Troubles musculosquelettiques

120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs d'un modèle de myopathie de Duchenne, ils reçoivent une molécule mêlée à la nourriture et une injection intramusculaire nécrosante que le porteur décrit comme modérément douloureuse, avec mesures de force et prélèvement de sang, avant mise à mort pour prélever muscles, diaphragme et cœur. Le porteur revendique une réduction des effectifs à six rats par groupe grâce aux données déjà accumulées. Il affirme que la validation pharmacologique sur ce modèle est une étape "indispensable" avant d'envisager un essai clinique.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’identifier les signalisations moléculaires de nécrose dans les myopathies. Ces mécanismes ne peuvent être déterminés qu’en condition in vivo puisque le mécanisme de mort cellulaire par lequel une cellule meurt dépend de plusieurs paramètres dont l’importance reste largement méconnue. Le projet vise également à tester le potentiel thérapeutique de l’inhibition de la nécroptose (une nouvelle voie de mort cellulaire) dans la myopathie de Duchenne, avec un composé mélangé à la nourriture dont on attend qu'il protège les muscles de la dégénérescence qui les touche

Bénéfices attendus

Ces dernières années ont vu l’émergence de nouveaux types de mort cellulaires nécrotiques. Parmi la famille étendue des dystrophies musculaires, la dégénérescence par nécrose des fibres musculaires est un mécanisme pathogénique central et commun. Nous attendons de ce projet une cartographie plus précise des types de nécrose à l'œuvre dans la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). À court terme, nous attendons aussi chez nos animaux modèles de DMD traités avec un inhibiteur de nécrose un bénéfice avec une amélioration de la microstructure et de la fonction du muscle dystrophique traité. En cas de résultat encourageant chez les animaux DMD avec des traitement courts, nous projetons de poursuivre avec une évaluation à plus long terme de cet inhibiteur pour consolider le dossier préclinique en vue d’un éventuel essai clinique chez l’humain.

Procédures

Le traitement est mélangé à la nourriture et consommé spontanément par les animaux. Les animaux anesthésiés seront injectés par voie intramusculaire une fois dans le muscle de la patte pour induire une régénération musculaire. Cette intervention est rapide (moins de 10 minutes). La mesure de la force du membre antérieur sera réalisée une seule fois par animal et dure une vingtaine de minute (5 répétitions de mesure d'une minute avec 3 minutes de repos entre 2 mesures). La durée d'un enregistrement de la force musculaire du membre postérieur est de 90 minutes, anesthésie comprise (une injection sous cutanée avec une aiguille hypodermique très fine). Les animaux seront également prélevés une fois pour récupérer un millilitre de sang, en vue de quantifier des biomarqueurs de la maladie. Ce prélèvement sera réalisé pendant l’anesthésie de la mesure de force, le prélèvement lui-même dure moins de 30 secondes).

Impact sur les animaux

L’injection intramusculaire sera réalisée sous anesthésie générale et ne sera réalisée qu’une seule fois dans chaque muscle tibialis anterior, de façon bilatérale. En raison du volume injecté dans le muscle (100 µl) et de la réaction inflammatoire induite, cette injection nécrosante est modérément douloureuse.

Devenir

La totalité des rats inclus dans ce projet seront mis à mort à la fin de la procédure afin de recueillir leurs muscles (ceux des membres, le diaphragme, le cœur) en vue de les analyser par des techniques d'imagerie, d'histolgie et de biologie moléculaire (expression différentielle de gènes, de protéines).

Remplacement

Le but de notre projet est la validation pharmacologique d’une stratégie thérapeutique préalablement testée in vitro puis par inhibition génétique sur souris dystrophique. L’inhibition pharmacologique vise à protéger les fibres musculaires dystrophiques de la nécrose de type « nécroptotique » en utilisant une molécule dont l’efficacité a déjà été éprouvée dans des publications issues de laboratoires distincts. La nécrose du rat DMD étant optimale, la validation pharmacologique dans ce modèle est une étape indispensable pour évaluer un éventuel bénéfice sur la progression de la maladie, avant d’envisager une étape clinique, en cours pour d’autres maladies.

Réduction

Nous avons accumulé beaucoup d'expérience sur les lots de rats DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Pour certaines de ces études, nous sommes en train de rédiger les conclusions et avons déjà réalisé les analyses statistiques. Il apparaît que pour chacun des groupes, traiter 6 rats permet d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution fatale de la maladie. Pour réaliser cette estimation, nous utilisons des tests statistiques en prenant en compte des paramètres tels que la différence à mettre en évidence entre les différents lots, la puissance et le risque du test. Par ailleurs, en raison de ce nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wildtype, WT) et DMD traités avec un placebo, nous avons accumulé des données nombreuses qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages. Il est donc possible de réduire les cohortes de ces animaux. Au bilan, chacun des groupes a pu être réduit à 6 animaux.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage à l'âge d'un mois. Puis nous réduisons ce nombre progressivement jusqu'à atteindre un maximum de 3 rats par cage. L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux sont habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (maladie irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle historique de la souris, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle du chien dystrophique. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format).

260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections intramusculaires répétées de deux candidats myorelaxants, avec prélèvements sanguins, puis sont tués pour analyse du muscle. Le porteur n'attend aucun signe clinique et situe les nuisances dans le stress de contention et la douleur des injections. Il affirme que les modèles cellulaires sont débattus et ne reproduisent pas le système immunitaire, l'étude vérifiant l'absence de réaction immunitaire à ces molécules d'un développeur privé.

Objectifs

Après avoir démontré le bénéfice d’efficacité des produits (FTP-501 et FTP-101) face aux produits de référence utilisés en clinique lors de projets précédents, ce projet expérimental s’intéresse au potentiel immunogène de ces candidats. Cette étude a pour objectif de confirmer la non-présence d’Anticorps Anti-Drug (ADA) suite aux injections des différents composés. Ces molécules pourraient a priori provoquer une réaction immunitaire suite aux injections, diminuant ainsi l’efficacité du traitement et sa tolérance. Il est donc important de vérifier qu’une telle réaction est limitée ou inexistante.

Bénéfices attendus

Les troubles du mouvement sont des maladies neuromusculaires, qui handicapent durablement les patients et ont un impact sociétal important. La dystonie est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires, pouvant entrainer des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces maladies implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène… Ces traitements systémiques comportent tous des effets secondaires conséquents. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces malades : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente des avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Cette approche doit encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après l’injection, et dont les effets seraient durables. L’objectif de notre projet est de mettre en évidence les effets bénéfiques de l’utilisation locale de différents produits myorelaxants novateurs à effet rapide et durable, sur la contraction musculaire pour les patients souffrant de troubles du mouvement comme la dystonie et la spasticité. Au cours d’une étude princeps, nous avons pu identifier au moins 5 produits présentant une activité myorelaxante d’intérêt ; ensuite, grâce aux différents projets déposés, nous avons avancé nos 2 premiers Lead (FTP-501 et FTP-101) quasiment au terme de leur développement préclinique. Chacun des produits identifiés au cours de l’étude princeps semble avoir des caractéristiques pharmacologiques différentes : certains induisent une myorelaxation très rapide (FTP-101), et d’autres offrent un effet durable par exemple (FTP-501). Or, selon la maladie neuromusculaire, le besoin clinique est différent, et donc chaque caractéristique est plus ou moins critique. Ce projet permettra de vérifier qu’aucune réaction immunitaire ne se manifeste suite aux injections et que les produits sont bien tolérés quelle que soit la dose injectée, et bien tolérés après des injections répétées.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - Injection intramusculaire = 3 injections, durée 30 secondes/injection/animal = 1 min 30 sec - Pesée des animaux = 7 pesées / animal => 30 secondes / pesée = 3 minutes 30 sec / animal - Prélèvements de sang = 7 maximum par animal, durée 2 minutes = 14 minutes / animal.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, aucun signe clinique ni effets secondaires n’est attendu ici suite à l’injection des composés, d’après nos résultats obtenus dans nos études précédentes et la littérature. En effet lors de nos précédents projets, aucun signe clinique de type infection ou inflammation suite à une seule injection n’a été observé. Nous n’attendons pas ici de réactions suite aux multiples injections. Dans le cadre de nos procédures, les nuisances attendus sont : le stress des animaux dû à la contention pour l’injection, une douleur liée aux injections i.m. et les multiples prélèvements de sang (6 maximum).

Devenir

Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés. Un prélèvement pour analyse histologique du muscle injecté sera réalisé.

Remplacement

Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de coculture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés). De plus, nous recherchons ici des réactions immunitaires suite aux injections de nos composés. Le système immunitaire d’un hôte est extrêmement complexe (impossible à reproduire dans sa globalité in vitro) et nécessite des expérimentations in vivo.

Réduction

Pour la réduction, la taille des groupes nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs a été déterminé avec le logiciel G-Power. Nous utiliserons donc le nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à une conclusion. Soit 10 animaux par groupe (5 mâles et 5 femelles). Cependant, si les résultats sont dépendants du sexe, les groupes d’analyse seront de 5 animaux. Cette taille de groupe nous permet néanmoins d’obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les animaux seront stabulés dans des cages en plastique transparent de 1800cm2 au sol et comportant une plateforme. Les cages seront ventilées individuellement, placés dans une pièce sous air conditionné, avec un cycle jour/nuit de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. Ils seront maintenus en groupe de 2 ou 3 rats par cage. Ils disposeront de matériel de nidification (litière en chips de cellulose) puis d’enrichissement : les rats ont un tunnel rouge ainsi qu’un bâton de bois à ronger. Les animaux seont surveillés quotidiennement permettant un suivi clinique de chaque animal. Ainsi, des points limites sont mis en place durant tout ce projet permettant de définir des critères d’arrêt si nécessaire. Les prélèvements sanguins seront réalisés par un expérimentateur entraîné, et via une approche limitant le stress et la douleur, tout en ne dépassant pas les limites de volume prélevables chez un rat.

Choix des espèces

La comparaison de la rapidité d’action entre notre molécule et les traitements sur le marché ne pourra se faire que sur un modèle : i) exprimant les cibles moléculaires d’intérêt à la jonction neuromusculaire, et ii) dans lequel il existe une limite de diffusion dans les tissus. En effet, la cinétique des molécules après injection intra-musculaire est fortement dépendante de la capacité à diffuser dans le muscle, un tissu très compartimenté comportant plusieurs membranes interne. Nous recherchons ici des réactions immunitaires suite aux injections de nos composés. Le système immunitaire d’un hôte est extrêmement complexe et nécessite des expérimentations in vivo. De plus, nous avons choisi le rat d’une part, par continuité avec nos études précédentes et notre expérience sur ce modèle et d’autre part, car il s’agit d’un modèle de choix pour des études de toxicité de composé. Nous utiliserons des rats Sprague Dawley âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (200g) et 18 semaines maximum en fin d’expérimentation (600g pour les mâles). Des jeunes adultes sont choisis ici pour le bon fonctionnement de leur système immunitaire.

36 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie générale, on leur injecte des nanocapsules dans les disques intervertébraux, avec suivi par IRM pendant six mois, puis mise à mort pour analyse des disques. Le porteur indique une douleur modérée transitoire après l'injection et précise recourir à des animaux réformés destinés à l'abattoir. L'objectif est d'évaluer un traitement des lombalgies avant d'éventuelles études chez l'humain.

Objectifs

Les douleurs lombaires chroniques fréquemment rencontrées chez l’Homme concernent des sujets de tous âges. Le coût de leur prise en charge représente 240 milliards d’euros par an pour la totalité de l’UE. Toutefois, le tribu payé par l’individu malade reste le plus important : les lombalgies sont une cause majeure d’incapacité et de morbidité dans le monde. Le contributeur majeur de ces douleurs lombaires est la dégénérescence des disques intervertébraux (40%), appelée lombalgie discogénique. Le disque intervertébral (DIV) joue un rôle essentiel d’amortisseur dans la biomécanique de la colonne vertébrale. Il subit un processus dégénératif progressif inévitable au cours du temps (vieillissement), qui, lors de dégénérescence discale, est accéléré. Les DIV concernés sont alors plus rapidement altérés, avec pour conséquence une modification de la biomécanique vertébrale et une lombalgie discogénique. Aujourd’hui, aucune option thérapeutique disponible ne permet de ralentir l’évolution de cette maladie. Les traitement préconisés sont symptomatiques : physiothérapie, médicaments antidouleurs ou même chirurgie pour les patients les plus atteints. Les traitements chirurgicaux reposent sur l’exérèse totale du DIV incriminé : les procédures restent très invasives et s’accompagnent le plus souvent d’une convalescence longue et de risques de complications. A plus long terme, une instabilité vertébrale et une aggravation de l’atteinte des DIV adjacents sont souvent observées, aboutissant à des rechutes. L’amélioration des connaissances autour de la physiopathologie discale à l’origine des douleurs lombaires offre aujourd’hui de nouvelles opportunités de traitement. Il s’agit en particulier des approches de médecine régénératrice qui ont pour objectif de restaurer le tissu discal en modifiant la machinerie cellulaire à l’aide de miARN (petites molécules d’acide ribonucléique). C’est dans ce contexte que ce projet a pour objectif de démontrer l’innocuité et l’efficacité d’une injection intradiscale de nanocapsules lipidiques (LNC) renfermant des miARN chez des individus ovins (modèle animal spontané de dégénérescence discale), avant de pouvoir envisager des études cliniques chez l’Homme. L’efficacité thérapeutique sera évaluée contre placebo pour trois concentrations croissantes de miARN, pour un volume d’injection et une concentration en LNC constants : 36 animaux seront répartis en 4 groupes de 9 individus.

Bénéfices attendus

La dégénérescence discale (vieillissement prématuré des disques intervertébraux jouant le rôle d’amortisseurs entre les vertèbres) est responsable de 40% des lombalgies. Actuellement, il n’existe pas de solution thérapeutique permettant de stopper l’évolution de cette maladie ni de restaurer un disque intervertébral (DIV) fonctionnel. Les patients les plus atteints, pour lesquels la physiothérapie et l’administration d’antalgiques ne sont pas suffisantes, peuvent bénéficier d’une intervention chirurgicale au cours de laquelle le DIV incriminé est retiré. Les conséquences d’une telle chirurgie sur la biomécanique de la colonne vertébrale ne sont pas négligeables et les DIV adjacents sont alors d’autant plus sollicités, avec une aggravation de leur atteinte. Le projet que nous menons aspire à développer une nouvelle alternative thérapeutique qui pourrait être proposée aux patients atteints de lombalgie discogénique à des stades précoces, afin de restaurer un fonctionnement cellulaire permettant la synthèse de fibres de collagène et le maintien de l’hydratation du DIV, paramètres indispensables pour qu’il joue son rôle biomécanique. Il ne s’agirait plus de traiter les dégâts causés par la maladie (douleurs, hernie discale) mais de stopper son évolution voire de restaurer un DIV complètement fonctionnel. A court terme, cette expérimentation doit permettre d’évaluer l’innocuité de la procédure mini-invasive décrite (injection intradiscale sous contrôle radioscopique de nanocapsules lipidiques renfermant des molécules de miARN). A moyen terme, elle doit permettre d’évaluer l’efficacité d’une telle injection dans des DIV atteints de dégénérescence discale, et de choisir la dose de miRNA optimale véhiculée par les nanocapsules lipidiques. Et enfin, à long terme, elle doit permettre d’envisager plus rapidement la mise en place d’études cliniques chez l’Homme, l’obtention de résultats encourageants chez un modèle animal spontané représentant un tremplin non négligeable.

Procédures

Chacune des 36 brebis sera manipulée 4 fois pour des soins réalisés systématiquement sous anesthésie générale ou des examens/prélèvements post-mortem : - le premier jour (durée de l’anesthésie = 2h) : radiographies et IRM du rachis lombaire, injection intradiscale des nanocapsules lipidiques dans 3 disques intervertébraux (DIV) lombaires sélectionnés par randomisation. Les animaux sont répartis en 4 groupes de 9 animaux : un groupe placebo (nanocapsules lipidiques vides) et 3 groupes avec des nanocapsules lipidiques renfermant des miARN à trois concentrations différentes. - M1 et M3 (durée de l’anesthésie = 1h) : radiographies et IRM du rachis lombaire - M6 : euthanasie des animaux, radiographies et IRM du rachis lombaire (les DIV étant des tissus non vascularisés, leur aspect à l’IRM reste inchangé pendant plusieurs heures après la survenue de la mort), prélèvement de la totalité des DIV du rachis lombaire (nombre variant entre 6 et 7 selon les brebis) Par ailleurs, les animaux seront soumis à un examen clinique quotidien pendant toute la durée de l’expérimentation, sur leur site d’hébergement (pas de déplacement prévu pour les animaux). L’examen clinique se fait dans un premier temps à distance (temps mis à profit pour que les animaux s’habituent à la présence humaine) puis de manière rapprochée et individuelle (quelques minutes par animal, sans douleur).

Impact sur les animaux

La procédure décrite ici ne fait appel à aucun geste particulièrement douloureux. L’injection intradiscale par voie transannulaire (injection au sein du noyau pulpeux, élément central du DIV, à travers l’anneau fibreux, élément périphérique du DIV) se fait de manière percutanée (procédure mini-invasive correspondant à un geste de radiologie interventionnelle) et sous anesthésie générale. Une douleur modérée transitoire peut être ressentie par les animaux dans les jours qui suivent l’injection. Le risque infectieux lié à l’injection intradiscale est très faible.

Devenir

L’euthanasie des brebis aura lieu au 6ème mois après le début de la procédure, c’est à dire à l’issue des 6 mois de suivi par imagerie médicale et à la fin de la procédure expérimentale. Cette euthanasie est indispensable afin de pouvoir réaliser les analyses histologiques et immunohistochimiques prévues sur l’ensemble des DIV des brebis concernées par l’expérimentation (216 à 252 DIV au total). Ces analyses permettront d’identifier les modifications résultant des injections intradiscales du nouveau médicament évalué par ce projet, tant au niveau cellulaire que moléculaire (informations non disponibles par imagerie médicale).

Remplacement

Ce projet correspondant à une étude préclinique d’évaluation de l’innocuité et de l’efficacité d’un nouveau médicament in vivo, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation de l’animal. Toutefois, nous avons choisi de faire appel à des animaux de production réformés destinés à l’abattoir (élevage laitier) plutôt qu’à des animaux élevés spécifiquement pour l’expérimentation animale. Toutes les étapes de développement des nanocapsules lipidiques renfermant des miARN ont été réalisées in vitro, sans utilisation de l’animal.

Réduction

A l’IRM, le degré d’atteinte d’un DIV atteint de dégénérescence discale est évalué par la détermination du score de Pfirrmann (valeur allant de I à V). Nous souhaitons pouvoir mettre en évidence, entre chacun des 4 groupes (1 groupe placebo et 3 groupes avec une concentration croissante en miRNA), une différence de 1 point dans la valeur moyenne du score de Pfirrmann. Pour cela, après analyse statistique, chaque groupe doit être composé de 27 DIV. En injectant des nanocapsules lipidiques dans 3 DIV lombaires d’un même animal (sélection des DIV recevant une injection de nanocapsules lipidiques par randomisation), nous réduisons le nombre total d’individus utilisés : 9 animaux par groupe, soit 36 animaux au total (108 DIV recevant une injection intradiscale, analyse histologique de 216 à 252 DIV au total). De plus, la méthode de suivi choisie (par imagerie médicale et ne faisant appel qu’à une euthanasie terminale) limite également le nombre d’animaux utilisés (par comparaison avec des procédures où des animaux seraient euthanasiés à chaque temps de suivi). Tests statistiques : Nous avons prévu de comparer des moyennes entre chacun des 4 groupes.

Raffinement

Conditions d’hébergement : Les animaux sont stabulés en groupe dans des conditions similaires à leur hébergement en élevage. Ils ont accès librement au foin et à l’eau (ad libitum). L’alimentation est complétée par des granulés spécifiques (Terrena, France) et par des pierres à lécher (apport en minéraux). Les animaux bénéficient d’un suivi individuel quotidien pendant toute la durée de l’expérimentation : examen clinique et évaluation de la douleur/inconfort selon une grille adaptée à l’espèce ovine : intégration dans le troupeau, comportement à l’approche de l’opérateur, appétit et rumination, vigilance, posture (debout, couchée), port de tête à l’arrêt et en déplacement, aspect et posture au niveau du dos et des membres postérieurs, confort global (addition sur une grille de 1 à 10). Prévention de la douleur : De façon générale, la gestion de la douleur per- et post-opératoire suit les règles de l’analgésie multimodale associant l’administration de molécules antalgiques et le recours à l’anesthésie locorégionale. Un examen clinique sera fait quotidiennement par un vétérinaire pour déceler toute complication post-injection.

Choix des espèces

L’espèce ovine est un modèle spontané de dégénérescence discale. Les similitudes avec l’Homme concernent la physiopathologie de cette maladie, les anomalies détectées à l’IRM au niveau des disques intervertébraux (DIV) atteints et l’évolution clinique. Ainsi, la brebis est un modèle classiquement utilisé en médecine régénératrice du DIV. Par ailleurs, la taille des animaux facilite la réalisation des injections (taille relativement proche de celle de l’Homme) et leur hébergement en stabulation est aisé (contrairement aux porcs par exemple). Chez l’Homme comme chez la brebis, la sévérité de l’atteinte des disques intervertébraux lors de dégénérescence discale n’est pas corrélée à l’âge des individus. Nous avons choisi de travailler avec des animaux adultes âgés de 3 à 7 ans (animaux réformés destinés à l’abattoir du fait de problème de production de lait) afin de nous assurer que des lésions de dégénérescence discale seront identifiées à l’IRM chez chacune des 36 brebis de l’étude, sans que d’autres affections liées à l’âge n’interfèrent avec leur santé.

240 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur crée chirurgicalement des défauts osseux pour y déposer des biomatériaux, sous anesthésie, avec prélèvements sanguins par cathéter posé à l'oreille. Le porteur indique que l'intervention peut provoquer une fracture du fémur ou une inflammation chronique douloureuse. L'objectif déclaré est d'obtenir les autorisations d'études cliniques et de mise sur le marché, le porteur affirmant qu'il n'existe pas d'autres méthodes.

Objectifs

Ce projet fait partie d’un ensemble de programmes de recherche qui s’intéressent à l’ingénieurie tissulaire et au développement de biomatériaux susceptibles de stimuler la formation de tissus osseux, seuls ou en association avec des cellules souches mésenchymateuses (CSM) isolées et/ou de molécules actives. L’objectif de ce pojet est de confirmer l’apport de ces biomatériaux sur la cicatrisation osseuse par l’utilisation du modèle lapin. Les résultats in vivo, permettraient d’obtenir les autorisations nécessaires pour des études cliniques chez l’homme ainsi que les autorisations de mise sur le marché (marquage CE-Conforme au exigences de l'Union Européenne, FDA-Food and Drug Administration - Etats-Unis).

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de s’assurer de la tolérance et du comportement de biomatériaus et de potentiels principes actifs destinés in fine à un usage en médecine humaine.

Procédures

Une anesthésie générale pour réaliser une procédure chirugicale d'induction de défauts osseux avec dépôt du biomatériau associé ou non à un principe actif (durée de l'anesthésie/intervention entre 60 et 90 minutes). Un prélèvement de sang sous anesthésie générale à l'aide d'un cathéther intra-artériel posé à l'oreille pour mélange avec le biomatériau quand dicté par le protocole (tonte, désinfection, mise en place du cathéter, sécurisation du cathéter en place, désinfection du bouchon perforable, aspiration d'un à 5 mL de sang selon le protocole, procédure totale prenant environ 5 minutes). Une anesthésie généraleavant euthanasie (durée d'environ 15 minutes entre l'injection des anesthésiants par voie sous-cutanée et l'administration de l'euthanasique)

Impact sur les animaux

En raison de l’objectif de l’étude, les effets indésirables majeurs sont la survenue d’une fracture du fémur ou le développement d’une réaction inflammatoire prolongée au niveau des sites d’implantation pouvant générer une douleur locale et une inflammation chronique. La survenue d’une fracture consistue une atteinte immédiate d'un point limite. Un retentissement systémique de la réaction inflammatoire prolongée avec baisse d'activité et de l'appétit entraînant une perte de poids constitue également un des points limites lorsqu'un échec thérapeutique à l'administration d'antalgiques et de soins locaux est constaté.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement post-mortem, examen par imagerie et analyse histologique.

Remplacement

A l’heure actuelle, il n’existe pas d’autres méthodes d'étude de la tolérance de l'hôte permettant d’éviter ou de remplacer l’utilisation d’animaux pour l’approche thérapeutique abordée dans ce projet.

Réduction

Compte-tenu d’études comparables déjà publiées et des travaux précédement réalisés sur la plateforme, le nombre d’animaux par groupe correspond au nombre minimal requis pour atteindre une significativité statistique. Le test statistique retenu pour comparer les différentes conditions sera un test non paramétrique de comparaisons multiples de données quantitatives de plus de deux échantillons indépendants (N

Raffinement

Les manipulations se dérouleront dans le strict respect du bien-être des animaux. L’hébergement est assuré dans des cages conformes à la réglementation en vigueur. Le modèle chirurgical est maîtrisé et réalisé par des chirurgiens qualifiés. Des traitements analgésiques adaptés seront mis en place et ajustés au niveau de douleur identifiée individuellement sur chaque lapin. Toute maladie concomitante apparaissant pendant l’étude fera l’objet de soins et de traitements adaptés. L’échec aux traitements conventionnels et l’impact de la maladie sur les résultats de l’étude seront évalués comme point limite. Les animaux ont accès librement aux granulés spéciaux pour lapins et à l’eau de boisson (ad libitum). L’enrichissement du milieu se fait par des jouets et des blocs de foin compacté et une tablette surélevée permettant aux lapins de se placer au-dessus ou en dessous. Les moyens mis en œuvre pour détecter, identifier et mettre un terme sans délai aux douleurs, souffrances et angoisses potentielles consiste en une surveillance quotidienne des animaux, des modifications importantes du comportement (agitation, agressivité, positions anormales, immobilité), une modification de l’apparence physique (contractures, poils ébouriffés) et un arrêt de l’alimentation entrainant une perte de poids supérieure à 10-15%. En cas d’apparition de l’un de ces symptômes, l’animal sera retiré de l’étude et euthanasié dans les plus brefs délais. Par ailleurs, le soin des lapins est assuré par un personnel qualifié dans un hébergement conforme et enrichi. Les animaux sont manipulés dans un environnement calme et sous sédation ou anesthésie dès lors que la manipulation est stressante et source d’inconfort. L’immobilisation chimique est réalisée par voie sous-cutanée ce qui évite de requérir à une contention physique pour réaliser l’injection des produits sédatifs et analgésiques.

Choix des espèces

Le choix des lapins est fondé sur plusieurs critères : - Animaux adultes : maturité squelettique - Modèle de reconstruction osseuse chez le lapin largement répondu et décrit dans la littérature

650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage quotidien de tamoxifène pendant cinq à quinze jours, dont le porteur reconnaît le risque de perforation de l'œsophage ou de passage dans les poumons, subissent un test d'effort sur tapis roulant une heure par jour et un séjour de sept jours en cage métabolique isolée. À la fin, les 650 sont tuées pour prélever leurs organes. Le projet étudie le rôle de deux facteurs de transcription dans la croissance musculaire, le porteur affirmant qu'aucun modèle cellulaire ne peut reproduire ce processus.

Objectifs

Le muscle squelettique est un tissu hautement spécialisé capable de se régénérer et de s’adapter à son environnement. La mécanotransduction se définit par la façon dont la cellule intègre le signal mécanique et le transforme en signal biochimique lui permettant de réagir, de s’adapter et même de modifier l’expression de ses gènes. Nous nous intéressons à 2 facteurs de transcription qui ont récemment été identifiés pour jouer un rôle clef dans la mécanotransduction dans divers tissus dont le muscle squelettique. De récentes données, montrent que ces 2 facteurs sont importants pour maintenir le bon fonctionnement du muscle squelettique adulte et la taille des organes car leur dérégulation peut conduire à un phénotype musculaire retrouvées dans différentes pathologies musculaires telles que les dystrophies musculaires. Notre objectif est de mettre en place pour la première fois des modèles de souris porteurs de 2 gènes non fonctionnels spécifiquement dans le muscle.

Bénéfices attendus

A terme ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant à des désordres de croissance, de régénération et de respiration mitochondriale dans le muscle. Il permettra d’identifier de nouveaux biomarqueurs potentiellement impliqués dans d’autres pathologies musculaires et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Des souris seront soumises à des injections par gavage quotidiennement durant 5-15 jours pour induire l'inactivation de gènes spécifiques et seront ensuite mises à mort pour examen des tissus. Des souris seront soumises à un test d'effort musculaire à l'aide d'un tapis de course informatisé pendant 1H sur une période de 5 jours consécutifs pour évaluer les fonctions métaboliques dans le tissu musculaire. Des souris seront placées en cage métaboliques pendant 7 jours.

Impact sur les animaux

Certaines souris pourraient dévéloppées des problèmes de locomotion. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’oesophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. La mise en cages métaboliques des animaux pendant 7 jours peut générer un stress lié à l’isolement.

Devenir

A l'issue des Procédures, l'ensemble des 650 animaux seront mis à mort afin de collecter les organes postmortem pour analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

La croissance et régénération musculaire est un processus biologique complexe où de nombreux types cellulaires communiquent entre eux en 3 dimensions, aucun modèle cellulaire ne peut mimer à ce jour ces processus. Les modèles animaux sont nécessaires pour évaluer les altérations moléculaires à la base des maladies et les interactions avec les différents organes, le système immunitaire et les régulations hormonales. Les modèles in vivo permettent d’envisager des essais précliniques. Tous les gènes concernés sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction. La souris est le modèle de choix pour introduire des mutations dans le génome des mammifères. Nous remplacerons dès que possible les expériences animales par des expériences in vitro.

Réduction

L'analyse de paramètres multiples par souris et l'utilisation de tests statistiques adaptés permettront de réduire le nombre de souris utilisées à son minimum. De plus, l’expérience du laboratoire montre qu’un groupe de 50 animaux est suffisant pour le test statistique choisi. Des groupes de 50 animaux seront donc utilisés. De plus, nous utiliserons un nombre minimal d'animaux pour avoir une puissance statistique (n= 650).

Raffinement

Le raffinement des conditions d’hébergement, d’élevage et de soins sera respecté par l’emploi de points limites précoces entraînant la mise à mort des animaux. Les souris bénéficieront d'un enrichissement constitué de coton et de « maisons » en carton. Les animaux sont observés tous les jours par le personnel qualifié pour assurer leur bien-être. Pendant les procédures, les responsables du projet tiendront une fiche d’observation des points limites tous les jours. Par ailleurs, toute procédure douloureuse ressentie par les souris entrainant une douleur, une souffrance ou une angoisse entrainera la mise à mort de l'animal. Le traitement au tamoxifen est donné sous forme de gavage quotidien qui sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des gavages sera réduit au minimum possible. Selon les seuils atteints, l’interruption de la procédure et la mise à mort anticipée de l’animal sera possible.

Choix des espèces

Voici plusieurs facteurs qui justifient le choix de la souris : 1) tous les gènes de la signalisation hippo jusqu’à présent identifiés sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction ; 2) la souris est le modèle de choix pour les techniques qui visent à introduire des mutations dans le génome des mammifères ; 3) nous disposons également de nombreux outils (anticorps, vecteurs, méthodes) adaptés à la souris ; 4) la taille des souris, leur durée de vie, leur capacité reproductive est particulièrement adaptée à un programme de recherche de 5 ans. L’âge des animaux choisis pour l’induction au tamoxifen sera de 1 à 3 mois. Il est nécessaire que l’organogenèse soit terminée. L’âge de mise à mort sera choisi en fonction de l’âge de la survenue du phénotype musculaire attendus vers 1,5-4 mois.

121 animaux non-humains vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 16 chiens et 105 porcs. Les porcs subissent des interventions chirurgicales pouvant durer jusqu'à six heures sous anesthésie profonde, puis sont tués sans réveil du fait des lésions provoquées dans plusieurs organes, alors que les chiens, opérés lors de procédures présentées comme non délabrantes, sont réutilisés ensuite. Le projet vise à mettre au point des plateformes robotiques d'ablation tumorale et de biopsie destinées d'abord à la chirurgie humaine. Le porteur affirme choisir le porc et le chien pour leur proximité anatomique avec l'humain et décrit un modèle qu'il juge indispensable pour valider l'efficacité in vivo.

Objectifs

Le projet a pour objectif le développement de plateformes robotiques destinées à l'oncologie interventionnelle (ablations tumorales), au diagnostic (biopsies) et/ ou à des interventions osseuses, par voie percutanée. Les objectifs principaux des plateformes robotiques sont: - d’atteindre très précisément les tumeurs afin de s’assurer que ces dernières seront bien détruites en limitant au maximum la destruction de cellules saines environnantes. - de cibler très précisément des tumeurs de très petite taille afin de disposer d'outils diagnostics fiables et performants (biopsies sous IRM par exemple) pour une prise en charge précoce. - de pouvoir ponctionner l'os ou y délivrer une substance (ciment osseux par exemple) de façon précise

Bénéfices attendus

Les plateformes robotisées proposent une atteinte très précise et sécurisée des tumeurs / tissus par voie percutanée. Couplées à une modalité d'imagerie CT-scan ou IRM, elles offrent un vaste panel d'utilisations, tout en élargissant le nombre de patients pouvant bénéficier de ces traitements mini-invasifs. Principalement destinées à l'utilisation en oncologie / chirurgie humaine, elles pourront également être utilisées en médecine vétérinaire et ainsi améliorer la prise en charge des animaux de compagnie. Une plateforme robotique a d'ores et déjà pu être mise au point et installée en centre anticancer pour le traitement de patients avec tumeurs des organes abdominaux.

Procédures

Les animaux sont soumis à des procédures chirurgicales: 1) insertion de cibles synthétiques (intervention non systématique) - par laparotomie, sous anesthésie: durée env. 30min - par voie percutanée, sous contrôle echographique, sous anesthésie: durée inférieure à 15 minutes 2) procédure chirurgicale robotique: - chez le Chien, la durée d'anesthésie totale sera plafonnée à 3h, et limitée autant que possible à 2h30, afin d'assurer une récupération optimale aux animaux. La procédure chirurgicale ne pourra donc pas excéder ces temps. - chez le Porc, la procédure pourra durer jusqu'à 6h, les animaux n'étant pas réveillés, et placés sous anesthésie profonde et analgésie adaptée. Ces procédures longues permettent d'évaluer un maximum de paramètres sur un seul animal et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pour les animaux sont liés à la réalisation des chirurgies pour l'insertion de cibles syntéthiques dans les organes par laparotomie: risque d'inconfort lié à la cicatrice, stress lié à l'isolement post-opératoire.

Devenir

Les porcs sont mis à mort sans réveil à l'issue de la procédure de chirurgie robotisée, du fait de la durée d'intervention et des essais effectués, qui peuvent entrainer des lésions dans différents organes. La procédure effectuée sur chiens est non délabrante et les animaux pourront être réutilisés après la procédure soit sur le même projet, soit sur un projet différent ou lors d'activités pédagogiques.

Remplacement

Les tests in-vitro (tests réalisés sur un fantôme et sur pièces anatomiques/cadavres) précédemment réalisés ont permis de vérifier et valider plusieurs paramètres dont la précision d’atteinte de la tumeur. En revanche, ils ne permettent pas de s’assurer que cette atteinte sera similaire sur un organisme vivant. En effet, ils ne prennent pas en considération les mouvements liés à la respiration et les risques potentiels d’atteinte d’autres structures tels que des vaisseaux sanguins ou organes lors du geste. Le projet a pour objectif de valider les aspects d’efficacité et de sécurité dans un modèle in-vivo, ne pouvant être validés lors des tests in-vitro.

Réduction

La réalisation d'une majorité de tests préalable in vitro ou sur pièces anatomiques permet de réduire le nombre d'animaux utilisés au strict minimum nécessaire pour la mise au point du protocole opératoire et l'obtention des données d'efficacité et de sûreté exigées par les autorités réglementaires (les robots opératoires sont des dispositifs médicaux). Les animaux sont opérés un par un, ou par petites séries de 2 animaux: cela permet de traiter les données obtenues au fur et à mesure, de réaliser des ajustements s'il le faut, et de stopper les procédures dès que les données nécessaires sont obtenues. Ainsi aucun animal "surnuméraire" n'est opéré.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leurs besoins éthologiques avec enrichissements propres à l’espèce. : ils disposent de vastes boxes, d'une taille supérieure à celle requise par la législation. Le sol est recouvert d'une litière végétale changée tous les jours. La nourriture est distribuée dans les gamelles et dans la litière pour leur permettre de prendre le temps de la trouver. Le suivi quotidien des animaux et les pesées hebdomadaires sont assurés par le personnel technique et animalier formés aux soins et à la manipulation de ces espèces. Les animaux suivront également un programme de socialisation avec renforcement positif afin de réduire le stress engendré par les actes quotidiens. Tout acte douloureux ou fortement stressant sera réalisé sous sédation ou sous anesthésie générale selon les besoins. Si nécessaire, la douleur sera prise en charge par l'administration de traitements analgésiques adaptés.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce animale se rapprochant anatomiquement le plus de l’Homme. Pour ce projet, nous avons besoin d’avoir des organes similaires à l’Homme en terme de structure et de taille, afin de pouvoir évaluer l’effet attendu en clinique. Les organes abdominaux du porc de 35 à 80kg (dont le foie) sont parmi ceux qui se rapprochent le plus de l’Homme. Le chien est l'espèce cible du robot de biopsie prostatique, donc le modèle de choix pour l'obtention des données recherchées. Par ailleurs les caractéristiques anatomiques de la prostate canine en font également un modèle intéressant pour l'obtention de données applicables à l'Homme, pour lequel ce robot pourra être adapté par la suite. Les animaux utilisés permettront donc de générer des données à double fin: le passage rapide en essais cliniques chez le Chien, et le développement utltérieur de la même technologie destinée à l'Homme. Les porcs utilisés en étude sont de jeunes animaux qui arrivent à maturité sexuelle, leur croissance n’est pas terminée mais leur taille permet un hébergement en animalerie conventionnelle dans de bonnes conditions. D’autre part, leur poids de 35kg à 80kg permet de travailler sur des organes abdominaux, notamment un foie de taille comparable à un foie humain, indispensable pour reproduire les conditions attendues en clinique. Les chiens seront des animaux adultes de plus d'1 an, de façon a avoir une prostate de taille définitive.

15 910 souris et 972 mini-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue pour analyse des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit un modèle de souris à phénotype dommageable dont environ 30 % meurent dans les premières 48 heures et 10 % développent des complications sévères comme une hydrocéphalie ou des troubles respiratoires. Les souris subissent des prélèvements sanguins jusqu'à sept fois par semaine, une biopsie d'oreille et des injections, les mini-porcs des prélèvements de sperme, de sang et des injections. Il affirme que le projet ne peut se faire sans modèle animal, le bénéfice pour les patients d'une maladie osseuse rare étant présenté comme "éventuel" et à long terme.

Objectifs

Le but de ce projet est de développer un traitement pour une pathologie osseuse rare. Il s'agit d'une maladie osseuse génétique qui cause une forme rare de nanisme chez l'être humain (1 naissance sur 100 000). Elle est caractérisée par une petite taille avec un raccourcissement du tronc et du cou, induisant un risque important d'instabilité au niveau des vertèbres cervicales pouvant provoquer une paralysie. Les patients souffrent également d'anomalies au niveau de l'oeil et d’une perte d'audition. Ce projet a pour but de continuer le développement d’un potentiel traitement pour cette pathologie. Ce projet nécessite l'utilisation de souris atteintes de la maladie mimant la pathologie humaine ce qui permettra de tester l’approche thérapeutique validée et l’améliorer.

Bénéfices attendus

Ce projet va nous permettre de faire la preuve de concept chez l’animal d’une approche thérapeutique pour cette maladie rare. Il s’agit d’une maladie rare sévère pour laquelle à l’heure actuelle il n’existe aucune approche thérapeutique. Dans le cas où cette approche fonctionnerait cela nous permettrait de continuer le développement dans le but d’apporter un jour un traitement efficace pour les patients. Il s’agit donc d’un bénéfice éventuel à long terme pour ces patients.

Procédures

Souris: prélèvements de sangs (30s), maximum 7 fois par semaine pour les microprélèvements et 1 fois par semaine pour les prélèvements de 7,5% du volume sanguin circulant. biopsie d'oreille (quelques secondes), une fois dans la vie de l'animal. Injection 1 à 3 fois dans la vie de l'animal (30sec à 10min) Miniporc: prélèvements de sperme (10-20min), maximum 1 fois par semaine. injections (1-60min), maximum 1 fois par semaine dans la vie de l'animal sauf pour les injections terminales 2 dans la même journée. prélèvements de sang (3-10min), maximum 2 fois par semaine.

Impact sur les animaux

Le modèles de souris utilisé dans ce projet est à phénotype dommageable. En effet, les animaux malades présentent des complications qui surviennent de façon chronologique et si les souris survivent les premières semaines, elles restent modérément atteintes. Environ 30% des animaux malades meurent dans les 48 premières heures et environ 10% développent des complications sévères (hydrocéphalie, pectus excavatum, troubles respiratoires) dans les 3 premières semaines de vie. Une attention toute particulière est apportée à ces animaux qui sont surveillés quotidiennement dès leur naissance. En ce qui concerne les souris et miniporc non malades, il n'y a pas d'effets indésirables prévues suite aux procédures. Il s’agit d’injection et de prélèvements réalisés par des personnes compétentes et formées. Les tampons qui sont prévus d’être utilisés sont à pH physiologique et peu visqueux.

Devenir

Tous les animaux inclus dans les procédures seront euthanasiès à la fin des procédures afin de pouvoir analyser les organes.

Remplacement

Ce projet ne peut pas se faire sans modèle animal car avant de pouvoir envisager un traitement, et de commencer une étude clinique sur les patients souffrant de cette pathologie osseuse, il est nécessaire de démontrer que les molécules choisies ont l'effet attendu au niveau du modèle animal de la maladie et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé de manière à produire les animaux nécessaires pour la partie expérimentation. Nous avons inclus dans les procédures des contrôles communs dès que possible.

Raffinement

Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur et les visites régulières des expérimentateurs (à minima trois fois par semaine) nous permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. En cas d'apparition d'une souffrance ou toxicité inattendue, les animaux seront exclus de l'étude et mis à mort dans les 24 heures avec l’accord du directeur d’étude.

Choix des espèces

Ce projet développe un traitement pour une pathologie rare de la croissance. Nous allons avoir besoin de souris pour faire du criblage de thérapie. Cela permet de cribler un grand nombre de molécules rapidement (gestation courte de 3 semaines et 5 à 8 petits en moyenne par portée). Le mini porc est utilisé pour démontrer la pénétration de l'approche thérapeutique dans la plaque de croissance d’une espèce non-rongeur. La plaque de croissance du mini porc est proche de celle de l’homme, donc cette espèce est un bon modèle dans le cadre de cette étude. Nous travaillons sur les porcelets, ce modèle permet d’avoir entre 6 et 10 petits par mise-bas et donc raffiner le nombre de femelles nécessaires. Nous allons utiliser des souris qui sont un mutant spontané caractérisé à l'état homozygote. Ces animaux ont un phénotype de nanisme similaire à la pathologie humaine. Chez la souris, les études de bio distribution seront réalisées sur des animaux âgés de 5 à 8 semaines et pour les études d’efficacité nous utiliserons les animaux de la naissance jusqu’à 18 mois d’âge. Dans le cas des mini porcs, les porcelets seront utilisés de la naissance jusqu’à l’âge de 12 mois maximum et les génitrices jusqu’à ce que les porcelets soient euthanasiés. Il n’est pas possible de remettre les génitrices en croisement après la mise bas. Cela nous permet de couvrir tous les âges potentiels d’utilisation du traitement chez l’homme.

1593 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une greffe sous-cutanée de quatre biomatériaux sous anesthésie, puis est tué de six heures à six semaines après l'opération pour récupérer les implants. Le porteur qualifie la chirurgie de faiblement invasive et bien supportée, tout en reconnaissant un risque de septicémie. Il affirme que la sélection du meilleur couple cellules-biomatériau passe par l'animal, une partie du travail restant menée in vitro.

Objectifs

Le traitement des grands défauts osseux est un défi chirurgical puisque 5 à 20% des fractures des os longs sont incapables de se consolider après 6 mois, causant ainsi des morbidités et des hospitalisations prolongées. Actuellement, une partie de l’os de la hanche du patient est prélevée puis greffée au niveau du site du défaut osseux. Ces fractures vont augmenter avec le vieillissement de la population, ce qui nécessite de trouver des alternatives de soin moins invasives et moins douloureuses pour le bien être des individus touchés. Plusieurs alternatives ont donc été développées comme l’utilisation de matériaux synthétiques ou d’origine naturelle (biomatériaux). Cependant, ces supports ne possèdent pas la capacité de former de l’os du fait, notamment, de l’absence de cellules souches. L’ingénierie tissulaire combinant les cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse humaines (BMSCs) avec des biomatériaux, représente une approche prometteuse pour réparer l’os endommagé. Cependant, malgré des résultats cliniques encourageants (essais de phase II), le délai de reconstruction de l’os reste encore trop long pour 75% des patients, révélant ainsi la nécessité d’optimiser l’efficacité de ces approches. Les résultats encore insuffisants des essais cliniques sont probablement dus à la courte durée de vie des BMSCs en raison du foyer inflammatoire et de l’absence de nutriment et d’oxygène au niveau du site endommagé. Ce projet est une phase préliminaire permettant d'étudier la vascularisation au niveau de l’implant afin d'améliorer la survie des cellules stromales mésenchymateuses greffées et ainsi améliorer la formation osseuse. L’association cellules-biomatériau ainsi que la répartition des cellules au sein du biomatériau semblent donc être fondamentales. L’objectif de ce projet à long terme est d’améliorer les thérapies de reconstruction osseuse existantes en concevant un produit d’ingénierie tissulaire efficace, adapté au patient et à moindre cout.

Bénéfices attendus

Tout d’abord, en travaillant sur les procédés de culture des cellules stromales mésenchymateuses humaines, nous envisageons de réduire le temps et le cout de production des cellules. Concernant le biomatériau, nous utiliserons des biomatériaux issus de l’impression 3D permettant une adaptabilité parfaite au défaut du patient. Ce projet nous permettra de déterminer le biomatériau avec la porosité et les propriétés biomécaniques les plus adaptées au développement de la vascularisation, ainsi qu’à la croissance et à la différenciation vers la voie osseuse de nos cellules.

Procédures

Chaque animal du projet sera soumis à un acte chirurgical sous anesthésie générale d’une durée de 15 minutes environ. Les animaux seront mis à mort afin de récupérer les biomatériaux greffés 6 heures, 72 heures, 1 semaine, 2 semaines, 4 semaines et 6 semaines après l’acte chirurgical.

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale de greffe sous-cutanée est faiblement invasive et très bien supportée par les animaux. Une fois réveillés de l’anesthésie, les animaux retrouvent très rapidement leur mobilité permettant de retrouver une alimentation et des interactions sociales normales. Toutefois, bien que toutes les précautions nécessaires d’asepsie soient respectées, un risque de septicémie suivant l’acte chirurgical ne peut être écarté.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue du projet afin de récupérer les échantillons greffés en sous-cutané.

Remplacement

Une partie du projet s’effectuera in vitro en testant la toxicité des potentiels biomatériaux sur les cellules ainsi que les capacités d’adhésion des cellules au biomatériau, son impact sur la différenciation vers la voie osseuse et sur la sécrétion de protéines favorisant l’inflammation. Le but de ce projet est de déterminer la meilleure association cellules / biomatériau afin d’améliorer les stratégies thérapeutiques existantes. Pour sélectionner la meilleure association, des analyses in vivo sont nécessaires afin d’étudier les interactions avec les cellules de l’hôte ainsi que la mise en place de la vascularisation.

Réduction

-La procédure chirurgicale est maitrisée dans le laboratoire et est effectuée par du personnel qualifié. - chaque animal est greffé avec 4 biomatériaux en sous-cutané afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en s’assurant de la véracité des résultats obtenus - Pour que l’étude soit statistiquement pertinente, 6 implants par condition dans 6 animaux indépendants seront réalisés. Afin de limiter les effets donneurs-dépendants, l’étude sera menée en utilisant les cellules stromales mésenchymateuses de 3 donneurs différents.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès libre à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, abris en carton, ou carré de coton compacté. La présence de blessure ou de tout autre signe de souffrance seront évalués quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Une période d’acclimatation d’une semaine est respectée avant de démarrer toute procédure sur les animaux. Une grille de score d'évaluation est proposée pour la prise en compte des critéres d'arrêt de la souffrance. Pour cela, nous suivrons la grille d’évaluation proposée : a)Changement du poids corporel 0. Normal 1. Perte de poids 20% b)Apparence physique 0. Normale 1. Manque de toilettage 2. Poil ébouriffé, paupière fermée 3. Poil très ébouriffé, posture anormale c)Comportement 0. Normal 1. Changements mineurs : activité réduite 2. Anormal : inactif 3. Très agité ou immobile, auto-mutilation Tout animal auquel aura été attribuée une valeur totale comprise entre 3 et 4 recevra de la Buprénorphine toutes les 12h pendant 3 jours après la chirurgie (0.1mg/kg en sous-cutané). Tout animal auquel aura été attribuée une valeur > 4 sera immédiatement mise à mort.

Choix des espèces

Afin d’éviter les biais dus à des variations physiologiques durant la phase de croissance osseuse, les souris utilisées seront d’âge adulte situé entre 6 semaines et 9 semaines (au-delà de cet âge une diminution de la masse osseuse due au vieillissement est observée)