Troubles respiratoires

125 chiens, cochons, chèvres et moutons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit des prélèvements sanguins réguliers puis une ou deux chirurgies, dont la création d'une lésion et l'implantation d'un dispositif ORL, avant une euthanasie destinée aux analyses nécropsiques et histologiques. Les bénéfices annoncés pour les patients, implants plus durables et récupération plus rapide, restent renvoyés à l'application future du dispositif. Le porteur affirme que l'expérimentation sur "organisme entier" est "incontournable" et relève d'une "obligation règlementaire" pour valider les dispositifs implantables.

Objectifs

La sphère ORL (pour oto-rhino-laryngologie) est une zone anatomique complexe qui regroupe un large ensemble de structures comme entre autres les oreilles, le nez, les sinus et la gorge (y compris la bouche, la langue, le larynx et la trachée). Elle peut être le siège de différentes pathologies, acquises ou congénitales comme par exemple les cancers des voies aérodigestives supérieures (VADS) qui se situent au 5ème rang des cancers les plus fréquents en France, et dont la chirurgie par voie mini-invasive constitue l’un des traitements de première intention et représente la modalité de référence pour les tumeurs de la cavité buccale et à la suite de laquelle une reconstruction est souvent nécessaire; ou encore des anomalies du développement comme certaines sténoses dont la correction peut nécessiter l'emploi de stents par exemple. Le développement des techniques et des méthodes d’imagerie et de chirurgie interventionnelles, l’essor de la thérapie génique et cellulaire ou la découverte et l’amélioration des connaissances vis-à-vis d'entités pathologiques comme les cancers ont permis ou permettent d’envisager le développement de nouvelles techniques chirurgicales et/ou dispositifs permettant d’améliorer la santé des patients. On entend par dispositif implantable tout dispositif destiné à être implanté de façon invasive en totalité dans le corps humain ou à remplacer une surface épithéliale grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer en place après l'intervention. L'évaluation et le développement de nouveaux dispositifs, méthodes et techniques pour le diagnostic et/ou le traitement des affections ORL par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives requièrent une phase de recherche et de développement. Durant ce projet le recours à l’animal vivant est indispensable pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire visés par les applications chez les patients et qui ne peuvent être obtenus par des méthodes alternatives. Les objectifs du projet sont doubles : raffiner les prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) dans la phase initiale du projet, puis ces versions entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour valider les dispositifs/méthodes/techniques selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patients, une amélioration de la durabilité et de l’efficacité des implants pour éviter leur rejet, et ainsi les ré opérations parfois multiples des patients, pour réduire les temps de cicatrisation qui handicapent les patients, et réduire le traumatisme tissulaire, corollaire de ces interventions ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. - Des procédures chirurgicales d'évaluation de dispositif en O.R.L avec ou sans procédure chirurgicale de création de modèle lésionnel préalable. Chaque animal du projet ne subira qu'une seule chirurgie d'évaluation de dispositif O.R.L associée ou non à une chirurgie de création de modèle antérieur soit une seule et parfois deux interventions chirurgicales par animal dont une mini-invasive pour la création de modèle lésionnel. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - La faim ,lors de la mise à jeun (12 heures pour les porcs, 12 à 24 heures pour les ovins/caprins et 6 à 8 heures pour les chiens) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - En fonction des besoins et préalablement à la procédure d'évaluation du dispositif O.R.L, l'induction d'une lésion à la faveur d'une intervention chirurgicale mini-invasive de type anastomose, création d'un defect tissulaire, ligature ou occlusion de vaisseaux par exemple - La douleur en phase postopératoire : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique, pour ces derniers points, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple le recours systématique à l'anesthésie générale, l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur opiacés, la protection des plaies, la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en oeuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, une analgésie est mise en place et des protocoles de prise en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (Anti-Inflammatoires Non Stéroidiens et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques détaillés dans la procédure ANIM-WI-015 sont appliqués tout au long du projet. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs doivent être testés sur une anatomie semblable à celle de l’Homme (de l’enfant à l’adulte de grande taille), cela impose l’expérimentation sur des gros animaux. Les différences interspécifiques tissulaires, anatomiques et fonctionnelles nécessitent différentes espèces pour optimiser l’expérimentation. L’évaluation des différents dispositifs du projet se fera uniquement sur le modèle animal préalablement identifié comme le plus pertinent : Les ovins et les caprins pour l'évalution de la durabilité des stratégies opératoires des dispositifs testés. Leurs intérêts principaux sont leur croissance limitée à l'âge adulte et leur robustesse. Les porcins pour l'évaluation de la durabilité de l’ancrage des dispositifs. Les canins lorsqu’ils sont les seuls à présenter la spécificité anatomique ou fonctionnelle recherchée. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.

220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation pulmonaire leur est induite par injection de bléomycine ou de LPS, puis elles reçoivent un agent de contraste par un cathéter posé sous anesthésie pour tester une technique d'imagerie à particules magnétiques. Le porteur indique que la fibrose pulmonaire peut provoquer des difficultés respiratoires, de la prostration et une perte de poids, les animaux perdant plus de 15 % de leur poids étant tués. Il affirme que les procédures ont un caractère de stricte 'nécessité' et ne peuvent pas être remplacées par des méthodes sans animaux vivants.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de tester in vivo l'imagerie à particules magnétiques (MPI) pour le diagnostic précoce de l'inflammation pulmonaire en utilisant un nouvel agent de contraste composé de microparticules de polydopamine couplées à un anticorps anti-VCAM-1. Ces molécules d’adhésion endothéliales VCAM-1 sont exprimées à la surface des cellules endothéliales lors d’un épisode inflammatoire aigu ou chronique comme une inflammation systémique, une atteinte rénale ou une maladie rénale chronique. Des tests préliminaires sur cet agent de contraste en imagerie à particules magnétiques ont montré que les propriétés magnétiques de cet agent de contraste permettaient une sensibilité de détection en MPI supérieur à celle de l’imagerie par résonance magnétique (IRM). D’autres part, des études in vitro et in vivo ont montré les propriétés biocompatibles et biodégradables de cet agent de contraste et il a été également démontré que cette stratégie était efficace pour cibler les cellules endothéliales activées humaines, ouvrant la voie à une potentielle translation en clinique. L'utilisation de cet agent de contraste semble donc être un outil prometteur pour la détection en pré-clinique de l'inflammation en MPI et nous prévoyons de tester dans ce projet la capacité de détecter l’inflammation pulmonaire dans différents modèles chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce nouvel agent de contraste a montré une sensibilité et une spécificité élevées pour détecter l'inflammation in vivo dans le cerveau, les reins et la muqueuse intestinale. Nous savons que ces microparticules ont un signal en MPI du fait de leur propriété magnétiques spécifiques. Il est donc attendu de la technique d'imagerie MPI utilisant les M3P qu'elle puisse elle aussi permettre d'imager de manière ultra-sensible, spécifique et précoce l'inflammation pulmonaire par rapport aux animaux contrôles n'ayant pas d'inflammation.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : o Induction du modèle inflammatoire par une unique injection d’un produit induisant l’inflammation (durée : inférieure à 10min) o Pesée lors des manipulations (durée : inférieure à 5 min) o Pose d’un cathéter sous anesthésie profonde (durée : environ 15min) o Imagerie MPI avec injection de produit de contraste (durée : environ 30min).

Impact sur les animaux

Les deux modèles présentés peuvent en effet induire des effets indésirables sur les animaux. La bléomycine est un agent anti-cancéreux dont un de ces effets secondaire est d’induire de la fibrose pulmonaire, d’où son utilisation courante en recherche préclinique pour l’induction d’inflammation pulmonaire. Le LPS est un sucre que l'on trouve à la surface des bactéries dont l'injection simule la présence de bactérie et induit ainsi une réaction immunitaire forte. Il est important de noter que la dose de LPS choisie pour ce projet (100 µL à 0.5 mg/mL) n'induit pas de mortalité chez les souris. L'induction de l’inflammation pulmonaire et la fibrose pulmonaire peuvent entrainer des difficultés respiratoires. Dans ces deux modèles, les animaux peuvent être en mal-être qui peut alors être repéré par de la prostration, une inactivité dans la cage, un arrêt de la prise alimentaire et de boisson suivie d'une perte de poids. Lors du protocole d'imagerie MPI, celui-ci se déroulera sous anesthésie générale des animaux mais la pose du cathéter veineux pour l'administration de l'agent de contraste peut provoquer un hématome.

Devenir

Tous les animaux de cet étude sont mis à mort à l’issue des 2 procédures.

Remplacement

Des tests in vitro ont été réalisées sur l'gent de contraste en imagerie à particules magnétiques (utilisation de "fantômes") et ont permis de montrer que les propriétés magnétiques des microparticules conféraient un signal spécifique en imagerie à particules magnétiques (MPI). Toutefois, les expériences in vivo ne peuvent pas être totalement remplacées par des études in vitro car il est nécessaire d'estimer l'affinité de l'agent de contraste pour les molécules d'adhésion endothéliales exprimées en conditions inflammatoires ainsi que les temps de ciblage et de détectabilité de l'agent de contraste en imagerie MPI lorsqu'elles sont injectées dans un organisme. D'après les études pilotes citées, on sait que l'agent de contraste cible efficacement l'inflammation dans d'autres pathologies et l'on souhaite savoir si ce ciblage sera détectable en imagerie MPI pour révéler l'inflammation pulmonaire. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures par rapport à nos précédents projets, ayant utilisé des protocoles d'imagerie similaires pour évaluer l'inflammation dans d'autres tissus avec les mêmes types de microparticules. Dans ces deux études précédentes il a été montré que 5 animaux par modèle étaient suffisants pour obtenir une différence significative du signal en imagerie par résonance magnétique. Les données de ces 5 animaux étaient comparées à 5 autres animaux du groupe contrôle. Il semble intéressant d'étudier l'effet sexe sur le développement de ces modèles d'inflammation ainsi que l'efficacité du ciblage de l'agent de contraste et de leur détection par imagerie photoacoustique, nous prévoyons donc de réaliser chaque modèle sur 5 souris mâles et 5 souris femelles. Avec les animaux contrôles (recevant des injections de liquide physiologique), cela fait donc 20 animaux par modèle. De plus, nous aurons besoin d'évaluer la sensibilité et la spécificité de la méthode en utilisant des microparticules non ciblées, en utilisant 20 autres animaux (10 animaux pour chaque modèle d'inflammation (5 mâles et 5 femelles) et 10 animaux contrôles (5 mâles et 5 femelles aussi) ), amenant au total à 40 animaux par modèle. Ces effectifs ont été confirmés par un calcul de taille d'échantillons avec pour paramètres : moyenne anticipée groupe 1 (modèle) = 10 +/- 5 et groupe 2 (contrôle) = 1, alpha = 0.05, ayant donné un résultat de 5 animaux nécessaires par groupe. Les moyennes de signal obtenues seront analysées par un test de Mann-Whitney.

Raffinement

Les animaux auront le temps d’acclimatation d’une semaine. Un enrichissement du milieu d'hébergement des animaux de type boite à œuf, tunnel PVC et/ou igloo PVC est prévu. A partir du début de la mise en place des modèles, une attention particulière sera accordée à l'état général des animaux, notamment pour vérifier l'absence d'apparition de signes de détresse ou de douleur extérieure (points limites cités plus loin) ainsi que la bonne prise alimentaire et de boisson. Une coupelle de croquettes humides aura été préalablement placée dans la cage afin de permettre aux animaux malades de s'alimenter et de s'hydrater plus facilement. Une attention particulière sera aussi accordée à l'évolution de la masse corporelle avec une pesée quotidienne afin de vérifier que la perte de poids n'est pas supérieure à 15%. Après induction des deux modèles, une surveillance sera faite 15 minutes après les instillations (LPS ou bléomycine), puis 1 heure après et 2 fois par jour jusqu’à l’euthanasie des animaux. De plus, pendant la durée des modèles et avant la perfusion intracardiaque réalisée pour le prélèvement des organes d'intérêt (reins), la douleur des animaux sera réduite au maximum en veillant à couvrir ces temps d'étude par une analgésie. En amont de ce projet, pour limiter la douleur engendrée par l’intubation lors de l’injection intratrachéale, nous avons choisi de n'utiliser qu'une dose de LPS, connue pour ne pas induire de mortalité chez les souris. Les points limites suivants et les décisions prises en conséquence sont définis comme suit : Niveau 1 : diminution de l’activité dans la cage, réduction de l’interaction avec les congénères, absence de toilettage, dos vouté, rétrécissement de l’ouverture orbitaire, changement de position des oreilles et des moustaches (oreilles vers l’extérieur, moustaches vers l’avant ou vers l’extérieur) --> Augmentation de la surveillance (4 fois par jour). Niveau 2 : perte de poids de plus de 15 %, prostration dans la cage, absence de réaction au toucher, tremblements/convulsions, saignements rectaux --> Mise à mort de l’animal par administration d’une dose létale d’anesthésique.

Choix des espèces

D’un point de vue scientifique cette étude va permettre des recherches translationnelles ou appliquées menées pour le diagnostic d’un mauvais état de santé chez l'homme. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude d’un diagnostic positif d'inflammation cérébrale doit s’effectuer sur des modèles in vivo.

1728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent, sous anesthésie, des instillations de cellules immunitaires et de la bactérie Pseudomonas aeruginosa dans les voies respiratoires, certaines à dose létale, pour étudier des globules blancs suppresseurs comme modulateurs de l'inflammation pulmonaire. Le porteur indique que l'infection peut entraîner perte de poids et souffrance, l'euthanasie étant alors pratiquée. Sur le remplacement, il se borne à affirmer que ces connaissances ne peuvent être obtenues qu'à l'échelle de l'organisme.

Objectifs

Pseudomonas aeruginosa (P.a) est une cause majeure d'infections respiratoires chez l'homme, notamment chez les personnes atteintes de mucoviscidose, ou celles atteintes d'emphysème et de bronchite chronique. Cette bactérie provoque des infections aiguës dramatiques chez les personnes immunodéprimées (personne dont les défenses immunitaires sont affaiblies) et elle devient progressivement multirésistante aux antibiotiques et représente une menace considérable pour la santé publique. Il est bien établi dans d’autres pathologies telles que le cancer et les maladies infectieuses qu'une catégorie de globules blancs immuno-suppresseurs particuliers, les cellules myeloides suppressives ( MDSCs) sont induites par l'infection et/ou les infections. Il est également connu que dans les infections où P.a est présente, par exemple chez les patients placés sous ventilation respiratoire, ou chez les patients souffrant de mucoviscidose, c’est l’inflammation exacerbée qui est la cause de la morbidité. Les cellules MDSCs générées post-infection/inflammation représentent probablement un mécanisme protecteur pour contrecarrer cette réponse excessive inadaptée. En effet, il a été montré que des MDSCs fabriquées à partir de moelle osseuse de souris C57/Bl6 sont anti-inflammatoires, lorsqu ’infectées in vitro avec la bactérie P.a. En effet, la littérature indique que les MDSCs (avant ou après infection par P.a) peuvent inhiber la réponse immune. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le rôle des MDSCs comme modulateurs de l’inflammation pulmonaire exacerbée observée chez les patients infectés, et dans les modèles de souris d’infections à P.a et d'étudier les mécanismes en jeu.

Bénéfices attendus

Il est bien connu que la bactérie P.a entraîne une forte morbidité et/ou mortalité chez les patients immuno-déprimés (patients sous-ventilation mécanique, patients souffrant de mucoviscidose, sujets grands brûlés), dûes à une inflammation exacerbée non contrôlée. A ce titre, nous pensons que ce projet pré-clinique visant à utiliser les cellules myeloides suppressives (MDSCs), cellules spécifiquement 'anti-inflammatoires’ est innovant et pourrait grandement bénéficier à la communauté scientifique, et à moyen terme aux patients souffrant de ces pathologies.

Procédures

Pour l’ensemble des souris étudiées, les injections intrapéritonéales (dans la cavité abdominale) d’anesthésiques réalisées sur les animaux vigiles durent quelques secondes. Lorsque l’animal est endormi (au bout de quelques minutes), les instillations des cellules et des bactéries s’effectuent par la voie oro-pharyngée et intra-nasale, respectivement, en déposant quelques gouttes de liquide sur les narines ou au niveau du pharynx . Ces instillations durent au maximum une minute. Pour certains animaux, juste avant la première instillation oro-pharyngée (J0) nous réaliserons un prélèvement sanguin de quelques microlitres à la veine sous-maxillaire sur les animaux vigiles. Ce prélèvement dure moins d’une minute.

Impact sur les animaux

Sur la base de la litterature utilisant des macrophages transferrés de façon adoptive par la même voie, l’instillation par voie oro-pharyngée des cellules myéloides suppressives (MDSCs) pourrait entrainer une perte de poids très modérée durant 24-48h. Dans toutes les procédures, l’instillation de MDSCs et les infections par P.a par voie oro-pharyngée sera effectuée sous anesthésie. D’après l’état de l’art, l’instillation des MDSCs et l’infection sous-létale avec P.a n’entraînera pas d’effets indésirables (pas de perte excessive de poids progressive, pas de réduction de la mobilité, pas de négligence du toilettage. Pour les animaux instillés avec une dose létale, la cinétique de développement des signes cliniques nous permettra d’anticiper la souffrance et la douleur pouvant être associées. En cas de souffrance et de douleur, l’euthanasie de l’animal sera effectuée. Les pathologies développées par les souris souffrant de mucoviscidose peuvent entraîner à partir de la naissance une dégradation de l’état général des souriceaux nécessitant une surveillance journalière.

Devenir

Dans le cadre de l’étude de la réponse immune post traitement, il est important d’euthanasier les animaux à la fin de l’expérience pour pouvoir étudier leurs réponses immunitaires.

Remplacement

Les connaissances issues de cette étude sur la souris ne peuvent pas être actuellement obtenues autrement qu’à l’échelle de l’organisme, compte-tenu de la complexité des mécanismes à étudier.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous utilisons 6 souris par groupe expérimental. Trois procédures expérimentales seront effectuées. La 1ère nous permettra d’étudier la présence des cellules myéloides immunosuppressives (MDSCs) dans les poumons et les ganglions de souris après infection par Pseudomonas aeruginosa (P.a). Si des différences ne sont pas observées dans cette procédure, un certain nombre d’expériences ultérieures ne seront pas effectuées, ce qui permettra de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Les tests statistiques adéquats permettront de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée sur le bien-être des animaux par une surveillance journalière qui sera assurée par le personnel de l'animalerie, en complément à celle des expérimentateurs. Les animaux seront hébergés dans des cages avec 6 souris maximum par groupe expérimental dans une animalerie dédiée aux expérimentations à caractère infectieux. L’ensemble des actes sera réalisé par du personnel qualifié et expérimenté. Une grille d’évaluation des signes cliniques (prenant en compte l’apparence physique, le poids, le comportement ou la progression de la maladie) sera renseignée une fois ou deux fois par jour, suivant les procédures. Les souris présentant une souffrance et/ou une douleur mise en évidence par une modification comportementale et/ou physique seront euthanasiées. En cas d’affaiblissement des animaux, des croquettes humidifiées seront mises dans la cage afin que les souris puissent accéder plus facilement à la nourriture. Lorsque nécessaire, l'utilisation d'analgésiques locaux sera effectuée, afin de minimiser l'inconfort potentiel des animaux lors des procédures.

Choix des espèces

Les souris utilisées seront âgées de 6-8 semaines, c’est à dire à l’âge de maturité du système immunitaire de souris à l’état normal. L’utilisation de souris dans notre projet se justifie par des raisons scientifiques. En effet, la souris est un animal sensible à l’infection respiratoire à la bactérie que nous utilisons dans ce projet, et cette espèce est utilisée classiquement depuis de nombreuses années par la communauté scientifique.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Atteintes d'une forme de myopathie de Duchenne, elles reçoivent des injections d'un traitement, des prélèvements de sang, une échographie cardiaque sous anesthésie et des tests de force, pour évaluer une immunothérapie censée réduire la fibrose musculaire et cardiaque. Le porteur indique que la maladie induit un affaiblissement musculaire et un décès prématuré des souris. Il affirme que les modèles murins restent une "source unique et indispensable" pour évaluer le traitement, les modèles cellulaires servant au préalable.

Objectifs

La myopathie de Duchenne est une pathologie neuromusculaire grave. Elle est causée par des mutations d’un gène qui assure la stabilité structurelle des muscles. Chez les patients, les fibres musculaires sont progressivement endommagées et remplacées par du tissu fibreux et adipeux. Si la recherche d’un traitement curatif pour cette maladie est plus forte que jamais, le besoin médical reste à ce jour non satisfait. En effet, l’une des causes communes aux échecs des thérapies géniques et cellulaires en développement est la difficulté d’accès à leurs cibles en raison d’une fibrose excessive. C’est pour cette raison qu’il est cliniquement pertinent d'explorer une réduction de la fibrose comme une nouvelle piste. L’une de ces pistes consiste à cibler une protéine exprimée spécifiquement à la surface des fibroblastes activés, à l’aide de cellules immunitaires ou particules génétiquement modifiés qui ciblent spécifiquement cette protéine. Une étude de preuve de concept a préalablement montré que ces stratégies étaient capables de limiter la fibrose cardiaque dans un modèle murin d’hypertension. Cette pathologie diffère toutefois de la myopathie, il est donc important d’établir si les conclusions initiales positives sont extrapolables. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les effets thérapeutiques de traitements innovants dans un modèle murin de myopathie. A l’issue de ces expériences, nous pourrons déterminer si cette thérapie est efficace pour réduire la fibrose musculaire et cardiaque induite par la myopathie.

Bénéfices attendus

La mise en évidence d'une réduction de la fibrose et d'une amélioration de la fonction cardiaque et musculaire par une approche d'immunothérapie basés sur l’administration de lymphocytes T spécifiques dans des modèles murins de la myopathie de Duchenne constitue un préalable important pour une utilisation future et sûre chez l’homme. Le terme ce projet est de développer un médicament biologique susceptible d’améliorer le pronostic de la maladie à travers une réduction de la fibrose et l'amélioration des fonctions cardiaques et musculaires dont souffrent les patients. Ce projet permettra également d’ouvrir la piste d'une utilisation des approches d'immunothérapie dans le contexte des maladies génétiques rares et ceci en combinaison avec une thérapie génique à visée curative.

Procédures

Les interventions sur les animaux seront 1- l’Injection du traitement (5 min) 2- les Prélèvements sanguins espacés d'une semaine pour les deux premiers et 1 mois plus tard pour le dernier (1 min chacun) 3- Echographie cardiaque réalisé sous anesthésie (5 min) 4- Test de force (10 min).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues causées par la maladie consistent en un affaiblissement musculaire (respiration haletante, démarche incertaine, fatigue) et une réduction modérée de la fonction cardiaque. Il est à noter que cette maladie induit un décès prématuré (11 mois par rapport à une espérance de vie d’environ 2 ans chez les souris saines). Le pré-traitement peut induire un état transitoire de fragilité (4-7 jours) chez la souris avec notamment une perte de poids. Les prélèvements sanguins et injections peuvent générer du stress chez l'animal et une douleur minime. Les prélèvements et injections n’induisent qu’une très faible douleur. L’échocardiographie nécessite une anesthésie pour garantir l’immobilité de l’animal pendant la mesure (5 min) et occasionne un stress chez l’animal.

Devenir

A l'issue de cette procédure, l'ensemble des souris impliqué dans le protocole sera mise à mort par une méthode réglementaire et ceci afin de récolter les différents tissus (cœur, muscles) et procéder à l'examen histologique et moléculaire de ces tissus et recueillir ainsi les données indispensables pour évaluer l'efficacité de l'approche thérapeutique mise en place.

Remplacement

En amont de l’administration de cette thérapie dans le modèle murin, une évaluation de la fonctionnalité est mise en place sur des modèles cellulaires. Ainsi, ne sont administrés aux animaux que des traitements ayant fait la preuve de leur fonctionnalité. Cependant, les modèles murins restent une source unique et indispensable pour évaluer une amélioration induite par le traitement testé. De plus, ces modèles nous permettront d’obtenir des informations sur la sécurité de ce traitement.

Réduction

Le nombre de souris par groupe est calculé grâce à des tests statistiques qui seront réalisés pour analyser les résultats et l’utilisation de calcul de puissance statistique pour évaluer au mieux le nombre d’animaux nécessaires. Ces calculs se fondent sur les données de la littérature et l’expérience déjà acquise par l’équipe, en prenant en compte des sorties des animaux de protocoles (atteinte de points limites ou décès prématuré). Toutes les interventions sur les souris seront réalisées dans des conditions de reproductibilité maximale afin de minimiser la variabilité et donc le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Toutes les manipulations chez l’animal durant nos procédures, à l’exception de l’injection intra-veineuse et du prélèvement de sang, sont des tests indolores, garantissant une pénibilité minimale pour celui-ci. Nous avons opté pour l'injection intraveineuse étant donné qu’elle est non invasive. La surveillance du bien-être des animaux sera assurée au quotidien par le personnel de l’animalerie et de manière hebdomadaire par les expérimentateurs. Une grille d’évaluation des points limites est établie afin de prévenir et limiter la survenue de la souffrance animale. L’animal sera mis sous surveillance accrue et l’administration d’un analgésique sera envisagée en cas de nécessité.

Choix des espèces

La souris est l’espèce permettant de reproduire la complexité de la myopathie puisqu’aucun système in vitro et aucun modèle d’organisme plus simple ne permet de reproduire la complexité de la myopathie. En outre, les modèles pré-cliniques de la myopathie ont été développés chez la souris et récapitulent la chronologie de la progression et les altérations observées chez les patients. L’âge choisi de la souris constituant le modèle sera au stade adulte, plus précisément entre 3 mois à 6 mois d'âge car à partir de 3 mois, les souris sont considérées comme ayant atteint la fin de leur croissance musculaire et cardiaque. Il est aussi prouvé dans la littérature que la fibrose se met en place dans ce modèle à partir de 4 mois.

1 424 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections dans le plexus veineux derrière l'œil, par la trachée, par gavage ou dans l'abdomen, et sont infectées par des bactéries pour provoquer un sepsis suivi d'une perte de poids et de poils hérissés. Le porteur indique retenir un inoculum faible censé éviter la mortalité, et précise qu'aucun anti-inflammatoire ne peut être administré sur un projet portant sur le système immunitaire. Il étudie le rôle de lymphocytes régulateurs dans l'immunodépression qui suit une infection sévère et affirme que seule l'étude in vivo permet cette approche globale.

Objectifs

Notre laboratoire a montré que suite d’une infection sévère, une cicatrice immunitaire se mettait en place, avec des perturbations prolongées des capacités des organismes à se défendre contre une nouvelle infection. Cette cicatrice immunitaire associé à un plus haut risque de complication infectiologique secondaire est associée à l’apparition de plusieurs populations de lymphocytes dont l’activation des lymphocytes dit « T régulateurs » spécialisés dans le contrôle de l’inflammation. Nous avons montré qu’une sous population ces lymphocytes T régulateurs porteur d’un récepteur de type 2 au Tumoral Necrosis Factor (aussi appelé TNFR2) jouaient un rôle majeur la survenue de cette immunodépression faisant suite à une infection sévère. Les objectifs du projet sont de caractériser le rôle de ces populations de lymphocytes T régulateurs porteur du récepteur TNFR2 au cours de la défense anti-infectieuse et lors de la phase d’immunodepression post-septique.

Bénéfices attendus

Notre projet nous permettra d’améliorer nos connaissances des mécanismes d’extinction des capacités de réaction du système immunitaire faisant suite à une infection sévère aussi appelée immunosuppression post-septique (IS). Ce projet nous aidera à comprendre les modifications induites par le sepsis sur les fonctions des lymphocytes des Treg et les conséquences de ces modifications au cours d’une 2ème infection. Ceci nous permettra la mise en place de traitements adaptés pour lutter contre les infections bactériennes.

Procédures

Tous les animaux de ce projet sont soumis à une administration intra-veineuse retro-orbitale sous anesthésie générale. Un tiers des animaux de ce projet est soumis à une administration intra-trachéale sous anesthésie générale. Deux tiers des animaux sont soumis à une administration unique per os (sonde de gavage pour l’administration du traitement) en condition vigile. Un tiers des animaux est soumis à des injections intrapéritonéales en condition vigile. Tous les gestes sont de courte durée (au maximum 1 minute) et pour les souris anesthésiées, le réveil est quasiment instantané. En fonction de l’état général des souris (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections sous-cutanées d’analgésiques pourraient être réalisées.

Impact sur les animaux

Modèles d’infection bactérienne : Le modèle d’infection par administration de bactéries par voie intra-veineuse, a déjà été validé dans ce projet, nous utiliserons des souches bactériennes de référence de laboratoire. Nous réaliserons une injection dans le plexus veineux sous orbitaire d’une suspension bactérienne. Suite à l’administration de bactéries (inoculum faible concentration) par voie intra-veineuse, une inflammation est attendue durant les 4 premiers jours avec comme signes cliniques une perte de poids inférieure à 20% et des poils hérissés, suivis d’une récupération progressive de leur poids au 5ième jour du sepsis. Cette injection entraine une septicémie sans induction de mortalité, permettant d'évaluer l'impact d'une seconde infection et d'éviter les biais de sélection. Les procédures de gavage et de transfert adoptif utilisées au cours des procédures expérimentales n’induisent pas d’effets indésirables connus chez la souris. La pesée de référence est réalisée au J0 avant le début de l’induction du sepsis ou de tout autre procédure. Avec l’utilisation d’un inoculum bactérien faible pour l’induction du sepsis (permettant de reproduire l’IS), aucun signe de souffrance n’est observé en dehors d’une perte de poids inférieure à 20% et les poils hérissés. L’effet de la délétion du TNFR2 sur les Treg sur le sepsis. Il est envisageable que les Treg étant moins suppresseurs, les effets du sepsis sur l’état général des souris pourraient être plus marqués. Il en est de même pour l’effet du traitement par des anticorps anti-TNFR2 sur le sepsis. Pour ces raisons, Les animaux seront observés quotidiennement pendant 3 jours après l’induction du sepsis et pesés tous les 48 à 72h de façon à s’assurer que s’il y des effets, ils ne soient pas durables dans le temps. Les modèles d’inflammation respiratoires aiguës sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3jours) et modérée (inférieure à 10%) est observée, sans perte de motricité. Après J2, les souris reprennent une courbe de poids normale.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications immunologiques.

Remplacement

Les mécanismes responsables d’une immunosuppression suite au sepsis sont à l’heure actuellement mal compris. Les méthodes in vitro développées par d’autres laboratoires de recherche ne permettent pas une étude globale des modifications entrainées par une activation du système immunitaire. L'étude du rôle des Treg dans cette maladie et la mise au point de nouveaux traitements ne peut se faire qu'in vivo. Cependant, dès que la question scientifique le permet nous privilégions l’utilisation de méthodes substitutives (méthode in vitro et ex vivo) pour y répondre. Nous avons développé des protocoles de culture de Treg primaires permettant de disposer d’une grande quantité de Treg.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit au minimum (n=7) afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Le test statistique utilisé sera une Anova suivie d’un test post-hoc. Une valeur de p inférieure à 0,05 sera considérée comme significative.

Raffinement

L’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation par scoring des points limites adapté aux modèles a été mis en place. En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections de buprénorphine seront réalisées. L’utilisation d’anti-inflammatoire n’est pas possible dans le cas de projet sur le système immunitaire. Comme indiqué dans notre tableau de points limites, il est également prévu un apport d’enrichissement en cas de signes cliniques légers ou modérés, définis par les scores de 1à 14 suivant notre échelle de suivi (cf annexe). Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage de 24G est préalablement enduite d’anesthésiant local afin d’anesthésier localement la trachée. Une anesthésie générale est réalisée pour les procédures d’injection intraveineuse. Pour les injections IV en retro-orbital, en plus de l'anesthésie par inhalation, une anesthésie ophtalmique sera réalisée sur l'œil qui recevra l'injection. Les souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet ne présentent aucun phénotype dommageable, en comparaison des souris contrôles, elles ne développent aucune forme de maladie apparente même à l’âge d’un an.

Choix des espèces

Les modèles murins d’infections bactériennes sont des modèles fiables et reproductibles. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les datas déjà générées dans ce projet de recherche. 7-14 semaines de vie. A ce stade le système immunitaire est mature

112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de la mutation de la mucoviscidose, elles reçoivent dans la trachée des fragments de la bactérie Pseudomonas aeruginosa pour déclencher une inflammation pulmonaire, plus une injection d'un candidat anti-inflammatoire, avant une ponction cardiaque, un lavage des poumons et la mise à mort. Le porteur indique que l'exposition peut provoquer une gêne respiratoire sur une durée courte de 24 heures. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ou informatique ne reproduit cette réponse inflammatoire complexe entre le poumon et la rate.

Objectifs

La mucoviscidose est une maladie génétique incurable qui touche 1 enfant sur 4500 naissances en France. Elle atteint le système digestif et l’appareil respiratoire mais l’atteinte pulmonaire est responsable du décès dans 90% des cas. La faible espérance de vie de ces enfants résulte majoritairement de leurs prédispositions génétiques et des infections chroniques pulmonaires contractées qui aggrave leur pathologie pulmonaire. Afin de comprendre les mécanismes physiopathologiques de ces infection chroniques, nous avons établi un modèle murin permettant de mimer l’inflammation présente chez les patients. Pour mener notre étude, nous allons valider notre modèle d’inflammation. La mutation génétique la plus fréquemment rencontrée chez les patients atteints de mucoviscidose est la mutation F508del du gène CFTR. Nous avons donc utilisé le modèle murin portant la même mutation F508del. Les poumons de ces souris seront exposés à des extraits de bactéries mortes Pseudomonas aeruginosa. Cette bactérie est celle qui contamine majoritairement les patients atteints de mucoviscidose. Nous travaillons sur le composé CIGB-552, un peptide synthétique qui a montré son efficacité contre l’inflammation liée au cancer et aux infections généralisées. Notre objectif est de mesurer les paramètres de l’inflammation par des méthodes scientifiques robustes, afin de montrer l’effet anti-inflammatoire du CIGB-552 sur les infections pulmonaires dans le contexte de la mucoviscidose. Cela permettra de proposer un nouveau médicament pour les patients.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont : 1) D’obtenir un modèle murin de la mucoviscidose qui se rapproche des patients. La mesure des différents paramètres de l’inflammation pulmonaire permettra de mieux identifier les phénomènes inflammatoires sur lesquels agis le CIGB-552. 2) Que ce modèle murin d’inflammation soit suffisamment caractérisé, validé et reproductible. Cela permettra d’utiliser ce modèle pour mieux caractériser les futures molécules anti-inflammatoires développées par notre équipe ou par la communauté scientifique. 3) D’évaluer l’efficacité anti-inflammatoire du CIGB-552 sur plusieurs paramètres de l’inflammation qui sont observable seulement à l’échelle d’un individu.

Procédures

Pesée des souris : les souris vigiles seront pesées sur une balance conçue pour les petits animaux. Sera réalisée sur les 112 animaux, 4 fois par animal, pendant la durée de l’expérimentation (25h). Injection intra-péritonéale de CIGB-552/véhicule : les souris vigiles seront maintenues par contention par l’expérimentateur dans un environnement conçu pour l’expérimentation animale. Il sera injecté un volume de 100µl à une dose de 1,4 mg/kg avec une seringue. Sera réalisée sur les 112 animaux, 1 fois par animal au début de la procédure. Instillation oro-pharyngée de LPS de p.a. : les souris sont anesthésiées (Buprénorphine (0.05mg/Kg), Zoletil (40mg/Kg) et Xylazine (4.2mg/Kg) (150 μL par voie IP)). Injection dans la trachée à l’aide d’un cathéter, d’un volume de 20µl de LPS de pseudomonas aeruginosa 4mg/kg et 2mg/kg (ou du véhicule). Après ce geste, l’instillation d’un petit volume d’air via le cathéter permet de dégager les voies respiratoire en favorisant le dépôt du LPS (ou du vehicule) sur les paroies des voies aériennes. Sera réalisée sur les 112 animaux, 2 fois par animal à 1h et 22h après le démarrage de la procédure. Le geste technique par animal ne dure que quelques minutes et est réalisée dans un environnement conçu pour l’expérimentation animale.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent subir une gène respiratoire causée par l’exposition de leurs poumons aux bactéries mortes de Pseudomonas aeruginosa (P.a). Les morceaux de bactérie vont induir la réponse immunitaire des souris, et développer l’inflammatoire pulmonaire comparable à l’observation chez les patients atteints de mucoviscidose. Notre maitrise des gestes techniques montre que la méthode d’exposition des poumons des souris (instillation oro-pharyngée) n’est pas un geste invasif, ce qui garranti que le déclencheur de l’inflammation sont les morceaux de bactérie P.a. Dans l’état de nos connaissances, nous ne pouvons prédire l’effet de l’inflammation sur la perte de poids des souris. Du moins, nous n’anticipons pas de perte de poids sur une exposition aussi courte à la bactérie P.a (24h). Nous peserons les animaux au cours de la procédure. Si une nuisance de l’animal est observée, elle sera déclenchée seulement après l’exposition au LPS jusqu’à la fin de la procédure, soit un temps maximal de 24h.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l’issu de notre seule procédure par injection d’Euthasol 40 (140mg/kg). Nous récupèrerons le sang par ponction intra-cardiaque, le lavage broncho-alvéolaire et les lobes des poumons pour étudier la signature moléculaire et cellulaire liée à l’inflammation. Ces paramètres seront évalués par la méthode d’ELISA, d’histochimie, de RT-qPCR et de cytométrie de flux.

Remplacement

Notre étude porte sur l’évaluation de l’inflammation pulmonaire. Ce phénomène se prépare à l’échelle d’un individu par des échanges de messagers chimiques et cellulaire entre le poumon et la rate. Les modèles disponibles en laboratoire (cellule et prédiction bio-informatique) ne permettent pas à ce jour d’étudier cette réponse complexe de l’inflammation. C’est pourquoi l’utilisation d’animaux est nécessaire afin de comprendre et la réponse anti-inflammatoire, et d’évaluer la part bénéfique du CIGB-552 dans la modulation et la résolution de la réponse inflammatoire locale pulmonaire. En revanche nous limiterons cette étude préliminaire à un seul modèle de souris qui est le modèle F508del, le plus pertinent de la communauté scientifique pour étudier le processus complexe de l’inflammation.

Réduction

Précédemment au laboratoire nous avons optimisé les procédures afin d’observer sur un même animal, les paramètres clés de la mesure de l’inflammation. Les deux expositions aux morceaux de bactérie P.a. à deux temps différents de la procédure sur un même animal, permettent d’étudier deux moments de la réponse inflammatoire dans un même individu : les messagers chimiques ainsi que les messagers cellulaires qui permettent de répondre à l’infection. De ce fait, nous divisons par deux le nombre d’animaux nécessaires pour observer l’effet du CIGB-552 sur ces deux phénomènes de l’inflammation distincts dans le temps. D’après les expérimentations animales antérieures de l’équipe, nous estimons que 14 souris (7 mâles et 7 femelles) par groupe sont nécessaires pour révéler statistiquement l’effet bénéfique du CIGB-552.

Raffinement

Les souris seront élevées dans des cages ventillées de 5 animaux maximum, pour favoriser leur vie sociale. Un enrichissement de l’habitat sous forme de maisonnettes, de briquettes de bois et de morceaux de cotons permettra de réduire le stress des animaux et de favoriser leur bien-être. Les souris F508del possèdent une alimentation en croquettes Teklade plus riches en protéines pour éviter la perte de poids liée à la mucoviscidose. Les souris sont abreuvées avec une eau contenant de faibles doses de laxatifs (movicol) pour favoriser l’évacuation des selles. Les zootechniciens ainsi que les expérimentateurs sont tous formés et familiers aux soins particuliers à donner à notre modèle d’étude. Au cours de l’expérimentation, toutes les étapes de la procédure seront réalisées en limitant au maximum le caractère invasif. L’ensemble des geste technique est maitrisé au sein de notre équipe. Les souris seront placées dans un caisson de réveil à 25°C après anesthésie, et nous contrôlerons particulièrement les paramètres température, respiration et battement cardiaques pour mener au réveil et à la reprise d’activité normale des animaux. Les souris d’une même cage appartiendront au même groupe expérimental, afin d’homogénéiser le comportement social des animaux lié aux injections et instillations. Par ailleurs, les souris recevant les morceaux de bactéries P.a. seront dans la même cage afin d’éviter la contamination croisée lors du toilettage des souris. Nous raffinons cette partie de l’expérimentation pour atteindre efficacement nos objectifs. Notre étude se concentre sur un phénomène inflammatoire court, ce qui limite la durée d’exposition et la douleur liée à des phénomènes d’exposition répétée et long. Nous pourrons modéliser l’effet de l’inflammation par des méthodes de prédiction mathématique lorsque nous aurons les conclusions de notre étude. L’évaluation permanente de la souffrance des souris permettra de respecter le bien-être animal et d’appliquer la mise à mort à l’atteinte d’un point limite. Enfin, nous raffinons notre étude en observant deux phénomènes inflammatoire distincts dans le temps, sur un même individu sans en affecter la qualité des résultats. Nous étudions les effets du CIGB-552 sur la réponse inflammatoire en évaluant plusieurs paramètres sur un même individu, ce qui nous permet de comprendre les phénomènes inflammatoires et leurs liens.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour des raisons multiples. 1) Le modèle murin F508del est le plus utilisé dans la recherche sur la mucoviscidose et est très bien caractérisé. Ces souris sont fournies et recommandées aux chercheurs français par l’association de patients Vaincre la Mucoviscidose. 2) Les modèles murins peuvent facilement être exposées aux morceaux de bactéries de Pseudomonas aeruginosa. Cela permet le développement d’un modèle plus affiné pour répondre à notre objectif qui est d’évaluer les propriétés anti-inflammatoire du CIGB-552 dans un contexte d’inflammation pulmonaire proche de celui des patients mucoviscidose. Il est donc pertinent d’utiliser ce modèle. 3) La génétique de la souris compte parmi les meilleures connaissances de la communauté scientifique. Les souris utilisées pour notre procédure seront âgées d’au moins 8 semaines (adultes). Nous choisissons cet âge pour deux raisons expérimentales : 1) La trachée des souris adultes est plus grande. 2) les souris F508del ont une anomalie de la trachée. Le choix de l’âge adulte facilite la procédure d’exposition des poumons aux morceaux de bactéries (instillation oro-pharyngée).