Troubles respiratoires

Vingt-quatre injections dans l'abdomen, quarante gavages, deux instillations dans la gorge et une chirurgie de quinze minutes s'enchaînent sur deux mois pour chaque souris concernée. 1 214 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, dont une partie du seul fait qu'elles n'ont pas le génotype recherché. Le modèle repose sur une lignée génétiquement modifiée qui développe une fibrose de la peau et des poumons, à laquelle le projet ajoute des contaminants de l'environnement comme la silice, pour tester des molécules bloquant l'activation immunitaire. Les souris circulent entre trois établissements, et le porteur ne précise ni en quoi consiste l'acte chirurgical ni comment il arrive à 1 214 animaux.

Objectifs

La sclérodermie est une maladie rare du tissu soutenant les organes et des petites artères dont la principale caractéristique est un durcissement (fibrose) de la peau et des organes internes. Les atteintes pulmonaires constituent les complications potentiellement graves de la sclerodermie. Les artères allant du cœur aux poumons peuvent également être affectées ce qui entraîne une hypertension artérielle pulmonaire. La fibrose est la conséquence d’une réaction inflammatoire inadaptée, il existe en effet une activation anormale du système immunitaire. Les causes de cette maladie sont favorisées par des facteurs de l’environnement. La silice a été reconnue comme responsable du déclenchement de la maladie. Notre projet a pour but de bloquer, par une approche thérapeutique, les molécules engagées dans l’activation des cellules et d’explorer l'impact des contaminants environnementaux sur la gravité de la maladie.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront d'éclairer notre compréhension sur les mécanismes mis en jeu dans le développement de la maladie. Ces données nous permettront d'identifier de nouveaux candidats médicaments dans cette maladie capables de prévenir ou freiner le développement des atteintes potentiellement mortelles chez les patients.

Procédures

Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs : l’élevage et traitement dans l’établissement 1, l’imagerie dans l’établissement 2, la chirurgie dans l’établissement 3. Les animaux vigiles seront soumis à : 1) contention et injections intrapéritonéales tous les 2 jours pendant 2 mois, au total 24 injections d’une durée de 20 secondes 2) contention et gavage 5 jours consécutifs pendant 2 mois, au total 40 gavages d’une durée de 20 secondes, 3) injection intraveineuse caudale réalisée 2 fois d'une durée de 40 secondes. Les animaux anesthésiés seront soumis à : 1) Instillations oro-pharyngées réalisée 2 fois sous anesthésie générale en 2 minutes 2) prélèvement sanguin unique sous anesthésie générale en 30s 3) imagerie unique sous anesthésie générale en 5 minutes 4) acte chirurgical unique sous anesthésie générale en 15 minutes.

Impact sur les animaux

Le modèle va induire à partir de 14 semaines des potentielles atteintes cutanées. A partir de 17 semaines, une perte de poids et une mobilité réduite pourraient être observées. le gavage va induire une irritation potentielle et du stress, les injections intrapéritonéales et intraveineuses vont induire du stress et une douleur légère de courte durée. L’instillation oropharyngée va induire du stress. La chirurgie pourra induire une douleur. Les transports des souris entre les 3 sites utilisateurs vont induire du stress aux souris.

Devenir

Une partie des animaux seront mis à mort car sans génotype d'interêt. L'autre partie seront mis à mort pour prélèvement de tissus spécifiques : sang, poumon, rate, peau, afin de réaliser une évaluation approfondie de l’atteinte pulmonaire et de l’hypertension artérielle pulmonaire par différentes techniques.

Remplacement

Les cellules spécifiques du système immunitaire ont été traitées avec les différentes molécules thérapeutiques et ont montré leur intérêt dans des expérimentations in vitro. Néanmoins, ces expériences de cultures cellulaires ne permettent pas de recréer les interactions entre les différentes cellules de l’organisme. Ainsi l'expérimentation animale est un élément clé de ce projet.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux nécessaires, déterminé par une analyse de puissance statistique, sera inclus dans chaque groupe. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Nous nous efforcerons quotidiennement de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Les traitements débutent à un stade précoce avant l’apparition des premiers signes cliniques. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Une surveillance régulière et une application de points limites stricts et spécifiques au projet permettra de garantir le bien-être des animaux. Une grille de score sera utilisée et des actions réalisées en cas d’atteintes, L’instillation oropharyngée a été choisie car elle est moins invasive et moins douloureuse qu’une chirurgie, elle sera réalisée sous anesthésie générale. Des anesthétiques seront utilisés pour le prélèvement sanguin. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale. La chirurgie sera réalisée sur souris ayant reçu un analgésique, puis une anesthésie générale. Les souris seront transférées dans des cages de transport agrées, bords opaques, sans visibilité de l’extérieur.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les études de processus inflammatoire. Seule cette espèce possède une lignée transgénique permettant l’étude de la fibrose et de l'hypertension pulmonaire avec une séquence temporelle identique à celle de la maladie humaine. Les souris jeunes adultes seront mises en accouplement à 8 semaines. Les souris génétiquement modifiées et les souris contrôles seront âgées soit de 6 à 14 semaines pour l’administration de traitement.

Comprendre pourquoi une maladie génétique rare abîme surtout les vaisseaux du foie et des poumons: 620 souris vont être utilisées pour cela, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit trois à dix injections en état vigile, et environ un tiers subit une chirurgie avec perfusion menée sous anesthésie, sans réveil. Le porteur indique que les injections provoquent une douleur passagère, un risque d'infection et d'hématome, et que l'invalidation du gène étudié peut entraîner une perte de poids ou une baisse d'activité, l'état des nouveau-nés étant noté sur une grille qui suit la prise de nourriture, la croissance et la respiration. Les souris portent la modification génétique des patients, et le porteur juge "indispensable" d'en étudier à la fois de jeunes et des adultes.

Objectifs

Nous étudions une une maladie génétique héréditaire qui fragilise les vaisseaux sanguins et qui se manifeste, entre-autre, par des hémorragies, par l’élargissement des vaisseaux sanguins ainsi que des malformations entre les artères et les veines. Cette maladie peut conduire à des complications sévères touchant différents organes : atteinte du foie pouvant nécessiter une greffe, des poumons mais aussi du cerveau. Le diagnostic est souvent tardif car les symptômes se manifestent autour de 40 ans avec une grande variété de symptômes. Il s’agit d’une maladie génétique rare (1 cas sur 6000 naissances) dont la prise en charge et le contrôle des symptômes est difficile. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la maladie pour développer de nouvelles approches thérapeutiques. Différents acteurs sont impliqués dans le développement de cette maladie qui contrôlent qui contrôlent, ensemble, à différents niveaux, la bonne organisation du réseau vasculaire sanguin. Pour comprendre le rôle de chacun de ces acteurs, on utilise des modèles de souris ne produisant plus certains de ces acteurs et on étudie les conséquences de cette perte sur les vaisseaux sanguins. Cette étude pourra apporter un bénéfice certain dans le développement de traitements pour des patients atteints de cette maladie.

Bénéfices attendus

Notre étude vise à identifier les conséquences de la perte de facteurs connus pour contrôler l’organisation des vaisseaux sanguins principalement dans le foie et les poumons. Ces facteurs sont à l’origine d’une maladie vasculaire génétique. Les patients atteints de cette maladie ont des problèmes de malformations vasculaires hépatiques et pulmonaires. Aucun traitement à cette pathologie n’existe, nécessitant des recherches dans ce domaine.

Procédures

Des injections sur animaux vigiles sont effectuées sur l’ensemble des animaux, au nombre de 3 à 10 maximum et d’une durée inférieure à 30 secondes chacune. Une injection sur animaux anesthésiés est prévue sur moins d’un quart des animaux et d’une durée inférieure à 30 secondes. Une chirurgie avec perfusion est prévue sur environ un tiers des animaux, après administration d’analgésiques et d’anesthésiants, et d’une durée maximale de 10 minutes.

Impact sur les animaux

Les injections sur animaux vigiles induisent une douleur passagère (quelques minutes maximum), un risque d’infection et d’hématome, ainsi qu’un stress suite à l’immobilisation (maximum 30 secondes). Lorsqu’une chirurgie est prévue, elle est sans réveil et d’une durée inférieure à 10 minutes. Une légère perte de poids ou une diminution d’activité sont possibles à la suite de l’invalidation du gène étudié.

Devenir

Les protocoles nécessitent qu’à la fin de chaque procédure, tous les animaux soient euthanasiés, afin de récupérer les organes.

Remplacement

Le développement de cette pathologie fait intervenir plusieurs types cellulaires. Il n’est actuellement pas possible de recréer les interactions cellulaires entre tous ces acteurs in vitro. De plus, les cellules des vaisseaux sanguins ont un phénotype différent d’un tissu à l’autre. Cette différence est fondamentale mais non maintenue en culture. Afin de comprendre pourquoi cette pathologie touche particulièrement les vaisseaux du foie et du poumon, nous devons avoir recours à l’expérimentation animale, les modèles in vitro n’étant pas adéquats.

Réduction

Nous avons utilisé un logiciel statistique ainsi que les données de la littérature pour déterminer la taille des groupes nécessaires pour garantir la validité des résultats avec un nombre d’animaux minimal.

Raffinement

Le bien-être des animaux est évalué quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Dans chaque procédure induisant une douleur, des anesthésiants et des analgésiques sont utilisés. Suite à l’anesthésie (après environ 10 minutes), la perte totale de réactivité est testée en exerçant une pression sur les pattes avant d’effectuer tout geste technique invasif. Chez les nouveau-nés, un examen attentif permet d’évaluer les animaux sur les différents points de la grille de scoring mise en place qui évalue la prise de nourriture du nouveau-né, la croissance et la respiration. Chez l’adulte, un examen attentif permet d’évaluer les animaux sur les différents points de la grille de scoring mise en place qui évalue le changement de poids corporel, l’apparence physique et le comportement.

Choix des espèces

Les souris utilisées ont une modification génétique équivalente à celles des patients atteints de la maladie que nous étudions. Ce modèle murin est le seul existant actuellement permettant d’analyser le développement des malformations vasculaires de cette maladie. Les animaux seront soit des jeunes pour l’étude des vaisseaux en cours de développement, soit des adultes pour l’étude des vaisseaux stabilisés. Certains symptômes de la maladie sont de naissance, tandis que d’autres apparaissent à l’âge adulte. Il nous apparaît donc indispensable d’étudier les 2 âges.

Tués à l'issue d'une sixième intervention menée sans réveil, pour prélever la trachée greffée et de la muqueuse nasale, 20 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit six chirurgies sous anesthésie générale sur 56 jours, dont une de quatre à cinq heures, avec un prélèvement de 50 mL de sang à chaque anesthésie. Le porteur attend des douleurs cervicales de cinq à six jours, des troubles de la déglutition, un risque d'infection du site opératoire et, pour les animaux porteurs d'un stent, des difficultés respiratoires si le dispositif se déplace. Il décrit le remplacement trachéal chez l'humain comme une impasse thérapeutique et conclut que le recours à l'expérimentation animale est "indispensable" avant tout essai clinique.

Objectifs

En chirurgie des voies aériennes pédiatriques, les maladies nécessitant d’enlever une grande partie de la trachée sont des impasses thérapeutiques. En effet, une résection étendue nécessite un remplacement trachéal dont la technique chirurgicale n’est pas maitrisée à ce jour. De nombreuses techniques de remplacement ont été publiées chez l’adulte et l’enfant, avec des suites opératoires compliquées. Le remplacement trachéal reste exceptionnel. Néanmoins, la problématique clinique demeure. Notre équipe a fait le choix d’un projet de recherche de remplacement trachéal avec un procédé de décellularisation. L’objectif du projet est l’évaluation in vivo de ce remplacement de trachée par une étude comparative de la survie sans événement respiratoire et de l’aspect endoscopique après remplacement trachéal avec et sans stent trachéal.

Bénéfices attendus

A ce jour, il n’y a pas d’étude comparative de l’évolution clinique et endoscopique d’un modèle vivant de gros animal après un remplacement trachéal. Cette étude comparative permettra d’analyser d’une part les événements cliniques et endoscopiques survenant dans les suites à court et moyen termes, avec ou sans stent trachéal, et d’autre part les processus cellulaires, tissulaires et systémiques sous-jacents. Les différences attendues, dans le groupe avec stent par rapport au groupe sans stent, sont une diminution des événements respiratoires obstructifs par fragilisation de la trachée et diminution du calibre de la trachée. Les bénéfices à long terme seront la preuve de concept de la fiabilité du remplacement trachéal par décellularisation et la possibilité d’une étude du remplacement trachéal chez l’homme. De plus, des résultats positifs permettront également d’envisager la technique pour des indications différentes

Procédures

20 porcs auront six interventions chirurgicales sous anesthésie générale. La première intervention dure 60 minutes. La deuxième dure 240 à 300 minutes. Les troisième, quatrième, cinquième interventions durent 30 minutes. La sixième intervention dure 90 minutes et est sans réveil. Un prélèvement sanguin de 50 mL sera réalisé lors de chaque anesthésie générale. Les interventions auront lieu sur une période de 56 jours.

Impact sur les animaux

La première intervention peut être génératrice de stress et de douleur modérée dont la durée prévisible est de 3 à 4 jours. L’infection du site opératoire est une complication potentielle. Le prélèvement du muscle peut entrainer des douleurs modérées à la mobilisation de la tête. Il n’y pas de trouble de déglutition attendu. La perte de poids, sauf cause infectieuse, n’est pas attendue. La deuxième intervention peut être source de difficulté à respirer soit aiguë, soit progressive dans le temps. Il n’y a pas de risque hémorragique attendu. Des douleurs modérées sont attendues au site opératoire cervico-trachéal, d’une durée prévisible de 5-6 jours. Le prélèvement musculaire peut entraîner des douleurs modérées à la mobilisation de la tête. Le geste trachéal peut générer des troubles modérés de la déglutition. Les difficultés majeures d’alimentation ne sont pas attendues. Des douleurs cervicales légères à modérées sont attendues après les interventions 3, 4, et 5, d’une durée prévisible d’un à deux jours. Pour les animaux qui seront porteurs de stent trachéal, une mobilisation du stent peut également être cause de difficulté à respirer.

Devenir

Les 20 animaux seront mis à mort à l’issue de la sixième intervention pour prélèvement du complexe trachée native-matrice trachéale implantée, et pour prélèvement de muqueuse nasale.

Remplacement

Le remplacement n’est pas possible car l’étude porte sur le remplacement trachéal circonférentiel au sein d’un organisme vivant complexe (avec une anatomie proche de celle de l’homme). Il n’y a ni modèle in vitro ni modèle in silico. Par ailleurs, cette étude n’a pas été rapportée par une autre équipe à ce jour. Le recours à l'expérimentation animale est indispensable pour ce projet avant la réalisation d’essais cliniques chez l’homme.

Réduction

Nous avons déjà débuté les études chirurgicales d’implantation sterno-céphalique sur des porcs vivants. Ces chirurgies nous ont permis d’affiner et de perfectionner les techniques chirurgicales au préalable, et d’étudier la sécurité de cette intervention. Le nombre total d’animaux a été calculé́ en respectant les critères pour une analyse statistique non paramétrique par échantillons appariés. Les extrémités du remplacement seront conservées pour études histologiques, immunologiques et biomécaniques. Les prélèvements non utilisés seront cryopréservés ou fixés pour une possibilité d’étude rétrospective sans recourir à de nouvelles expérimentations animales. Enfin lors de la mise à mort, sur le principe de la mutualisation des prélèvements, d’autres tissus du porc pourront également être mis à disposition de nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, de manière globale, en expérimentation animale.

Raffinement

La méthodologie utilisée nous permettra d’assurer l’absence de souffrance inutile et le bien-être des animaux. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi). Le vétérinaire référent du Laboratoire passera une fois par semaine et à la demande des zootechniciens si besoin. Durant les périodes post-opératoires immédiates, le suivi des animaux est quotidien à l’aide d’une grille de suivi des points limites définis a priori (dyspnée, alimentation, perte de poids, douleur). Les animaux auront un traitement antalgique adapté. Afin d’éviter une surinfection de la zone de greffe, une antibioprophylaxie systématique sera administrée. En cas de signes externes de souffrance (perte de poids, prostration, fièvre) ou de difficulté aiguë à respiratoire sans traitement possible, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Parmi les différents modèles animaux envisageables (rongeurs, lapins, chèvre, mouton, porc), le porc a une trachée dont les caractéristiques anatomiques et biomécaniques se rapprochent le plus de celle de l’homme. De plus, des modèles de porcs sont déjà utilisés dans d’autres études de remplacement trachéal. Enfin, l’immunologie du cochon est bien connue. Cette connaissance établie facilitera notre analyse de la réaction inflammatoire potentielle sur le site de greffe. Animaux matures sexuellement pour limiter la croissance des tissus, plus intense chez les animaux en croissance (juvéniles). L'âge est relativement secondaire en revanche nous visons des animaux dont le poids est stabilisé entre 45 et 60 kg. Cette stabilité (relative) du poids est habituellement atteinte entre 12 et 18 mois.

Préparer les études réglementaires à venir est la fonction déclarée de ce projet cadre, qui prévoit jusqu'à cinquante études par espèce sur cinq ans, avec trente rats ou cinquante souris par étude. 2 500 souris et 1 500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 000 d'entre eux étant réutilisés ensuite dans d'autres projets, à des fins de formation ou pour constituer des bibliothèques de tissus, les autres étant tués. Un même animal peut subir une vingtaine d'interventions par semaine, dont douze prélèvements de sang, jusqu'à seize heures en cage métabolique et autant de mise à jeun. Le porteur ne nomme aucun des tests comportementaux employés, désignés par les seuls domaines explorés, locomotion, sociabilité, communication, sensoriel, et fonde le recours au rongeur sur une exigence réglementaire, la norme ICH M3(R2).

Objectifs

Ce projet ne comporte qu’une seule procédure, au sein de laquelle seront réalisées des études exploratoires multidisciplinaires dans un modèle rongeur. Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier, en recherchant/vérifiant les homologies avec l'Homme (par exemple vérification de la liaison du candidat médicament à sa cible pharmacologique dans cette espèce). Ces études peuvent permettre de comprendre grâce à des investigations perfectionnées les mécanismes de toxicité (toxicité rénale, hépatique, testiculaire, etc.) ou de carcinogénicité observée dans des études précédentes, d'établir la pertinence de certains effets observés chez le rongeur en comparaison avec l’Homme (ex : effets sur le système immunitaire, recherche de biomarqueurs, effets sur le comportement), avec pour but d'assurer la santé des patients humains (composés pharmaceutiques) et/ou la sécurité des personnes exposées (produits chimiques). Elles permettent également de sélectionner un composé possédant un rapport efficacité/toxicité optimal dans une espèce rongeur. Ces études sont aussi utilisées pour choisir une voie d'administration efficace et adaptée chez le rongeur, ou pour démontrer la validité de nouvelles techniques d'investigations. Il est prévu d'utiliser en moyenne 30 rats, ou 50 souris par étude, et de réaliser jusqu'à 50 études par espèce sur la durée du projet (5 ans).

Bénéfices attendus

Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier. De plus ces études permettent d’obtenir des données sur la réponse immunitaire, la toxicité éventuelle du composé, et aussi de bien choisir les doses dans les premières études règlementaires. Ces études permettent d’obtenir une meilleure connaissance du composé et du modèle animal, pour une meilleure conception/design des études réglementaires à suivre, que ce soit du point de vue du choix des doses, mais aussi dans le choix des voies d’administrations, du nombre d’animaux, etc. D’un point de vue éthique, une réduction du nombre d’animaux dans les études futures est potentiellement possible, et la douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables sera minimisée au maximum. L’utilisation de tests neurocomportementaux dans le cadre de ce projet permet une approche par des méthodes non invasives, dans le cadre des 3Rs (Raffinement).

Procédures

Les animaux sont traités par différentes voies (principalement orale mais aussi par injection intramusculaire, voies sous- cutanée ou intraveineuse, etc.) de façon journalière ou hebdomadaire avec le composé d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 1 heure maximum, dans le cas de perfusions intraveineuses. La durée des études varie entre 1 jour et 1 an. Des prélèvements sanguins (sur animal vigile placé dans un tube de contention ou sous anesthésie) et des recueils d’urines et /ou de feces sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/ contrainte pour l'animal). La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse en cage métabolique, n’excédant pas 16h est aussi possible. Une mise à jeun temporaire (en présence d’eau) peut être nécessaire (maximum 16h). Pour les tests de comportements, ils sont toujours faits après une administration unique par test, les tests sont non invasifs, avec manipulation et contraintes limitées des animaux et observation par suivi video (domaines explorés : locomotion, sociabilité, communication, sensoriel), d’une durée maximale d’une heure ; un seul test est réalisé par jour maximum et dans la limite de 3 dans la même semaine d’examen, sur une durée d’étude de 3 mois maximum. Dans tous les cas où l’hébergement individuel est requis , les animaux restent en contacts visuels, auditifs et olfactifs avec les autres animaux en hébergement individuel ou non.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent : - aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), - à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures (prélèvements, administration répétée, contention, mise à jeun éventuelle) ; - aux effets systémiques du composé testé (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire). - à l’hébergement individuel (rare) en cas de nécessité absolue

Devenir

Si l’état de santé des animaux le nécessite, l’avis et/ou l’intervention d’un vétérinaire seront requis, mais si la souffrance d'un animal est jugée trop importante et si aucun soin ne peut lui être apporté, il sera euthanasié selon une procédure éthiquement acceptable. Chaque fois que cela sera envisageable (ex : animaux contrôles), les animaux seront réutilisés dans d’autres projets, ou à des fins de formation, ou pour réaliser des bibliothèques de tissus.

Remplacement

Les explorations dans ce projet s'appuient parfois/souvent sur des études vitro préalables, mais ne peuvent pas être menées in vitro. Il n’existe pas toujours de méthode alternative in vitro pour mettre en évidence certains effets, en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant. Il n'existe pas de méthodes alternatives à l'heure actuelle qui permettent de remplacer les tests neurocomportementaux prévus dans ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude : un ou deux sexes, animaux satellites ou non pour analyses, nombre de temps intermédiaires pour des sacrifices ou analyses spécifiques, type de marqueurs mesurés (sensibilité des méthodes d’analyse), comparaison avec des composés de référence, etc En se basant sur des tests statistiques, comprenant a minima des tests de normalité, analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes, le nombre d’animaux utilisés sera le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude.

Raffinement

L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement (en fonction des signes attendus) afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel, consommation de nourriture et/ou d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et si besoin, au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés, etc.), que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des techniques de prélèvement sanguin (ex : via veine caudale, sublinguale, jugulaire, sous-mentonnière, mandibulaire, saphène, etc.) sont utilisées selon les bonnes pratiques vétérinaires et procédures internes validées, quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences à obtenir. Certains traitements sont réalisés sous anesthésie pour éviter le stress, le douleur ou l’inconfort, comme les administrations intramusculaires et intra-articulaire. Les rongeurs sont hébergés en groupe (il doit être évité le plus possible tout hébergement individuel d’individus). Cependant, certaines situations expérimentales exigent l’hébergement individuel et devront être dûment argumentées (comportements antisociaux comme chez la souris mâle, voie d’administration dermale, par exemple). Pour certains produits (exemple : CNS) une période d'habituation aux doses peut être effectuée sur les animaux avant la toute première administration.

Choix des espèces

Au-delà des aspects opérationnels (manipulation), le recours à une espèce rongeur dans le développement préclinique est une exigence réglementaire (ICH M3(R2), CPM/SWP1042). C’est aussi une espèce de laboratoire très largement utilisée en recherche biomédicale (littérature et connaissance très larges) qui permet le classement de produits chimiques dans de nombreuses classifications de dangers. Le rat est souvent utilisé car il reste d'une taille suffisante pour l'observation des lésions (la souris étant petite et plus sujette à variabilité ou parfois plus sensible à certaines classes de produits) ou car il est le seul modèle validé (exemple perturbateur endocrinien). La souris est parfois préférée au rat pour raison d’homologies avec l’homme (exemple paramètres immunologiques). Le choix de l’espèce/souche est dicté par différents facteurs dont notamment : résultats déjà existants, métabolisme vitro et/ou pharmacocinétique/pharmacodynamique, ou incompatibilité avec une autre espèce animale, par exemple. Les animaux ont en général 5 à 12 semaines d’âge en début de traitement pour assurer une administration pendant la phase de croissance. Dans certains modes d'administration, (voie dermale, souris) les animaux pourront être plus âgés de quelques semaines pour répondre à des conditions expérimentales particulières (ex : pour avoir un poids plus élevé, ou un âge en adéquation avec la maturité sexuelle) ou pour des raisons scientifiques (ex : maturité du système immunitaire). Les animaux ne doivent pas être gravides. Cet âge permet, selon les modes d’administration choisis, de réaliser des analyses avant le premier jour de traitement (prises de sang, pesées corporelles, ophtalmologie, etc.) ainsi que de prévoir une période d’acclimatation suffisante après réception des animaux.

Une ou deux injections dans l'abdomen, puis une goutte du même produit déposée dans le nez dix jours plus tard : 84 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes. L'inflammation pulmonaire ainsi déclenchée peut s'accompagner de difficultés respiratoires. Le projet cherche à comprendre comment certaines cellules immunitaires pénètrent dans les poumons, les applications thérapeutiques étant renvoyées au long terme. Sur la réduction, le porteur écrit avoir calculé le nombre d'animaux "au plus juste", sans donner ni méthode ni effectif par groupe.

Objectifs

Les pathologies inflammatoires pulmonaires ont pour caractéristique commune une inflammation pulmonaire qui perturbe les échanges gazeux lors de la respiration.Les cellules du système immunitaire participent à la maladie et pourraient constituer une cible thérapeutiques intéressante. Ce projet a pour but d'étudier la façon dont certaines de ces cellules immunitaires (les cellules lymphoïdes innées) pénètrent dans les poumons.

Bénéfices attendus

A court terme sur un plan fondamental, ce projet permettra de faire avancer les connaissances scientifiques sur la façon les cellules du système immunitaire infiltrent les poumons. Sur un plan pathologique, ce projet pourra déterminer comment l'infiltration des cellules lymphoïdes innées participe aux maladies inflammatoires respiratoires. A plus long terme, cela permettra de proposer des applications thérapeutiques ciblant les cellules immunitaires dans ces pathologies.

Procédures

Les souris subiront, selon la procédure, soit une soit deux injections dans l'abdomen des produits les sensibilisant. 10 jours après les souris devront absorber par le nez une goutte des mêmes produits.

Impact sur les animaux

L'injection dans l'abdomen peut causer une douleur légère de courte durée. Le développement de l'inflammation pulmonaire pourrait s’accompagner de difficultés respiratoires.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de la procédure. En effet, l'analyse du système immunitaire nécessite la mise à mort pour le prélèvement et l'analyse des organes.

Remplacement

Les résultats précédemment publié par la communauté scientifique nous a confirmé qu'il n’existe pas d'autre possibilités que l'animal nous permettant de reproduire les mécanismes biologiques complexes à l’œuvre dans la réponse immunitaire. Notre projet nécessite donc l’utilisation d’un modèle animal.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons calculé le nombre d'animaux nécessaire au plus juste afin de limiter le nombre de souris.

Raffinement

La méthodologie utilisée a été optimisée dans le laboratoire afin de limiter l'utilisation des animaux. Les souris feront l’objet d’une surveillance rapprochée afin de détecter tout stress et souffrance et d'y pallier. De la naissance à la mort, les animaux seront hébergés dans des conditions optimales incluant un enrichissement.

Choix des espèces

Il n’existe aucun modèle n'utilisant pas les animaux capable de reproduire la complexité de la réponse immunitaire, le recours à l’animal est donc nécessaire. La souris est couramment considérée comme le modèle le plus proche de l'humain pour l’étude du système immunitaire. L'utilisation de souris jeunes est indispensable puisque l’altération des poumons est un processus normal du vieillissement qui pourrait changer nos résultats.

Valider un composé candidat avant son passage en clinique suppose ici de déclencher une inflammation pulmonaire chez des souris dont le gène murin CRTH2 a été remplacé par son équivalent humain. 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse des poumons et du sang. Elles reçoivent jusqu'à quatre administrations intranasales d'une molécule inflammatoire et d'un allergène sous anesthésie, jusqu'à trois administrations du composé testé et quatre prélèvements de sang, avec une perte de poids possible et une modification passagère du comportement. Le porteur vise un traitement de l'asthme sévère tout en indiquant que le modèle employé n'induit pas d'asthme, et précise que les innovations issues du projet seront protégées par des demandes de brevet avant toute publication.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est de démontrer l'effet thérapeutique d'un nouveau composé spécifiquement dirigé contre les cellules lymphoïdes innées ILC2 pulmonaires responsables du déclenchement de l'allergie dans les poumons. Le résultat attendu est l'élimination de ces cellules pathogéniques et donc une guérison de l'allergie pulmonaire. Les maladies allergiques sont une priorité de santé publique car elles touchent des millions de personnes et leur prévalence devrait augmenter dans les années à venir. Aucun médicament permettant une guérison totale des patients n'existe aujourd'hui. Cette étude préclinique permettra de valider ce nouvel outil thérapeutique. Ce projet nécessite l'utilisation de souris génétiquement modifiées dans lesquelles le gène humain codant pour CRTH2 remplace le gène murin. Les souris seront soumises à l'administration d’une molécule inflammatoire et d’un allergène, par voie intranasale pour déclencher une inflammation pulmonaire. Remarque : Ce modèle n'induit pas d'asthme mais une accumulation de cellules immunitaires dans les poumons. Les souris suivront, ensuite un protocole d'administration du composé thérapeutique. Une analyse du sang et des poumons (post-mortem) seront réalisées pour évaluer l'évolution de la pathologie induite et déterminer l'effet thérapeutique du composé.

Bénéfices attendus

Le résultat attendu sera l’élimination des cellules pathogéniques et donc la guérison de l’allergie pulmonaire. Ce projet a donc un impact sociétal fort puisqu’il permet de répondre aux besoins médicaux non satisfaits dans le cadre des allergies sévères. En effet, ce trouble inflammatoire chronique des voies respiratoires affecte le bien-être des patients à tout âge, et les symptômes sont traités par des traitements palliatifs coûteux. Il n'existe actuellement aucun traitement curatif de cette maladie. Notre projet vise à fournir de nouveaux traitements pour l’asthme sévère, forme la plus grave de l’inflammation allergique pulmonaire, en éliminant spécifiquement les cellules appelées ILC2 (Cellules Lymphoïdes Innées de type 2), acteurs clés de la maladie, et à améliorer le bien-être des patients. Notre projet a aussi un impact économique puisqu’il permettrait de développer un nouveau traitement innovant pour l'asthme sévère. Les innovations potentielles qui pourraient émerger du projet seront protégées par des demandes de brevet avant tout rapport ou publication des résultats scientifiques.

Procédures

• Sur animal vigile : Administration du composé thérapeutique (maximum 3 fois, 15s) ; • Sur animal anesthésié (anesthésie gazeuse) : Administration de l’IL33 recombinant avec ou sans Thymic Stromal Lymphopoietin (maximum 4 fois, 30s) ; Administration du composé thérapeutique (maximum 3 fois, 15s) ; Prélèvement de sang (maximum 4 fois, 30s).

Impact sur les animaux

Stress et douleur légère lors de l’administration du composé. Possibilité d’effets indésirables liés au composé : Perte de poids transitoire, modification temporaire du comportement.

Devenir

Les animaux seront mis à mort soit lors de l’atteinte d’un point limite justifiant l’euthanasie soit en fin de procédure pour collecte et analyse d’organe.

Remplacement

Le projet vise à évaluer l'efficacité de composés à visée thérapeutique chez l’homme. Pour tester cet effet nous devons reproduire la pathologie humaine dans un modèle animal. La souris est de loin le modèle le plus fiable pour étudier les cellules du système immunitaire comme les ILC et les maladies influencées par ces mêmes cellules telles que l’allergie. L’utilisation de souris humanisées reste une des rares méthodes permettant la validation préclinique de médicaments en immunothérapie. Il n’y a donc pas d’alternative actuellement à l’utilisation des souris pour atteindre l’objectif de ce projet, qui est la guérison de l’inflammation pulmonaire avec des outils immunologiques. L’inflammation pulmonaire est une réponse immunitaire intégrant des systèmes de communications cellulaires complexes que l’on ne peut actuellement pas reproduire in silico, in vitro ou ex vivo. Il n’existe pas de méthodes in vitro (cultures cellulaires, organoïdes) pour étudier les maladies influencées par cellules ILC comme l’allergie, car elles ne permettent pas d’étudier une réponse immunitaire globale comme possible sur animal entier. Toutefois, dans le cadre de ce projet des études préliminaires à l’utilisation animale sont réalisées telles que les tests de cytotoxicité et d’affinité in vitro.

Réduction

Le plan de nos expériences sera construit de sorte à limiter le nombre de souris selon la loi des 3R par une approche conditionnelle (lot 1 testé, puis lot 2 testé selon le résultat obtenu sur le lot 1). Afin de réduire au minimum le nombre de souris et d'assurer la robustesse statistique, des groupes de 5 individus seront analysés à 4 conditions et à 2 temps donnés, l'expérience devra aussi être reproduite 2 fois.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux variables de 2 à 5 par cage, en fonction des impératifs liés à l’expérimentation avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où une souris doit être maintenue seule (agressivité, euthanasie de ses congénères) un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les souris seront hébergées dans des « zones protégées » dont les conditions d’environnement et d’hygiène sont contrôlées (barrière aseptique) pour éviter toute contamination et assurer ainsi le maintien de leur statut sanitaire. Le volume et la fréquence des prélèvements de sang suivront strictement les recommandations émises par la Structure chargée du Bien Être des Animaux (SBEA). En fonction du site de prélèvement, ils seront réalisés sous anesthésie gazeuse associée à un analgésique local. Certaines injections pourront être réalisées sous anesthésie gazeuse et la taille des aiguilles utilisées sera la plus petite possible afin de limiter la douleur. Des points limites précoces relatifs à l’apparence/comportement de l’animal ainsi qu’à la perte de poids seront suivis et évalués de manière précise, tout au long de l’étude, grâce à un tableau de scoring. Ils pourront justifier la mise en place d’enrichissement supplémentaire, d’une surveillance accrue ou l’euthanasie de l’animal. Le poids des animaux sera suivi au minimum 1 fois/semaine. Le composé injecté pourra induire une perte de poids des animaux plusieurs jours post-injection. Dans ce cas, la fréquence des pesées sera augmentée et de la nourriture humidifiée ou gélifiée pourra être ajoutée au fond de la cage, afin de faciliter son accessibilité. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement) sera suivi lors des mesures de poids (minimum 1 fois/semaine). Si un animal présente une lésion cutanée mineure, une pulvérisation de spray cicatrisant et antiseptique (jusqu’à 2 fois/jour jusqu’à guérison complète) pourra être réalisée.

Choix des espèces

Les expériences doivent être effectuées sur des souris, car elles disposent d’un système immunitaire qui est très similaire à celui de l'homme. La souris est, actuellement, le modèle le plus important et le plus fiable pour étudier les cellules du système immunitaire comme les ILC et les maladies influencées par ces mêmes cellules telles que l’allergie. L’utilisation de souris humanisées reste une des rares méthodes permettant la validation préclinique de composés en immunothérapie. La littérature sur les modèles allergiques se réfère exclusivement aux souris et aux rats. Il est donc nécessaire d'utiliser ce modèle approprié reflétant la pathologie humaine. Nous utiliserons une souris humanisée pour tester l’effet thérapeutique de nos composés à des fins cliniques. Les souris utilisées auront un âge compris entre 7 et 15 semaines lors de leur entrée dans l’étude, âge auquel le système immunitaire de l’animal est décrit comme mature.

Tous tués en fin de protocole pour prélever leur sang, leur liquide alvéolo-pulmonaire et leurs tissus pulmonaires, 1 680 cobayes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun inhale, vigile, des substances tussigènes pendant vingt à trente minutes pour déclencher des épisodes de toux, isolé dans une boîte en plexiglas. Le porteur décrit une bronchoconstriction, une gêne respiratoire, des épisodes de toux sévères et un écoulement de mucus par le museau, et prévoit en plus des chirurgies de pose de cathéter de vingt à trente minutes et des ponctions veineuses répétées sous anesthésie. Il écrit limiter le nombre d'animaux "tout en prenant en compte les besoins de nos clients", et fixe le sexe et le poids des cobayes "selon la demande client".

Objectifs

La toux est un réflexe primordial pour la protection des voies respiratoires et pulmonaires contre la production de substances internes (sécrétions) ou externes (inhalées). La toux chronique (durée dépassant les 8 semaines) affecte environs 10% des adultes de la population mondiale et représente un des symptômes les plus courant pour lequel les individus consultent les centres de soins primaires. La toux représente également la manifestation clinique dont les patients atteints de pathologies respiratoires se plaignent le plus. De nombreux facteurs de risques sont associés à la toux dont l’âges et le genre, les pathologies pulmonaires et extra-pulmonaires (e.g. infections respiratoires, asthme, reflux gastroœsophagiens…), les facteurs environnementaux (e.g. polluants), les produits chimiques irritants ou les allergènes. Le plus souvent, les patients souffrant de toux chroniques présentent également une hypersensibilisation des voies nerveuses impliquées dans le réflexe de toux amplifiant la fréquence et le nombres d’épisodes de toux. Malgré l’existence de nombreux traitements permettant de lutter contre ces épisodes de toux, l’efficacité de ces derniers peut être limitée et présentent un effet interindividuel très variable. De plus, chez 40% des patients, les mécanismes physiopathologiques à l’origines de la toux chronique ne sont pas toujours bien identifiés diminuant ainsi l’efficacité de la prise en charge du patient avec un traitement adapté. Le projet a donc pour objectif de tester l’efficacité de candidats médicaments sur un modèle de toux in vivo chez le cobaye vigile. De plus, il est essentiel de pouvoir connaitre la dose efficace d’un candidat médicament en déterminant sa concentration permettant d’assurer son effet thérapeutique optimal tout en minimisant le risque d’effets indésirables. Pour cela, il pourra être établi une analyse du devenir du candidat médicament dans l'organisme après son administration, et testé en parallèle de l’étude de son efficacité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’apporter des arguments scientifiques sur l’efficacité de nouveaux candidats médicaments chez le cobaye soumis à l’inhalation d’agent irritants des voies respiratoires. Les effets de ces molécules pourront être évalués sur une analyse solide de la réponse comportementale des épisodes de toux mais pourront également être confortés par une analyse approfondie de la réponse moléculaire et/ou immunohistochimique. En parallèle, l’établissement du profil pharmacocinétique des candidats médicaments pourra permettre de déterminer leur dose thérapeutique optimale pour, à terme, proposer une posologie adaptée de la molécule d’intérêt.

Procédures

Les animaux seront soumis à l'inhalation de substances tussigènes afin d'induire des épisodes de toux. La durée de cette étape est d'environ 20 à 30 min et s'effectue sur animaux vigiles. Ces derniers seront également traités avec des candidats médicaments ou des analgésiques par voie intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée ou orale de manière aigue ou répétée (pour les analgésiques si besoin). Ces types d'administrations prennent 1 minute pour être effectuées. Les cobayes pourront également être traités avec les candidats médicaments par voie intraveineuse directement dans la veine jugulaire lorsqu'une seule administration sera nécessaire. Cette procédure se déroule sous anesthésie gazeuse et dure environs 10 min. Les administrations intraveineuses peuvent également être effectuées à travers un cathéter veineux sur animaux vigiles pour réaliser des traitements répétés et l'acte prend 1 minute. Il sera cependant nécessaire de réaliser une chirurgie unique sous anesthésie gazeuse pour implanter le cathérer dont la durée de l'intervention est de 20 à 30 min. Des prélèvements de sang seront réalisés, impliquant parfois des ponctions directes dans les vaisseaux veineux à l’aide d’une aiguille. Ces prélèvements pourront nécessiter également d’anesthésier les animaux et ce de façon répétée pour une durée de 10 min par prélèvement.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration du candidat médicament du sponsor. Un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul. De plus, pour l’analyse de la toux, l’animal doit être placé et isolé dans une boite en plexiglass pendant plusieurs minutes ce qui peut engendrer de l’anxiété. L’induction des épisodes de toux via l’inhalation de substances tussigènes est une source d’inconfort pour le cobaye car ce sont des agents irritants pour les voies respiratoires et peuvent également causer une bronchoconstriction entrainant une gêne respiratoire, des épisodes de toux sévères et un écoulement de muscus par le museau. Pour les administrations de composés par voie sous-cutanée, intrapéritonéale ou orale, les animaux seront maintenus en contention, ce qui peut générer du stress. Une ou plusieurs administration par voie orale des composés pourront être réalisées, ou des injections de composés impliquant l’introduction d’une aiguille pouvant être source de douleur. Certaines modalités d’administration, telles que les injections intraveineuses directement dans les vaisseaux veineux nécessiteront d’avoir recours à l’anesthésie des animaux tout comme lors des chirurgies d’implantation de cathéters. Cette dernière modalité peut entrainer un risque d’infection et être l’origine de douleur et de perte de poids en post-opératoire. Des prélèvements de sang seront réalisés, impliquant parfois des ponctions directes dans les vaisseaux à l’aide d’une aiguille. Ces prélèvements pourront nécessiter également d’anesthésier les animaux et ce de façon répétée, générant potentiellement du stress et de l’inconfort.

Devenir

A la fin du protocole, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir collecter le sang, le liquide alvéo-pulmonaire, les tissus pulmonaires et les voies aériennes pour quantifier les effets du candidat médicament sur l’aspect moléculaire et/ou immunohistochimique. De même, certains animaux seront mis à mort pour les analyses de pharmacocinétique permettant de quantifier la biodistribution par organes du candidat médicament étudié.

Remplacement

L’objectif principal du projet étant de tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments sur les caractéristiques comportementales de la toux (i.e., fréquence et/ou intensité des épisodes de toux), il n’est pas possible de substituer les cobayes par des modèles in vitro. Par ailleurs, si des méthodes d’extrapolation in vitro-in vivo sont de plus en plus utilisées, comme la modélisation pharmacocinétique à fondement physiologique, ces approches présentent malgré tout encore certaines limites, notamment la difficulté à paramétrer certains processus mis en jeu en particulier pour les phases d’absorption et d’excrétion. Ces approches ne constituent qu’une aide à la caractérisation des interactions pharmacocinétiques, et l’évaluation in vivo du devenir d’un composé dans un organisme vivant reste incontournable.

Réduction

Toutes les mesures seront prises pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet tout en prenant en compte les besoins de nos clients (nombre de voies d’administrations et de doses à tester et nécessité de collecter les organes en fin de protocole). Selon l’objectif des projets, chaque animal pourra être son propre contrôle au cours des inductions des épisode de toux. Un même animal inclus dans un des groupes d’efficacité subira les tests d’induction de la toux, les prélèvements sanguins et la collectes des organes permettant de faire un suivi longitudinal. Le nombre d'animaux choisi par groupe doit permettre de mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre le groupe contrôle négatif et le(s) groupe(s) traité(s) avec un composé de référence. Par ailleurs, suite à la phase de pré-sélection des animaux répondeurs ou non-répondeurs aux agents tussigènes, les animaux non-répondeurs pourront être utilisés dans les groupes d’analyse de pharmacocinétique du même projet. Pour ces analyses pharmacocinétiques, chaque animal pourra être son propre contrôle en fonction du volumes de sang nécessaire (

Raffinement

Les expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement grâce à une grille de score. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Les animaux sont familiarisés avec l'ensemble des outils de mesures, les nouveaux environnements ainsi qu’aux expérimentateurs. Avant de rentrer dans la salle d’hébergement, il est demandé aux expérimentateurs de toquer 2 fois à la porte pour diminuer le stress lié à la surprise. Pour l'induction de la toux par inhalation d’agents tussigènes : - les inductions sont réalisées dans une pièce attenante aux pièces d’hébergement. - les animaux sont habitués à être placés dans la boite de plexiglass. - l’induction de la toux se fait sur animaux vigiles évitant l’expositions à des agents anesthésiques et aux méthodes d’administrations de ces agents qui peuvent être source de stress. - pour limiter la bronchoconstriction, un bronchodilatateur est administré à la fin après la nébulisation facilitant la ventilation. Les actes pouvant générer de la douleur telles que les implantations de cathéter et les administration/prélèvements dans la veine jugulaire nécessitant une incision cutanée seront réalisés sous anesthésie chimique ou gazeuse et analgésie pré-opératoire et/ou locale et/ou post-opératoire selon le score sur la grille d’observation. Les animaux seront également habitués à la manipulation et à la contention. Les prélèvements sanguins et les volumes d’administration seront réalisés selon les recommandations éthiques. Après chaque prélèvement, une injection de sérum physiologique sera réalisée (volume équivalent) pour compenser la perte de volémie. Lorsque qu’une chirurgie sera nécessaire pour l’implantation de cathéter, elle sera réalisée en conditions aseptiques, et les animaux bénéficieront d’une surveillance accrue (min 2x/jour) en phase post-opératoire. De la nourriture et/ou des gels enrichis seront déposés dans la cage limiter la perte de poids des animaux après la chirurgie.

Choix des espèces

L’espèce animale la plus appropriée pour évaluer l’efficacité des candidats médicaments antitussifs et la physiologie du réflexe de toux est le cobaye. Cette espèce exprime une réaction comportementale proche de celle de l’Homme en présence de 3 agent tussigènes communément utilisés pour induire des épisodes de toux chez l’Homme. En effet, les cobayes sont capables de tousser contrairement aux rats et aux souris ne permettant pas, chez ces espèces, de modéliser la toux d’un point de vue comportemental. De plus, les mécanismes nerveux sous-tendant le réflexe de la toux impliquent les fibres sensorielles composant le nerf vague, dont la neurophysiologie et l’aspect histologique sont très similaires à ceux de l’Hommes. Suite à l’activation de ces fibres, l’intégration des influx nerveux au niveau supraspinal se fait dans le bulbe rachidien dans le noyau du tractus solitaire tout comme chez l’Homme. Selon la demande client, les animaux utilisés dans le cadre de ces études seront des cobayes : -Femelles : > 200g correspondant à un âge > 4-8 semaines -Mâles : > 350g correspondant à un âge > 9-10 semaines Ces âges correspondent, en fonction du genre, à l’atteinte de la maturité sexuelle indiquant un ralentissement du développement, limitant ainsi la variabilité des résultats.