Troubles respiratoires

12 480 souris et 3 120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. On leur induit une fibrose de la peau et des poumons, avec pose chirurgicale de pompes, injections intradermiques et administrations intranasales ou oropharyngées, pour cribler l'efficacité de nouvelles molécules contre la sclérodermie. Le porteur indique que la fibrose se développe sans autre effet indésirable attendu et fixe la mise à mort à un score de souffrance déterminé. Sur le remplacement, il affirme qu'il est "indispensable" d'examiner l'"animal entier" et que ces essais ne peuvent être reproduits sur cellules, pour un total de 15 600 animaux.

Objectifs

La sclérodermie systémique (SSc, systemic sclerosis) est une maladie systémique du tissu conjonctif. Elle est caractérisée par des lésions de fibrose cutanée et/ou viscérale, une atteinte microvasculaire et une réponse immunitaire activée et dérégulée. La SSc est une pathologie rare, sa prévalence varie de 30 à 240 cas par million d’habitants. Cette maladie touche essentiellement les femmes (4 femmes pour 1 homme environ), et se déclare généralement entre 45 et 60 ans. La SSc est associée à une surmortalité significative. Le pronostic dépend essentiellement de la survenue d’atteintes viscérales et plus particulièrement d’une pneumopathie infiltrante diffuse (PID) parfois sévère, d’une hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) ou d’une atteinte cardiaque primitive, qui représentent les 3 premières causes de mortalité au cours de la SSc. C’est une maladie multifactorielle qui implique des facteurs environnementaux et un fond génétique de susceptibilité. Actuellement, aucun traitement curatif n’est disponible sur le marché mais une prise en charge adaptée permet seulement d’atténuer les symptômes. Il est donc nécessaire de trouver de nouvelles molécules efficaces. C’est dans ce contexte que s’inscrit ce projet, le but étant d’étudier l’effet de nouveaux traitements potentiels contre la sclérodermie. Le projet inclus un screening de nouvelles molécules, une étude si besoin de leur mécanisme d’action et évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique. Ainsi, ces études permettront de trouver potentiellement un médicament contre la sclérodermie. Dans le cadre de nos programmes de maturation, nous développons au stade pré-clinique des nouvelles molécules pharmaceutiques ou des molécules en repositionnement. Pour chaque nouvelle molécule intégrée dans notre pipeline, des études de toxicologie (in vitro et/ou in vivo), de pharmacocinétique et d’efficacité seront entreprises. Cette demande d’éthique concerne les études d’efficacité dans le contexte de l’sclérodermie avec la mise en place de différents modèles animaux de fibrose cutanée et pulmonaire chez la souris ou le rat. L’objectif est d’étudier l’effet de nouveaux traitements potentiels ou de molécules en repositionnement sur la fibrose et l’inflammation dans des modèles animaux mimant les symptômes de la sclérodermie diffusée chez l’homme.

Bénéfices attendus

Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet dans des maladie chronique fibrotiques. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, nos études permettront de trouver potentiellement des médicaments dont les effets seraient supérieurs aux molécules de référence déjà existantes, qui soulageraient à la fois les symptômes de la fibrose et l’inflammation.

Procédures

Tous les animaux de la procédure 6 (sauf le groupe 1, opéré à blanc) subiront une chirurgie pour incorporer les pompes osmotiques. La chirurgie de 20-45minutes aura lieu au jour 0 sur animal anesthésié et analgésié. Tous les animaux de la procédure 1et 2 subiront des injections intradermiques, les animaux de la procédure 3 et 4 subiront des administrations intranasale et oropharyngée (sauf le groupe 1, sérum physiologique) et les animaux de la procédure 5 sauf le groupe 1, avec du véhicule) subiront des injections sous-cutanées et intramusculaires. Les traitements pourront être administrés avant, pendant ou après l'induction du modèle. Selon la molécule, la voie d'administration pourra être par voie intra-veineuse, intra-péritonéale, sous la peau, par voie orale (sur animal vigile). Tous les animaux recevront un véhicule, un traitement à tester ou une molécule de référence. Le nombre d'administration dépendra de la molécule et de la voie d'administration considérée. Cela pourra être une fois par semaine jusqu'à une à deux fois par jour. En amont des études in vivo, la toxicité potentielle des molécules testées et du véhicule aura été testée in vitro. Dans le cas où les molécules d’intérêt ne sont pas des molécules déjà sur le marché pour d’autres indications, des études de toxicologie in vivo pourront être entreprises afin de travailler avec des doses non toxiques.

Impact sur les animaux

Du fait de l'induction des modèles, les animaux vont développer de la fibrose cutanée et pulmonaire, et l’inflammation sans autre effet indésirable attendu. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques).

Devenir

Euthanasie pour récupérer différents organes, dont les articulations, pour analyses histologiques ou autre.

Remplacement

L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules pouvant agir sur la fibrose et l’inflammation implique de disposer de modèles animaux adéquats mimant au mieux la pathologie humaine. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce rat ou souris à travers nos différents modèles reproduisent au mieux la pathophysiologie de fibrose humaine. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Pour vérifier et déterminer l’effet d’un traitement sur la réponse à la fibrose et l’inflammation et structure des organes viscéraux, il est essentiel d’examiner l’animal entier. Il est indispensable car ne peut être reproduit en cellule.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Le traitement des données entrainera la comparaison de 7 groupes de 6-12 animaux pour chaque étude. Une analyse statistique appropriée sera réalisée par un test non paramétrique (Mann Whitney test) ou une analyse de variance (ANOVA).

Raffinement

Toutes les procédures induisant une douleur seront réalisées sous anesthésie (chirurgie, administrations oropharyngée) durant toute la procédure expérimentale afin de maitriser et limiter la douleur et la souffrance des animaux. L’anesthésie sera induite par induction à l’isoflurane (et maintien au masque). Les procédures de chirurgie seront effectuées par une personne habilitée et formée. Toutefois, pour les modèles d’induction de fibrose pulmonaire par la chirurgie, les animaux recevront un analgésique sera administré en phase pré- et post-opératoire. Les animaux seront également sous surveillance rapprochée. Les animaux seront suivis quotidiennement pendant les 10-15 premiers jours qui suivent l’induction puis de façon bi-hebdomadaire ensuite pour pouvoir identifier les signes de souffrance caractérisés par le comportement du rat ou de la souris : les changements physiques (pelage, peau, yeux…), la mobilité, l’alimentation, l’agressivité, le poids du corps (mesuré 2 fois par semaine) limité à une perte de 20% maximum par rapport au poids initial, la consistance des fèces et la réponse respiratoire. Nous avons mis en place un tableau de suivi qui permet de définir les points limites adaptés Si le score total d’un animal, toutes catégories confondues, au cours de l’étude est >6 ou bien si le score dans une seule catégorie est 3, l’animal est euthanasié pour raisons éthiques.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des modèles d’étude très développés et caractérisés, de par leurs tailles et leurs spécificités. Ce sont des espèces communément utilisées pour les études de fibrose cutanée et pulmonaire en accord avec les recommandations internationales et la littérature. Notamment la souche de souris C57Bl/6 est un modèle de laboratoire bien connu avec suffisamment de données historiques. Cependant, il est envisageable d’utiliser d’autres souches de souris comme les BALB/C ou des rats comme la souche de rat Sprague Dawley qui est également un modèle de laboratoire bien connus. Chez la souris, la souche C57Bl/6 représente la souche de choix pour ces études mais d’autres souches pourront également être utilisées dépendant de leurs susceptibilités à l’induction de la pathologie en fonction du modèle Le choix de l’espèce utilisée dépendra en particulier des objectifs et besoins de l’étude. Si une molécule s’avère efficace dans une espèce, celle-ci pourra être éventuellement testée dans l’autre espèce afin de montrer une efficacité espèces indépendante. Les rats ou souris seront âgés de 6-19 semaines au début de l’étude selon le type ou le stade de progression de la maladie sur des patients atteints de sclérodermie (Sclérodermie juvénile ou sclérodermie sur des patients adultes).

7 272 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles sont infectées par la peste, sous ses formes bubonique, septicémique et pulmonaire, ou par d'autres Yersinia, puis reçoivent des peptides ou des anticorps à tester, l'infection étant décrite comme fatale pour les témoins non traités. Le porteur définit des points limites déclenchant la mise à mort, tous les animaux étant tués en fin de procédure. Il affirme qu'"aucun modèle non-animal ne peut remplacer l'animal" pour évaluer ces traitements et présente la peste comme une potentielle arme bactériologique.

Objectifs

Face au risque de résistance aux antibiotiques, nous souhaitons tester, en collaboration avec des équipes extérieures les ayant développés, de nouveaux agents thérapeutiques pour lutter contre les Yersinia pathogènes : Y. pestis (l'agent de la peste et potentielle arme bactériologique) et les Yersinia entéropathogènes (Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica). Dans une première phase ces agents vont être sélectionnés pour leur capacité à tuer les bactéries in vitro. Les meilleurs seront ensuite testés pour leur efficacité thérapeutique chez la souris. La peste sera abordée sous ses trois formes principales : la peste bubonique, septicémique et pulmonaire. Ces infections sont modélisées chez la souris car ces animaux y sont sensibles et développent des formes de ces maladies comparables à celle de l’homme. Les infections par Yersinia entéropathogènes (Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica) seront modélisées par infection orale chez la souris. Ces nouveaux agents thérapeutiques sont : • des anticorps monoclonaux (de souris ou humains) dirigés contre des antigènes cibles spécifiques des Yersinia, • de nouveaux peptides antimicrobiens. En cas de succès leur potentielle synergie avec des antibiotiques sera testée.

Bénéfices attendus

Les avantages escomptés sont d’identifier de nouveaux agents thérapeutiques efficaces contre la bactérie Yersinia pestis, en particulier contre des souches résistantes à des antibiotiques, ainsi que contre les Yersinia entéropathogènes (Yersinia pseudotuberculosis et Yersinia enterocolitica). Le travail sera fait chez la souris pour qu’ensuite les agents thérapeutiques puissent être développés pour l’homme.

Procédures

Procédure 1 : injection (ip, dose unique) de peptides antimicrobiens à toutes les souris vigiles Procédure 2 : injection (ip, dose unique) de peptides antimicrobiens ou d’anticorps à toutes les souris vigiles, puis prélèvement de sang (

Impact sur les animaux

La nuisance résultera principalement de l’infection, qui sera fatale pour le groupe témoin ne recevant pas de traitement thérapeutique, et aussi si les agents testés échouent à contrôler l’infection. La toxicité possible des agents sera évaluée dans le projet. D’autres nuisances moindres viennent de l’injection des agents testés par voie intrapéritonéale et la prise de sang pour suivi pharmacocinétique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car les animaux ayant été infectés ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.

Remplacement

Les tests préliminaires in vitro sur cellules permettront de réduire l’usage des animaux aux agents intéressants : tous les peptides antimicrobiens testés auront montré une capacité à tuer la bactérie in vitro. Les Anticorps auront montré une capacité de blocage de la bactérie in vitro. Leur toxicité aura été évaluée sur des cellules en culture et les agents toxiques ne seront pas testés sur animaux. Toutefois, les infections bactériennes induisent des processus pathologiques complexes impliquant de multiples organes et le système immunitaire dans son ensemble (organes divers, relations entre organes, circulation sanguine et lymphatique, multiples populations cellulaires et mécanismes effecteurs). L'action des agents antibactériens ne se limite donc pas à une action simple sur la bactérie et doit tenir compte de la complexité de la pathologie. C'est pourquoi aucun modèle non-animal ne peut remplacer l'animal pour évaluer des agents thérapeutiques, et des agents à action d’intensité moyenne seront testés.

Réduction

Les procédures seront optimisées : - étude simultanément du plus grand nombre possible de paramètres sur chaque animal, - regroupement des expérimentations de façon à limiter les groupes d'animaux témoins nécessaires. Les groupes (traité, non traité) seront comparés par le test de Student si les valeurs y satisfont (distribution normale, variances égales), sinon par le test non paramétrique de Mann-Whitney. Le test exact de Fisher sera utilisé pour comparer la survie des groupes (naïf, vacciné) exposés à la peste. Des modèles linéaires à effets mixtes pourront être utilisés afin de prendre en compte d'éventuels effets techniques liés à la cage et aux répétitions. Le détail des statistiques est décrit dans les procédures. Le nombre d’animaux indiqué a été obtenu par un calcul de puissance statistique en collaboration avec un biostatisticien, et est basée sur le nombre minimum d'animaux permettant d’obtenir des résultats statistiquement robustes et reproductibles. Les tests préliminaires in vitro permettront de réduire l’usage des animaux aux agents intéressants.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupe, avec une litière appropriée et des matériaux de nidification. Durant les infections, un suivi strict des animaux sera opéré tout au long de l’expérience via une observation régulière pour détecter tout changement physique ou comportemental qui précède généralement les signes cliniques, tels que : poil ébouriffé, yeux sales, comportement prostré. Les animaux présentant un état pathologique (score de 2 pour un paramètre de la grille de score utilisée ou perte de poids supérieure à 20% du poids initial) seront mis à mort. Dès l’apparition des signes cliniques des actions seront mises en place pour limiter la souffrance et la déshydratation : mise à disposition de nourriture Dietgel, réhydratation sous-cutanée (10 ml/kg/heure solution saline chaude SC). Si des animaux atteignent les points limites définis, ils seront mis à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des hôtes idéaux pour l'étude de la peste puisqu'ils y sont très sensibles, et sont les principales cibles et réservoirs de la peste dans la nature. La peste se développe chez la souris sous les formes bubonique et pulmonaire avec des cinétiques, signes cliniques et léthalités comparables à celles de la peste humaine. Les souris sont utilisées à l'âge de 7-14 semaines afin d’être représentatifs de l’espèce à l’âge adulte, par souci d’utiliser des animaux comparables tout au long du projet. Les infections par Yersinia pathogènes ne sont pas sensibles à l’âge. Ces indications d'âge sont ± 1 semaine selon les disponibilités du fournisseur.

4 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 4 000 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par le virus respiratoire syncytial et exposées à la poussière d'acariens pour reproduire une bronchiolite et un asthme, y compris des nouveau-nés de cinq à sept jours infectés éveillés, avec des pertes de poids pouvant dépasser 25% et une trachéotomie avant la mise à mort. Le porteur indique que la manipulation des nouveau-nés peut entraîner leur rejet par la mère. Les nouvelles molécules testées ne visent une introduction en clinique qu'à terme, l'apport immédiat restant l'évaluation chez la souris.

Objectifs

L’objectif est de tester l’efficacité thérapeutique de composés chimiques ou biologiques dans des modèles de bronchiolite et d’asthme induits par le virus respiratoire syncytial, la poussière d’acariens, ou leur combinaison.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif ou en curatif sur l’infection au RSV, l’asthme allergique ou l’asthme exacerbé. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces maladies.

Procédures

Pour reproduire la bronchiolite, des souris de 5-7 jours ou de plus de 6 semaines seront infectées une ou deux fois au virus respiratoire syncytial par voie intranasale, vigile pour les nouveau-nés (acte de 5min) ou sous anesthésie générale pour les animaux sevrés (

Impact sur les animaux

Dans le cas de l’infection au RSV, avec ou sans administration de poussières d’acariens, nous nous attendons à des pertes de poids importantes pouvant dépasser 25%, mais 25% de perte de poids (ou 20% maintenue sur 3 jours) constituera un point limite. Des difficultés respiratoires pourraient être observées et seront suivies grâce à une grille de scoring (voir procédures 1&3). Elles sont toutefois très rares. Les animaux pourraient présenter le poil hérissé de manière transitoire. Dans le cas des poussières d’acariens seules, nous nous attendons à des pertes de poids modérées . Dans ce modèle, nous n’attendons pas de difficultés respiratoires ou d’autre signe que la perte modérée de poids mais leur absence sera surveillée. Compte tenu des volumes administrés, et à l’analgésie et anesthésie si besoin mis en place, le stress et la douleur associés aux administrations et prélèvements seront légers. Dans le cas particulier de la pose d’une minipompe, la douleur associée à la chirurgie sera modérée au vu de l’analgésie mise en place. Le stress associé sera léger. Concernant les mesures de paramètres mécaniques par ventilation forcée, elles impliqueront une trachéotomie, donc l’anesthésie inclura l’administration de buprénorphine et un alpha-2 agoniste. Par ailleurs, elles seront réalisées sous anesthésie profonde (avec ajout de curares pour bloquer les mouvements respiratoires spontanés) et suivies d’une euthanasie sans réveil. Dans le cas d'utilisation de nouveau-nés, leur manipulation pourrait entrainer un rejet par la mère.

Devenir

Après les deux procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, ainsi qu’à des lavages broncho-alvéolaires et des mesures de compliance pulmonaire, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt.

Remplacement

Toutes les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Elles auront aussi si possible été sélectionnées in vivo chez le rongeur sur leurs propriétés pharmacocinétiques (vérification de la compatibilité avec une efficacité dans la maladie visée). L’ensemble de ces données est souvent insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus des pathologies telle que décrites chez l’homme.

Réduction

Chez la souris, d’après la littérature et d’après les études déjà réalisées dans notre laboratoire et sur la base de tests de type ANOVA, un nombre minimum de 8 animaux adultes par groupe est nécessaire pour observer une réduction significative de 50% d’un seul paramètre d’intérêt (exemple : inflammation constatée par histologie). Ce nombre pourra monter jusqu’à 15 pour une réduction significative sur plusieurs autres paramètres suite à un traitement préventif ou curatif (analyse de l’expression de cytokines…). Des animaux satellites devront être utilisés pour les mesures de paramètres mécaniques ventilatoires (sur animaux non infectés donc études sans RSV). La possibilité de se passer d’animaux satellites et de réaliser ces mesures sur les mêmes animaux que les autres analyses sera évaluée lors des premières études utilisant cette méthode.

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : • A partir de 10% de perte de poids, les animaux seront pesés quotidiennement et une réhydratation sous-cutanée sera mise en place • Entre 10 et 15% du poids au J0 du protocole : les animaux seront réhydratés avec du Lactate, 0.5mL, une fois par jour • Entre 15 et 20% du poids au J0 du protocole : les animaux seront réhydratés avec du Ringer Lactate, 0.5mL, deux fois par jour. Un scoring des difficultés respiratoires sera effectué tous les jours. En pratique, toute gêne respiratoire très marquée constituera un point limite avec euthanasie immédiate. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, les traitements seront interrompus. Les principaux points limites en plus de ceux liés au scoring concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction d’inflammation pulmonaire et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux. En cours d’étude, plusieurs anesthésies seront pratiquées notamment en cas de prélèvements de sang ou d’injections de produits : • Les administrations IV, IM, IP, SC et ID de composés tests se feront si nécessaire sous anesthésie générale à l’Isoflurane. • Une administration de buprénorphine sera réalisée avant les administrations IM/ID. • L’implantation d’une mini pompe en sous-cutané pourra être nécessaire lors d’une délivrance continue du composé test. La chirurgie d’implantation sera réalisée sous anesthésie générale Isoflurane et dans des conditions d’asepsie, avec une prise en charge analgésique 30 min avant l’anesthésie, puis jusqu’à 48 heures post chirurgie si besoin. Le suivi de la cicatrisation sera enregistré, et les sutures désinfectées régulièrement. Afin de minimiser les risques d’infection lors d’injections intradermiques, une tonte de la peau avec désinfection sera réalisée avant injection. Les injections intradermiques se feront sous un volume de 50 µL par site d’injection afin de limiter la douleur.

Choix des espèces

- L’infection RSV chez la souris est bien documentée dans la littérature. - L’inhalation de poussière d’acariens pour déclencher une réponse asthmatique allergique est aussi très bien caractérisée chez la souris. - Les études de toxicité pour toute nouvelle molécule chimique ou biologique devant être réalisées a minima sur une espèce rongeur (rat ou souris), la connaissance de la dose active dans un modèle rongeur est une donnée critique qui permet de calculer la fenêtre thérapeutique entre la dose active sur la pathologie pulmonaire et la dose toxique dans la même espèce. Pour les études RSV, des nouveau-nés de 5-7 jours pourront être utilisés, de même que des animaux sevrés (jeunes adultes ≥ 6 semaines). Des femelles gestantes seront commandées à 2 semaines de gestation, afin d’avoir une mise bas une semaine plus tard dans nos locaux. Les nouveau-nés seront utilisés pour réaliser une primo-infection à l’âge de 5-7 jours, suivie d’une seconde infection 5 semaines plus tard. Cette condition permet de récapituler tous les signes cliniques de la bronchiolite du jeune enfant. L’infection RSV unique ou double pourra aussi être réalisée sur des animaux sevrés (≥ 6 semaines) pour reproduire uniquement la composante inflammatoire de la maladie, sans production de mucus. Pour les études utilisant la poussière d’acariens, seuls des animaux adultes sevrés ≥ 6 semaines seront utilisés. Pour les études combinant infection RSV et poussière d’acariens, seuls des animaux adultes sevrés ≥ 6 semaines seront utilisés.