administration d‘un antidouleur en début de procédure et toutes les 6 heures post-chirurgie est prévue et la réinjection d’une dose supplémentaire peut être considérée en cas de signe de douleur. De plus, nous associerons une infiltration d’un anesthésiant local (lidocaïne 0,5%, maximum de 0,03mL) au niveau de la zone incisée. Tout au long de l’étude, les animaux seront hébergés par 3 dans des cages avec enrichissement, sur portoirs ventilés et avec accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Un respect strict des cycles jour/nuit sera observé. Après chirurgie, afin d’éviter au maximum le stress, les animaux seront replacés avec leurs congénères opérés le même jour. Tout au long des procédures, les animaux seront sous une couverture anesthésique (mélange O2/sévoflurane – induction : 8% à 1L/min ; maintien : 3% à 0,5L/min). Nous proscrirons l’usage d’anti-inflammatoires non stéroïdiens du fait de leur impact sur l’inflammation, voit majeure dans la physiopathologie du choc septique. La liste des points limites est présentée en annexe. Ces points seront adaptés avec la phase de mise au point. Un score sera établi et des décisions seront prises en fonction de ce score afin de limiter la douleur de l’animal. Si nous observons que notre score n’est pas totalement adapté lors des premières expériences, nous modulerons la rigidité de ce dernier toujours dans le but de réduire au maximum la souffrance animale. Les gestes réalisés au cours de ce projet sont des gestes simples et maîtrisés par l’équipe chez le rat (cathétérisation artérielle, ligatures du caecum).
Choix des espèces
Ce modèle est, historiquement et actuellement, l’un des plus utilisé et des mieux décrit. Sa proximité avec la symptomatologie du choc septique chez l’Homme, sa facilité de mise en place en fait un modèle efficace pour cribler et valider l’efficacité des traitements. Les souris utilisées sont des souris C57BL/6J de 10-12 semaines, âge standard pour ces manipulations. La taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. 10-12 semaines. C’est un âge standard pour ce genre de manipulations. De plus la taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés.