Troubles respiratoires

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une fibrose pulmonaire leur est induite par instillation de bléomycine, puis elles sont exposées une semaine à une atmosphère reproduisant la pollution de l'air de Paris, avant lavage broncho-alvéolaire et prélèvement des poumons. Le porteur indique que la fibrose peut provoquer une insuffisance respiratoire sévère et une mortalité d'environ 20 %, ce qui justifie le classement en sévère. Les retombées annoncées, des mesures préventives pour les patients atteints de fibrose, restent au conditionnel, et le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet cette étude intégrée.

Objectifs

Nous émettons l’hypothèse que l’exposition à la pollution atmosphérique urbaine pourrait favoriser l’aggravation de la fibrose pulmonaire soit directement en accélérant le(les) processus physiopathologique(s) fibrosant(s), soit indirectement en potentialisant l’effet délétère d’un autre facteur déclenchant. Nous émettons également l’hypothèse que les variations saisonnières de la pollution atmosphérique urbaine ( selon le degré d’ensoleillement et/ou de l’activité industrielle) pourraient moduler ses effets sur le poumon. L’objectif général de notre projet est donc d’étudier par une approche intégrée les effets potentiellement délétères d’atmosphères polluées complexes reproduisant de façon réaliste la pollution de l’air de Paris lors de la saison hivernale et lors de la saison estivale sur la fibrose pulmonaire induite expérimentalement chez la souris par la bléomycine. Nos objectifs spécifiques sont les suivants : - Objectif 1 : évaluer si l’exposition à une atmosphère polluée complexe est suffisante pour initier par elle-même une exacerbation de la fibrose pulmonaire expérimentale, et déterminer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. - Objectif 2 : évaluer si l’exposition préalable à une atmosphère polluée complexe potentialise l’exacerbation de la fibrose pulmonaire induite par un agent oxydant, et déterminer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. - Objectif 3 : comparer les effets de l’atmosphère polluée complexe « Paris été » à ceux de l’atmosphère « Paris hiver » dans ces 2 modèles expérimentaux.

Bénéfices attendus

Si notre étude démontrait expérimentalement un lien de cause à effet entre atmosphère polluée complexe et survenue d’exacerbation aigue dans la fibrose pulmonaire, cela aurait des conséquences importantes tant d’un point de vue scientifique qu’en matière de santé publique. Sur le plan scientifique, ces résultats permettraient de confirmer les résultats observés dans les études épidémiologiques. Par ailleurs, si l’impact de l’exposition à la pollution atmosphérique varie selon la saison (Paris été ou Paris hiver) cela pourrait nous permettre de mieux comprendre la différence de prévalence des exacerbations aigues au cours d’une année. En matière de santé publique, des mesures préventives vis-à-vis des polluants aériens évitables chez les patients ayant une FPI pourraient être instaurés au moment de leur prise en charge ou au cours du suivi, afin de réduire le risque d’évolution vers une exacerbation et améliorer leur survie. Avec notamment la mise en place de conseils autour de la protection lors des pics de pollution, diminution des sources de pollution dans le logement et un contact précoce avec l’équipe médicale. Ces mesures préventives pourraient diminuer la morbidité et la mortalité de la FPI ainsi que les coûts en santé

Procédures

Pour répondre à nos objectifs nous utiliserons un modèle murin de fibrose pulmonaire induite à la blémoycine. Suite à cela les souris développant une fibrose pulmonaire seront exposées pendant une semaine à une atmosphère polluée complexe ou à l’air à l'aide du montage PolluRisk. Sur ces animaux la mesure des variables ventilatoires sera réalisée par plethysmographie sur animaux non anesthésié et non contraint. Ensuite, aprés anesthésie, la saturation sera mesurée. Enfin deux groupes seront réalisés. Dans le premier un lavage broncho-alvéolaire sera réalisé avant euthanasie des animaux. Dans le second, la compliance sera évaluée puis lles poumons seront prélevés pour analyses.

Impact sur les animaux

Le développement d’une fibrose pulmonaire est indolore du fait de l’absence d’innervation sensitive à la douleur dans le parenchyme pulmonaire. En revanche elle peut entraîner une insuffisance respiratoire sévère chez les souris et une mortalité d’environ 20%, justifiant sont classement en tant que procédure « sévère ».

Devenir

A la fin du projet, l'ensemble des animaux sera euthanasié pour prélèvement d'organe.

Remplacement

il n'existe pas à ce jour de méthode alternative à l'expérimentation in vivo pour étudier de façon intégrée l'impact de la pollution atmosphérique sur l'aggravation de la fibrose pulmonaire et l'utilisation de la souris permettra d'étudier les altérations pulmonaires causée par l'exposition à ces particules atmosphériques. D'autre part, l'étude des mécanismes sous-jacent à ces aggravations peut-être plus facilement entreprise dans cette espéce du fait de l'existance d'outils moléculaires.

Réduction

Nous veillerons à réduire le nombre d'animaux utilisés. Nous disposons de données, publiées ou non, nous permettant de réaliser des calculs statistiques permettant de définir le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un effet statistiquement significatif et pour déterminer des points d'arrêt d'expérimentation.

Raffinement

Toutes les procédures seront réalisées dans le respect total des règles du raffinement et les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi. Le personnel travaillant avec les animaux possède les diplômes d'expérimentation animale requis. Les conditions de soins et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour réduire le plus possible toute souffrance que pourrait ressentir les animaux. Des points limites précis et des critéres d'arrét sont prévus.

Choix des espèces

Notre projet nécessite d'induire une fibrose pulmonaire , d'exposer les aniamux à des atmosphéres complexes réalistes et de prélever des tissus, Pour cela notre choix c'est porté sur la souris car: - c'est un modèle qui s'héberge et se reproduit facilement, avec une gestation courte permettant l'obtention rapide des individus nécesaires à nos séries expérimentales. - Le modéle murin de fibrose pulmonaire induite par instillation intra-trachéale de bléomycine est validé et courament utilisé dans la littérature internationale - Le protocole d'exposition à des atmosphéres complexes réalistes permet d'évaluer l'impact de la qualité de l'air sur la santé Les animaux utilisés seront des souris mâles adultes agés de 8 semaines. Pour cette étude, nous avons besoins que le système ventilatoire soit mature et fonctionnel. De plus la fibrose pulmonaire est une pathologie du patient âgé. En outre, les souris plus jeunes sont moins sensibles à la bléomycine que les souris agées. Cependant, il est décrit dans la littérature que les souris C57Bl6/J agées développent une fibrose pulmonaire sévére, risquant d'accroite le risque de surmortalité. Le compromis que nous avons choisit est des souris agèes de 8 semaines au moment du début de l'expérimentation. Les animaux seront identifié par un système de marquage à l'oreille

192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteurs d'une dystrophie musculaire de Duchenne, ils reçoivent jusqu'à 510 injections sous-cutanées et des prélèvements de sang au sinus rétro-orbitaire, pour tester une immunothérapie peptidique. Le porteur décrit une maladie évolutive, avec perte de masse musculaire, faiblesse et défaillance cardiorespiratoire conduisant à une "euthanasie compassionnelle" entre six et treize mois. Il annonce, en cas de succès, un passage aux chiens dystrophiques puis aux enfants, et présente le rat comme un modèle "plus fidèle" que la souris.

Objectifs

La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie rare, rapidement invalidante, causée par des mutations dans le gène de la dystrophine (porté par le chromosome X). La dystrophine est une proteine clé dans le fonctionement et la survie des cellules musculaires. Le déficit en dystrophine induit donc une perte progressive de force dans les muscles, menant à la perte de la marche à un âge médian de 10 ans. L'atteinte des muscles de la ventilation et du muscle cardiaque produit une insuffisance cardiorespiratoire irrémédiablement fatale à l'âge médian de 20 ans. Il n'existe à ce jour aucune solution de guérison. Cependant, le traitement par les glucocorticoïdes, anti-inflammatoires puissants, largement répandu chez les enfants, permet de retarder significativement la perte de la marche et le décès d'environ 2 à 8 ans, mais avec le désavantage de provoquer parfois des effets indésirables qui dégradent la qualité de vie des patients. Depuis 5 ans, on assiste à une accélération de propositions de solutions therapeutiques (thérapies géniques ou molecules pharmacologiques) et on dénombre une cinquantaine d'essais cliniques en cours. Les mutations aboutissent à l'absence de dystrophine dans les cellules musculaires (en particulier cardiaque). Cette absence aboutit à une fragilité de ces cellules, ce qui se traduit tôt ou tard par une rupture de leur membranes, soumises aux forces latérales lors des cycles de contraction/relâchement. Il s'ensuit une mort des fibres musculaires à l'origine de la perte de force musculaire et une série de mécanismes secondaires délétères tels que l'inflammation chronique et la fibrose. Cette combinaison empêche les cellules souches musculaires de réparer durablement le muscle qui entre alors en sénescence (arrêt des cycles cellulaires qui aboutit à la mort). Dans ce contexte, notre objectif scientifique est de proposer une alternative aux traitements existants en apportant la preuve de principe préclinique de l'efficacité d'une immunothérapie innovante. Nous posons l'hypothèse que notre immunothérapie ciblant une protéine clé de l'inflammation est capable de ralentir la progression de la DMD, en luttant pour la première fois contre l'ensemble des mécanismes néfastes induits de sorte que les cellules souches du muscle échapperont à la sénescence précoce et poursuivront ainsi plus durablement leur contribution réparatrice.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet vise à obtenir des données robustes démontrant le bénéfice de l'immunothérapie innovante ciblant une proteine clé de l'inflammation sur le modèle original et pertinent du rat DMD développé au laboratoire qui reproduit plus fidèlement la maladie que les modeles classiques de souris. Le traitement testé permet de bénéficier simultanément de propriétés anti-sénescentes et anti-inflammatoires, sans les effets indésirables des corticoïdes actuellement utilisés dans le traitement de la DMD pour contrer l’inflammation. Le traitement testé devrait de surcroît améliorer la contribution des cellules souches à la réparation musculaire. À moyen terme et en cas de succès de cette immunotherapie sur le rat DMD, un essai sera ultérieurement programmé sur un nombre restreint de chiens DMD. Notre équipe dispose d'une expertise, d'une compétence et d'une base précieuse de données sur ces chiens, acquises antérieurement lors de l'évaluation d'autres stratégies thérapeutiques. Nous pourrons alors établir le potentiel de l'immunothérapie sur ce second modèle translationnel, hautement prédictif du succès d'un essai clinique chez l'humain. En cas de bénéfice évident chez les rats et les chiens, nous aurons contribué à produire des données précliniques robustes qui seront un argument fort pour accélérer le financement des essais cliniques chez les enfants atteints de DMD. À long terme, le bénéfice attendu est une amélioration de la qualité et de l'espérance de vie des enfants atteints de DMD. Notre immunothérapie est conçue en particulier pour remplacer les glucocorticoïdes en récapitulant voire en augmentant leurs effets bénéfiques, tout en annulant leurs effets secondaires.

Procédures

Les animaux reçoivent le candidat médicament par une injection quotidienne sous cutanée. Cela correspond à un nombre d'injections compris entre 21 (procédures 1, 2 et 3) et 510 (procédures 4 et 5). Les animaux seront prélevés au sinus rétro-orbitaire, 4 fois en un mois ou 7 fois en 17 mois selon les procédures. Chaque prélèvement dure moins de 2 minutes, réalisé par une personne très expérimentée. Avant ce prélèvement, l'animal est anesthésié par voie générale et locale et reçoit en plus une analgésie. L'évaluaton fonctionnelle privilégie les méthodes non invasives. Seule la mesure de force nécessite une anesthésie injectable, réalisée 1 fois pour les animaux des procédures 1 à 3 et 3 fois en 6 mois pour les procédures 4 et 5. Il n'y a pas de chirurgie prévue.

Impact sur les animaux

Il n'est attendu aucun effet indésirable majeur à la suite de l'injection du peptide NC-P7, y compris pour les doses élevées. L'immunothérapie par peptide présente l'intérêt majeur de ne pas produire de toxicité. En revanche, les rats R-DMDdel52 développent spontanément une dystrophie musculaire caractérisée par une perte significative et progressive de masse corporelle à partir de l'âge de 4 semaines. La perte de masse musculaire cause une faiblesse musculaire et une difficulté croissante à se mouvoir. Le fonctionnement du cœur et du diaphragme, principal acteur de la ventilation de repos, est également progressivement altéré, ce qui conduit à une déficience cardiorespiratoire progressive. Combinées, ces défaillances conduisent à la nécessité d'une euthanasie compassionnelle entre 6 et 13 mois d'âge. On assiste par ailleurs à un comportement de "freezing" chez les animaux, caractérisé par une absence de mouvements chez les animaux qui semblent se reposer plus que leurs congénères non atteints. Ce "freezing" survient par exemple lorsqu'on prend un animal dans les mains et qu'on le remet dans sa cage. Nous connaissons bien cette évolution de la maladie et ces comportements parfois atypiques, ce qui nous permet de les repérer immédiatement quand ils surviennent. Cela garantit une surveillance très rigoureuse et rapprochée des animaux. Une zootechnicienne est dédiée à cette surveillance. Par expérience des derniers mois, nous n'avons pas à intervenir sur des animaux avant l'âge de 6 mois. Les procédures 1, 2 et 3 de ce projet incluent des animaux jeunes chez lesquels les nuisances de l'évolution spontanée de la maladie sont faibles et ne semblent pas, en milieu confiné, poser de problèmes particuliers, facilement gérables. Les procédures 4 et 5 de ce projet incluent des animaux au-delà de 6 mois. Nous porterons une attention particulière à ces animaux.

Devenir

À l'issue des cinq procédures, tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques permettant d'évaluer à l'échelle microscopique l'efficacité du traitement sur les muscles prélevés (muscles des membres, diaphragme, cœur). Il est également essentiel de prélever les organes sentinelles d'une éventuelle toxicité (reins, foie, rate, poumons) et de les soumettre à une expertise anatomopathologique. La méthode précise de mise à mort des animaux est décrite dans le chapitre 3.3.3. Il est attendu que l'immunothérapie testée améliorera grandement l'état de santé des animaux et retardera la survenue des signes cliniques les plus sévères. Mais administrée seule dans un premier temps, l'immunothérapie n'empêchera pas totalement la nécrose des fibres musculaires. Les animaux vieillissants nécessiteront donc toujours une surveillance rapprochée et des compétences médicales pour décider du niveau de l'atteinte générale de l'animal et du recours à une euthanasie compassionnelle, par exemple en cas de décompensation cardiorespiratoire. Dans ce cas, l'euthanasie interviendra en anticipation de la mise à mort programmée des rats de l'étude. Les organes seront néanmoins récupérés sur les animaux euthanasiés, de sorte que tous les animaux, même morts précocement au cours de la procédure, pourront être inclus dans les analyses histologiques et anatomopathologiques.

Remplacement

L'expression de la cible CD38 dans le système immunitaire (monocytes, macrophages, lymphocytes T et B), le muscle, le système nerveux central, le tissu conjonctif a déjà été confirmée par de nombreuses expériences réalisées sur cellules, in vitro. Le ciblage de CD38 dans les maladies inflammatoires, cardiovasculaires, neurodégénératives, immunitaires ainsi que dans la lutte contre les effets indésirables du vieillissement a également été largement documenté. Les effets bénéfiques de la modulation spécifique de CD38 par l'immunothérapie brevetée par ENCEFA via le NAD, le cADPR et le NAADP boosting sur la réduction de l'inflammation (NAD), l'accroissement de la contractilité du cœur et des muscles et de leur métabolisme (cADPR) et la stimulation du flux autophagique (NAADP) ont également été mis en évidence sur de nombreux modèles cellulaires, puis sur des modèles de souris. Sur ces bases mécanistiques très robustes, nous souhaitons avec ce projet répondre à deux questions qui ne peuvent être obtenues que chez l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes en interrelation constante : quelle dose de NC-P7 faut-il injecter pour obtenir un engagement optimal de la cible CD38 dans le muscle (PK-PD) et quels effets bénéfiques sur l'éventail de mécanismes pathogènes ouvert par le processus dystrophique peut-on attendre d'un traitement précoce ou tardif, court ou long sur un modèle animal de dystrophie musculaire de Duchenne.

Réduction

Nous avons accumulé beaucoup d'expérience sur les lots de rats R-DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Pour certaines de ces études, nous sommes en train de rédiger les conclusions et avons déjà réalisé les analyses statistiques. Il apparaît que pour chacun des groupes, traiter 5 rats permet d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution fatale de la maladie. Le problème majeur auquel nous avons été confrontés est la sensibilité des animaux à l'anesthésie. Malgré nos soins, nous avons déploré l'absence de réveil chez quelques animaux. Il faut donc prévoir un animal supplémentaire par groupe de sorte qu'en cas d'accident anesthésique (essentiellement), on puisse traiter les données de 5 animaux arrivés au terme de la procédure. Par ailleurs, en raison de ce nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wildtype, WT) et R-DMD traités avec l'excipient, nous avons accumulé des données nombreuses qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages. Il est donc possible de réduire les cohortes de ces animaux et en cas de mort de l'un d'eux, de ne pas le remplacer. Au bilan, chacun des groupes a pu être réduit à 6 animaux. Nous avons pu réduire ce nombre à 4 pour la procédure 1 car l’intensité de la variation d'un biomarqueur tel que la créatine kinase qui présage de l’efficacité du traitement (et qui sera privilégié dans le cas de la procédure 1) est beaucoup plus forte.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Depuis janvier 2021, la température dans nos nouveaux locaux a été très bien maintenue dans la fenêtre 22 ± 2 °C, sauf lors de périodes courtes de réglages ou de pannes corrigées dans un délai court. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se lever. Les cages XL ont une surface de 2080 cm2 et une hauteur de 23 cm sur une moitié de la surface, soit 5 cm de plus que la réglementation. Nous sommes le premier laboratoire académique à utiliser ces cages. L'observation des animaux nous conforte dans la pertinence de ce choix : les animaux profitent pleinement de la hauteur pour se lever fréquemment sur leurs pattes arrière. Sur le plan fonctionnel, cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12 h par jour (5 h-17 h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage au début (3-4 semaines, animaux de 100 g ; nous préférons rester sous le seuil réglementaire de 10 pour des raisons de confort des animaux). Puis nous réduisons ce nombre progressivement jusqu'à atteindre 3 rats par cage pour les animaux de plus de 600 g (animaux WT au-delà de 5 mois, les R-DMD non traités n'atteignent jamais cette masse corporelle). L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft et des bâtons de bois à ronger ou des carrés de coton compacté. À tour de rôle, les groupes font également des séjours de quelques heures dans une grande cage de type "cage à furet" (Savic suite royale 95 double®). Cette cage de 6000 cm2 (le triple de leur cage habituelle) mesure 159 cm de hauteur. Elle est organisée en 3 niveaux, les deux plus haut accessibles via des échelles. Nous avons constaté que les rats s'y plaisent beaucoup et pratiquent une intense exploration du volume selon leurs capacités. Nous les filmons et mettons actuellement au point une méthode de quantification de ces mouvements spontanés, réduisant ainsi à terme la nécessité de les contraindre à des exercices imposés. Une fois validée, cette méthode permettra de réduire le nombre de tests fonctionnels, réservés aux mesures de force ou d'endurance par exemple.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat R-DMDdel52 mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle emblématique de la souris Mdx, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle canin GRMD. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format). Comme indiqué ci-dessus nous utiliserons : 1) des jeunes animaux sevrés reçus dans notre EU à l'âge de 3 semaines et après la semaine d'acclimatation, inclus dans nos cohortes d'étude à partir de 4 semaines pour les Procédures 1, 2 et 4 et à partir de 5 mois d'âge pour les Procédures 3 et 5. Les animaux âgés de 4 semaines sont choisis parce qu'ils correspondent au stade post-sevrage le plus précoce pour initier un traitement précoce dans la phase asymptomatique de la maladie. Les animaux âgés de 5 mois expriment déjà les signes cliniques de la maladie et sans traitement, devront être euthanasiés dans les 2 à 8 mois suivants. En cas d'efficacité du traitement durable chez ces animaux, il est attendu qu'ils récupèrent en partie de la maladie et le cas échéant, qu'ils survivent au-delà de l'âge de l'euthanasie habituel pour le groupe des rats DMD non traités (6 à 13 mois). Une réussite de ce traitement durable augurera d'une possibilité de proposer des essais cliniques avec cette immunothérapie.​

5 070 souris et 3 900 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les expérimentateurs déclenchent un sepsis par injection de toxine LPS ou par ligature du caecum, provoquant septicémie, inflammation, perte de poids, atteintes pulmonaires et choc septique, pour tester de nouveaux traitements du syndrome de détresse respiratoire aiguë. Le porteur n'attend pas de nuisance liée aux traitements eux-mêmes, qu'il présente comme non toxiques. Il affirme que le rat et la souris reproduisent au mieux la maladie humaine et que les essais in vitro ne suffisent pas.

Objectifs

Le Syndrome de Détresse Respiratoire Aigüe (SDRA) est un syndrome clinique d'inflammation et d'œdème pulmonaire diffus qui provoque généralement une insuffisance respiratoire aiguë. Le SDRA peut être causé par des déclencheurs infectieux ou non infectieux qui impliquent l'activation et la dérégulation de multiples voies de lésion, d'inflammation et de coagulation qui se chevauchent et interagissent dans les poumons et dans le système. Le plus souvent, le SDRA peut se développer dans le cadre d'une pneumonie, d'une septicémie (39% des cas), d'une aspiration du contenu gastrique ou d'un traumatisme grave. Le SDRA représente 10 % de tous les patients dans les unités de soins intensifs dans le monde entier, avec un taux de mortalité élevé (30-40 %). Le SDRA se caractérise par une mauvaise oxygénation et des poumons non conformes ou "rigides", c'est pourquoi la ventilation mécanique et les thérapies de soutien sont les piliers du traitement de la maladie. Cependant, le taux de mortalité est toujours très élevé, il est donc nécessaire de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques visant à découvrir ou repositionner des molécules et comprendre les mécanismes qui jouent un rôle dans la survenue et l’évolution de la pathologie. Dans le cadre de nos programmes de maturation, nous développons au stade pré-clinique des nouvelles molécules pharmaceutiques ou des molécules en repositionnement. Pour chaque nouvelle molécule intégrée dans notre pipeline, des études de toxicologie (in vitro et/ou in vivo), de pharmacocinétique et d’efficacité seront entreprises. Cette demande d’éthique concerne les études d’efficacité dans le contexte du SDRA avec la mise en place de modèle animaux reproduisant ces pathologies chez la souris ou le rat. L’objectif est de trouver des molécules pouvant retarder la progression de la maladie et améliorer la qualité de vie des patients atteints par cette pathologie.

Bénéfices attendus

Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet dans la septicémie et le SDRA. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, nos études permettront de trouver potentiellement des médicaments dont les effets seraient supérieurs aux molécules de référence déjà existantes, qui ralentiraient la progression de la maladie évaluée par des analyses sanguines (marqueurs inflammatoires, de toxicité, de NEToses (formation de pièges extracellulaires des neutrophiles) et de fibrose) ou par analyse histologique (recrutement des fibrocytes, fibrose, NEToses, toxicité).

Procédures

Tous les animaux des groupes 2 à 7 subiront soit une injection unique en intra-péritonéale de LPS, soit une administration unique en intra-nasale de LPS, soit une administration unique en intra-trachéale de LPS, soit une ligation du caecum par méthode chirurgicale pour induire la pathologie. L’injection intra-péritonéale se fera sur animaux vigiles tandis que pour l’administration intranasale et intratrachéale ainsi que pour la méthode chirurgicale, l’induction se fera sur animaux anesthésiés. Les animaux du groupe 1 quant à eux recevront du sérum physiologique, du PBS ou seront opérés à blanc. Les injections intra-péritonéales dureront moins d’une minute par animal. Les administrations intra-nasales et intra-trachéales dureront environ 5 minutes par animal et la méthode chirurgicale durera environ 20 minutes par animal. Les traitements pourront être administrés en préventif (jusqu'à 1 mois avant l'induction du modèle) et/ou en curatif (jusqu'à 4 semaines après l'induction du modèle). Selon la molécule, la voie d'administration pourra être par voie intra-veineuse, intra- péritonéale, sous-cutanée, par voie orale, par voie topique sur animal vigile ou par système de mini-pompe osmotique qui sera la voie préférentielle. Tous les animaux recevront un véhicule, un traitement à tester ou une molécule de référence. Le nombre d'administration dépendra de la molécule et de la voie d'administration considérée. Cela pourra être une fois par semaine jusqu'à une à deux fois par jour. En amont des études in vivo, la toxicité potentielle des molécules testées et du véhicule aura été testée in vitro. Dans le cas où les molécules d’intérêt ne sont pas des molécules déjà sur le marché pour d’autres indications, des études de toxicologie in vivo pourront être entreprises afin de travailler avec des doses non toxiques. Les animaux seront pris en contention pour être anesthésiés avec un mélange de kétamine /xylazine, qui sera administré par injection intra-péritonéale ou par inhalation d’isoflurane. Lors des prélèvements de sang intermédiaires par voie rétro-orbitale ou lorsque qu’un animal présentera un score total compris entre 5 et 7, toutes catégories confondues dans le tableau des points limites, les souris et les rats seront traités avec de la buprénorphine. Le prélèvement sanguin durera environ 5 minutes par animal. A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort selon les méthodes réglementaires.

Impact sur les animaux

Du fait de l'induction des modèles, les animaux vont développer une septicémie associée à une élévation des marqueurs inflammatoires, une perte de poids et des complications aux longs termes telle que des dommages dans les poumons et un choc septique. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques).

Devenir

Euthanasie : le poumon sera prélevé pour analyse histologique et prélèvement de sang.

Remplacement

L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules pouvant agir sur l’inflammation, le recrutement des neutrophiles et la fibrose implique de disposer de modèles animaux adéquats mimant au mieux la pathologie humaine. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce rat ou souris à travers nos différents modèles reproduisent au mieux la pathophysiologie du sepsis et du SDRA. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Pour vérifier et déterminer l’effet d’un traitement sur l’inflammation et les dommages pulmonaires pouvant mener à la fibrose, il est essentiel d’examiner l’animal entier. Il est indispensable car ne peut être reproduit en modèle cellulaire.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux grâce à une approche statistique, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Le traitement des données entrainera la comparaison de 7 groupes de 6-12 animaux pour chaque étude donc une analyse statistique appropriée sera réalisée.

Raffinement

Toutes les procédures induisant une douleur seront réalisées sous anesthésie (chirurgie, prélèvement de sang) durant toute la procédure expérimentale afin de maitriser et limiter la douleur et la souffrance des animaux. L’anesthésie sera induite par induction à l’isoflurane (et maintien au masque) ou par injection de kétamine/xylazine en intra-péritonéale. Les procédures de chirurgie seront effectuées par une personne habilitée et formée. Pour les modèles d’induction par la chirurgie, les animaux recevront un analgésique qui sera administré en phase pré- et post-opératoire ainsi qu’un analgésique local appliqué lors de la procédure chirurgicale. En dehors de la phase de chirurgie, l’utilisation d’antibiotiques peut être nécessaire afin de retarder le choc septique. Toutefois, en cas de douleur ou de souffrance importante, un analgésique pourra être employé. Nos études étant basées sur des modèles inflammatoires, les anti-inflammatoires ne sont pas applicables. Les animaux seront également sous surveillance rapprochée. Les animaux seront suivis quotidiennement pendant les 5 premiers jours qui suivent l’induction puis trois fois par semaine pour pouvoir identifier les signes de souffrance caractérisés par le comportement du rat ou de la souris : les changements physiques (pelage, peau, yeux…), la mobilité, l’alimentation, l’agressivité, le poids du corps (mesuré 2 fois par semaine) limité à une perte de 20% maximum par rapport au poids initial, la consistance des fèces. Nous avons mis en place un tableau de suivi qui permet de définir les points limites adaptés. Si le score total d’un animal, toutes catégories confondues, au cours de l’étude est compris entre 5 et 7, l’animal recevra une injection de buprénorphine ou de meloxicam. Si le score total d’un animal, toutes catégories confondues, au cours de l’étude est >7 ou bien si le score dans une seule catégorie est 3, l’animal est euthanasié pour raisons éthiques.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des modèles d’étude très développés et caractérisés, étant donné leurs tailles et leurs spécificités. Ce sont des espèces communément utilisées pour ces modèles en accord avec les recommandations internationales et la littérature. Notamment la souche de rat Sprague Dawley (SD) est un modèle de laboratoire bien connu avec suffisamment de données historiques. Chez la souris, les souches C57Bl/6 et Balb/c représentent les souches de choix. Le choix de l’espèce utilisée dépendra en particulier du modèle utilisé, des objectifs et des besoins de l’étude. Si une molécule s’avère efficace dans une espèce, celle-ci pourra être éventuellement testée dans l’autre espèce afin de montrer une efficacité espèces indépendante. Les rats ou souris seront âgés d’au moins 8 semaines au début de l’étude, en accord avec la littérature existante pour effectuer ces différents modèles. De plus, à cet âge, le système immunitaire de ces animaux est totalement développé.