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Prélèvement de globules blancs circulants canins pour mise au point d’un produit de thérapie cellulaire ciblée
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
15 chiens vont être utilisés, réutilisés dans la suite du projet ou proposés à l'adoption plutôt que tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent jusqu'à trois prélèvements sanguins et une cytaphérèse de deux à trois heures sous anesthésie générale pour recueillir des globules blancs. Le porteur met au point la production de cellules CAR-T canines en vue de traiter la fibrose de la myopathie de Duchenne chez le chien malade. Il affirme que le prélèvement de lymphocytes T ne peut se faire que chez un individu vivant.
Objectifs
En cancérologie, l'une des approches thérapeutiques actuellement utilisées est basée sur l'utilisation de cellules CAR-T (lymphocytes T(=sous-population de globule blanc) avec récepteur antigénique chimérique). Les globules blancs du patient sont isolés par cytaphérèse (procédure s'apparentant à celle utilisée lors de dons de plaquettes par exemple), puis modifiés en culture pour cibler un marqueur spécifique de la tumeur à traiter. L'idée d'appliquer cette méthode à d'autres contextes pathologiques dans lesquels un marqueur spécifique d'une cible à détruire est exprimé, a émergé. En particulier, un marqueur spécifique de la fibrose a récemment été identifié et des cellules CAR-T pourraient être utilisées pour attaquer la fibrose qui est présente dans de nombreux contextes pathologiques. Une maladie dans laquelle une fibrose s'installe et entraîne une perte de fonction majeure est la myopathie de Duchenne. Chez le chien modèle de cette maladie, une fibrose s'installe dans les muscles et le coeur, comme chez les patients humains, et il a été démontré que le marqueur de la fibrose est bien présent dans ces tissus. Avant d'entamer une étude thérapeutique chez des chiens malades, il est nécessaire de réaliser une phase de mise au point pour maîtriser la production ex vivo des cellules CAR-T canines. Ce projet a donc pour objectif de prélever des globules blancs circulants chez des chiens afin de les mettre en culture et mettre au point la technique permettant de les manipuler génétiquement pour en faire des cellules CAR-T.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre au point la manipulation ex vivo des globules blancs canins nécessaire à la production de cellules CAR-T dirigées contre la protéine spécifique de la fibrose. Cela permettra de démarrer les études de tolérance et d'efficacité avec une bonne maîtrise et standardisation de ces étapes cruciales.
Procédures
- Prélèvements sanguins 50 mL (3 maximum par chien de plus de 20 kg, espacés d'au moins 3 semaines), sur chien vigile. Durée totale 10 minutes, 1 minute pour le prélèvement proprement dit. - Prélèvement de globules blancs (1 fois) par cytaphérèse, sur chien placé sous anesthésie générale. Durée 2-3 heures.
Impact sur les animaux
Au cours des deux procédures, les animaux pourront subir un stress, lié à la contention et à la ponction sur chien vigile pour la première procédure, et à l'anesthésie générale pour la seconde. Tout sera mis en oeuvre pour réduire ce stress, en travaillant avec douceur, en rassurant les chiens par la voix et les caresses. Les chiens seront manipulés uniquement par des personnes qu'ils connaissent bien. Ils recevront une friandise à la fin du prélèvement réalisé vigile. Par ailleurs, s'agissant dans les deux procédures de ponctions veineuses, la formation d'un hématome pouvant générer une douleur n'est pas exclue. Une vigilance sera portée à la bonne coagulation, mais si un hématome se formait, le chien se verrait prescrire des anti-inflammatoires non stéroïdiens durant 3 jours après le prélèvement. Durant la cytaphérèse, le citrate introduit par la machine comme anticoagulant, et réinjecté au chien après passage du sang dans le circuit, peut avoir un effet hypocalcémiant (chute de la quantité de calcium dans le sang). Ce point sera surveillé attentivement par des dosages à intervalles réguliers. Une perfusion de gluconate de calcium sera systématiquement mise en place, et son débit ajusté à la concentration sanguine en calcium.
Devenir
Les chiens pourront être réutilisés dans la suite du projet. Dans le cas contraire, ils seront proposés à l'adoption.
Remplacement
Afin de travailler in vitro sur des lymphocytes T de chiens, il est nécessaire de pouvoir les prélever chez un individu vivant. L'utilisation d'animaux dans ce contexte ne peut donc être évitée.
Réduction
Le nombre de chiens prélevés, que ce soit par prélèvement de sang classique ou par cytaphérèse sera réduit le plus possible. Pour ce faire, chaque prélèvement réalisé sera exploité le plus possible in vitro afin de limiter le nombre de prélèvements nécessaires pour la mise au point technique prévue. Il est très probable qu'il ne sera pas nécessaire d'utiliser les 15 animaux prévus dans ce projet.
Raffinement
Les prélèvements par cytaphérèse seront réalisés sous anesthésie générale afin de limiter le stress généré par ce prélèvement non douloureux mais long (2-3 heures). Au cours des deux procédures, une attention particulière sera portée à la coagulation correcte après le prélèvement. En cas d'hématome, celui-ci pouvant générer une douleur, une analgésie (anti-inflammatoires non stéroïdiens) sera mise en place après le prélèvement. Au cours des prélèvements par cytaphérèse, l'anticoagulant utilisé pouvant avoir un effet de diminution de la concentration sanguine en calcium, cette concentration (calcémie) sera étroitement surveillée, et le chien sera complémenté par une perfusion continue de calcium, dont le débit sera adapté en fonction de la calcémie. Si un chien avait une valeur de calcémie basse en fin de cytaphérèse, l'anesthésie générale ne serait stoppée qu'après retour à une calcémie normale. Les chiens seront hébergés en petits groupes compatibles, sur litière végétale. Ils auront à leur disposition un lieu de couchage (corbeille + tapis), une plateforme, des jouets. Ils bénéficieront d'intéractions quotidiennes avec leurs soigneurs (caresses, jeux), et d'une sortie quotidienne 7j/7 dans des espaces de jeux intérieur et extérieur.
Choix des espèces
L'étape préclinique de validation de l'efficacité du produit thérapeutique en développement est prévue chez le chien. La mise au point de la production des cellules CAR-T dans ce contexte ne peut donc se faire que dans l'espèce canine. Nous utiliserons des animaux adultes, afin que leur poids corporel soit supérieur à 20 kg, et donc compatible avec un prélèvement sanguin volumineux et une cytaphérèse.
Etude des mécanismes de l’atteinte musculaire dans des modèles de titinopathies
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
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80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent deux implantations de pastilles sous la peau par une canule et trois prélèvements sanguins, pour tester si l'activation de l'autophagie par la rapamycine améliore une dystrophie musculaire d'origine génétique. Le porteur indique que les souris seront euthanasiées à la fin pour prélever leurs organes, et que l'insertion des pastilles peut provoquer une douleur ainsi qu'une sécheresse oculaire pendant les anesthésies. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet d'étudier cette maladie, décrivant les cultures cellulaires comme incapables de reproduire une pathologie qui se développe trop lentement.
Objectifs
L'objectif de ce projet s’inscrit dans l’évaluation d’approches thérapeutiques pour des maladies génétiques rares, les dystrophies musculaires, pour lesquelles il n’existe, à l’heure actuelle, aucun traitement. Les dystrophies musculaires sont des maladies dégénératives du muscle qui conduisent à une perte progressive des fonctions motrices telle que la marche. La dystrophie musculaire étudiée dans ce projet est la dystrophie musculaire tibiale (TMD) qui est due à une mutation dans le gène de la titine. Bien que les mécanismes pathogéniques moléculaires de cette maladie ne soient pas entièrement compris, un certain nombre d’éléments suggèrent qu’une activation du mécanisme de nettoyage cellulaire appelé autophagie pourraient être bénéfique pour améliorer le phénotype. Notre étude vise à déterminer l’effet d’une activation de l’autophagie sur le phénotype de souris modèle de la TMD afin de comprendre si une modulation de l’autophagie pourrait consister en une approche thérapeutique pour les patients TMD.
Bénéfices attendus
Dans ce projet, nous proposons de définir si l’activation de l’autophagie a un effet bénéfique sur la pathologie TMD. La molécule utilisée, la rapamycine (Sirolimus, Rapamune®) est une molécule ayant déjà l’autorisation d’utilisation chez l’homme. Il sera donc possible à la fin du projet de préparer un essai clinique chez les patients TMD pour valider son usage dans cette pathologie qui n’a pas de traitement à ce jour.
Procédures
Les interventions sur les animaux comprennent l'insertion des pastilles par une canule deux fois au cours du protocole et les prélèvements sanguins trois fois au cours du protocole.
Impact sur les animaux
Les nuisances (douleur ou stress) attendues sur les animaux sont liées à la nature des actes réalisés: douleur liée à l’insertion des pastilles par la canule deux fois au cours du protocole et aux prélèvements sanguins. Il y a une possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser le prélèvement des organes.
Remplacement
Aucun modèle alternatif à des modèles animaux ne nous permet d’étudier les symptômes typiques des dystrophies musculaires pour répondre aux questions posées. Théoriquement, les méthodes alternatives à l’expérimentation animale peuvent être de différentes natures : méthodes in silico ou in vitro. Les approches in silico utilisées en alternative à l’expérimentation animale à ce jour permettent uniquement des modélisations physico-chimiques comme la relation entre structure et activité biologique d’une molécule ou des modélisations toxico-cinétiques d’élimination de molécules. Des modèles in silico qui pourraient permettre de modéliser numériquement les expériences proposées dans ce projet à partir d’un ensemble de données n’existent donc pas à ce jour. Les méthodes in vitro les plus utilisées aujourd’hui comme alternative en expérimentation animale sont basées sur l’utilisation de cultures cellulaires. Elles présentent l’avantage d’offrir la possibilité d’utiliser des cellules humaines avec les considérations éthiques correspondantes bien sûr. Il est possible de réaliser des cultures cellulaires ou des organoïdes pour les organes considérés avec, même une certaine complexité, comme en co-culture avec certaines cellules additionnelles. Cependant, il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro de la pathologie étudiée dans ce projet d’autant que les symptômes se développe lentement sur une période qui dépasse la durée possible de maintenance de cellules en culture.
Réduction
Ce projet se limite aux expériences considérées comme absolument indispensables et prévoit l'exploitation maximale des données obtenues. Vu l’âge des animaux et la durée du protocole, nous réaliserons un maximum de prélèvements après la mort des animaux, plus que ce qui serait nécessaire pour la réponse à la question de ce projet. Ces prélèvements seront conservés et seront donc disponibles pour répondre à des questions qui pourraient émerger des résultats obtenus ou d’autres sources comme la littérature. Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le critère choisi est une réduction du niveau des fibres musculaires ayant subi au moins un cycle de dégénérescence. Le test statistique utilisé donne N=10 par groupe.
Raffinement
Nous avons choisi d’administrer la molécule à l’aide de pastilles sous cutanées qui permettent la délivrance de la molécule pendant une période de 60 jours. Cette méthode permet un contrôle de la quantité de produit administré en assurant une distribution continue et une stabilité du produit et donc une meilleure reproductibilité. Cette méthode permet de limiter drastiquement la manipulation des animaux avec 2 implantations sur 4 mois au lieu de manipulations quotidiennes, évitant par la même du stress aux animaux.
Choix des espèces
Pour ce projet, nous utiliserons l’espèce souris car le modèle existant de la pathologie étudiée est sur cette espèce Les animaux seront utilisés au stade adulte à un âge permettant l’observation d’une atteinte histologique bien installée à la fin du protocole pour des souris non traitées avec la molécule.
Etude de l’impact de différents types de vésicules extracellulaires sur le processus de régénération musculaire chez le rat dystrophique
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
122 rats dystrophiques vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal reçoit des injections de vésicules extracellulaires dans le muscle et en intraveineuse, avec des prises de sang, l'injection intramusculaire provoquant un dommage au site, puis est tué après cinq jours à trois mois de suivi. Le porteur indique avoir choisi le rat DMDmdx car la souris mdx présente des lésions musculaires trop limitées, jugeant sa transposition à l'humain peu fiable. Il affirme que seul l'animal vivant permet d'étudier l'effet de ces vésicules sur un muscle dystrophique.
Objectifs
La myopathie de Duchenne (DMD) est la plus fréquente des dystrophies musculaires liée à des mutations du gène de la dystrophine conduisant à son absence et entrainant une dégénérescence musculaire progressive avec atteintes cardiaques et respiratoires sévères. L’évolution conduit au décès du patient. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Il a été récemment démontré que certaines vésicules extracellulaires (EVs) issues de certaines cellules souches et administrées chez la souris, permettaient une réexpression de la dystrophine, une diminution de la fibrose et de l’inflammation du muscle, ainsi qu’une amélioration de la fonction musculaire, cardiaque comme squelettique. Ces données démontrent un intérêt majeur des EVs dans la thérapie pour la DMD. Cependant ces données ont été obtenues sur un modèle de souris peu affecté cliniquement et sur un temps d’étude court. De même, l’origine cellulaire de ces EVs détermine leur contenu et donc leur efficacité. Les études menées jusqu’alors ont utilisé des EVs de certaines cellules murines, aucune à partir de cellules humaines. Nous souhaitons déterminer l’effet long terme de des EVs issues de nos cellules spécifiques humaines sur le model de rat DMD. D’autre part, nous souhaitons comparer l’effet de ces EVs issues de myoblastes avec des EVs issues d’une autre source cellulaire qui constituent un candidat cellulaire potentiel à la thérapie de la DMD en partie lié à leur effet paracrine sur le tissu musculaire. L’objectif du projet est de déterminer in vivo dans quelle mesure l’injection intramusculaire ou systémique des EVs pourrait moduler positivement le processus de régénération musculaire dans le contexte de la DMD.
Bénéfices attendus
Ce projet est basé sur des résultats in vitro montrant un intérêt potentiel des EVs de myoblastes dérivés d’iPS et du secrétome de cellules hMuStem dans le cadre du traitement de la DMD. Pour positionner ces EVs comme traitement, des données in vivo sont fondamentales à ce stade du projet et permettront de développer une nouvelle proposition thérapeutique pour une pathologie musculaire à ce jour sans traitement curatif.
Procédures
Des injections d’EVs en IM et IV seront réalisées sur l’ensemble des 122 rats. Des prélèvements sanguins seront également réalisés à l’occasion de cette procédure aux temps initiaux et terminaux et jusqu'à une fois par mois. Elles se feront au niveau de la veine jugulaire sous anesthésie et analgésiques et durent 5 min maximum. Les injections IM se font une fois par animal au niveau des muscles tibiales sous anesthésie et analgésie et durent environ 10 min. Les injections IV se feront une fois par animal au niveau de la veine caudale ou pénienne sous anesthésie et analgésie et durent environ 5 min.
Impact sur les animaux
L’administration des EVs se fera par injection IM (générant un dommage au site d’injection) ou IV.
Devenir
Tous les animaux des groupes cités seront gardés en vie, suite à l’injection IM des EV et suivis sur une durée fixe de 5 jours, 3 semaines ou 3 mois, à l’issue de laquelle ils seront mis à mort.
Remplacement
Le remplacement d'animaux ne sera pas possible dans cette étude car l’objet est ici précisément de tester l’effet des EVs in vivo après avoir générées des données expérimentales in vitro, et ce dans le but de déterminer leur pertinence biologique. L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier cet impact sur le phénotype d’un muscle dystrophique.
Réduction
Le projet sera divisé en 4 parties séquentielles afin de réduire au maximum l’utilisation d’animaux. Les parties I (étude pilote) et II seront déterminantes pour la suite du projet. D’autre part, les groupes d’animaux utilisés ont été réduits au minimum pour répondre aux questions biologiques pertinentes et le nombre d’animaux par groupe a également été réduit tout en demeurant suffisant pour une analyse statistique robuste
Raffinement
Concernant le raffinement, le bien-être animal passera par : - de bonnes conditions d'hébergement selon réglementation avec enrichissement du milieu (tunnels en cartons ou PVC, frisottis de papier, bûchettes de bois et hébergement à deux animaux si possible). - un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement), - l'instauration de points limites pertinents avec mise en place de mesures adaptées (anesthésies, analgésie ou euthanasie), - une réactivité accrue du personnel animalier avec mise en place d’une grille de scoring de la douleur dès que nécessaire pour détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates (Cf. annexe I), - la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions (anesthésie et analgésie).
Choix des espèces
Les modèles animaux de la DMD le plus souvent utilisés sont des modèles rongeurs et plus spécifiquement le modèle de la souris mdx. Ce modèle souffre de sérieuses limitations, notamment la mise en place de mécanismes de compensation aboutissant à des lésions musculaires très limitées et une faiblesse musculaire quasiment inexistante. Ceci limite grandement la transposition des résultats obtenus sur ce modèle avec l’Homme. Le choix du modèle de rat DMDmdx s’avère pertinent car il présente dès 3 mois une nécrose et une forte régénération des muscles des membres et du diaphragme. Ces rats montrent une faiblesse musculaire accompagnée d’une cardiomyopathie dilatée et d’une diminution de la force motrice. Les rats seront injectés à 4 mois d’âge afin de se placer dans un contexte de lésion musculaire suffisamment avancé afin de détecter un potentiel effet tissulaire.
Evaluation de composés administrés chez le rat développant une ostéodystrophie consécutive à une insuffisance rénale
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1 500 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent une alimentation enrichie en adénine qui provoque une insuffisance rénale et une forte baisse de poids, puis des composés par gavage ou injection et des prélèvements de sang et d'urine, avant d'être autopsiés pour prélever les os. Le porteur indique que l'insuffisance rénale peut entraîner une rigidité abdominale et une inflammation, surveillées par des grilles cliniques. Il affirme qu'aucune méthode ne reproduit le remodelage osseux d'un organisme entier et juge l'évaluation chez l'animal "indispensable" avant l'usage des composés chez des patients.
Objectifs
En France, 10 % des adultes présentent une maladie rénale chronique (MRC). Le nombre de personnes atteintes est ainsi estimé à près de 3 millions. La MRC induit des troubles du métabolisme des minéraux conduisant à des lésions osseuses (ostéodystrophie) et des calcifications vasculaires qui aggravent le pronostic fonctionnel et vital du patient. 45 à 80% des patients atteints de MRC développent des lésions osseuses plus ou moins sévères. Dans le but d'améliorer la qualité de vie des patients et de réduire leur morbidité, l'évaluation de composés susceptibles de réduire les lésions osseuses devient indispensable, et c’est dans ce contexte que s’inscrit ce projet. La présente demande a pour but d'évaluer les effets de l’administration d’un composé d’intérêt chez le rat atteint d’ostéodystrophie. Le composé étudié est susceptible de réduire des lésions osseuses. Des études pilotes seront réalisées pour chaque lot de composé d’intérêt étudié. Dans ce contexte, il est prévu de réaliser le suivi de ce composé ainsi que de tout marqueur physiologique et/ou physiopathologique identifié au niveau systémique, urinaire, fécal. De même, l’analyse de certains organes préalablement déterminés sera réalisée afin de confronter ces observations avec les résultats des observations, mesures, dosages spécifiques qui seront effectués dans l’étude. La durée maximale des protocoles sera de 70 jours, et des animaux seront sacrifiés à différents temps intermédiaires ou en cas d’atteinte de points limites.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - Court terme : chaque protocole, permettra à son échelle d’informer sur l’efficacité du composé évalué et sur le degré de réduction des lésions osseuses. De plus les informations recueillies à chaque étape mettront en évidence une potentielle toxicité osseuse de la molécule étudiée - Long terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’évaluation, la détection, le contrôle ou les modifications des conditions physiologiques osseuses chez les animaux après application du composé. De plus, ce projet doit permettre d’établir des plans de prévention, prophylaxie (ensemble des mesures à prendre pour prévenir les maladies), et diagnostic robustes indispensables à la prise en charge et à l’amélioration de la qualité de vie des patients atteints d’insuffisance rénale développant une ostéodystrophie
Procédures
L’administration orale du composé se fera par gavage sur animaux vigiles (moins de 5min par gavage). Les fréquences d’administration dépendent de la prophylaxie des lots de composé testés. Les injections du composé en parentérale (sous cutanée ou intramusculaire ou intrapéritonéale : dans le cadrant caudal droit de l'abdomen ventral) seront réalisés sur animaux vigiles ou anesthésiés (moins de 5 min par injection). Les fréquences d’administration dépendent de la prophylaxie des lots de composé testés. Les prélèvements sanguins seront effectués sur animaux vigiles ou anesthésiés (moins de 5 min par prélèvement). Un traitement analgésique sera systématiquement appliqué aux animaux. Si des prélèvements à l’aorte abdominale sont effectués, ils ne se feront qu’en point final sous anesthésie avant sacrifice de l’animal. Les urines pourront être prélevées en cours de protocole sur animaux vigiles, en pressant sur la vessie des animaux (moins de 5 min par prélèvement) ou en point final, sur animaux euthanasiés. Elles peuvent être également collectées suite au placement des animaux en cage métabolique pendant un maximum de 24h où l'urine libérée par l’animal pendant ce laps de temps sera collectée.
Impact sur les animaux
Du fait du faible attrait des animaux pour la nourriture enrichie en adénine, une forte baisse de poids est observée les premiers jours de la prise alimentaire sans pour autant être délétère pour l’animal. La prise de poids redevient physiologique après 2 semaines maximum d’alimentation spécifique (supplémentée en adénine). L’insuffisance rénale induite par l’apport d’adénine peut induire une rigidité abdominale signe d’inflammation des organes abdominaux comme les reins et/ou une anurie. Une possible réaction inflammatoire pourra également apparaître au cours du temps en cas de toxicité osseuse (due à l’administration du traitement thérapeutique). Pour prévenir ces cas de figure, les animaux sont suivis de près et des grilles d’évaluation clinique ainsi que les conduites à tenir en cas de l’observation de ces signes ont été prévus.
Devenir
A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront humainement euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les pièces osseuses, seront prélevés. Les prélèvements sanguins et urinaires seront utilisés pour évaluer les modifications éventuellement des biomarqueurs du remodelage osseux, du métabolisme phosphocalcique, de l’insuffisance rénale et de la présence de cristaux calciques. Les organes seront également utilisés pour doser le composé et/ou réaliser des analyses histopathologiques et d’imagerie
Remplacement
De manière systématique, les composés que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais l’évaluation chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des agents thérapeutiques testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, le tissu osseux est un tissu en perpétuel remodelage avec une activité de résorption et de formation osseuse. Cet équilibre repose sur des mécanismes de régulations systémiques et locaux grâce à une communication étroite entre les différentes cellules osseuses afin de maintenir l’homéostasie du tissu. Ce mécanisme complexe ne peut être mimé par un modèle simple de culture in vitro. Il n'existe donc pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer la réduction de lésions osseuses. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité probable des réponses aux principes actifs et en accord avec l’article R.214-105 du Code rural et de la pêche maritime, 10 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance), sur nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif sera revu à la baisse dans le cas où le traitement évalué est connu, et après analyse des résultats d’études précliniques préliminaires d’efficacité, afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre. Pour chacune des procédures, des tests statistiques seront réalisés
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un anesthésique lors des prélèvements sanguins à la jugulaire et des traitements antalgiques dès l’apparition de premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux ou trois fois par semaine. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera euthanasié
Choix des espèces
Le rat a été choisi pour ce projet car cette espèce mammifère présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires notamment en termes de remodelage osseux, proches de celles observables chez l'homme. Le rat, étant fréquemment utilisé à des fins de recherche, l’étude des effets de composés chez cet animal de laboratoire, permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, la taille de cet animal permet d’obtenir un volume suffisant de liquides biologiques parfaitement analysables. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents composés seront utilisés.
Caractérisation d’un modèle murin reproduisant une myopathie liée à une déficience en cavéoline 3 et évaluation de potentielles thérapies.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une myopathie liée à un déficit en cavéoline 3, elles subissent des tests de force hebdomadaires, des courses forcées jusqu'à épuisement contraintes par de petits chocs électriques, un isolement de douze heures, des prélèvements sanguins par la queue et des examens cardiaques sous anesthésie. Le porteur reconnaît que les nuisances comprennent la contention, la chute dans la litière et l'extension de l'animal par tirement de la queue, tout en indiquant que les souris ne présentent pas de symptômes cliniques sévères. Il affirme qu'évaluer la force musculaire in vivo est "indispensable" pour tester deux thérapies, les souris étant tuées pour prélever leurs muscles.
Objectifs
Les cavéolinopathies sont des maladies rares du muscle associées à de la faiblesse, des crampes et des douleurs musculaires chez les patients. Actuellement, aucun traitement n’existe. Le but de ce projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique de deux thérapies, capables d’améliorer les fonctions motrices de souris atteintes d’autres maladies du muscle et présentant des symptômes similaires.
Bénéfices attendus
Ce projet pourra fournir les premières preuves de concept pour soigner des patients atteints d'une maladie rare du muscle. Elle permettra, en outre, de mieux comprendre cette maladie et les acteurs impliqués.
Procédures
Des tests de force non invasifs et durant 1 minute au maximum seront réalisés une fois par semaine entre 7 et 12 semaines. Chacun de ces tests sera réalisé 3 fois par jour avec un temps de repos minimal de 10 mins. Un autre test de fonction motrice consistant à faire courir la souris jusqu'à épuisement sera réalisés entre 1 et 3 fois durant la période de test des animaux et durera au maximum 1h40. L'animal sera également laissé libre dans une cage pendant 12h afin d'étudier ses mouvement spontanés. Des prélèvements de sang seront effectués toutes les deux semaines au maximum et ne dépasseront pas 10% du volume total de l'animal. Durant ces prélèvements, les souris seront maintenues dans un tube pendant moins de 5 mins afin d'avoir accès à leur queue pour la prise de sang. Des tests cardiaques seront réalisés sur des souris anesthésiées au cours de la même expérience, afin de limiter le nombre d'anesthésies. Ces tests dureront au maximum 30 mins. Un test final sera effectué sur souris anesthésiées précédant l’euthanasie des animaux pour mesurer la force musculaire des souris. Ce test dure au maximum une heure. Une biopsie auriculaire durant moins de 2 mins sera effectuée à 3 semaines afin d'identifier les animaux ainsi que leur mutation grâce à l'ADN qui sera extrait de cette biopsie.
Impact sur les animaux
Il est attendu que les animaux n’aient pas de symptômes cliniques sévères. Les nuisances causées par les différents tests sont la contention temporaire de l’animal, la chute de l’animal dans une cage remplie de litière, l’extension de l’animal par tirement progressif de la queue par l’expérimentateur, l’isolement de l’animal dans un cage spéciale pendant 12 h, la contrainte à la course par délivrance de petits chocs électriques et l’anesthésie générale de l’animal.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issu des tests afin de récolter les muscles nécessaires aux analyses moléculaires et d'évaluer à une échelle plus petite les effets potentiellement bénéfiques des thérapies.
Remplacement
Le projet consiste à évaluer l'effet bénéfique de deux thérapies sur le muscle et la fonction cardiaque. Malheureusement, l’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni sur l’ensemble de l’organisme. Evaluer les fonctions motrices et la force musculaire in vivo est indispensable pour déterminer l'efficacité d'un traitement contre des myopathies. Le modèle murin est suffisament proche physiologiquement et structurellement pour étudier la physiopathologie ainsi qu'une potentielle amélioration des symptômes dans le cadre d'une thérapie.
Réduction
La grande majorité des tests étant non invasif, il est possible de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. Les tests histologiques et moléculaires seront effectués sur les mêmes animaux après euthanasie. Ces deux points nous permettent de réduire drastiquement le nombre d'animaux. Le nombre d'animaux a été choisi à partir des données présentes dans la littérature, ainsi que de façon à pouvoir détecter une différence statistiquement significative entre les animaux malades, sains et traités.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage avant d'être hébergés en groupe. Chaque cage sera enrichie avec des nids de chanvre ainsi que du carton, pour permettre aux souris de ronger. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 1 à 2 fois par semaine. Dès lors qu’une perte de poids sera notée, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. L’animal sera sorti de la cage à l’aide d’un tube ou les mains du manipulateur disposées en coupe pour réduire leur stress. Lors de l'évaluation des fonctions cardiaques sous anesthésie, une crème ophtalmique sera appliquée pour éviter l’assèchement des cornées et la phase de réveil s’effectuera sous une lampe chauffante dans une cage où l’animal sera seul, puis l’animal sera replacé dans sa cage avec ses congénères. Durant les mesures de force, l'animal sera anesthésié et analgésié afin d'éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. Pour chaque anesthésie, la température corporelle de l'animal sera maintenue au moyen d'une plaque et d'une lampe chauffante. Pour chaque expérience de phénotypage, l'animal sera tout d'abord familiarisé avec le matériel pour minimiser autant que possible son stress.
Choix des espèces
Le modèle murin utilisé reproduit les problèmes de dégénérescence de fibres musculaires retrouvés chez les patients. Les souris malades ne présentent cependant pas de symptômes cliniques importants et peuvent vivre aussi longtemps que des souris saines sans être handicapées au quotidien. Dès 8 semaines, on retrouve des défauts de fibres musculaires, et à 12 semaines une forte régénération des fibres. Les tests seront donc réalisés entre 7 et 12 semaines, sur souris adultes.
Modulation du niveau de BIN1 par croisement génétique dans le traitement des myopathies centronucléaires liées au gène SPEG
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses d'une mutation reproduisant une myopathie centronucléaire, elles développent une faiblesse musculaire et cardiaque, subissent des tests de force et de coordination (suspension, agrippement, rotarod), des mesures contractiles et une échographie cardiaque sous anesthésie, ainsi qu'un perçage d'oreille, avant le prélèvement d'organes. Le porteur indique que le phénotype cardiaque, progressif, deviendrait "potentiellement sévère" si les souris étaient maintenues en vie, ce qui motive leur mise à mort. Il vise une preuve de concept d'une stratégie de compensation génétique, conditionnée à des résultats hypothétiques.
Objectifs
Les myopathies centronucléaires (CNM) sont une classe de maladies génétiques qui détériorent la fonction des muscles squelettiques et handicapent fortement la qualité de vie des patients qui en sont atteints. Aucune thérapie n’est à ce jour disponible. Récemment dans la littérature, il a été décrit que le gène X, présent au niveau du muscle et du coeur et codant pour une protéine X jouant un rôle clé dans la contraction musculaire, a été identifié comme étant responsable de certains cas de myopathies centronucléaires. Il a été montré également qu’une diminution de la quantité de la protéine Y améliore les signes cliniques musculaires chez la souris ayant un déficit en protéine X (X-déficiente). Cependant, l’amélioration de l’espérance de vie et des signes cliniques cardiaques restent limitée chez ces souris. L’objectif du projet consiste à valider une preuve de concept selon laquelle une augmentation de l'expression d’une autre protéine, protéine Z, pourrait restaurer les signes cliniques cardiaques de la souris X- déficiente. Cette stratégie de thérapie où la surexpression d’une protéine peut compenser les effets négatifs liés à une mutation d’une autre protéine a déjà montré son efficacité dans la littérature. Pour vérifier notre hypothèse, nous souhaitons réaliser des croisements génétiques de souris afin d'obtenir des souris déficientes en protéine X et surexprimant la protéine Z humaine. Si une amélioration des signes musculaires et cardiaques ainsi qu’une augmentation de l’espérance de vie sont observées, la mise en place d’une thérapie génique sera conduite par la suite dans le modèle de souris X-déficiente.
Bénéfices attendus
Dans l’hypothèse où notre stratégie thérapeutique s’avèrerait efficace sur le phénotype de notre animal modèle, cette étude serait une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène X.
Procédures
Concernant les tests liés au phénotype musculaire : - Test de suspension : Mesure de la force du corps. -Test d’agrippement : Mesure de la force des pattes -Test de performance Rotarod : Mesure de la coordination motrice, l'équilibre, l'endurance et la résistance à la fatigue. -Mesure des propriétés contractiles musculaires in situ (AURORA): Les souris seront totalement anesthésiées pour qu'il n'y ait pas de réponse à la stimulation tactile (injection intrapéritonéale, deux injections) pendant maximum 1 heure. Concernant les tests liés au phénotype cardiaque: Les animaux seront soumis à une anesthésie sans intervention chirurgicale d'une durée de 20 minutes pour réaliser l'échographie et l'électrocardiogramme.
Impact sur les animaux
Selon les travaux issus de la littérature, les souris X-déficientes présentent une faiblesse musculaire et cardiaque aux âges étudiés. Dans cette étude, un nouveau modèle de souris X-déficiente sera étudié et des tests seront effectués pour confirmer le même profil observé dans la littérature. Les nuisances ou effets indésirables attendus causés par le retrait de la protéine X dans le modèle de souris X-déficiente sont les suivants : - Les animaux X- déficientes vont avoir une diminution de la motilité à 6 semaines de vie ainsi qu'une diminution de la contractilité musculaire à 13 semaines de vie à cause de la faiblesse musculaire dû à une perte de fonction de la protéine X. Au niveau cardiaque, à 6 semaines, elles vont développer une anomalie cardiaque qui va entraîner comme conséquence une diminution de la fonction cardiaque. Une diminution de la taille de la souris ainsi que du poids seront observées dès la sixième semaine. Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests sont les suivants : -Pour le test de suspension et le test d'agrippement, la souris peut subir un léger stress. -Pour l’électrocardiographie, les souris peuvent avoir une bradycardie liée à l'anesthésie. La température sera contrôlée par une sonde rectale sur la plateforme de l'échographie tout au long de l'expérience. -Pour l'échographie, le thorax des souris sera rasé, et des électrodes seront insérées en sous cutané pendant l'électrocardiogramme, ce qui peut également entraîner un stress de courte durée -La mesure des propriétés contractiles musculaires est également réalisée sous anesthésie, pouvant provoquer une sécheresse oculaire au réveil. Concernant le perçage d'oreille des animaux à partir du 14ème jour après la naissance pour leur identification couplée au génotypage, ces animaux peuvent ressentir une douleur de courte durée.
Devenir
Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin des deux procédures expérimentales pour plusieurs raisons : Notre projet nécessite la collection d’organes pour compléter l’analyse au niveau histologique et moléculaire. Le phénotype cardiaque étudié est progressive et deviendrait potentiellement sévère si les souris étaient maintenues en vie.
Remplacement
Le modèle murin étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie et d’autre part de mieux comprendre une activité essentielle de la protéine défectueuse dans cette myopathie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire seraient impossible à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car le phénotype musulaire pathologique ne se développerait pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.
Réduction
Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un test maximum par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d’accouplements avec deux femelles pour un mâle. Un nombre minimum de souris sera également utilisé pour évaluer les dommages liés à cette lignée, à savoir 20 souris par groupe (mâles et femelles sauvages, mâles et femelles porteuses de la mutation). Les résultats obtenus des deux cohortes (souris sauvages et souris X-défcientes) seront utilisés pour deux procédures, ce qui permet une réduction du nombre de souris.
Raffinement
Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les cages d’accouplements seront constituées de deux femelles par cage facilitant l’élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. En cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré et l’étude sera prématurément stoppée.
Choix des espèces
Afin d’évaluer et de mieux comprendre les mécanismes cellulaires induits par une mutation du gène X, nous avons besoin de réaliser des expériences physiologiques in vivo. De plus, cette nouvelle lignée mutante nous permettra de mieux comprendre un des rôles clé dans la maladie musculaire. Les symptômes de faiblesse musculaire et cardiaque liés à cette mutation apparaissent relativement tôt c'est à dire vers 6 semaines et d’autre part, nous souhaitons suivre l 'évolution de cette maladie. Les tests pour évaluer les signes musculaires et cardiaques ne peuvent pas ête réalisées sur d 'autres espèces évolutivement plus éloignées de l'Homme car la structure du muscle y serait trop différente. La souris est la seule espèce physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser ces expériences.
Etude de l’accumulation tissulaire et de l’impact sur l’ativité mitochondriale et sur la composition des fibres musculaires d’un composé X en développement après administration chronique chez la souris adulte et chez la souris âgée
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une administration orale quotidienne pendant huit semaines et des pesées hebdomadaires, avec un risque de fausse route lors du gavage. Le porteur mesure l'accumulation musculaire d'un composé X pour le compte d'un client, un éventuel médicament contre la faiblesse musculaire restant renvoyé aux étapes suivantes. Il affirme qu'il n'existe "pas de modèle de substitution suffisamment prédictif" pour un traitement chronique chez l'animal entier.
Objectifs
Le présent projet constitue une étape préliminaire visant à étudier la capacité du composé X à s'accumuler au niveau tissulaire (et tout particulièrement au niveau musculaire) afin d'atteindre des quantités seuils nécessaires à son activité biologique. Il s'agit donc d'une étude d'accumulation tissulaire à long terme (56 jours d'administration). L'étude sera néanmoins optimisée par une analyse de la composition des fibres musculaires afin d'obtenir des premiers indices d'efficacité.
Bénéfices attendus
Ce projet constitue une phase préliminaire dans le développement du composé X visant, en premier lieu, à étudier la propriété pharmacocinétique d'accumulation tissulaire. Si ce paramètre s'avère satisfaisant, le développement du composé X sera poursuivi dans les étapes précliniques (efficacité et sécurité) et clinique. A terme, le composé X pourrait devenir un médicament visant à traiter la faiblesse musculaire chez l'adulte pathologique ou liée au vieillissement.
Procédures
Les animaux seront pesés une fois par semaine pendant 10 semaines. Ils recevront également des administrations quotidiennes par voie orale pendant 9 semaines (1 semaine pour les habituer à la voie d'administration et 8 semaines de traitement).
Impact sur les animaux
L'ensemble des traitements quotidiens par voie orale et les pesées hebdomadaires peuvent être source de nuisances pour les souris. En effet, ces procédures nécessitent une brève manipulation des animaux qui peut être source de stress. Par ailleurs, bien que cela soit extrêmement rare, les traitements par gavage sont susceptibles d'être source de fausses routes. Dans ce cas, l'animal concerné serait immédiatement euthanasié.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure. En effet, l'étude implique des analyses biochimiques et histologiques sur les organes qui doivent ainsi être collectés à l'issue de la procédure.
Remplacement
Les composés testés ont d'abord été développés à l'aide de méthodes sur cultures cellulaires (myocytes) et sur explants tissulaires (muscle gastrocnémien) afin de déterminer leur action sur l'activité mitochondriale. Des résultats positifs ayant été obtenus dans ce cadre, il est nécessaire de vérifier que les données restent cohérentes sur l'animal entier. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe pas de modèle de substitution suffisamment prédictif pour garantir une bonne accumulation tissulaire d’un composé dans le cadre d'un traitement chronique chez l'animal entier.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire et par notre client sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de réaliser les dosages tissulaires du composé X (4 animaux/groupe) et de réaliser par ailleurs les analyses relatives à l'activité mitochondriale et à la composition des fibres musculaires (5 animaux/groupe). Nous avons donc fixé à 9 le nombre d'animaux nécessaire pour chacun des groupes. Concernant les groupes constitués de souris âgées (21 mois à réception), nous avons ajouté 3 animaux supplémentaire par groupe afin de prendre en compte la mortalité naturelle attendue entre 21 et 23 mois d'âge. Le projet emploiera donc un total de 2 x 9 + 2 x 12 = 42 souris.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés par groupes de 3 par cage afin de leur permettre de maintenir une interaction sociale. Un enrichissement sera apporté sous forme de dômes en cartons et de matériel de nidification spécifiques pour rongeur de laboratoire. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis, notamment l'emploi d'analgésie (buprénorphine) pour soulager la douleur le cas échéant.
Choix des espèces
La physiologie musculaire est bien documentée dans la littérature chez la souris c57Bl/6, ce qui permettra des comparaisons avec les résultats obtenus au cours de la présente étude. Par ailleurs, le client de l'étude a déjà obtenus des résultats préliminaires sur ce même modèle avec d'autres composés en développement et souhaite donc conserver le modèle à des fins de comparaison. La partie des animaux seront au stade jeune adulte (8 semaines) alors que l'autre sera au stade de souris âgées (21 mois). Ces stades de développement correspondent aux âges des population cibles du composé X en développement (jeune adulte pathologique ou sujets âgés).
Développement de virus adeno-associé (AAVs) spécifiques pour cibler les cellules satellites du muscle squelettique
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie reçoit des injections de virus adéno-associés, l'autre subit en plus une lésion musculaire provoquée par un composé chimique, avec mise à mort quinze à trente jours après. Le porteur affirme n'attendre "aucun effet indésirable majeur". Il justifie le recours à l'animal par l'impossibilité de prédire in vitro le tropisme réel des vecteurs viraux.
Objectifs
Le muscle squelettique est l'un des rares tissus chez les mammifères capables de régénérer complètement même à un âge avancé, grâce aux cellules souches, les cellules satellites. Afin d'améliorer l'efficacité des thérapies pour certaines maladies musculaires, il est important de pouvoir adresser les traitements vers les cellules satellites, cellules souches du muscle qui en sont la cible principale de ces traitements alors qu'elles résident dans un environnement où coexistent plusieurs autres types de cellules qui ne participent pas directement à la réparation du tissu musculaire. Nous allons utiliser des vecteurs viraux pour tester des séquences régulatrices de certains gènes myogéniques afin de créer des virus adeno-associés (AAVs) qui cibleront spécifiquement les cellules satellites du muscle squelettique pour l'expression des transgènes thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Nous espérons développer des AAVs portant des séquences régulatrices qui permettront d'adresser par la suite des produits de thérapie génique spécifiquement dans les cellules satellites du muscle squelettique. L'idée est donc de faire des vecteurs qui vont donner une expression des transgènes thérapeutiques que dans des cellules satellites.
Procédures
Dans la procédure 1, la totalité des animaux (200) seront anesthésiés à 4 semaines sous isoflurane (induction 4%; maintien 2%) et soumis à des injections d'AAV, puis mis à mort à 15 ou 30 jours après l'infection virale. Dans la procédure 2, les animaux de 8 semaines (100) subiront une lésion musculaire réalisée par injection intramusculaire d'un composé chimique puis une injection d'AAV avant d'être également mis à mort à 15 ou 30 jours après l'infection virale (voir annexe). Les prélèvements des muscles pour analyse seront réalisés en post-mortem.
Impact sur les animaux
Il n'est attendu aucun effet indésirable majeur dans le contexte de l'injection des AAVs ou de lésion du muscle dans les souris. Les AAVs n'expriment qu'une protéine fluorescente, qui ne doit pas avoir un effet sur le comportement des souris. Le muscle lésé est complètement régénéré dans un mois, et ne pose pas de problème pour le mouvement des souris après quelques jours maximum. Les génotypes des animaux utilisés ne sont pas délétères ou indésirables. Donc, à ce jour, nous ne nous attendons pas à un phénotype associé à cette injection ou à la lésion en dehors d'un ciblage spécifique du type celllulaire d'intérêt.
Devenir
Tous les animaux injectés sont mis à mort pour analyse au plus tard 30 jours post-injection.
Remplacement
Nos projets s’intéressent à des processus biologiques qui reposent sur l’évolution au cours du temps et/ou l’interaction entre de nombreux types cellulaires/tissus. De fait, l’étude de ces processus au sein d’un organisme dans son ensemble où toutes les cellules impliquées sont en étroite communication est nécessaire et ne peut être substituée qu’en partie par les études in vitro. Même si les constructions AAV sont testées in vitro, on ne peut préfigurer du réel tropisme de ces vecteurs qu'en les testant dans l'animal vivant.
Réduction
Dans un but de réduire l’utilisation excessif d’animaux, le nombre d’animaux a été calculé sur la base de protocoles déjà publiés avec 5 animaux par lot ce qui est le minimum pour obtenir suffisamment de matériel biologique pour réaliser l’ensemble des analyses nécessaires et obtenir des résultats significatifs pour des t-test de student en comparant deux groupes et pour des analyses ANOVA pour plus de deux groupes.
Raffinement
Pour essayer de minimiser la souffrance et le stress induit aux animaux, des analgésiques seront administrés avant et après d’induction de la régénération musculaire et aussi pour l'injection des AAVs. De plus, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages les 3 premiers jours pour faciliter l’alimentation des animaux. Tous les animaux qui présentent les signes anormaux décrits ci-dessus sont soumis à une mise à mort compassionnelle.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris pour des raisons multiples. D’abord, la souris est de petite taille ce qui réduit la quantité de virus qu’il faut utiliser, son élevage est facile et sa durée de vie compatible avec nos études. La souris est aussi un mammifère dont une bonne partide des séquences d’ADN que nous allons mettre dans les vecteurs viraux sont conservées ou très similaires. Donc si une séquence a une activité forte dans les cellules murines, il est très probable que cette activité sera maintenue dans les cellules humaines. Pour les souris utilisées en procédure 1, les vecteurs viraux seront injectés à l'âge de 4 semaines d’âge, lorsque le muscle est encore en croissance, parce que les cellules satellites sont plus accessibles au virus à ce stade. Dans la procédure 2, la régénération sera induite à l'âge de 8 semaines, quand la musculature est complètement formée pour que les vecteurs viraux ciblent cette fois les celllules satellites activées suite à la lésion.
Validation d’un dispositif implantable de thérapie cellulaire de la régénération ostéochondrale pour la prévention de l’arthrose précoce chez la brebis
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
16 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 13 tuées à l'issue et 3 rendues à l'élevage après un simple prélèvement de moelle. Les brebis opérées subissent sous anesthésie une ponction de moelle osseuse, l'implantation d'un dispositif dans le genou et des IRM, avant l'euthanasie pour prélever les condyles. Le porteur justifie l'augmentation des effectifs par le risque qu'un incident sur un seul animal "compromette le résultat de l'ensemble de l'étude". Il affirme qu'il n'y a "pas d'alternative non animale" pour étudier le cartilage articulaire et que le passage sur animal vivant est "indispensable".
Objectifs
Les pathologies ostéo-articulaires sont aujourd’hui un problème de santé publique dont la prévalence augmente avec l’augmentation de l’âge de la population avec plus de 10 millions personnes qui souffrent de l’arthrose en France aujourd’hui . Actuellement, les possibilités thérapeutiques proposées chez l’homme ne permettent pas de régénérer un tissu cartilagineux articulaire normal, et de ce fait, sont incapables de restaurer la fonction de l’articulation. Suite à des études in vitro, nous avons montré l’efficacité de ce biomatériau en termes de régénération tissulaire et avons également confirmé ces résultats après implantation chez le petit rongeur. Une étude in vitro réalisée sur le modèle ovin a permis de montrer l'efficacité de notre implant associé une autogreffe de cellules souches mésenchymateuses autologues pour la régénération de lésions ostéocartilagineuses. Dans l’étude actuelle, nous souhaitons confirmer ces résultats chez la brebis, en utilisant le même modèle d’étude que précédemment pour la régénération cartilagineuse avec comme différence l’utilisation de cellules souches mésenchymateuses (CSM) allogéniques de brebis et d’une membrane déposée en superficie du matériau composite utilisé dans l’étude précédente, au niveau de lésions intra-articulaires du genou. Nous avons développé des biomatériaux résorbables hybrides dans le but de régénérer à la fois le tissu ostéochondral mais également le cartilage articulaire. Ces matériaux sont d’une part nanofibreux et équipés de nanoréservoir contenant de l’hydroxyapatite, pour régénérer l’os sous-chondral et d’autre part, ils sont recouverts d’un hydrogel d’alginate contenant des CSM allogéniques pour la réparation du cartilage articulaire en surface. Une couche superficielle supplémentaire nanofibreuse contenant de la chondroitine sulfate et de l’acide hyaluronique vient recouvrir l’ensemble du biomatériel dans certains groupes à tester. L’hypothèse est que les données apportées par cette étude nous permettrons ainsi de confirmer le potentiel de réparation ostéo-chondrale de ces biomatériaux associés à des CSM allogèniques. L’objectif de cette étude sera d’évaluer l’efficacité sur la régénération du cartilage articulaire de ces implants hybrides.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu à court terme est la validation de l’utilisation de cellules souches mésenchymateuses allogéniques dans la réparation des lesions du cartlilage articulaire chez la brebis. Ce travail fera l’objet d’une publication. Le bénéfice à long terme concerne essentiellement l’être humain. Le but est de traiter les lésions cartilagineuses pour éviter qu’elles aboutissent à une arthrose évoluée nécessitant une intervention de type prothèse. Ce serait un bénéfice (une économie) en termes de coût de la santé. Il est nécessaire de tester cette hypothèse sur un modèle gros animal avant de proposer ce type de traitement chez l’être humain (principe de précaution) car les tests sur des petits animaux ne sont pas transposables pour des raisons évidentes de taille, d’anatomie et donc de contraintes mécaniques. Les principaux avantages de l’utilisation de cellules allogéniques par rapport aux cellules autologues sont : a/ d’éviter le prélévement de moelle osseuse 2 à 3 semaines avant l’intervention sur le cartilage b/ de pouvoir administrer un nombre connu à l’avance de cellules.
Procédures
Il n'est pas prévu de prélèvement sur animaux vigiles. Tous les gestes seront réalisés sous anesthésie générale. 3 procédures seront utilisées .1. ponction de moelle osseuse (5 min). 2. intervention pour implantation du dispositi (45 min). 3. IRM (3 x15 min)
Impact sur les animaux
Une intervention sur les genoux et douleur post-opératoire au niveau des genoux opérés, traitée par antalgiques adaptés. Tout geste sur une articulation peut entraîner des complications : -Anesthésiques : difficultés à l’intubation, troubles du rythme cardiaque etc … Moyens mis en œuvre = surveillance permanente de l’animal -Per-opératoires : pas de complications per-operatoires prévisibles car - pas de risque de hémorragique puisqu’on est à distance des gros vaisseaux qui sont à la face postérieure du genou. L’hémostase des petits vaisseaux sera faite au bistouri électrique et la brebis n’est pas sous anticoagulant. - Pas de risque de fracture car aucune contrainte sur l’os, seul un geste sur le cartilage - Post-opératoires : comme pour tout geste chirurgical sur une articulation les risques sont : - Une douleur post-opératoire, qui n’est pas certaine mais dont la présence sera détectée par l’observation de l’animal - Un retard de cicatrisation : surveillance quotidienne - Infection : surveillance quotidienne et geste chirurgicale adapté si nécessaire ou euthanasie Déambulation libre en box de 3,5 m x 3,5 m pendant la période de cicactrisation puis jusqu’au 6ème mois, Déambulation quotidienne sur un périmétre plus large.
Devenir
Les 3 brebis prévues pour le prélèvement de moelle osseuse, pourront être replacées dans l’élevage. Ce prélèvement ne modifie en rien leur état. Les 7 brebis opérées devront être euthanasiées pour pouvoir prélever les condyles en vue de l’analyse des implants et de leur effets sur la régénération du cartilage, ainsi que les 6 brebis surnuméraires (3 déjà autorisées, et 3 demandées dans cet avenant).
Remplacement
Ce protocole d’étude respecte la règle des trois R de l’expérimentation animale (Replacement, Reduction, Refinement) grâce à la possibilité d’imagerie non invasive de l’IRM qui permet de suivre l’évolution des lésions sans avoir à faire de prélèvement chez l’animal. L’utilisation de cellules souches mésenchymateuses allogéniques évite une anesthésie supplémentaire car il n’est plus nécessaire de prélever de moelle osseuse autologue. Il n’y a pas d’alternative non animale pour étudier le cartilage articulaire. Suite à des études in vitro, nous avons montré l’efficacité des implants 3D des chondro-, ostéo-inducteurs et des CSM en termes de régénération ostéochondrale. La principale limite des études-in vitro est l’absence de contrainte biomécanique et son effet sur l’implant et la cicatrisation. Le passage sur animal vivant est ensuite indispensable pour valider notre approche. Il n’est actuellement pas légal de tester chez l’homme une technique innovante sans l’avoir testé chez l’animal quand cela est possible (principe de précaution)
Réduction
Une première étude a été faite sur ce même schéma avec 4 brebis mais en utilisant des CSM autologues, confirmant leur utilité dans la réparation des lésions cartilagineuses.
Raffinement
Dans le protocole actuel le même schéma est reproduit avec comme différence l’utilisation des CSM allogéniques et dans un des groupes une membrane superficielle sensée améliorer la cicatrisation du cartilage. Les 4 brebis de la première étude (opérées des 2 genoux) ont pu être toutes suivies jusqu’au terme de l’expérimentation, ce qui a permis de valider le concept de l’implant utilisé. Cependant sur un aussi petit effectif un incident (problème à l’anesthésie, mauvaise récupération post-opératoire, infection du site opératoire) la perte d’un seul animal peut compromettre le résultat de l’ensemble de l’étude et donc finalement avoir inclus inutilement les autres animaux. Pour pallier cela et augmenter les chances d’atteindre les objectifs scientifiques il est prévu d’augmenter le nombre d’animaux à 7 brebis minimum pour pallier aux éventuels incidents rendant inexploitable une implantation chez l’un des animaux. 3 brebis supplémentaires ont déjà été autorisées afin de comparer l’efficacité des cellules allogénique du premier groupe aux cellules autologues de ce nouveau groupe. 3 de plus font l'objet de cet avenant, afin de tester le même implant avec des cellules autologues (provenant des 3 brebis de l’avenant d’octobre 2022) et allogéniques sur 6 brebis (les 3 brebis ayant fourni les cellules, et 3 brebis supplémentaires faisant l’objet de cet avenant) en induisant l'arthrose à l'aide d'une curette. Les point limites attendus sont : - Une prostration avec abattement et anorexie en cas de douleur importante, difficulté à se déplacer ; - Fièvre, abattement, polynée en cas d’infection post opératoire.
Choix des espèces
La brebis est le modèle gros animal reconnu pour l’étude de l’arthrose. Les brebis agées de 2 à 4 ans sont le modèle animal utilisé habituellement dans les autres études sur le cartilage. Pour ne pas induire une variable supplémentaire par rapport aux études existantes il a été décidé de conserver ce sexe et cette tranche d’age .
Optimisation d’un traitement de thérapie génique pour l’hypophosphatémie liée au chromosome X
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
366 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Reproduisant un rachitisme génétique lié au chromosome X, elles reçoivent une injection unique d'un virus-médicament, puis des prélèvements sanguins rétro-orbitaux répétés cinq à vingt fois sur trois à dix-huit mois, avec des mesures morphologiques et un test de la grille inversée. Le porteur indique n'attendre aucun effet secondaire du traitement, les nuisances se limitant au stress de contention et à la douleur des piqûres. Il affirme que les résultats sur cellules "ne reflètent pas toujours" ceux obtenus chez l'animal, ce qui justifie le recours à la souris.
Objectifs
Notre projet a pour but de développer une solution thérapeutique pour les patients atteints d’hypophosphatémie liée au chromosome X (XLH). L’XLH est la forme de rachitisme génétique la plus fréquente touchant 1 naissance sur 20 000 chaque année. Cette maladie métabolique rare se traduit principalement par des malformations squelettiques. Les patients sont de petite taille et souffrent de douleurs osseuses, dentaires, et musculaires. Leurs os sont plus fragiles et les fractures nombreuses. Deux traitements sont actuellement disponibles, mais ils présentent des limitations importantes : i) leur efficacité est transitoire et/ou partielle et nécessite une réadministration fréquente; ii) ils peuvent provoquer des effets néphrotoxiques sévères. C’est pourquoi nous développons une alternative par thérapie génique, qui a le potentiel de guérir les patients en une seule administration. Ce projet va nous permettre d’identifier chez le modèle murin de XLH, un traitement sûr et efficace.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mettre au point, chez un modèle murin, un traitement sûr et efficace pour la maladie XLH. Nos précédents travaux ont permis d’établir la preuve de faisabilité d’une approche par thérapie génique. Dans ce projet, qui durera 5ans, nous voulons améliorer le produit que nous avons conçu et réaliser l’ensemble des études nécessaires à son développement vers la clinique. Les résultats obtenus nous permettront alors d’envisager une solution thérapeutique pour patients XLH, efficace sur le long-terme, afin de stopper l’évolution de leur pathologie. Les bénéfices attendus concernent donc directement l’amélioration de l’état de santé des malades et de leur qualité de vie.
Procédures
Les animaux seront injectés une seule fois avec des virus médicaments dans la veine temporale ou les sinus rétro-orbitaux selon l’âge des souris. Ce geste dure moins de 30 secondes. Les animaux seront anesthésiés par voir gazeuse (isoflurane) puis prélevés en sang au niveau des sinus rétro-orbitaux. Ce geste dure moins de 30 secondes. OEil gauche et oeil droit seront alternés. Ce geste sera réalisé entre 5 et 20 fois, en 3 à 18 mois. Les mesures morphologiques (taille du corps, taille de la queue) seront réalisées juste après les prélèvements de sang afin d’éviter une autre anesthésie. Ce geste dure moins de 30 secondes. Ce geste sera réalisé entre 5 et 20 fois, en 3 à 18 mois. Le test de la grille inversée sera réalisé entre 5 et 20 fois, en 3 à 18 mois. Nous réalisons ce test couramment dans d’autres projets, et aucun traumatisme physique n’a été observé. Ce test dure 3 minutes et le nombre de chutes par minute est comptabilisé.
Impact sur les animaux
Traitement injecté : aucun effet secondaire n'est attendu suite à l'injection du traitement. Traitement des souris HypDuk : diminution des problèmes liés à la maladie (augmentation taille et poids des souris) Injection : Stress lié à la contention + douleur liée à la piqure d'aiguille. Prise de sang : Stress lié à la contention + douleur liée à la piqure. Mesures morphologique : Réalisé sur souris endormies lors du prélèvement de sang : pas de stress supplémentaire. Test musculaire : Stress lié à la manipulation. Euthanasie : Stress lié à la manipulation. Souris HypDuk : pas de douleur quotidienne lié à la maladie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Dans un premier temps, nous avons réalisé un premier tri de nos candidats sur des cellules en culture. Ces tests nous ont permis d'éliminer les candidats produisant une trop faible quantité de protéine. Néanmoins, par expérience, nous savons que les résultats obtenus sur cellules ne reflètent pas toujours les résultats obtenus chez l'animal et ne permettent pas d’identifier si l’approche permet de traiter les symptômes de la maladie. L’utilisation d’animaux est donc primordiale pour réaliser cette étude car (1) il est nécessaire de tester nos produits sur un corps entier pour observer les effets simultanés sur le foie, les reins et sur les os (2) il est nécessaire d’évaluer la croissance ainsi que la force musculaire des souris (3) il faut obtenir des fluides (sang, urine) pour mesurer les marqueurs de la maladie.
Réduction
Afin de d'utiliser le moins d'animaux possible, nous avons calculé le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir des résultats suffisamment fiable (6 souris par groupe soit 186 souris saines et 166 souris malades). Le nombre de souris déterminé ici est le nombre maximal de souris utilisé, si la deuxième procédure n'aboutit pas à des résultats concluant, nous ne passerons pas aux étapes suivantes ou seulement avec 1 candidat. De plus, nous allons prioriser l'utilisation d'animaux sains (186 souris) lors de la sélection de nos meilleurs candidats, cela permettra d'obtenir des animaux plus rapidement (il est plus facile d'accoupler des animaux sains que malades et le nombre de petits par portée est plus important) et permettra aussi de limiter la génération de souris malade.
Raffinement
Dès leur arrivée en zone d’expérimentation, les souris seront manipulées et contentionnées afin d’être familiarisées aux expérimentateurs et aux gestes expérimentaux. Cette habituation devrait réduire le stress et l’angoisse des animaux. Les souris utilisées lors de ce projet ne présentent pas de signes de douleurs évidents. Les virus utilisés sont non dangereux et les doses utilisées ne sont pas toxiques, de ce fait aucune toxicité n’est attendue. Prélèvements de sang: ils seront réalisés au niveau de la veine mandibulaire sur animal vigile. Une fois le prélèvement terminé, un éventuel saignement sera stoppé par l’application d’une compresse au niveau du point de prélèvement. L’animal sera remis dans sa cage. Si des signes de souffrance venaient à apparaitre, la souris sera pesée et surveillée de manière assidue. En absence d’amélioration sur une semaine, ou en cas de perte de poids supérieure à 20% du poids initial, la souris sera euthanasiée. Le nombre d'accouplement mit en place sera réduit au strict nécessaire afin de ne pas générer de souris inutilisées. Certaines souris générées ne seront pas utilisées (comme les femelles qui ne portent pas la maladie), elles seront rapidement euthanasiées afin de limiter le nombre de souris en élevage.
Choix des espèces
A notre connaissance, les seuls modèles animaux de la maladie XLH sont des modèles murins. Il y a 2 modèles : le modèle HypDuk-B6 et le modèle HypDuk-Balb. Ces deux modèles reproduisent les signes cliniques retrouvés chez les patients XLH. La population de patients que nous visons sera composée d’enfants, de jeunes adultes et des adultes, aussi, nous avons besoin de traiter des souris à des âges qui correspondent à ces étapes chez l’homme (souris de 0-2 jours, de 2 semaines, de 4 semaines et de 6 semaines) et d’évaluer si notre traitement pourra être efficace en : (1) en prévention de la pathologie : le traitement est-il efficace s'il est administré avant l'apparition de symptômes important (traitement des souris les deux premiers jours de vie (=nourrisson)) ? (2) le traitement est-il efficace s'il est administré à l'apparition des premiers signes de la maladie (traitement des souris à 2 ou 4 semaines (=enfant ou adolescent)) ? (3) le traitement est-il efficace s'il est administré une fois que la pathologie est bien établie et que les symptômes sont important (traitement des souris à 6 semaines (=adulte)) ?
Développement d’une molécule thérapeutique pour la sclérose latérale amyotrophique
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
1 722 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant du léger au sévère, la grande majorité en sévère. Génétiquement modifiées pour développer une paralysie progressive proche de la sclérose latérale amyotrophique, elles reçoivent des injections, une pose de minipompe par chirurgie et des tests moteurs répétés, pour tester une molécule dérivée du virus de la rage. Le porteur indique que la paralysie apparaît vers cent jours et que les souris sont mises à mort à un score neurologique de 4 ou une perte de poids de 25 %. Il affirme que le modèle murin est "le plus utilisé" pour développer de nouvelles thérapies de cette maladie.
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est provoquée par une dégénérescence progressive des neurones moteurs du cerveau et de la moelle épinière qui contrôlent la contraction et le relâchement des cellules musculaires. Cette mort neuronale entraîne une atrophie des muscles qui ne sont plus stimulés et une paralysie. Une réaction inflammatoire impliquant plusieurs populations de cellules immunitaires amplifie ce processus de mort neuronale et aggrave la pathologie. Il a été démontré que cette neuroinflammation est en partie causée par une déficience des cellules régulant l’inflammation, les lymphocytes T régulateurs (Treg).Ces cellules inhibent normalement l’activité des autres cellules immunitaires. Les souris transgéniques SOD1G93A expriment plusieurs copies du gène humain SOD1 comportant la mutation G93A qui est responsable de cas familiaux de SLA chez l’homme. Ce modèle murin développe une pathologie très proche de la SLA sur le plan clinique et pathologique. Sur le plan histopathologique, une diminution progressive du nombre de neurones moteurs dans la moelle épinière est observée ainsi que des processus neuroinflammatoires. Cette lignée de souris est la référence dans le domaine de la SLA et est largement utilisée pour tester de nouvelles molécules thérapeutiques. Nous souhaitons tester dans ce modèle expérimental de SLA, les propriétés neuroprotectrices et anti-inflammatoires de la biomolécule «NV», développée et brevetée par notre laboratoire. NV est un bio-peptide dérivé du virus de la rage. Notre laboratoire a montré sur des cultures de neurones que NV favorise la survie des cellules, l’élongation des prolongements cellulaires qui permettent les connections entre neurones, et la repousse de ces connections après lésion. L’effet neuroprotecteur de NV a également été démontré in vivo dans un modèle murin de dégénérescence des neurones de la rétine. Par ailleurs, nous avons observé que NV possède des propriétés anti-inflammatoires par un mécanisme impliquant l’augmentation de l’expression d’une molécule immunosuppressive, PDL1 (Programmed Death PD-1 ligand). De plus, il a été montré que PDL1 était également un activateur de l’activité des cellules Treg. Ces résultats suggèrent que NV pourrait être utilisé dans la SLA à la fois pour protéger les neurones moteurs de la mort cellulaire (effet neuroprotecteur) et inhiber le processus neuroinflammatoire délétère (effet anti-inflammatoire).
Bénéfices attendus
La SLA est une maladie neurodégénérative qui détruit graduellement les motoneurones induisant une paralysie musculaire progressive et qui devient rapidement létale lorsque les muscles respiratoires sont touchés. Les traitements actuellement disponibles se limitent à deux molécules qui ne prolongent que de quelques mois la vie des patients. Dans ce contexte, de nouvelles molécules sont activement recherchées et plusieurs essais cliniques suivant de nouvelles approches thérapeutiques sont actuellement en cours. NV, une nouvelle molécule qui pourrait à la fois stimuler la survie des motoneurones, ralentir leur atrophie et en même temps inhiber la neuro-inflammation retarderait le début de la paralysie létale et prolongerait la vie des patients. En traitant les symptômes communs à toutes les formes de SLA et non la cause, NV pourrait être appliquée à tous les patients atteints de SLA.
Procédures
Tout d’abord, les nuisances prévues sont liées au phénotype dommageable. A cela s’ajoute les nuisances prévues lors des procédures testant l’administration de la molécule NV directement ou vectorisées par un vecteur viral par différentes voies d’injections en liens avec les protocoles d’anesthésie et d’analgésie. Chaque animal ne sera inclus que dans une seule des procédures du projet de recherche. Par conséquent, chaque animal ne subira qu’une injection unique, quelle que soit la voie d’administration nécessitant une chirurgie ou non. Les souris seront soumises à 6 types d’interventions : anesthésie gazeuse à l’isoflurane, injection de la biomolécule ou du vecteur virale, prélèvements sanguins, intervention chirurgicale pour la pose d’une minipompe osmotique, test neurologique et test moteur. Toutes les souris subiront une anesthésie gazeuse à l’isoflurane, ponctuelle, de 3 minutes environ. Cette anesthésie gazeuse précédera soit une injection unique de la biomolécule NV ou du vecteur viral par voie intraveineuse (moins d’une minute), par voie intrathécale (moins d’une minute) ou par voie intracérébroventriculaire (moins de 5 minutes). Soit l’anesthésie gazeuse, suite à une analgésie, précédera une intervention chirurgicale d’une dizaine de minute pour la pose d’une minipompe osmotique diffusant la biomolécule NV durant au moins 4 semaines. Les souris subiront toutes un prélèvement sanguin hebdomadaire de moins d’une minute pendant 3 à 17 semaines selon les procédures. Enfin, 3 fois par semaines, les souris subiront un test neurologique et un test des capacités motrices de moins de 5 minutes chacun.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris SOD1G93A. Les souris SOD1G93A expriment plusieurs copies d’un transgène contenant le gène humain mutant SOD1 et sont le modèle animal de référence pour l’étude de la SLA. Ce modèle murin présente des signes cliniques et pathologiques en commun avec la maladie chez l’Homme tel que la perte des motoneurones, une faiblesse et une atrophie musculaire progressive avec une éventuelle paralysie allant jusqu’à la mort de l’individu. Les souris SOD1G93A développent une SLA agressive caractérisée par une paralysie progressive des membres postérieurs dès l’âge de 3 mois (90 jours) suivi d’une mort des individus à l’âge de 5 mois environ. Pas d’effets indésirables liés à la molécule NV en elle-même ne sont attendus. De même, pas d’effets indésirables liés à l’utilisation des vecteurs viraux ne sont attendus. Les potentiels effets indésirables sont liés aux interventions chirurgicales (injections intra-cérébro-ventriculaire et pose de la pompe osmotique) où il est probable qu’une infection se développe après l’intervention. Néanmoins, les mesures d’hygiène seront rigoureusement respectées afin d’éviter au maximum ces effets liés à la chirurgie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. L’ euthanasie des animaux est nécessaire afin d’étudier et de comprendre le plus précisément possible les potentiels effets bénéfiques de NV au niveau immunitaire et au niveau histologique dans les tissus nerveux.
Remplacement
Au préalable de ce projet d’étude, la biomolécule NV a fait l’objet d’une sélection in vitro sur des cultures de neurones parmi plusieurs molécules candidates. Seule la molécule ayant montrée les meilleurs résultats a été retenue. Les effets bénéfiques de NV ayant été démontré sur des cultures de neurones in vitro, l’étape suivante est de tester la biomolécule NV dans un modèle in vivo. Cette étape est nécessaire pour savoir si les effets de NV sont effectivement bénéfiques dans un modèle murin de Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), De plus, l’utilisation d’un modèle animal est une étape cruciale et déterminante pour évaluer efficacement le potentiel thérapeutique de la biomolécule NV avant de la tester chez des patients atteints de SLA.
Réduction
La lignée SOD1G93A a été historiquement utilisée sur un fonds génétique mixte. Nous utiliserons dans ce projet les souris SOD1G93A sur un fonds pur C57BL/6 ce qui limitera la variabilité phénotypique et ainsi le nombre d’individus requis dans les différentes procédures. Pour réduire le nombre d’animaux, une seule molécule thérapeutique sera testée in vivo. Le nombre d’animaux requis pour pouvoir démontrer l’efficacité de NV dans le modèle SOD1G93A a été calculé par des tests de puissance statistique à partir de données publiées dans la littérature sur le phénotype des souris SOD1G93A.
Raffinement
Les techniques de chirurgie nécessaires à la réalisation du projet (injections intracérébroventriculaires, pose de minipompe osmotique) seront acquises auprès d’un laboratoire de référence. Les animaux recevront des antalgiques avant et après chirurgie. La surveillance des animaux sera quotidienne durant les 5-7 jours suivant les chirurgies, puis bihebdomadaire. La douleur et le stress seront mesurés selon une grille d’évaluation mise en place en partenariat avec la structure responsable du bien-être animal encadrant notre laboratoire. Les souris SOD1G93A développent de façon spontanée une paralysie progressive à partir de 100 jours. La progression de la pathologie musculaire sera évaluée deux fois par semaine à partir de 80 jours à l’aide d’un système de score neurologique de référence.. A partir d’un score de 2 les souris seront suivies quotidiennement. Le poids sera mesuré deux fois par semaine. A un score neurologique de 4, une immobilité > 24h ou une perte de poids > 25%, les animaux seront mis à mort
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle souris car son génome est facilement modifiable et permet d’établir des lignées transgéniques. Le modèle souris SOD1G93A développe une pathologie très proche de la SLA humaine et est le modèle le plus utilisé pour développer de nouvelles thérapies. Nous utiliserons à la fois des nouveau-nés et des souris adultes pour administrer les AAV-NVs. Chez les nouveau-nés, l’administration d’AAV permet de cibler un plus grand nombre de neurones que chez l’adulte. En effet les barrières hématoencéphaliques et la barrière liquide céphalorachidien/cerveau sont plus perméables chez le nouveau-né et permettent un meilleur accès des AAVs au système nerveux central. L’expression du transgène par les neurones et ensuite stable tout au long de la vie de l’animal. Ces expériences nous permettront de réaliser une preuve de concept de l’efficacité de NV lorsque la molécule est exprimée avant le développement de la maladie. L’administration chez les adultes permettra de déterminer l’effet thérapeutique de la molécule NV lorsque la pathologie est déjà présente.
Variabilité de fréquence cardiaque chez un modèle canin de myopathie de Duchenne : investigation des anomalies par modulation pharmacologique.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
12 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, six chiens atteints d'une forme canine de myopathie de Duchenne et six chiens sains. Ils reçoivent trois molécules par voie orale ou par patch, un enregistrement ECG continu non invasif et neuf prises de sang, pour comprendre une anomalie cardiaque précoce. À l'issue, les chiens sains sont proposés à l'adoption et les chiens GRMD réutilisés dans un autre projet, sans mise à mort prévue. Le porteur affirme que cette anomalie ne peut être modélisée in vitro et que le chien GRMD est le modèle "le plus fidèle" de la maladie humaine.
Objectifs
La myopathie de Duchenne est une maladie génétique qui touche le muscle chez l'enfant. Les patients sont contraints à l'usage du fauteuil roulant vers l'âge de 10 ans, et décèdent d'insuffisance respiratoire ou cardiaque vers l'âge de 30 ans. Le chien GRMD (golden retriever muscular dystrophy) reproduit de manière fidèle la maladie humaine, dans un organisme de grande taille, pouvant être suivi sur le long terme. Il occupe donc une place pré-clinique immédiate dans le développement de thérapies pour la myopathie de Duchenne. Au cours d'une étude visant à décrire les anomalies de l’électrocardiogramme des chiens GRMD à l'aide d'enregistrements holter réalisés au cours d'un suivi longitudinal de plusieurs années, la proximité des anomalies rencontrées chez le chien et chez l'Homme, tant dans leur nature que dans la séquence de leur survenue, a pu être démontrée. Cependant, une anomalie, encore jamais investiguée chez les patients, a été identifiée et est celle qui survient le plus précocement chez le chien et permet de prédire, plusieurs mois auparavant, l’atteinte fonctionnelle cardiaque ultérieure. Cette même anomalie a été relevée dans plusieurs études chez l'Homme, dans des contextes pathologiques divers, comme un marqueur de mauvais pronostic très robuste. L'origine de cette anomalie est cependant mal comprise, mais plusieurs hypothèses sont avancées. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre l’origine de cette anomalie chez le chien GRMD en ciblant par voie pharmacologique les différents acteurs possiblement impliqués dans sa survenue. Cela permettra de mieux comprendre cette anomalie électrocardiographique très précoce et prédictive de la dégradation de la fonction cardiaque et de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre l'origine de cette altération électrocardiographique chez le chien GRMD, et plus largement de contribuer à la compréhension de l'origine de la puissance générée dans les très basses fréquences en variabilité de fréquence cardiaque. Cette anomalie survenant précocement dans le cours de la maladie, et semblant liée à la dégradation ultérieure de la fonction cardiaque, comprendre son origine permettra éventuellement d'identifier des cibles thérapeutiques permettant de retarder la survenue de la dysfonction cardiaque chez les chiens GRMD et a fortiori chez les patients atteints de myopathie de Duchenne.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, les seuls gestes invasifs effectués sur les animaux seront des prises de sang (9 prélèvements), effectués sur animaux vigiles, en prenant soin d'effectuer une contention la plus douce possible, de prendre le temps de rassurer les animaux, d'effectuer un prélèvement rapide (durée du prélèvement en lui-même = moins d'une minute) et indolore, et de récompenser les animaux après chaque prélèvement.
Impact sur les animaux
Les 3 molécules testées sont des molécules utilisées chez le chien, pour lesquelles les doses sont bien connues ainsi que les potentiels effets secondaires. Ces derniers seront principalement à surveiller pour ce qui concerne le donneur de NO (trinitrine). Une baisse importante de la pression artérielle pourrait être observée chez les animaux en cours de traitement. Afin d'éviter tout incident grave lié à une hypotension, les chiens seront surveillés de très près durant les premières heures de traitement, et leur pression artérielle (brassard) sera mesurée toutes les heures, la fréquence de ces mesures sera augmentée en cas de chute de plus de 20 %. Si la pression artérielle chute en dessous de 100 mm Hg, le patch de trinitrine sera immédiatement retiré. Le retrait des électrodes adhésives utilisées pour l'ECG pouvant être douloureux pour la peau, un anti-adhésif sera préalablement appliqué.
Devenir
Les chiens sains utilisés dans ce projet seront mis à l'adoption à l'issue du projet. Les chiens GRMD pourront être réutilisés dans un autre projet compatible, sous réserve de l'accord du vétérinaire désigné.
Remplacement
L'anomalie de l'électrocardiogramme étudiée dans ce projet ne pourrait pas être modélisée in vitro/ex vivo. En effet, il s'agit de mesurer la modulation de fluctuations des intervalles entre pulsations cardiaques, celle-ci étant sous le contrôle de facteurs multiples hormonaux, neurovégétatifs, vasculaires qui ne peuvent donc être étudiés autrement que dans un organisme vivant. L'anomalie que nous cherchons à comprendre ayant été identifiée chez les chiens GRMD, ce projet sera donc conduit chez ces animaux.
Réduction
Grâce à la variabilité connue de l'indice étudié chez les chiens GRMD, nous avons pu déterminer que 6 chiens seraient nécessaires et suffisants pour démontrer une augmentation de cet indice à une valeur intermédiaire entre celle mesurée chez les chiens GRMD non traités et celle observée chez des chiens sains du même âge. Dans un souci de réduction, les 6 chiens GRMD inclus dans ce projet seront réutilisés d'un projet précédent, sous réserve de l'accord du vétérinaire désigné, et/ou pourront être réutilisés dans un autre projet après celui-ci. De plus, les chiens sains ne seront inclus que si les données obtenues chez les chiens GRMD ne vont pas dans le sens de celles attendues au vu des données bibliographiques disponibles sur des chiens sains. Dans ce cas les chiens sains seront inclus afin de vérifier les données obtenues dans les conditions expérimentales de l'étude, sur des chiens sains de la même souche que les chiens GRMD.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, nous aurons recours à un enregistrement de l'ECG non invasif (électrodes adhésives de surface), et de type holter, permettant au chien de mener une vie normale tout en permettant l'enregistrement continu de son électrocardiogramme. Cela permet une réduction du stress et une meilleure représentativité des données obtenues par rapport à un enregistrement ponctuel. Par ailleurs, les trois molécules dont nous testerons l'effet seront administrées de manière également non invasive, soit par voie orale dans une friandise, soit par diffusion continue à l'aide de patches. Les prises de sang seront effectuées par des personnels formés à la fois au geste technique et aux méthodes de réduction du stress des animaux pendant un geste médical. Les animaux seront récompensés (voix, caresses et friandise) après chaque prélèvement. Sur le plan de l'hébergement, les chiens sont hébergés en petits groupes sociaux compatibles, sur litière, et ont à leur disposition des plateformes, lieux de couchage et jouets. Ils bénéficient de sorties quotidiennes 7j/7 en groupes plus larges et d'interactions quotidiennes avec l'Homme. Leur état clinique est étroitement surveillé : pesée et prise de température quotidienne et présence d'un vétérinaire 7j/7.
Choix des espèces
Le chien GRMD est le modèle de DMD présentant la plus grande pertinence translationnelle. En effet, il mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle murin, dans un organisme de grande taille, et permet donc de modéliser au plus près, au stade préclinique, les enjeux qui seront rencontrés dans les essais cliniques chez les patients. Dans le cadre de ce projet plus précisément, le fait de travailler sur les chiens permet de se placer dans le seul modèle animal qui reproduit de manière fidèle les anomalies électrocardiographiques décrites chez les patients DMD. Les chiens inclus dans cette étude devront être d'âge supérieur à 6 mois afin que les anomalies électrocardiographiques étudiées soient clairement présentes, et également que leur poids corporel soit compatible avec les dispositifs d'administraton utilisés (patches notamment), mais inférieur à 24 mois afin de ne pas être dans une situation d'insuffisance cardiaque.