Troubles cardiaques

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie est immunisée pour déclencher une myocardite auto-immune, l'autre subit une chirurgie du thorax reproduisant une sténose de l'aorte, les deux menant à une insuffisance cardiaque avant la mise à mort pour analyses. Le porteur indique que les deux procédures sont classées sévères parce qu'elles conduisent à cette défaillance du cœur. Il prévoit quelques expériences in vitro mais juge l'animal "nécessaire" faute de modèle de myocardite ou d'hypertrophie cardiaque hors de l'organisme entier, les cibles visées restant renvoyées à d'éventuelles études cliniques.

Objectifs

L’objectif du projet est de déterminer les intéractions moléculaires des cellules immunitaires avec les vaisseaux lymphatiques pendant l’inflammation cardiaque afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies cardiovasculaires (MCV) tels que la myocardite ou l’hypertrophie pathologique. Nous souhaitons utiliser un modèle de myocardite auto-immune expérimentale (EAM) induit par immunisation contre la troponine I (TpnI) pour : 1) caractériser l’expression des molécules de co-signalisation et 2) moduler la réponse immunitaire à l’aide de traitement ICI (immune checkpoint inhibitors) afin de comprendre au mieux les cas cliniques rapportés dans la littérature de myocardite induite par traitement ICI chez des patients atteints de cancers. D'autre part, le modèle de sténose aortique (TAC : transverse aortic constriction) permet de modéliser une cardiomyopathie hypertrophique pathologique. En caractérisant finement la communication entre les cellules immunitaires infiltrant le cœur et les vaisseaux lymphatiques au travers des cytokines, chimokines et des molécules de co-signalisation, nous souhaitons proposer de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de moduler cette hypertrophie pathologique. Ensemble, ces deux modèles vont permettre d’améliorer notre compréhension de la réponse immunitaire cardiaque lors de MCV. Nous pourrons alors proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour la médiation de cette réponse immunitaire et ainsi prévenir le développement d’une insuffisance cardiaque.

Bénéfices attendus

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de mortalité dans le monde suivi dans les pays industrialisés du cancer (OMS, 2017). Le besoin de nouvelles thérapeutiques anti-tumorales a permis l’émergence de l’immunothérapie. Cependant, l’utilisation en oncologie d’immunothérapie a rapporté la présence d’effets indésirables d’origine auto-immune tel que les myocardites. Bien que rares, ces évènements sont associés à une mortalité élevée. C’est pourquoi nous avons choisi de mettre en place le modèle EAM pour comprendre le développement de ces effets indésirables à la suite d’un traitement d’immunothérapie. Ce projet va nous permettre de caractériser le remodelage lymphatique et la réponse immunitaire cardiaques au cours de maladies cardiovasculaires. Nos deux modèles décrit dans cette DAP permettent d’étudier deux maladies cardiovasculaires d’origine non-ischémique présentant un phénotype cardiaque différent. Dans un premier temps, la caractérisation précise de la communication qui existe entre cellules structurantes cardiaques (cardiomyocytes, fibroblastes, etc), cellules lymphatiques et cellules immunitaires dans le contexte de ces deux modèles de maladies cardiovasculaires au travers des cytokines, chimiokines et des molécules de co-signalisation va nous permettre, dans un second temps, de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de moduler l’inflammation, l’œdème et la fibrose afin de restaurer la fonction cardiaque. Ce projet s’inscrit dans un axe de recherche en plein essor qu’est la cardio-immunologie. A terme, ces nouvelles cibles thérapeutiques pourront faire l’objet d’études cliniques chez le patient et ainsi proposer de nouvelles solutions pour l’utilisation de l’immunothérapie antitumorale en limitant la survenue d’effets indésirables cardiaques mais également de nouvelles solutions pour le traitement de l’insuffisance cardiaque.

Procédures

Dans la procédure N°1 les animaux vont etre immunisés en 3 fois ( 1 par semaine pour les 310 souris). Des prélèvements sanguins sont réalisés sous anesthésie générale (1 fois par quinzaine, pour 360 souris) Dans la procédure N°2, une opération chirugicale de type mini Thoracotomie sera réalisée sur 180 souris. Des prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale (1 fois par quinzaine, pour ses 180 souris).

Impact sur les animaux

Les deux procédures sont classées sévères. Les deux procédures mênent à une insufisance cardiaque, la première procédure est produite par une immunisation, induisant une inflammation cardiaque. La deuxième procédure est réalisée par une chirurgie cardiaque (minimalement invasive).

Devenir

mise a mort de tous les animaux en fin d'etude pour analyses cellulaires et moleculaires

Remplacement

Dans l’objectif de remplacer l’expérimentation animale, nous mettrons en place certaines expériences par des études in vitro (prolifération de cellules, interactions cellules-cellules). Cependant l’utilisation des animaux est rendue nécessaire car il n’existe pas à ce jour de modèle de myocardite ou d’hypertrophie pathologique in vitro.

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude nous réaliserons séquentiellement des mesures non-invasives de la fonction cardiaque (échographie, IRM) puis des mesures invasives (hémodynamique, lymphangiographie). Nous avons également mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex vivo au moment de la mise à mort. De plus, nous avons réalisé des tests statistiques appropriés pour calculer le nombre de souris nécessaire afin de détecter une différence de 15% (ex : one way ANOVA et test de Tukey). Nos expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=15 sont nécessaires pour des évaluations fonctionnelles tel que l’échocardiographie. Un meilleur suivi post-opératoire permet de limiter le nombre d'animaux par groupe dans le modèle TAC.

Raffinement

Pour raffiner, les animaux sont hébergés aux normes requises et un enrichissement des cages est mis en place. Des points limites adaptés, une stratégie d’anesthésie et d'analgésie seront mise en place avec un suivi quotidien du bien-être animal. Nous allons dans ce projet utiliser des souris femelles, ce qui diminuera les variations dans les réponses immunitaires, et permettra une meilleure comparaison entre nos modèles.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par l’expérience du laboratoire avec des modèles de cardiomyopathies chez la souris. La souris a également l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des outils biologiques, comme certains anticorps monoclonaux qui ne sont parfois pas accessibles pour le rat. De plus, dans notre laboratoire, nous avons depuis de nombreuses années une excellente expérience des évaluations fonctionnelles et structurelles cardiaques in vivo ainsi que ex vivo chez la souris. Nous allons inclure uniquement des souris adultes de 20-24g pour ces études. La taille des souris à cet âge permet une réalisation facilitée des chirurgies et correspond à un âge habituel dans la littérature pour l’induction du modèle.

264 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par chirurgie sous anesthésie, suivi de jusqu'à onze séances d'imagerie, de prélèvements sanguins et d'injections dans le sinus rétro-orbitaire, pour tester un traitement répété à l'apéline. Le porteur reconnaît que l'infarctus peut entraîner des troubles de la déglutition, une asphyxie et la mort, ainsi qu'une hémiplégie potentiellement durable qui motive la mise à mort. Il affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne permet de reproduire un AVC et prélève le cerveau de tous les animaux.

Objectifs

L’Accident Vasculaire Cérébral (AVC) constitue la première cause d'handicap acquis chez l’homme, la 2ème cause de démence et la 3ème cause de mortalité en France. Sa forme ischémique est causée par l’occlusion d’une artère cérébrale par un caillot de sang. L’occlusion de l’artère entraine une crise énergétique, par défaut d’apport en glucose et oxygène et provoque la destruction rapide et définitive d’une zone du cerveau. Malgré l’avancée des traitements de recanalisations (thrombolyse chimique et thrombectomie mécanique), 50% des patients traités gardent des séquelles. La plasticité vasculaire et neuronale constitue le pivot de la récupération post-AVC. En situation post-AVC, différents mécanismes compensatoires de création de nouveau vaisceaux sont activés. Ces mécanismes physiologiques compensatoires peuvent s’avérer insuffisants pour assurer une reperfusion efficace lors d’épisodes ischémiques aigus, mais également chroniques. Plusieurs pistes expérimentales sont étudiées pour améliorer la récupération post-AVC (thérapies régénératives, agents neuroprotecteurs, entrainement physique + cognitif). Une molécule "l'Apeline" et son récepteur sont largement distribués dans différents tissus et organes. La littérature suggère un effet protecteur de l’Apeline sur la neurotoxicité, le stress oxydatif, l’apoptose neuronale et joue un rôle neuroprotecteur après une lésion aigue d’ischémie-reperfusion cérébrale. Cependant dans ces études une seule administration d’Apeline est faite le jour de l’ischémie, les bénéfices sont évalués à très court terme. L’objectif de ce projet est d’une part de caractériser le modèle AVC chez la souris à l’aide de l’imagerie clinique nucléaire et d’évaluer par la suite l’effet thérapeutique d'un traitement répété d’Apeline sur la récupération post-AVC dans ce modèle d'AVC murin.

Bénéfices attendus

Notre projet a pour objectif d’évaluer le potentiel neuroprotecteur d'injections répétées d’Apeline dans un contexte d’accident vasculaire cérébral (AVC) chez la souris. Ceci n’a jamais été rapporté dans la littérature à ce jour. Les troubles cognitifs pouvant être associés à l’AVC ont des répercussions négatives sur la qualité de vie du patient, sur le taux de mortalité dans les 4 années suivant l’AVC, et représentent un impact médico-social considérable pour la société. Il est donc essentiel de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le but de réduire ces troubles cognitifs. L’Apeline est un peptide dont l’effet neuroprotecteur est décrit lors d'une injection pendant l'ischémie. Dans ce modèles, les conséquences neurovasculaires de l’administration d’apeline sont encore très peu décrites. Dans ce projet l’objectif est de mettre en évidence l’intérêt d’un traitement répété sur une durée de traitement plus longue et d’évaluer l’impact de ce traitement sur la réduction des différents troubles moléculaires, moteurs et cognitifs après la survenue d’un AVC.

Procédures

(1) Chirurgie pour le modèle d'AVC, elle se fait sous anesthésié général gazeuse (durée moyenne 1h30 ) 1 fois par animaux. (2) imagerie isotopique: se fait sur souris anesthésié (5min pour l'injection du traceur, puis 30 minutes pour l'acquisitions des images) les animaux pourront avoir jusqu'à 11 imageries répartie sur 1 mois. (3) 3 Prélèvements sanguins (5 µL) par micro-incision sur la veine caudale, se fait sur animal anesthésié et 4 prélèvements de 150µl répartis sur 30 jours (durée 5 minutes le temps de l'induction de l'anesthésie gazeuse et du réveil). (4) injection des traitements, se fera en par injection dans le sinus retro-orbitaire sur animal anesthésie maximum 3 injections sur 3 jours (durée 5 minutes le temps de l'induction de l'anesthésie gazeuse et du réveil). (5) Frottis vaginaux 3 fois par semaines maximum sur animal anesthésiés (durée 5 minutes le temps de l'induction de l'anesthésie gazeuse et du réveil).

Impact sur les animaux

Ce projet nécessite des prélèvements sanguins itératifs, qui seront effectués par incision caudale pouvant entrainant une douleur au moment de l’incision et un risque d’infection. La chirurgie a pour conséquence de générer un infarctus cérébral conduisant à une perte de mobilité plus ou moins transitoire et d’intensité variable. Durant les premières heures, l'animal ne sera peut-être pas capable de boire ou manger, car il peut présenter des troubles de la déglutition, entrainant fausse route, asphyxie et décès. Une perte de poids peut être observée dans les jours suivants la chirurgie, ainsi que l'apparition d'infection au niveau des plaies. L’anesthésie prolongée lors de la chirurgie et des imageries peut induire un risque l’hypothermie. Les injections intraveineuses répétées dans les veines caudales ou dans les sinus rétro-orbitaires peuvent engendrer l’apparition de bleus et des risques de complications de cicatrisation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures, qui entrainerait une hémiplégie potentiellement durable. A la fin des protocoles les cerveaux des animaux seront récupérer afin de faire des études complémentaires de type immunohistochimie ou analyse par westerne blot ou Elisa.

Remplacement

L’étude des Accidents Vasculaire Cérébraux (AVC) et de ces traitements, nécessite un modèle animal complexe (système nerveux, système vasculaire, connexion en les organes). En effet, les AVC ont des impacts au niveau de différentes structures du cerveau ainsi que de conséquences moteur et physiologiques sur l’ensemble de l’organisme. Il n’existe à l’heure actuel aucun modèle in silico ou in vitro permettant de mimer les impacts d’un AVC ou d’étudier les effets d’un traitement. Suite à l’induction du modèle chez les souris, et à la fin de nos études in vivo nous récupérons les organes pour compléter et enrichir nos données avec des études ex vivo.

Réduction

Cette étude nous permettra d’évaluer l’effet de l’Apeline dans la réduction de la neurotoxicité cérébrale suite à un AVC. La première phase du projet nous permettra d’évaluer la faisabilité du projet. Si nous n'arrivons pas à obtenir un modèle de'AVC chez la souris suffisamment reproductible (nombre d'échecs < ou = à 20% sur 15 chirurgies consécutives) le projet sera arrêté. Une souris avec un AVC réussi répondra à 3 critères : (1) perte de la perfusion cérébrale d’au moins 80%pendant l’ischémie ; (2) un score d'évaluation clinique à J1 supérieur à 4 ; (3) survie de plus de 5 jours. Le nombre maximal de chirurgies réalisées pour un opérateur pour valider le modèle sera de 50. Pour évaluer le modèle ischémie cérébrale transitoire chez la souris au cours du temps nous utiliserons l’imagerie isotopique, technique permettant des études non invasives, longitudinales, multiparamétriques et quantitatives, ce qui permet de minimiser le nombre d’animaux nécessaire. Nous nous basons sur l’expertise de la plateforme et nous aurons donc besoin de 8 souris par traceurs. Ce nombre est suffisant pour prendre en compte la variabilité interindividuelle et permettre de déterminer la meilleure fenêtre d’imagerie pour chaque traceur dans notre modèle. Le modèle d'AVC chez le rongeur a des impacts physiologiques et fonctionnels interindividuels très variés. Les études déjà publiés chez la souris utilisent des effectifs par groupe très variable. Pour la dernière phase de notre étude où nous évaluerons les effets d’un traitement précoce d’Apeline sur 3 jours, études qui n’ont jamais été réalisées chez la souris, nous nous baserons sur notre expérience du modèle chez le rat pour déterminer le nombre d’animaux nécessaire. Nous avons donc choisi d'avoir des groupes de 12 animaux pour nous permettre une évaluation statistique fiable à la fin de l'étude (anova two way pour les analyses longitudinales entre les différents groupes et test non paramétrique de wilcoxon pour les comparaisons entre 2 groupes).

Raffinement

Les chirurgies, prélèvements sanguins, les injections iv et les séances d’imagerie se feront sous anesthésie générale gazeuse, ce qui permettra de minimiser le stress de l’animal et un réveil rapide de l’animal. Les souris anesthésiées seront toujours placées sur un tapis ou lit chauffant avec contrôle de la température pour éviter tout risque d’hypothermie. Les expérimentations douloureuses seront toujours accompagnées en plus de l’anesthésie générale d’une analgésie locale et/ou générale par injection en s.c de morphinique . Pendant une heure après la chirurgie une surveillance accrue des animaux sera mise en place, pour éviter tout complications post-opératoires. L’accès à la nourriture et à l’eau ne permise qu’une fois que l’animal sera parfaitement réveillé pour éviter les problèmes de fausse route. Puis le bienêtre des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel qualifié, ce qui nous permettra d’intervenir rapidement dès le moindre signe éventuel de souffrance pour la prendre en charge. Tout signe et/ou comportement anormal : difficultés à respirer, souris prostrée, en retrait, ou une perte de poids, par exemple, sera signalé et pris en charge par des compléments alimentaires ou une médication adaptée. Si les signes clinique ne s’améliore pas ou que la perte de poids est supérieur à 20% du poids initial l’animal sera sorti du protocole et mis à mort sans délai pour éviter toutes souffrances inutiles. Les conditions d’hébergement classique, animaux hébergés en groupe (maximum 5 par cage), avec accès à la nourriture et l’eau sans restriction et avec un cycle jour/nuit de 12/12h, seront enrichi en alternance par l’ajout de dôme, de tube, de matériel (fibre de coton) pour la nidification, afin d’enrichir l’environnement et d’éviter les comportements de stéréotypies.

Choix des espèces

Le modèle d’AVC transitoire chez la souris est bien décrit dans la littérature. Cette technique d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (tMCAO) par un filament de nylon introduit dans l'artère carotide commune via l’artère carotide interne pour occlure l’artère cérébrale moyenne, reproduit l’accident vasculaire cérébral ischémique le plus fréquent chez l’humain (par occlusion de l’artère cérébrale moyenne). Les animaux seront utilisés au stade adulte entre 3 et 4 mois conformément au modèle décrit dans la littérature. Après réception, les animaux seront hébergés pendant 7 jours minimum avant le début du protocole expérimental.

10 moutons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une première chirurgie cardiaque de trois heures dérivant la veine cave vers les artères pulmonaires, puis environ deux mois plus tard une seconde intervention, avant huit heures de cathétérisme, d'échographie et d'IRM, pour mettre au point un modèle de la circulation de Fontan pratiquée chez des enfants. Le porteur indique que les complications attendues incluent hémorragie aiguë, dysfonction cardiaque, troubles du rythme, défaillance respiratoire ou sepsis pouvant tuer l'animal pendant l'opération ou durant les soixante jours suivants. Il rappelle qu'un essai similaire en 2020 avait entraîné la mort de deux moutons sur dix, et prévoit une mortalité comparable, estimant avoir "besoin" de dix animaux pour en exploiter huit.

Objectifs

La procédure de Fontan est réalisée pour la prise en charge palliative d'enfants atteints d'une cardiopathie congénitale complexe de type « ventricule unique » en attente d’une transplantation cardiaque. Néanmoins, l’histoire évolutive des patients palliés par une circulation de Fontan est marquée par des complications telles que des dysfonctions d’organes menant au décès ou à la transplantation cardiaque. Afin de mieux comprendre les mécanismes à l’origine de ces défaillances, de nombreuses équipes ont tenté de développer des modèles animaux reproduisant ce montage. Cependant, très peu d’équipes sont parvenues à développer un modèle chronique fiable et reproductible. L’objectif principal de notre programme expérimental est la mise au point et la validation d’un modèle animal chronique fiable et reproductible de circulation de Fontan à partir d’une approche peu invasive. Ainsi, ce projet a pour objectif de mettre au point et de valider un modèle ovin chronique de circulation de Fontan, en utilisant une technique interventionnelle hybride - chirurgicale et percutanée, mini-invasive, qui ne nécessite pas d’assistance cardiaque per-procédurale afin de limiter la mortalité liée à la procédure.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’un projet ambitieux dont les résultats permettraient une meilleure compréhension des complications chroniques de la CF. Il permettrait aussi d’ouvrir de nouvelles perspectives de recherche, en permettant de tester des solutions thérapeutiques (médicamenteuses, dispositifs d’assistances) mais aussi d’avoir un véritable impact en termes de santé publique en améliorant la prise en charge de ces patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes opérations permettant de créer le modèle de la maladie, de suivre son évolution, de comprendre et répondre aux objectifs du projet : une dérivation cavo-pulmonaire partielle réalisée par voie chirurgicale d’une durée estimée à 3h qui consiste en la dérivation du sang veineux drainé par le veine cave supérieure vers le réseau artériel pulmonaire puis environ 2 mois plus tard, la réalisation d’une dérivation cavopulmonaire totale qui consiste en la finalisation de la dérivation du réseau veineux inferieur vers la circulation pulmonaire par voie per-cutanée. Ensuite une série de mesures par cathétérisme cardiaque, échocardiographies trans-thoraciques et IRM cardiaque sont réalisées sur une durée totale de 8h afin de comprendre les causes de défaillance aigues de ce modèle animal de circulation de Fontan.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont une défaillance multiviscérale par hémorragie aigue, dysfonction cardiaque, troubles du rythme cardiaque, défaillance ventilatoire ou sepsis sous anesthésie générale conduisant au décès pendant une procédure ainsi que pendant la période inter-procédurale de soixante jours.

Devenir

A la fin du projet, les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir poursuivre les investigations scientifiques ex-vivo.

Remplacement

Cette étude a pour objectif la mise au point du premier modèle animal chronique de circulation de Fontan afin de pouvoir identifier des cibles thérapeutiques et développer des traitements chez l’homme et notamment une assistance circulatoire mécanique de longue durée adaptée spécifiquement à la circulation de Fontan ; ces projets requièrent un modèle animal proche anatomiquement et physiologiquement de l’homme sur le plan cardiovasculaire et pulmonaire. Le remplacement par une espèce non vertébrée, ou autre qu’un mammifère terrestre serait donc non pertinent. Et la réalisation de cette étude in-vitro ou ex-vivo ne permettrait pas le recueil des données nécessaires et interprétables pour le développement de ce modèle animal chronique de circulation de Fontan. Le choix de l’Ovis aries résulte d’une réflexion autour de la meilleure stratégie de remplacement possible, en effet le projet par sa complexité technique nécessite un animal dont le cœur et les vaisseaux soient de taille suffisante.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé pour permettre un nombre suffisant d’observation pour permettre d’observer une variation significative des données. En 2020, le développement de la technique hybride par chirurgie et cathétérisme interventionnel sur 10 animaux a conduit à une mortalité per-procédurale de 20% soit 2 animaux. Nous prévoyons une mortalité similaire voire moindre compte tenu de l’expérience acquise en 2020, nous l’avons estimée à environ 15% pour ainsi assurer les manipulations et le recueil des données chez 8 animaux, nous avons estimé avoir besoin de 10 animaux. Notre stratégie est de réaliser successivement les différentes manipulations de telle sorte que l’une n’interfère pas les résultats de la suivante avec un recueil des données avant début des manipulations qui servira de référence pour en analyser les données. Chaque animal sera son propre témoin et permettra donc le recueil de données de 4 états différents, lors d’une seule et même anesthésie générale sans réveil.

Raffinement

L’animal est place dans les conditions d’hébergement initial avec les méthodes de raffinement adéquat a son espèce : groupe social, pierre a sel et jouets. Une acclimatation de 4 jours à l’animalerie de l’IHU est prévue avant la première étape. Les animaux sont suivis quotidiennement par du personnel formé. Les animaux sont suivis selon des points limites clairement définis et spécifiques au projet. Le transport durant les périodes intermédiaires entre les différentes étapes du projet offrira à l’animal des conditions quotidiennes maximales d’hébergement et de raffinement notamment du fait que les animaux auront accès à un enclos extérieur Pour l’intervention, l’animal sera prémédiqué. Sous anesthésie générale, le niveau de sédation et d’analgésie sera adapté aux besoins de l’animal L’ensemble des gestes invasifs, douloureux ou anxiogènes seront réalisés ensuite sous anesthésie générale. Une fois les manipulations terminées, une analgésie de relais est administrée, puis la sédation est levée, jusqu’à atteinte d’un niveau d’éveil suffisant pour permettre un réveil. Une analgésie est maintenue 7 jours. A l’issue de la dernière phase des manipulations, toujours réalisées sous anesthésie générale, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Le modèle ovin a été choisi pour plusieurs raisons, son anatomie et sa physiologie cardio-vasculaire proche de l’humain, une anatomie thoracique compatible avec la chirurgie prévue, des poids en bas âge et à l’âge adulte adaptés aux différentes procédures et à la mise en place de matériel dédié et une tolérance clinique induits par les modifications physiologiques induite. Nous utiliserons des animaux d’environ 12 semaines qui auront atteint 5 mois lors du deuxième temps chirurgical ce qui correspond au délai de totalisation de la circulation de Fontan chez l’humain (petite enfance).

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une thoracotomie provoquant une ischémie-reperfusion du coeur, avec un risque déclaré de douleurs post-opératoires, de saignements et d'hypothermie, avant que le coeur infarci ne soit prélevé. Le porteur cherche à identifier des récepteurs impliqués dans le remodelage cardiaque, en vue de "biomédicaments" dont il rappelle qu'ils sont une spécialité de son université. Il affirme que seul l'animal entier permet d'observer ces interactions, hors de portée des cellules en culture.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires dont le chef de file est l’infarctus du myocarde constituent à l’heure actuelle la première cause de mortalité dans les pays développés et ont une progression continuellement croissante dans les pays en voie de développement. Dans ces maladies, une part importante de la physiopathologie est liée à l’ischémie-reperfusion (l’ischémie est définie par la réduction ou l’interruption du débit sanguin dans un territoire vasculaire donné ; la reperfusion correspond à la restauration du flux sanguin). Même si leur prise en charge s’est beaucoup améliorée ces dernières années, certainescomposantes restent pour l’instant non ciblées par les thérapeutiques actuelles, qu’il s’agisse des lésions de reperfusion ou de la réponse immuno-inflammatoire à l’ischémie-reperfusion . La séquence ischémie-reperfusion myocardique, observée lors d’un infarctus du myocarde reperfusé, est associée à la libération de signaux de danger, parmi lesquels l’Adénosine Tri-Phosphate (ATP) et autres nucléotides extracellulaires. L’ATP et ses dérivés se fixent sur des récepteurs particuliers, les récepteurs purinergiques, entrainant des signaux extra et intracellulaires par cascades : la signalisation purinergique. Les récepteurs purinergiques sont communs aux cellules de l’immunité innée, aux cardiomyocytes et aux cardiofibroblastes. L'hypothèse de notre travail est que la modulation des récepteurs purinergiques pourrait permettre de diminuer l’impact de l’ischémie-reperfusion myocardique en diminuant les tailles d’infarctus. Dans ce nouveau projet, nous souhaitons réaliser une cartographie de l’expression des récepteurs purinergiques activés en contexte d’infarctus du myocarde chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’identifier les principaux récepteurs purinergiques impliqués dans le remodelage ventriculaire après infarctus du myocarde. A moyen terme, cette étape nous permettra d’identifier des biomédicaments cardioprotecteurs dont la production est une spécialité reconnue de notre université.

Procédures

Ischémie-reperfusion coronarienne sous anesthésie générale : sur 300 souris, 1 fois/animal, pendant moins d’1h30. Prélèvement sanguin dans la veine caudale sous anesthésie générale : sur 300 souris, 1 fois/animal, pendant moins de 10 minutes.

Impact sur les animaux

La chirurgie par thoracotomie peut générer des douleurs postopératoires, surtout dans les premières heures après le réveil. La prise de sang peut également engendrer un hématome. La contention peut stresser les animaux. Enfin, la période périopératoire est à risque de saignements, d’hypothermie, voire de deshydratation. Tous les moyens seront mis en œuvre pour prévenir ces différentes nuisances/complications.

Devenir

Mise à mort. Le protocole d'étude prévoit in fine l'étude du coeur infarci explanté. La survie sans coeur n'est pas invisageable.

Remplacement

Des études sur cellules cardiaques en culture suggèrent l’implication de certains récepteurs purinergiques dans la survie de ces cellules en condition d’ischémie-reperfusion. Seul le modèle animal permet de voir cette implication sur un tissu entier où des interactions cellulaires sont à l’œuvre.

Réduction

L’outil statistique permet de réduire au minimum le nombre d’animaux indispensable à l’obtention de résultats interprétables. D’après l’analyse des résultats préliminaires, le nombre de souris nécessaire dans chaque groupe pour obtenir des résultats interprétables est de 8 par groupe. Tenant compte dans notre expérience d’une mortalité périopératoire de 25%, le chiffre de 10 par groupe nous parait raisonnable pour respecter au mieux la règle des 3R. L’étude est réalisée en plusieurs étapes successives, ce qui permet de cibler les récepteurs les plus pertinents et de réduire d’autant le nombre de substances testées et d’animaux opérés.

Raffinement

Pour réduire le stress des animaux, un effectif maximal de 5 souris par cage de 800cm3 est prévu avant les manipulations. Les animaux seront anesthésiés. La cicatrice de thoracotomie sera infiltrée en postopératoire immédiat avec une injection sous-cutanée d'anti-inflammatoire et d'anesthésique. Une analgésie post-opératoire sera réalisée. En cas de symptômes douloureux marqués, l’analgésie sera complétée. Le point limite est la présence d’une douleur sévère réfractaire au traitement antalgique. Pour le confort des animaux, durant la chirurgie, l’animal sera placé sur une table chauffante afin d’éviter les problèmes d’hypothermie liés à l’anesthésie et le réveil des animaux sera suivi par les personnels impliqués dans le protocole. Une ambiance sonore calme sera respectée. Après la chirurgie les animaux sont placés en cage individuelle pendant 12h. Après 12h, si la mobilité est satisfaisante et en l’absence de signes de douleur marquée, la souris opérée est remise en collectivité. La durée de la convalescence est estimée à 24h avec observations pluriquotidiennes (3x/jour).

Choix des espèces

La souris est une espèce reconnue pour l'étude des mécanismes immunitaires. De plus dans cette espèce, des animaux délétés génétiquement sont disponibles pour étudier l'implication de la réponse immune sur les lésions d’ischémie-reperfusion. Souris adultes de 6 semaines. L’âge est un facteur de risque cardiovasculaire.