Troubles musculosquelettiques

80 rats Wistar âgés de 18 mois vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent chaque jour une solution bactérienne et subissent quinze prélèvements de sang sur animal vigile, une restriction alimentaire entraînant environ 10 % de perte de poids et une mise en cage individuelle. Le porteur teste un probiotique censé limiter la fonte musculaire, présenté comme un futur produit à destination des séniors. Il affirme qu'évaluer l'effet sur le muscle rend "nécessaire" le passage par l'animal.

Objectifs

Le projet vise à valider in vivo la capacité d'un probiotique (Limosilactobacillus muscosae seul ou en association avec L. casei) à limiter la fonte musculaire chez des rats dénutris, animaux modèles du syndrome de fragilité de l'Homme.

Bénéfices attendus

Le projet participera au développement d'un nouveau probiotique à destination des séniors favorisant la sensibilité à l'insuline et améliorant la régulation de la glycémie. Cet effet santé du probiotique permettra de limiter la fonte musculaire liée à l'âge (sarcopénie) et donc de limiter la dépendance des personnes âgées fragiles.

Procédures

Les animaux recevront une solution bactérienne quotidiennement et subiront des mesures de composition corporelle, de mesure de leur métabolisme protéique et l'analyse de leur sensibilité à l'insuline. ceci impliquera au total 15 prélèvements de sang sur animaux vigiles répartis sur la durée du projet de 1 mois.

Impact sur les animaux

Perte de poids (environ 10%) associée à une restriction alimentaire. Stress associé à une mise en cage individuelle.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure, des prélèvements d'organes devant être effectués pour analyses.

Remplacement

Ce projet vise à valider cette propriété in vivo et à tester son efficacité sur la masse musculaire. L'action d'un probiotique est à la fois directe (sur les cellules intestinales) mais aussi indirecte (sur d'autres organes via des médiateurs). Pour tester l'effet de ce probiotique sur le métabolisme musculaire, il est donc nécessaire de passer par une expérimentation sur animaux modèles.

Réduction

Pour ce projet 80 animaux seront utilisés. Ils seront répartis en 5 groupes de 16 animaux. Le nombre d'animaux a été limité au nombre minimum nous permettant d'avoir des résultats significativement différents entre les groupes, ce nombre a été déterminé par test statistique et grâce à l'expérience du laboratoire sur l'utilisation de ce modèle animal.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d'un enrichissement de leur milieu de vie et seront observés quotidiennement, y compris le week-end et les jours fériés, par des animaliers expérimentés. En cas d’apparition d’un point limite l’animalier alertera les responsables de l’étude. Les animaliers et les responsables de l’étude effectueront une observation plus poussée de l’animal et renseigneront le tableau d’observation des points limites. Si 3 points limites notables ou 1 point limite grave sont observés, nous utiliserons l’arbre décisionnel afin de décider si l’animal sera soigné ou euthanasié.

Choix des espèces

Les animaux utilisés seront des rats Wistar âgés de 18 mois. Notre laboratoire possède une forte expérience d'utilisation du rat âgé en tant que modèle de la sarcopénie humaine. Le rat est un animal de choix pour les études sur le vieillissement, son espérance de vie étant de 24 mois.

36 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs d'une forme de myopathie de Duchenne, ils reçoivent des injections intramusculaires sous anesthésie et une mesure de force musculaire, avant d'être tués pour analyses histologiques. Le porteur décrit une dystrophie spontanée avec perte de masse et comportement de "freezing", et présente le rat comme un modèle plus fidèle que la souris. Il situe à long terme l'usage de la protéine testée chez les enfants atteints, en complément de la thérapie génique.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie génétique rare qui touche un garçon sur 3500 à la naissance. Le pronostic de la DMD est très sombre et les jeunes patients meurent prématurément d'insuffisance cardiorespiratoire, en raison de l'absence de la protéine dystrophine dans les muscles striés. Cette maladie entraîne une dégénérescence de l’ensemble des muscles (squelettique, cardiaque ou lisse). Il n’existe pas à ce jour de traitement pour la DMD mais des stratégies de thérapie génique prometteuses sont en cours d’évaluation dans des essais cliniques. Néanmoins, nous savons aujourd’hui que la restauration de la dystrophine devra s’accompagner d’une stratégie permettant un meilleur maintien de l’intégrité musculaire qui favoriserait la croissance musculaire. En effet, chez les patients DMD, les fibres dépourvues de dystrophine se cassent et dégénèrent. La force musculaire diminue et le tissu musculaire laisse la place aux tissus conjonctif et graisseux. Les stratégies thérapeutiques utilisant les vecteurs viraux sont confrontées à des limites comme leur disparition consécutive aux cycles répétés de nécrose-régénération des fibres musculaires dystrophiques. La protéine-médicament testée dans ce projet a été décrite comme étant un acteur clé du maintien de la masse musculaire en inhibant la dégradation et en stimulant la synthèse protéique. Nous avons donc comme objectif d’évaluer le supposé bénéfice de sa supplémentation dans le muscle dystrophique de rats modèles de la DMD, avec pour objectif de renforcer le dossier préclinique préparatoire au montage d’un essai clinique chez les enfants attteints de DMD.

Bénéfices attendus

Nos laboratoires cherchent à identifier des traitements combinés pour optimiser la restauration fonctionnelle des muscles dystrophiques. La protéine testée joue un rôle dans le maintien de la masse musculaire en maintenant plus longtemps actif le processus de régénération des fibres musculaires. A court terme, nous attendons chez les rats DMD traités un bénéfice avec une amélioration du phénotype histologique et fonctionnel du muscle dystrophique traité. A moyen terme, nous envisageons en cas de succès de combiner l’utilisation de cette protéine avec une restauration de dystrophine, induite par un vecteur viral codant la microdystrophine, une forme raccourcie de la dystrophine utilisée aujourd’hui dans des essais cliniques. A long terme, nous projetons d’utiliser cette protéine comme traitement utilisable chez le patient DMD en complément des outils de thérapie génique en cours de développement.

Procédures

Les animaux anesthésiés seront injectés par voie intramusculaire une fois dans le muscle de la patte gauche puis une fois dans celui de la patte droite. Cette intervention est rapide (moins de 10 minutes). La durée d'un enregistrement de la force musculaire est de 90 minutes, anesthésie comprise (une injection sous cutanée avec une aiguille hypodermique très fine). Il n'y a pas de chirurgie prévue. Les animaux seront également prélevés une fois pour récupérer un millilitre de sang, en vue de quantifier des biomarqueurs de la maladie. Ce prélèvement sera réalisé pendant l’anesthésie de la mesure de force, le prélèvement lui-même dure moins de 30 secondes). La séquence d'enregistrement de la force musculaire dure au total 1 heure (jusqu'au réveil).

Impact sur les animaux

Les rats DMD développent spontanément une dystrophie musculaire caractérisée par une perte significative et progressive de masse corporelle. On assiste par ailleurs à un comportement de "freezing" chez les animaux, caractérisé par une absence de mouvements chez les animaux qui semblent se reposer plus que leurs congénères non atteints. Ce "freezing" survient par exemple lorsqu'on prend un animal dans les mains et qu'on le remet dans sa cage. Nous connaissons bien cette évolution de la maladie et ces comportements parfois atypiques, ce qui nous permet de les repérer immédiatement quand ils surviennent. Cela garantit une surveillance très rigoureuse et rapprochée des animaux. Une zootechnicienne est dédiée à cette surveillance. Par expérience des derniers mois, nous n'avons pas à intervenir sur des animaux avant l'âge de 6 mois. L’injection intramusculaire pouvant être douloureuse, des analgésiques seront utilisés avant et poursuivis après l’intervention.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires nécessaires à l'évaluation complète du produit testé.

Remplacement

Le but de notre projet est l’identification d’une possible stratégie thérapeutique pour le maintien de l’intégrité musculaire dans le muscle dystrophique. Nous avons préalablement contrôlé que les voies de la protéine testée étaient bien activées en utilisant in vitro des cellules stimulées avec cette protéine et nous avons réalisé les premières expériences in vivo chez un modèle de souris de la DMD. Nous souhaitons aujourd’hui, tester son efficacité sur un modèle plus sévère et plus proche de l'affection humaine. L’utilisation du rat DMD nous parait donc indispensable pour évaluer un éventuel bénéfice de cette protéine sur des processus tels que la régénération et le maintien de la masse musculaire pendant plusieurs semaines au cours de la phase active du processus pathologique.

Réduction

Nous avons accumulé beaucoup d'expérience sur les lots de rats DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Pour certaines de ces études, nous sommes en train de rédiger les conclusions et avons déjà réalisé les analyses statistiques. Il apparaît que pour chacun des groupes, traiter 6 rats (2 muscles traités indépendamment par rat) permet d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution fatale de la maladie. Pour réaliser cette estimation, nous utilisons des tests statistiques en prenant en compte des paramètres tels que la différence à mettre en évidence entre les différents lots, la puissance et le risque du test. Par ailleurs, en raison de ce nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wildtype, WT) et DMD traités avec un placebo, nous avons accumulé des données nombreuses qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages. Il est donc possible de réduire les cohortes de ces animaux. Au bilan, chacun des groupes a pu être réduit à 6 animaux. Pour l’analyse des résultats, nous utiliserons des logiciels qui permettent de comparer deux groupes ou plusieurs groupes entre eux.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage à l'âge d'un mois. Puis nous réduisons ce nombre progressivement jusqu'à atteindre un maximum de 3 rats par cage. L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux sont habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (maladie irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux par l'utilisation d'agents anesthésiques et analgésiques.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle historique de la souris, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle du chien dystrophique. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format).

4 725 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une forme de la maladie des os de verre, elles présentent des fractures spontanées et subissent biopsies de l'oreille, prélèvements sanguins, injections répétées et jusqu'à dix scanners sous anesthésie, pour tester une biothérapie. Le porteur décrit les fractures comme seul symptôme et affirme n'attendre aucun effet indésirable des gestes techniques. Il conclut que le recours à des souris malades reste "inévitable" et renvoie l'effet pour les patients à un "bénéfice probable à long terme".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer un traitement pour la maladie des os de verre. En effet, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif pour cette maladie. Les seules approches thérapeutiques actuellement utilisées sont des approches palliatives et seulement pour certains symptômes de la maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet va nous permettre de faire la preuve de concept chez l’animal d’une approche thérapeutique pour la maladie des os de verres. Il s’agit d’une maladie rare de fragilité osseuse responsable de fractures spontanées pour laquelle à l’heure actuelle il n’existe aucune approche thérapeutique. Dans le cas où cette approche fonctionnerait cela nous permettrait de continuer le développement dans le but d’apporter un jour un traitement efficace pour les patients. Il s’agit donc d’un bénéfice probable à long terme pour ces patients.

Procédures

Biopsie d'oreille sur animal vigile 2-3mm durée 10 sec Prélèvements de sang 10-20 sec, 1 par semaine maximum sur animal vigile ou anesthésié Injection IntraPéritonéale (animal vigile) et IntraVeineuse (animal anesthésié) 10-30 sec, 1 à 3 par semaines maximum, Scanner avec anesthésie gazeuse d'une durée maximum de 10 min par scanner et au maximum 10 scanners dans la vie de l'animal.

Impact sur les animaux

Le modèle de souris utilisé est un modèle de la maladie des os de verres qui présentent les memes symtomes que les patients soit des fractures spontanées. Cependant, les animaux ne présentent pas de problèmes pour se mouvoir ou s’alimenter aux âges où nous les utiliserons. Une attention toute particulière est apportée à ces animaux qui sont surveillés quotidiennement dès leur naissance. En ce qui concerne les gestes techniques réalisés sur ces animaux, il n'y a pas d'effets indésirables prévues. Il s’agit d’injection et de prélèvements réalisés par des personnes compétentes et formées. Les tampons qui sont prévus d’être utilisés sont à pH physiologique et peu visqueux.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés dans le but de prélever des organes pour réaliser une caractérisation histologique des tissus.

Remplacement

Globalement, la construction des molécules et l’optimisation de ces dernieres se sont faites et continuent à se faire en se basant sur des publications scientifiques, et sur un certain nombre de tests in vitro réalisés. Seules les molécules efficaces in vitro vont être testées in vivo. Une importante recherche bibliographique a été effectuée afin d’identifier les cellules atteintes lors de la pathologie et ainsi développer un traitement le plus ciblé possible. Cependant l’utilisation de souris malades est inévitable afin de déterminer le bénéfice thérapeutique ainsi que d’évaluer les potentiels effets toxiques du traitement.

Réduction

Le juste nombre d’animaux a été calculé de manière à utiliser le nombre minimum d’animaux par lot, tout en produisant des résultats statistiquement significatifs et robustes. De manière à répondre aux exigences de réduction, nous allons utiliser des groupes contrôles en commun chaque fois que cela est possible. Globalement, un ensemble de 10-12 animaux par groupe sera suffisant pour valider l’efficacité d’un traitement. Ce modèle étant un nouveau modèle de souris, il est possible que ce nombre soit amené à changer au cours des études et des différents résultats obtenus.

Raffinement

Chaque cage contient une tige en papier, un igloo et une buchette de peuplier afin de satisfaire l’instinct naturel des souris à ronger et éviter les problèmes dentaires. Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur et les visites régulières des expérimentateurs (à minima trois fois par semaine) nous permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. Les procédures mises en place dans ce projet ne nécessitent aucune analgésie particulière. En cas d'apparition d'une souffrance ou toxicité inattendue, les animaux seront exclus de l'étude et euthanasiés dans les 24 heures avec l’accord du directeur d’étude.

Choix des espèces

Ce projet ne peut pas se faire sans modèle animal car avant de pouvoir envisager un traitement, et de commencer une étude clinique sur les patients souffrant d’Ostéogénèse imparfaite, il est nécessaire de démontrer que les molécules choisies ont l'effet attendu au niveau du modèle animal de la maladie, et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs. Ce modèle de souris est pertinent car il est connu pour mimer les principales caractéristiques de la pathologie. Les animaux seront utilisés de la naissance jusqu’à environ 52 semaines maximum afin de pouvoir caractériser chacune des étapes du développement de la pathologie.

2 400 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats subissent l'ablation des cinq sixièmes de leurs reins en deux opérations chirurgicales, puis une exsanguination terminale, tandis que les souris reçoivent une injection de glycérol provoquant une destruction musculaire avant d'être décapitées sous sédation. Le porteur reconnaît une douleur modérée et continue liée à la chirurgie rénale. Il teste des molécules contre la maladie rénale chronique et présente les modèles in vivo comme "les plus adaptés et les plus prédictifs", écartant les cultures cellulaires limitées à un seul type de cellule.

Objectifs

La maladie rénale chronique est une détérioration lente et progressive de la capacité des reins à filtrer les déchets métaboliques du sang. Les causes majeures sont le diabète et l’hypertension artérielle. Les conséquences sont une acidification du sang, le développement d’une anémie, l’endommagement des nerfs, une détérioration du tissu osseux et un risque augmenté d’athérosclérose. De plus, une atteinte rénale aiguë peut devenir une maladie rénale chronique si la fonction rénale n’est pas rétablie après le traitement et dure plus de trois mois. Les traitements actuels visent à limiter les liquides, le sodium et le potassium dans l’alimentation ; la prise de médicaments destinés au traitement d’autres pathologies (telles que le diabète, l’hypertension artérielle, l’anémie et les déséquilibres électrolytiques) et, le cas échéant, à faire appel à la dialyse ou à une greffe de rein. Il existe un ensemble de données concordantes révélant que l’existence d’une atrophie continue et la diminution de la masse musculaire constituent des facteurs de risque indépendants de la mortalité chez les patients ayant une maladie rénale chronique. La lutte contre l’atrophie musculaire apparait donc comme une composante majeure pour améliorer le pronostic des patients ayant une altération de la fonction rénale. L’objet de ce projet est d’évaluer chez l’animal le potentiel de nouvelles molécules sur les fonctions musculaires et rénales, molécules dont on a démontré préalablement des effets bénéfiques sur le muscle squelettique in vitro. Deux modèles animaux ont été retenus ; le premier est un modèle aigu comparable à la rhabdomyolyse chez l’homme et le deuxième un modèle chronique avec une forte altération métabolique. • Quel est l’impact du muscle squelettique sur le bon fonctionnement du rein ? • Des molécules actives sur la fonction musculaire peuvent-elles préserver la fonction rénale ? • L’ensemble des données collectées permettront-elles de développer une nouvelle stratégie thérapeutique dans les maladies rénales afin de retarder et/ou diminuer le nombre de personnes dialysées ?

Bénéfices attendus

- Amélioration de la fonction musculaire - Amélioration de la fonction rénale - Retardement du moment de dialyse - Amélioration de la fonction d’autres organes. Pour l’homme, les molécules actives permettraient d’envisager une nouvelle stratégie thérapeutique pour les maladies rénales. La protection du muscle et du rein permettrait d’envisager un retardement du moment de la dialyse et de meilleures conditions de vie.

Procédures

Sur rats néphrectomisés, la procédure chirurgicale consiste à réaliser une résection au 5/6ème des 2 reins du rat. Elle est réalisée en 2 fois à une semaine d'intervalle; le rein droit est enlevé au cours de la 1ère opération, les 2/3 du rein gauche au cours de la 2nde opération. Chacune des opérations réalisées sous anesthésie a une durée moyenne par animal de 30 minutes. 2 prélèvements de sang de 500µl seront réalisés à l'extrémité caudale sur animaux vigiles (extrémité caudale après anesthésie locale) 2 semaines avant et 6 semaines après l'opération chirurgicale. Chaque prélèvement sanguin a une durée de 2 à 3 minutes. Une exsanguination terminale des rats et un prélèvement d'organes d'intérêt sont réalisés 10 à 12 semaines suivant l'opération après sédation à l'isoflurane 4%. Pour le modèle de souris présentant une atteinte rénale aigue, l'animal reçoit une injection (10 secondes) intramusculaire unique de glycérol sous anesthésie. 48 ou 72h après, chaque souris sera décapitée après sédation à l'isoflurane 4% pour permettre le recueil du sang terminal et des organes.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales entrainent une douleur modérée et continue. La chirurgie sous anesthésie générale et l'analgésie appropriée permettent d'atténuer cette douleur, la souffrance postopératoire et le trouble de l'état général. Aucune perte pondérale significative n'est attendue dans le modèle 5/6Nx ni aucun effet sur les paramètres comportementaux (activité motrice, anxiété, exploration, altération de la mémoire) malgré une forte variabilité et une fluctuation dans le temps de ces paramètres. Les différents travaux déjà réalisés sur ce modèle ne montre pas de lien entre l’aggravation des fonctions rénales et une baisse de l’activité motrice, de la cognition ou des émotions.

Devenir

Tous les rats ayant subi la procédure expérimentale de néphrectomie seront traités avec les molécules d'intérêt pendant 12 semaines minimum puis euthanasiés (prélèvement de sang + organes) Toutes les souris utilisée dans la procédure d'atteinte rénale aigue seront euthansiées au plus tard 72h après l'induction de la rhabdomyolyse (prélèvement de sang + organes)

Remplacement

Pour tester les molécules dans le cadre des pathologies rénales, les modèles vivo sont les plus adaptés et les plus prédictifs. En effet, le rein est un organe dont la structure tri-dimensionnelle est importante pour sa fonction de filtration et formé de plusieurs types cellulaires (podocytes, cellules mésangiales, cellules épithéliales). Les modèles in vitro sont restreints à l’observation d’un seul type cellulaire, sans prise en compte des interactions intercellulaires et environnementales caractéristiques d’un tissu dans son milieu d'origine. Il existe des organoïdes, cependant les structures obtenues ne sont pas organisées comme dans un rein et l’absence de l’uretère dans ces modèles empêche l’évaluation de l’ensemble des fonctions rénales. De plus, le but de ce projet est d’évaluer l’influence des muscles sur cette fonction rénale et les nouvelles thérapies envisagées sont de traiter le muscle. Ce but ne peut être atteint qu'en utilisant un modèle animal qui présente cette intégrité physique.

Réduction

Modèle de pathologie aigue (rhabdomyolyse) Une à deux études pilotes seront réalisées pour confirmer l’obtention du modèle avec un taux de réussite estimé proche de 100%. Il est donc envisagé d’injecter 10 souris par lot sur les 2 premières cohortes pour lesquelles les paramètres d’atteinte rénale et musculaire seront mesurés afin d’évaluer la robustesse du modèle obtenu (48 à 72h après induction) Les 2 lots de chacune de ces 2 premières cohortes seront des animaux contrôles injectés en intramusculaire avec du sérum physiologique (sham) et des animaux pathologiques injectés avec du glycérol 50%. Par la suite, si la mise au point est conforme aux attentes, les cohortes seront constituées de 5 à 6 lots de 10 souris pour permettre le test de 2 à 3 molécules. Il est prévu de réduire le nombre d’animaux induits à n=6 dans les lots sham et référence (quinacrine) en consolidant les données obtenues avec celles générées à l’occasion des études pilotes. Seules les molécules présentant une activité sur le modèle de rhabdomyolyse (pathologie rénale aiguë) seront évaluées sur un modèle de pathologie rénale chronique. Modèle de pathologie chronique (néphrectomie) Une à deux études pilotes seront réalisées afin de déterminer le nombre d’animaux nécessaires dans chaque lot test. L’induction de la pathologie rénale par néphrectomie pouvant présenter une légère variabilité, il est estimé nécessaire d’opérer 12 rats/lot pour obtenir 8 à 10 animaux présentant les signes cliniques de la maladie rénale chronique. A l’issue de la mise au point, les lots envisagés dans chaque cohorte d’étude d’un composé sont Contrôle Sham, Contrôle pathologique, référence (MnTBAP), molécules à tester. Chaque lot sera constitué de 8 à 10 animaux pour mettre en évidence des effets statistiques interprétables. Les molécules seront évaluées sur une période de 12 semaines et les cohortes seront constituées au minimum de 5 à 6 lots d’animaux pour permettre de tester 2 à 3 molécules. L’objectif est de réduire le recours à l’opération systématique d’animaux pour les lots sham, contrôle pathologique et référence. A l’issue des 2 premières études, il est prévu de ramener entre 6 et 8 le nombre d’animaux affectés au groupe sham et référence, les résultats sur ces 2 groupes seront consolidés avec les données obtenues lors des tests pilotes.

Raffinement

Pour le modèle de néphrectomie 5/6Nx, 48h avant l’opération, une analgésie pré-opératoire sera réalisée par voie orale L'anesthésie et l'analgésie pour l'opération chirurgicale seront obtenues avec l'association d'un sédatif, d'un analgésique et d'un anesthésique. Pendant l’opération, la température corporelle sera suivie et les animaux maintenus sous lampe chauffante. En fin de chirurgie, les rats recevront 2 fois/jour une dose d'antalgique pendant 3 jours. Les rats seront mis en boite individuelle jusqu'à cicatrisation complète. L'aliment dans la mangeoire sera également disposé dans la cage et un enrichissement type sizzle dry sera disposé avec la litière. La surveillance post opératoire sera quotidienne avec une grille de score associée à une feuille d'observation individuelle.

Choix des espèces

Les espèces choisies, souris pour l'atteinte rénale aigue (rhabdomyolyse), rat pour l'atteinte rénale chronique (néphrectomie) sont celles les plus couramment utilisées pour étudier ces pathologies et l'effet de nouvelles molécules permettant un traitement potentiel. Ces modèles permettent l’étude conjointe de l’atteinte musculaire et rénale. Les animaux sont des rats adultes (6-7 semaines) pour la néphrectomie et des souris adultes (7-8 semaines) pour le modèle de rhabdomyolyse. Pour ces 2 modèles, l'âge retenu permet d'inclure des animaux n'ayant pas une atteinte rénale spontanée et d'éviter une variabilité des paramètres biochimiques rénaux et plasmatiques liée à l'âge qui pourrait interférer avec l’effet attendu du traitement.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle de la myopathie de Duchenne, elles reçoivent des injections répétées de lymphocytes T génétiquement modifiés, des prélèvements sanguins, des échocardiographies sous anesthésie et une mesure de force par stimulation du nerf sciatique, avant la mise à mort pour prélever le cœur et les muscles. Le porteur décrit un affaiblissement musculaire et une baisse modérée de la fonction cardiaque liés au modèle lui-même. Les bénéfices annoncés pour les patients sont renvoyés à une utilisation future, et le porteur revendique la souris comme une source "unique et indispensable" faute de système in vitro reproduisant la maladie.

Objectifs

La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une pathologie neuromusculaire grave. Elle est causée par des mutations du gène de la dystrophine qui assure la stabilité structurelle des muscles squelettiques et cardiaque. Chez les patients DMD, les fibres musculaires sont progressivement endommagées et remplacées par du tissu fibreux et adipeux. La présence d’une quantité importante de tissus fibreux (fibrose) dans le muscle des patients est l’une des causes communes aux échecs des thérapies géniques et cellulaires en développement. Pour cette raison, il est cliniquement pertinent de réduire la quantité de tissus fibreux comme une nouvelle piste dans la prise en charge de la DMD. L’une de ces pistes consiste à cibler et dégrader une protéine présente en grande quantité au niveau des tissus fibreux et ceci à l’aide de lymphocytes T génétiquement modifiés ou de nanoparticules lipidiques permettant de cibler spécifiquement cette protéine. Une étude de preuve de concept que ces stratégies étaient capables de limiter la fibrose cardiaque dans un modèle murin de cardiopathie a été préalablement réalisée. Cette pathologie diffère toutefois de la DMD, il est donc important d’établir si les conclusions initiales positives sont extrapolables à la DMD. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les effets thérapeutiques de lymphocytes T génétiquement modifiés dans des modèles murins de DMD. A l’issue de ces expériences, nous pourrons déterminer si cette thérapie est efficace pour réduire la fibrose musculaire et cardiaque induite par la DMD.

Bénéfices attendus

La mise en évidence d'une réduction de la fibrose et d'une amélioration de la fonction cardiaque et musculaire par une approche d'immunothérapie basés sur l’administration de lymphocytes-T spécifiques dans des modèles murins de la dystrophie de Duchenne constitue un préalable important pour une utilisation future et sûre chez l’homme. L’objectif de ce projet est de développer un médicament biologique susceptible d’améliorer le pronostic de la dystrophie de Duchenne à travers une réduction de la fibrose et l'amélioration des fonctions cardiaques et musculaires dont souffrent les patients. Ce projet permet également d’ouvrir la piste d'une utilisation des approches d'immunothérapie dans le contexte des maladies génétiques rares et ceci en combinaison avec une thérapie génique à visée curative.

Procédures

Les interventions sur les animaux seront 1- Injection intra-péritonéale en solution saline (150 microlitres, réalisée en quelques secondes) -2 Injections intra-veineuse caudale espacées d'une semaine (solution isotonique saline contenant ou pas des lymphocytes) réalisés sous anesthésie avec un volume de 150 microlitres, avec une durée d'environ 5 minutes - 3 Prélèvements sanguins (une goutte, environ 50microlitre) espacés d'une semaine pour les deux premiers et 3 mois plus tard pour le dernier avec une durée d'une minute -Echocardiographie réalisé sous anethésie (fréquence 3, durée 20 minutes). -Test de préhension (Fréquence 5; Durée 2 minutes) qui consiste à mesurer la capacité de la souris à s'agripper sur une grille et de ce fait nécessite que l'animal soit éveillé. Cet examen n'est pas invasif et ne provoque donc aucune douleur chez l’animal. Le test de préhension n’occasionne pas de souffrance chez l’animal. -Mesure de la force musculaire suite à une stimulation du nerf sciatique réalisée sous anesthésie générale et analgésie (Fréquence 1; durée 15 minutes). A l'issue de ce test la procédure sera achevée pour procéder à l’analyse histologique des tissus afin de récolter les données. Ainsi, toutes les manipulations chez l’animal durant nos procédures seront réalisées sous anesthésie générale et si nécessaire analgésie, garantissant une pénibilité minimale pour celui-ci à l’exception du test de préhension et du prélèvement sanguin. Une grille d’évaluation des points limites sera établie. Si une souris présente des signes de stress ou de souffrance sans que le point limite soit franchi, il sera reconnu comme souffrant. L’animal sera mis sous surveillance accrue (avec marquage de cage par carte) et l’administration d’un analgésique sera envisagée en cas de nécessité. Tous les animaux qui ont atteint les points limites seront sortis de protocole précocement.

Impact sur les animaux

Ici, les souches de souris étudiées ont été choisies pour mimer la pathologie humaine. Les effets indésirables consistent en l'affaiblissement musculaire et une réduction modérée de la fonction cardiaque. La contention pour l'injection intra-péritonéale et le prélèvement sanguin pourrait générer du stress à l'animal, cependant le même expérimentateur sera chargé de l'acte et les souris seront préalablement habituées à la personne. Le prélèvement de sang (une goutte) peut occasionner un léger stress chez l'animal, ce niveau de stress est équivalent à l'effet d'une piqure. Le test de préhension n’occasionne pas de souffrance chez l’animal.

Devenir

A l'issue de cette procédure, l'ensemble des souris impliqué dans le protocole sera euthanasié par une méthode réglementaire et ceci afin de récolter les différents tissus (coeur, muscles) et procéder à l'examen histologique et moléculaire de ces tissus et receuillir ainsi les donnés indispensables pour évaluer l'efficacité de l'approche thérapeutique mise en place.

Remplacement

En amont de l’administration de cette thérapie dans le modèle murin, une évaluation de la fonctionnalité des CAR-T cells est mise en place in vitro via des tests cytotoxiques sur des modèles cellulaires musculaire et cardiaque. Ainsi, ne sont administrés aux animaux que des traitements ayant fait la preuve de leur fonctionnalité in vitro. Cependant, les modèles murins restent une source unique et indispensable pour évaluer une amélioration histologique et fonctionnelle induite par le traitement testé. De plus, ces modèles nous permettront d’obtenir des informations sur le profil de sécurité de ce traitement grâce à la détection d’un potentiel syndrome de relargage des cytokines, effet indésirable communément observé en clinique humaine.

Réduction

Nous allons dans un premier temps vérifier grâce à des coupes histologiques issues de travaux précédents la présence des protéine d’intérêt chez des animaux d’âge et sexe différents. Le but est de sélectionner le moment optimal de l’administration de CAR-T cells pour observer un effet thérapeutique. Lors du passage à la phase in vivo, les mêmes animaux sont utilisés pour les évaluations fonctionnelles, les tests de contraction musculaire ainsi que les études d’histologie et de transcriptomique à la suite de la mise à mort. Les procédures expérimentales sont donc conçues pour réduire le nombre d’animaux utilisés au maximum, sans compromettre la puissance statistique de l’étude. Les calculs d’effectifs, assurés par une statisticienne, se fondent sur les données de la littérature et l’expérience déjà acquise par l’équipe. Ce nombre devrait permettre de valider le concept et tient compte de l’exclusion du protocole de certains animaux (due à l’atteinte de points limites ou de décès prématuré). Toutes les interventions sur les souris seront réalisées dans des conditions de reproductibilité maximale afin de minimiser la variabilité et donc le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total de souris utilisé sera de 300 souris. L’effectif de 25 souris par groupe a été établi grâce à un calcul de puissance. Suite à l'analyse des données, des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Nous réduirons au maximum la souffrance des animaux. En effet, toutes les manipulations chez l’animal durant nos procédures, à l’exception des mesures de la force musculaire (test de préhension) l'injection intra-péritonéale et le prélèvement d'une goutte de sang, seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie, garantissant une pénibilité minimale pour celui-ci. Nous avons opté pour l'injection intraveineuse de CAR-T cells étant donné qu’elle est simple et non invasive. L'injection sera réalisée sous anésthésie et avec l'utilisation d'une source de chaleur pour dialter la veine ce qui facilitera l'injection. Pour réduire les effets indésirable liés à des anesthésies fréquentes, les prélèvements sanguins correspondant en terme de douleur et stress à une piqure seront réalisés sans anethésie. Des antalgiques sont prévus pour la mesure de la force musculaire qui intervient en étape finale. Une grille d’évaluation des points limites est établie. Si une souris présente des signes de stress ou de souffrance sans que le point limite soit franchi, il sera reconnu comme souffrant. L’animal sera mis sous surveillance accrue (avec marquage de cage par carte) et l’administration d’un analgésique sera envisagée en cas de nécessité . Tous les animaux qui ont atteint ces points limites seront euthanasiés précocement. Toutes ces attentions particulières portées au bien-être animal seront complétées par un hébergement adapté, c’est-à-dire avec des congénères (répartis en cages de 5) et avec des éléments d’enrichissement dans les cages (cubes de bois à ronger, abris, substrats pour la construction de nids, nourriture et eau de boisson ad libitum) afin de créer un environnement propice au confort des animaux.

Choix des espèces

Pour atteindre notre objectif, nous sommes amenés à utiliser des modèles murins car aucun système in vitro et aucun modèle d’organisme plus simple ne permet de reproduire la complexité de la DMD. Nous utiliserons ici un modèle préclinique pertinent de la Dystrophie de Duchenne. Ces modèles développent une fibrose du myocarde et des muscles squelettiques, ainsi qu'une altération fonctionnelle et récapitule ainsi la chronologie de la progression et les altérations observées chez les patients. Les contrôles seront des souris contrôle saines avec le même fond génétique. Ce projet constitue une des étapes précliniques indispensables avant l’application potentielle chez l’homme de ces approches thérapeutiques. La souris constituant le modèle sera étudiée entre 3 mois à 6 mois d'âge car à partir de 3 mois, les souris sont considérées comme ayant accompli leurs croissances musculaires et cardiaques. Il est aussi prouvé dans la littérature que la fibrose se met en place dans ces modèles à partir de 5 mois. Cette fourchette sera affinée en fonction de l’analyse histologique en cours de coupes issues d’études antérieures.

50 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une pastille immunosuppressive implantée sous la peau sous anesthésie, puis une injection intraveineuse de thérapie génique et plusieurs prélèvements sanguins, avant d'être tués pour prélever leurs organes. Le projet cherche à savoir si la toxicité cardiaque observée à forte dose de vecteur est liée à une réponse immunitaire contre le transgène. Le porteur passe en revue les méthodes in silico et in vitro puis affirme qu'aucun modèle alternatif ne permet d'étudier les liens entre système immunitaire et système cardiaque.

Objectifs

Les dystrophies musculaires sont un ensemble de pathologies invalidantes sans traitements présentant des signes histologiques et fonctionnels avec une réduction de la force musculaire, et parfois une atteinte cardiaque, respiratoire et cérébral. La thérapie génique est une stratégie envisagée dans ces pathologies d’origine génétique et des approches utilisant des vecteurs dérivés du virus associé à l’adénovirus sont déjà à l’étape clinique. Lors des injections des produits de thérapie génique chez l’homme, Il a été observé des réactions immunitaires contre le vecteur et contre le transgène (produit protéique exprimé à partir du gène apporté par le vecteur), ainsi qu’un certain nombre de réactions adverses. Dans ces cas, des traitements à base de produits immunosuppresseurs sont donnés aux patients et permettent une résolution des problèmes la plupart du temps. Dans nos études précliniques de transfert de gène dans un groupe de pathologies musculaires, les sarcoglycanopathies, nous avons également observé une toxicité cardiaque à des doses élevées de vecteur chez le rat. Nous avons observé de façon concomitante une réponse immune contre le transgène-médicament, sans qu’il soit possible de déterminer si cette réaction immune était en parallèle ou à l’origine de la cardiotoxicité. L’objectif de ce projet est de répondre à cette question en utilisant un régime immunosuppresseur qui va prévenir la réponse contre le transgène et de quantifier une potentielle diminution de la cardiotoxicité.

Bénéfices attendus

Dans ce projet, nous définirons si la cardiotoxicité observée à de forte doses de vecteurs est liée ou non à une réponse anti-transgène. La réponse à cette question nous orientera vers la génération de vecteur ayant un profil de sécurité plus élevé car nous saurons si nous devons privilégier des vecteurs ne conduisant pas à une réponse anti-transgène ou au contraire rechercher l’origine de la cardiotoxicité pour définir comment générer des vecteurs.

Procédures

Le traitement immunosuppresseur se fait par injection sous-cutanée de pastilles à l’aide d’une canule une seule fois au cours du protocole sur des animaux sous anesthésie gazeuse. Le transfert de gène se fait par injection intraveineuse en une seule fois sur animaux vigiles avec injection dans la veine caudale. Les prélèvements de sang se feront un jour avant l’injection de la thérapie génique, à 14 jours post-injection et à la fin (J21) du protocole. Les prélèvements de sang ne se font pas le même jour que les injections afin de ne pas induire de douleur supplémentaire.

Impact sur les animaux

Les nuisances (douleur ou stress) attendues sur les animaux sont liées à la nature des actes réalisés : - Douleur de piqûres pour injection du traitement par transfert de gène. Certains actes qui sont susceptibles d’entrainer des douleurs sont réalisés sous anesthésie gazeuse, la nuisance sera donc liée à l’acte d’anesthésie. Il y a une possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies. Effets immunosuppresseurs des drogues et l’effet toxique des doses élevées des injections de thérapie génique peuvent également entrainer des nuisances, comme une atteinte cardiaque et un dérèglement du système immunitaire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser le prélèvement des organes.

Remplacement

Aucun modèle alternatif à des modèles animaux ne nous permet d’étudier les relations entre la réponse immunitaire et la toxicité cardiaque pour répondre aux questions posées. Théoriquement, les méthodes alternatives à l’expérimentation animale peuvent être de différentes natures : méthodes in silico ou in vitro. Les approches in silico utilisées en alternative à l’expérimentation animale à ce jour permettent uniquement des modélisations physico-chimiques comme la relation entre structure et activité biologique d’une molécule ou des modélisations toxico-cinétiques d’élimination de molécules. Des modèles in silico qui pourraient permettre de modéliser numériquement les expériences proposées dans ce projet à partir d’un ensemble de données n’existent donc pas à ce jour. Les méthodes in vitro les plus utilisées aujourd’hui comme alternative en expérimentation animale sont basées sur l’utilisation de cultures cellulaires. Elles présentent l’avantage d’offrir la possibilité d’utiliser des cellules humaines avec les considérations éthiques correspondantes bien sûr. Il est possible de réaliser des cultures cellulaires ou des organoïdes pour les organes considérés avec, même une certaine complexité, comme en co-culture avec certaines cellules additionnelles. Cependant, il n’existe à ce jour aucun modèle permettant d’étudier les relations entre le système immunitaire et les système cardiaque..

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le découpage en 2 lots va permettre de définir le meilleure traitement immunosuppresseur dans le premier lot et de ne faire que le meilleur dans le deuxième lot. Le groupe contrôle injecté avec placebo sera mutualisé entre les 2 lots. Nos données suggérant que les observations de toxicité et de réponse immune sont globalement les mêmes entre les deux sexes, nous n’évaluerons la question que sur un seul sexe, ce qui nous permet une réduction d’animaux.

Raffinement

Nous avons choisi d’administrer les molécules à l’aide de pastilles sous-cutanées qui permettent la délivrance de la molécule pendant une période de 21 jours. Cette méthode permet un contrôle de la quantité de produit administré en assurant une distribution continue et une stabilité du produit et donc une meilleure reproductibilité. Cette méthode permet de limiter la manipulation des animaux avec une seule manipulation au lieu de manipulations quotidiennes, évitant par la même du stress aux animaux. L’administration systémique des vecteurs se fera 2 à 3 jours après de l’implantation de la pastille évitant un stress supplémentaire l’animal. Les animaux sont anesthésiés lorsque les procédures expérimentales sont jugées potentiellement douloureuses ou stressantes. Les prélèvements de sang sont effectués sous anesthésie de courte durée. Nous appliquons les points limites établis préalablement et utilisons les procédures d’euthanasies appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées telle que l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies.

Choix des espèces

Pour ce projet, nous utiliserons l’espèce rat car c’est sur cette espèce que nous avons observé la plus grande sensibilité à la toxicité cardiaque induite par l’injection des AAV à forte doses. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte à un âge permettant le montage d’une réponse immune.

168 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie abdominale de trente à quarante-cinq minutes sous anesthésie générale pour implanter une prothèse de diaphragme, avec des risques de saignement, de difficultés respiratoires, d'infection et de douleur postopératoire. Les rats sont ensuite tués pour analyser l'intégration de la prothèse dans les tissus. Le porteur présente cette étape in vivo comme "indispensable" avant une application clinique et vise le développement puis la commercialisation d'une prothèse pédiatrique.

Objectifs

Dans le cadre d’un projet de recherche, nous développons une prothèse pariétale pédiatrique et plus précisement, un implant diaphragmatique pour répondre à la problématique des récurrences de hernie diaphragmatique congénitale à large défect. Cette pathologie rare et grave du nouveau-né impose une chirurgie dès les premières heures de vie avec mise en place d’une prothèse pour combler le défect dans les formes les plus graves. Aucune prothèse dédiée n’existe à l’heure d’aujourd’hui et la prothèse la plus couramment utilisée est une prothèse en polytetrafluoroéthylène expansé (e-PTFE) qui présente un taux de lâchage de 30 à 50% imposant une reprise chirurgicale et grévant la morbimortalité de cette pathologie déjà lourde. Nous avons pu démontrer les faiblesses de cette prothèse par des précédents travaux ce qui nous a permis de définir le cahier des charges d’une prothèses dédiée et de développer les premiers prototypes de prothèse pédiatrique diaphragmatique. Nos premiers travaux ont permis de caractériser les propriétés mécaniques de cette prothèse, supérieures à la prothèse référente dans cette indication avec une meilleure étirabilité sans rupture. Les tests biologiques in vitro ont permis de prouver sa biocompatibilité, l’absence de toxicité cellulaire et de carcatère proinflammatoire, la qualité de la colonisation cellulaire à sa surface. Ainsi nous avons pu valider in vitro la pertinence de nos travaux et valider nos prototypes d’implant. Nous avons ainsi une réelle ambition d’innovation en biomatériaux. Après avoir validé les étapes in vitro de notre plan de développement, une analyse in vivo sur petit animal est indispensable pour poursuivre nos travaux vers une application clinique.

Bénéfices attendus

Actuellement, de toutes les prothèses existantes sur le marché, aucune n’est dédiée au diaphragme de l’enfant et les propriétés mécaniques et de biocompatibilité des prothèses les plus utilisées ne semblent pas idéales dans cette indication. Ainsi, nous développons des prothèses spécifiquement pensées pour cette indication mais plus globalement, dédié à l’enfant, organisme en croissance. Nos travaux ont débuté par une analyse des prothèses existantes et des échecs (récupération des explants), permettant de définir les caractéristiques de notre prothèse idéale en termes de propriétés mécaniques et biologiques. Nous avons développé différents prototypes pour lesquels nous testons systématiquement in vitro, les caractéristiques mécaniques et les caractéristiques biologiques, permettant peu à peu d’affiner les critéres de synthèse (type de matériau et prcess de synthèse). Une fois cette première phase validée, il est important de pouvoir tester nos prototypes sélectionnés in vivo in situ (implanté en diaphragmatique) avant d’envisager une application clinique. Si ces tests confirment les données in vitro, alors nous pouvons envisager de développer et commercialisé la première prothèse pariétale pédiatrique prenant en considération le phénomène de croissance de l’enfant mais aussi ses spécificités en termes de réponse biologique aux implants. A long terme, en implant diaphragmatique, nous pouvons espérer faire diminuer drastiquement le risque de récidive et donc de réintervention. Nous améliorerons la survie et la qualité de vie des patients atteinds de hernie diaphragmatique large porteur d’implant.

Procédures

Il s’agira de procédures chirurgicales sous anesthésie générale réalisées sur l’abdomen des individus, d’une durée de 30 à 45 minutes environ

Impact sur les animaux

En peropératoire : saignement, difficultés respiratoires, plaie d’organe En postopératoire : douleur postopératoire, infection du site opératoire, infection de paroi, désunion, perte d’appétit en lien avec la douleur ou un sepsis, ileus intestinal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en fin de projet pour analyse histologique des explants et comprendre l’integraiton de notre biomatériau aux tissus hôtes.

Remplacement

Les phases expérimentales in vitro du projet ont été décrites et permettent de valider et sélectionner les prototypes les plus abouties des prothèses diaphragmatiques en terme de biocompatibilité, de qualité de colonisation biologique et de prorpiétés mécaniques permettant ainsi de réduire l’experimentation animale aux prototypes les plus aboutis in vitro. Avant un développement clinique de ces prothèses, il est primordial de pouvoir évaluer la réponse biologique in vivo des prothèses ainsi que leur comportement mécanique en implantation orthotopique. Plusieurs équipes ont travaillé sur les diaphragmes de rongeurs (rats) ce qui valide le choix de cette espèce pour nos travaux à cette phase du projet. En effet, parmis les éspèces possible : la souris ne permet pas la réalisation des procédures du fait de la petite taille du diaphragme et le choix d’animaux vertébrés plus gros ne semble pas non plus justifié et imposerait le sacrifice de trop d’animaux, avec des temps d’étude pour l’analyse de la croissance trop important.

Réduction

Nous avons choisi le nombre d’animaux minimal nécessaiez à l’obtention de résultats fiables et robustes La procédure permet d’évaluer la réponse biologique au terme du délai attendu de 15 jours de cicatrisation de 6 prototypes sélectionnés en prenant comme gold standard le e-PTFE faisant référence actuellement.

Raffinement

En préopératoire, les individus bénéficieront d’un temps d’adaptation en cage de deux au sein de l’animalerie selon les conditions habituelles d’hébergement. En postopératoire immédiat, les animaux sont placés en cage individuelle pour une surveillance de 48H. Au-delà, ils seront à nouveau 2 par cage jusqu’au sacrifice. Ils seront surveillés de façon biquotidienne les 2 premiers jours, une fois par jour ensuite. En cas d’apparition de signe de souffrance (score de bien être anormal), les actions de gestion de douleur et de confort seront associées et la surveillance accrue jusqu’à normalisation ou mise à mort en cas d’atteninte des points critiques. L’environnement des cages est enrichi à l’aide de carrés de cellulose et de frisure pour la construction des nids, de tunnels pour permettre aux animaux de se cacher et ainsi diminuer le niveau de stress. Une nourriture adaptée pour les rongeurs et l’eau de boisson sont données ad libitum.

Choix des espèces

Le choix des rats Wistar s’est fait sur plusieurs critères : - Animal de taille adaptée à une chirurgie du diaphragme, - Potentiel de croissance sur une période d’étude concevable, - Résistance et maniabilité de la race wistar, - Travaux faisant référence sur la même pathologie déjà réalisés sur cette souche.