Troubles musculosquelettiques

220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intramusculaires et intrapéritonéales, des mesures de force musculaire sous anesthésie, un test de suspension et un test d'actimétrie, pour mettre au point une thérapie génique contre une myopathie liée au gène Bin1. Le porteur décrit une atteinte musculaire qu'il juge légère et sans douleur, mais tue les souris pour prélever leurs organes et parce que la maladie deviendrait sévère si elles restaient en vie. Sur le remplacement, il affirme que les cultures cellulaires ne reproduisent pas un "organisme entier" et conclut que seul le modèle animal permet d'étudier la maladie.

Objectifs

Les myopathies centronucléaires sont une classe de maladies génétiques qui détériorent la fonction des muscles squelettiques et handicapent fortement la qualité de vie des patients qui en sont atteints et aucune thérapie n’est à ce jour disponible. Le principal objectif de ce projet est de mettre au point une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène Bin1. En parallèle nous souhaitons également étudier plus en détail les fonctions des différentes régions de la protéine BIN1 ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.

Bénéfices attendus

Dans l’hypothèse où notre stratégie thérapeutique s’avèrerait efficace sur le phénotype de notre animal modèle, cette étude serait une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène Bin1. Ce projet permettra également de faire avancer les connaissances scientifiques relatives aux fonctions des différentes régions de la protéine BIN1 ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.

Procédures

Les 100 souris de la cohorte « Injections intra-musculaires » seront soumises aux procédures suivantes : - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, non-invasive, hebdomadaire de 6 à 12 semaines d’âge, 20min par animal. - Injections intra-musculaires sous anesthésie générale, non-invasive, unique à 8 semaines d’âge, 5min par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 12 semaines d’âge. Les 120 souris de la cohorte « Injections Intra-péritonéale » seront soumises aux procédures suivantes : - Injection intra-péritonéale, animal vigile, unique au premier jour post-natal, 1min par animal. - Test de suspension, animal vigile, non-invasif, hebdomadaire de 3 à 10 semaines d’âge, 5min par animal. - Test d’actimétrie, animal vigile, non-invasif, unique à 10 semaine d’âge, 24h par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 10 semaines d’âge.

Impact sur les animaux

Les animaux présentent une légère atrophie et faiblesse musculaire mais qui n’affecte pas leur qualité de vie de manière significative aux âges analysés. Les animaux interagissent, se déplacent et s’alimentent normalement (poids normal). A notre connaissance il n’y a pas de douleurs associées au phénotype myopathique. La pose des électrodes sous-cutanée et l’injection intra-musculaire peux causer une inflammation dans le muscle tibial antérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin des deux procédures expérimentales pour plusieurs raisons : Notre projet nécessite la collection d’organes pour compléter l’analyse au niveau histologique et moléculaire. La myopathie étudiée est progressive et deviendrait potentiellement sévère si les souris étaient maintenues en vie.

Remplacement

Ces analyses ne peuvent pas être effectuées sur des cellules en culture car celles-ci ne reproduisent pas la fonction d’un organe et encore moins d’un organisme entier. En effet seul le modèle animal permet d’étudier d’une part la maladie dans sa globalité et d’autre part l’évolution des symptômes, ce qui est essentiel dans le cadre d’une mise au point de thérapie.

Réduction

Le nombre d’animaux a été basé sur les résultats de précédentes études sur ces mêmes animaux. Il nous permet d’assurer la robustesse statistique des différences entre animaux sains et malades et ainsi d’évaluer correctement l’effet de notre traitement. Afin de limiter le nombre d’animaux de la cohorte d’injections intra-musculaires nous injecterons les deux pattes (muscle tibial antérieur) de chaque animal, l’une avec la solution contrôle et l’autre avec un des traitements. L’utilisation d’un contrôle interne à chaque souris plutôt qu’un groupe de souris contrôles permet de renforcer la puissance statistique en s’affranchissant de la variation inter-groupes et de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Toutes les souris passeront des tests phénotypiques et leurs tissus seront collectés pour compléter l’analyse histologique et moléculaire, nous permettant ainsi de nous affranchir de la création d’une deuxième cohorte pour la collection de tissus. La mesure de la force musculaire in vivo par la procédure non-invasive hebdomadaire nous permet de faire le suivi de chaque animal, ce qui renforce la puissance statistique et nous affranchit de créer une cohorte d’animaux pour chaque semaine d’âge analysée.

Raffinement

Si des difficultés de locomotion apparaissent lors de l’hébergement, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Lors de la procédure de mesure de la force musculaire hebdomadaire, les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir tout stress causé par la procédure. Un gel protecteur oculaire sera appliqué pour prévenir tout inconfort d’assèchement oculaire lors du réveil. Les souris seront observées jusqu’à leur réveil (~5min) pour s’assurer qu’elles sont capables de se déplacer après le test. Lors de la procédure de mesure de la force musculaire sous anesthésie générale , les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir toute douleur lors de l’opération chirurgicale. Durant la procédure les souris seront placées sur une plaque chauffante pour maintenir leur homéostasie thermique et elles seront monitorées en permanence.

Choix des espèces

Pour tester l'éventuelle amélioration thérapeutique, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo sur modèle animal. Nous disposons déjà de plusieurs modèles murins de myopathies avec lesquelles nous avons publié plusieurs études sur les myopathies centronucléaires. Conserver la même espèce animale pour ce projet s’inscrit dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Nous prévoyons ainsi de réaliser cette étude sur des lignées de souris déjà disponibles dans nos laboratoires, ces modèles présentent des phénotypes comparables aux symptômes observés chez les patients humains. Enfin, le modèle murin présente l’unique avantage d’être génétiquement très proche de l’homme et facile d’élevage en raison de sa taille et de ses capacités de reproduction. Nous utiliserons ces animaux à des stades très précoces pour étudier l’effet de notre traitement avant l’apparition des symptômes mais également des animaux adultes pour étudier cet effet après l’apparition des symptômes.

200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie créant un défaut osseux dans la boîte crânienne, où sont implantés des biomatériaux, puis des scanners répétés sous anesthésie avant une mise à mort au CO2 pour analyses histologiques. Le projet teste des biomatériaux à base de verre bioactif censés favoriser la réparation osseuse et visibles par imagerie. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour ce modèle de défaut osseux du crâne chez le rat.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de confirmer la biocompatibilité, l’ostéoinduction/conduction et le potentiel de réparation de ces nouveaux biomatériaux in-vivo, et d'établir l’impact de la minéralisation sur les particules à luminescence persistante. Ce projet nous permettra d’établir le temps de survie des particules, mais aussi d’en analyser la potentielle migration.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de développer des biomatériaux qui présenteront des compétences ostéogéniques par la présence de verre bioactif et qui pourront être visualisables directement par imagerie.

Procédures

Procédure chirurgicale : 10 min, tous les animaux. Scanner Haute résolution sous anesthésie Isoflurane (Induction 3%, maintien 1.5%) : 15 min, J0 (200 animaux), J15 (160 animaux), J30 (120 animaux), J60 (80 animaux), J90 (40 animaux). Mise à mort par inhalation progressive au CO2 dans un système dédié : 10 min, tous les animaux, 40 animaux à chaque temps histologiques.

Impact sur les animaux

L'estimation de la souffrance de cette procédure est estimée "modérée" mais brève et bien tolérée. Au sein de cette procédure, seul l'acte chirurgicale peut mener à des suites douloureuses avec la présence d'hématome, oedeme ou désunions des sutures. Le CT-scan et la mise à mort n'ayant pas d'actions iatrogènes douloureuses. Le nombre d'animaux par groupe et par temps (10) est justifié en fonction des effets observés et permet d'envisager une étude adéquate sur le plan statistique.

Devenir

Mise à mort pour analyses histologiques

Remplacement

La régénération osseuse présente une biologie complexe impliquant la participation et l’intéraction de différents types cellulaires. Ces processus complexes ne peuvent être mimés en utilisant uniquement des cultures in vitro ou des modèles informatiques. Ces biomatériaux ont été préalablement étudiés in vitro et in vivo et ne présente aucune toxicité. Le modèle de défaut osseux de calvaria chez le rat est un modèle in vivo classiquement utilisé et il n’existe à ce jour aucune méthode alternative. A terme, ces travaux permettront de mettre au point des matériaux utilisables en clinique pour la réparation de défauts osseux de la sphère cranio-faciale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit par l’utilisation de tests statistiques déterminant la taille minimale des groupes expérimentaux (ici 10 animaux par groupe et par temps dû à l'implantation bilatérale des matériaux). Sur 3 ans un nombre maximum de 200 rats seront utilisés, des études par imagerie longitudinale seront effectuées à différents temps afin de réduire au maximum le nombre d’animaux par temps d’analyse. Tous les matériaux sont préalablement sélectionnés sur leurs propriétés ostéogéniques démontrées in vitro et une veille bibliographique sera systématiquement effectuée pour éviter toute expérience redondante. Si nous n’observons pas de différence entre les groupes à la moitié du nombre requis d’animaux, l’expérience sera arrêtée et les matériaux repensés.

Raffinement

La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales notamment l'utilisation d’anesthésie et d’analgésique adaptée durant les procédures avec une médication anti-douleur systématique en per et également post-opératoire, et l’établissement de points limites adéquats. Une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée. Les conditions d’élevage sont présentes pour le bien-être animal de façon à réduire le stress et l’anxiété dans un environnent enrichi au sein de groupes sociaux de plusieurs individus, avant et après les procédures.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de laboratoire appropriée et classiquement utilisée pour l’étude de l’inflammation et du tissu osseux. Elle permet une faisabilité technique et la biologie du tissu est proche de celle de l’homme. Notre laboratoire possède une expertise sur cette procédure. Les animaux seront âgés de 8 semaines, les animaux étant alors des jeunes adultes. Les adultes jeunes supportant mieux les chirurgies et ayant un potentiel de cicatrisation/régénération plus important. A 8 semaines, ils ont la taille minimale requise pour pouvoir créer chez le rat des défauts critique de 5mm bilatéral dans la calvaria.

1 376 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent des prises de sang sur animal vigile et des injections, 880 sont placées en cage métabolique jusqu'à 18 heures dont une période sans eau, et d'autres portent un modèle de drépanocytose provoquant des crises douloureuses. Le porteur indique anesthésier les gestes les plus invasifs et surveiller la douleur par une grille de score. Il affirme que la souris est "le seul modèle" permettant d'étudier à la fois les atteintes rénales et musculaires de la maladie.

Objectifs

La drépanocytose est la maladie génétique du sang la plus fréquente au monde. Cette maladie se manifeste par une déformation et une rigidification des globules rouges. Ces globules rouges déformés sont plus fragiles et sont la source de l’anémie hémolytique décrite chez les patients drépanocytaires. La forme en faucille de ces globules rouges favorise leur agglomération, l’interruption du flux sanguin et par conséquent, des crises vaso-occlusives, très douloureuses, au niveau de tous les organes du corps. La répétition de ces ischémies (un arrêt ou insuffisance de la circulation sanguine dans une partie du corps ou un organe, qui prive les cellules d'apport d'oxygène) induit des lésions sévères, notamment des organes les plus vascularisés et donc une réduction de la qualité et de l’espérance de vie des patients.Notre projet se concentre sur deux complications chroniques majeures de la drépanocytose : la maladie rénale et la fonte musculaire en s'intéressant aussi le point sur d’autres atteintes tel que la cardiomyopathie et la rétinopathie associée a la drépanocytose. Ainsi, les objectifs de notre projet sont de comprendre : 1- comment telles altérations multi-organes se produisent 2- si le muscle altéré peut avoir des effets déletèrent sur le rein ou vice-versa 3- comment pourrait on les prévenir ou les traiter

Bénéfices attendus

Cette étude pourra révéler une voie commune jusqu'alors non reconnue affectant à la fois le rein et les muscles dans la drépanocytose et éventuellement d'autres maladies hématologiques hypoxémiques. Elle pourra apporter une stratégie thérapeutique puissante pour la progression de la maladie rénale chronique et la fonte musculaire chez les patients atteints de cette maladie. En outre, l'exploration d'une interférence potentielle entre le néphropathie et la sarcopénie associées à la drépanocytose ouvre un nouveau domaine de recherche.

Procédures

Tous les souris (1376 souris) subiront un prélèvement de sang de 20 microlitres a sur souris vigile maintenue en contention manuelle. 160 souris subiront une injection deux fois par semaine pour six semaines sur souris vigile. 160 souris subiront une injection pour 5 jours consécutifs sur souris vigile. 160 souris subiront une injections de la patte postérieure aprés anésthésie gazeuse. 160 souris subiront deux injections séparées de 56 jours, de la patte, postérieure aprés anésthésie à l'isoflurane. 80 souris subiront une injection aprés anésthésie gazeuse. Tout les souris (1376 souris) subiront un prélèvement de sang aprés anésthésie à l'isoflurane et avant mis à mort. 880 souris seront mises en cages metaboliques, pour deux fois, séparées de 24 heures. La premier confinement en cages metaboliques sera pour 18 heures, le second sera pour 6 heures. 880 souris subiront deux mesures de pressions de 20 minutes non ivasives sur souris vigiles sur deux jours consécutifs.

Impact sur les animaux

Les souris subiront le stress d'être isolées pendant 20 minutes pour les mesures de pressions. Elles subiront aussi le stress d'être isolées pendant 6 heures allant jusqu'à 18 heures en cages metaboliques. Elles resteront sans eau pour 18 heures lors du confinement en cage metabolique. Elles subiront une douleur minime lors de certains prélèvements et injections. Cependant, lors des procédures plus invasives les souris seront anésthésiées à l'isoflurane et analgésiées.

Devenir

Etant donné que les organes de ses animaux seront analysés, les animaux de ce projet seront mis à mort.

Remplacement

Le modèle animal permet de réaliser des expériences de physiopathologie rénale et musculo-squelettique de mammifère en prenant en compte tous les paramètres physiologiques qui existent in vivo. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas relevantes en ce qui concernent l'étude des maladies glomérulaires et musculaire car il existe beaucoup de paramètres physiologiques qui entrent en jeu.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d'animaux requis afin de permettre une analyse statistiquement pertinente des résultats en prenant compte de la variabilité inter et intra expérience. Les résultats seront analysés par des tests statistiques adaptés à la taille de nos échantillons. Pour chaque animal, un maximum d'organes et de prélèvement biologique sera fait afin de ne pas avoir à refaire des experiences sur de nouveaux animaux.

Raffinement

Afin de réduire l'angoisse et la souffrance des animaux des mesures seront prises : 1) Une surveillance des animaux, quotidienne par les zootechniciens et bihebdomadaire par l'expérimentateur, sera réalisée. Une grille de score d'évaluation de la douleur a été établie permettant d'évaluer la souffrance des animaux et de déterminer des points limites. 2) La procédure terminale sera réalisée sous anesthésie. 3)Les procédures invasives tel que certaines injections seront réalisées aussi sous anesthésie et les souris recevront un traitement analgésique qui sera renouvelé et poursuivie si les animaux présentent des signes de souffrance. 4)Les souris seront hébergées en groupe et l’enrichissement de leur environnement sera à base de coton déchiquetable, préservant ainsi une activité et un exercice naturel.

Choix des espèces

La souris est le seul modèle permettant à la fois de réaliser des expériences de physiopathologie rénale et musculo-squelettique de mammifère et d'utiliser la recombinaison homologue ou l'excision allélique dirigée afin de connaitre la fonction des produits des gènes in situ et in vivo. A partir de 4 semaines, une fois que le sevrage physiologique est effectif et jusqu'à 6 mois pour ne pas observer une potentielle fibrose rénale liée au vieillissement. En effet, l'âge est un facteur de risque de fibrose rénale et utiliser des souris trop âgées induirait une plus grande variabilité de nos résultats expérimentaux.

279 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur lèse un muscle de la patte arrière par injection d'une toxine, puis on leur injecte des cellules immunitaires génétiquement modifiées par voie intramusculaire ou dans la veine de la queue. Le porteur cherche à mettre au point une stratégie pour délivrer des molécules thérapeutiques aux muscles dans les maladies musculaires. La mise à mort sert des analyses des tissus, et le porteur précise que tout animal tué peut fournir des prélèvements à d'autres projets de l'équipe.

Objectifs

Un obstacle majeur au développement de thérapies musculaires est de parvenir à délivrer les molécules thérapeutiques aux muscles, qui sont répartis dans tout l'organisme et représentent plus de 40% de la masse totale chez l’adulte. Ce projet vise à développer une nouvelle stratégie de délivrance aux muscles, basée sur l'utilisation de cellules sanguines génétiquement modifiées. La plupart des maladies musculaires provoquent une dégénérescence des fibres, entraînent un recrutement naturel de cellules immunitaires du sang aux sites de régénération, le muscle étant très irrigué. En modifiant ces cellules immunitaires pour les rendre capable de reconnaître les sites de régénération et de fusionner avec les cellules musculaires, nous cherchons à générer un outil qui puisse cibler le muscle blessé, fusionner avec les fibres nouvellement formées et délivrer des molécules d'intérêt thérapeutique. Les cellules immunitaires utilisées dans ce projet sont des cellules T (lymphocytes) génétiquement modifiées par des virus, afin d'exprimer des molécules de reconnaissance musculaire et des protéines de fusion à leur surface. Des essais de fusion de ces cellules sanguines à des cellules musculaires ont déjà été réalisés dans l’équipe apportant une preuve de principe pour cette stratégie in vitro. Nous sommes prêts à étendre notre étude in vivo, par l'utilisation d’un modèle animal capable de reproduire cet obstacle de délivrance présent chez l'homme. La souris représente un modèle optimal pour ces approches, avec la possibilité d’utiliser des protocoles établis pour la délivrance de cellules par voie intraveineuse, et la possibilité de mimer les phénomènes de réparation des muscles. Les lymphocytes T génétiquement modifiés seront administrés à des souris immunodéficientes, dont le muscle a été lésé par une injection de toxine, induisant un contexte de régénération et d’inflammation aigu. L’objectif du projet est donc d’utiliser les cellules T comme cargo pour véhiculer des molécules thérapeutiques aux muscles en régénération via la circulation sanguine. Les objectifs sont donc multiples : s’assurer qu’après manipulation génétique, les cellules T thérapeutiques fusionnent aux muscles dans un contexte systémique d’organisme vivant, qu’elles peuvent être recrutées aux sites de régénération et qu’une combinaison de ces deux propriétés permette d’avoir un système de transport de molécules thérapeutiques efficace.

Bénéfices attendus

Ce projet totalement novateur permettrait de prouver la fusion de cellules immunitaires sanguines aux cellules musculaires in vivo et ainsi de mettre en avant l’utilisation de ces cellules sanguines comme outils thérapeutiques dans le combat contre les myopathies ; notamment la myopathie de Duchenne, très étudiée aujourd’hui, pour laquelle pourtant les alternatives thérapeutiques font défaut. Si cette stratégie fonctionne, des systèmes de réparation des mutations génétiques causant la maladie sont en train de faire leurs preuves sur le marché, leur expression par nos cellules immunitaires thérapeutiques pourrait être une avancée majeure dans le domaine. De plus, l’étude de la régénération des muscles dans ce modèle spécifique de souris immunodéficientes n’a jamais été réalisée et elle permettra d’enrichir la littérature.

Procédures

La première intervention commune à tous les animaux sera la lésion musculaire (d’un muscle de la patte arrière), par injection intramusculaire d'une toxine, qui peut occasionnellement entrainer une diminution de la mobilité des souris pendant les heures qui suivent. Cette injection sera unique pour chaque patte de l’animal, le temps d’injection par patte est de 30 secondes, l’anesthésie pour cette procédure est au maximum de 10 minutes par animal et se fait par isoflurane (transitoire par les voies respiratoires). Les animaux subiront également des injections de cellules immunitaires. Certains en intramusculaire, la procédure est la même que pour la lésion. D’autres en intraveineux, qui correspond à une injection unique de cellule dans la veine de la queue, sous anesthésie toujours par les voies respiratoires. L’injection dans la veine dure 1 minute par injection et les animaux seront anesthésié au maximum 10 minutes. Les souris recevront aussi une injection d’analgésique pour éviter les douleurs liées aux injections intra-musculaires et intra-veineuses, en sous-cutanée, au maximum 2 fois (une fois lors de la lésion et une fois lors de l’injection de cellules, si les deux injections sont à des temps différents). Les souris soumises à de l’imagerie in vivo pourront y être soumises tous les 3 jours (injection de réactif, en sous-cutanée, puis anesthésie, par les voies respiratoires pendant maximum 10 minutes le temps de la prise d’image) pendant au maximum 14 jours. Les animaux vont être transportés dans leurs cages d'habitat avant chaque lecture de bioluminescence (dans le même bâtiment), le transport (aller ou retour) dure au maximum 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux de ce projet vont subir des interventions non chirurgicales et les seuls actes effectués seront des injections sous-cutanées et intra-musculaires. L’injection intra-musculaire de cardiotoxine pour léser le muscle porte un risque spécifique et une attention particulière sera portée sur la capacité motrice des souris (même si les animaux présentent une régénération spontanée et totale des muscles après cette technique et qu’elle ne doit en théorie pas les empêcher de marcher, même directement après lésion). L’inconfort lié à la piqûre sera évitée car sous anesthésie et la douleur au réveil sera prise en charge par des analgésiques préventifs. Les injections de cellules intra-musculaire ou intraveineuses (prolifération non contrôlées in vivo) seront à surveiller pour toute apparition de masse dans la patte, l’inconfort et la douleur seront pris en charge de la même manière que lors de la lésion musculaire. Les effets indésirables attendus pour les injections sous-cutanées sont l’inconfort lié à la sensation de piqûre. Les animaux vont aussi être soumis à des inhalations d’isoflurane (anesthésique) plusieurs fois au cours des expériences, une bonne et rapide récupération de l’anesthésie (réveil) est à surveiller. Les animaux vont aussi devoir être transportés (dans le même bâtiment) avant toute imagerie de bioluminescence. L’accès à l’eau et la nourriture ainsi que leurs habitats ou le groupe dans la cage resteront inchangés.

Devenir

A l’issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort pour analyse des tissus. En effet, même dans le cas où les images de bioluminescence donnent des résultats positifs, des analyses histologiques des tissus (coupes musculaires) seront effectuées afin de comprendre plus en détail (de façon microscopique) le fonctionnement des phénomènes que l’on voit apparaître tels que la localisation des cellules injectées ou leur fusion aux muscles, ou tout simplement attesté d'une bonne régénération du muscle.

Remplacement

Ce projet vise à tester la capacité de fusion de cellules T modifiées avec les fibres musculaires, suite à leur administration systémique dans la circulation sanguine. Après une preuve de concept de la fusion des deux types cellulaires (sanguine et musculaire) in vitro, il n’existe actuellement aucun moyen de continuer ce projet pour une étude dans un contexte systémique autrement que dans un système animal complet. L’organisme de la souris pourra permettre de comprendre l’influence du micro-environnement de la lésion musculaire et l’implication des cellules en périphérie des muscles sur notre modèle thérapeutique.

Réduction

Ce projet a été pensé avec un nombre d’animaux minimum pour avoir un effet statistiquement significatif. Un effort de réduction des animaux est amené par l'utilisation de l'imagerie de bioluminescence in vivo : cela permet de suivre la progression de l'expérience à différents points de temps sans mettre à mort l’animal. De plus tout animal mis à mort peut être utilisé pour obtenir des prélèvements nécessaires à d’autres projets de l’équipe (notamment extraction de cellules T pour test in vitro sur ce projet). Lorsque cela est possible, les muscles des deux pattes seront injectés afin réduire le nombre d’animaux en conservant une puissance statistique qui nous permettra de conclure sur l’expérience. Finalement, le projet est découpé en multiples procédures qui vont nous permettre de comprendre le comportement des cellules injectées dans l’animal et d’ajuster certains paramètres avant l’expérience d’intérêt thérapeutique, ce projet ne représente alors pas seulement la recherche d'un résultat mais la compréhension de processus encore non décrits dans la littératures.

Raffinement

Dans un esprit de raffinement du projet, les protocoles choisis en priorité sont ceux qui limitent la douleur et l’inconfort de l’animal. Des analgésiques et des anesthésiques sont combinés pour réduire au maximum la douleur et le stress de l’animal lors des procédures de type lésion musculaire et injection de cellules. Les animaux sont surveillés quotidiennement dans les trois jours qui suivent l’injection de cardiotoxine ou de cellules notamment afin de s’assurer de la mobilité des animaux dans les cages. Une grille d’évaluation clinique est mise en place, basée sur le comportement (prostration, aggressivité), l’aspect physique (aspect du poil, prise ou perte de poids) et la physiologie de l’animal (de plis cutanés, signes de déshydrations, de diarrhées). Le niveau d'analgésique (de pallier 1, 2 ou 3) est adapté selon le score total. Un score supérieur à 8 sans effet des analgésiques de pallier 3 constitue un point limite de mise à mort de l’animal. Le raffinement des animaux passe aussi par l’enrichissement de leur habitat spécifique à leur génotype dommageable immuno-déficient comme des aliments et des éléments de jeu irradiés et des manipulations en milieu stérile.

Choix des espèces

La souris est couramment utilisée dans le domaine de l’immuno-oncologie (cellules CAR T) et les protocoles associés à cette technique sont hautement normalisés. De plus, le modèle de lésion aiguë à la cardiotoxine est vastement utilisé et la régénération spontanée et rapide des muscles de souris ce qui en fait un candidat très intéressant pour notre étude. Le modèle murin sert aussi couramment de modèle de dystrophie musculaire dans des études précliniques ce qui valide notre approche pour une potentielle étude dans un contexte de lésion chronique des muscles, voire, dans le cadre d’une application thérapeutique chez les patients. Le projet concerne des animaux adultes étant donné que le muscle termine sa croissance aux alentours de 5 semaines. Les animaux sont utilisés préférentiellement entre 7 et 12 semaines. Cependant, afin de réduire le nombre d'animaux pour former des cohortes, les souris peuvent être utilisées jusqu'à l'âge de 5 mois.