Troubles musculosquelettiques

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Mâles logés seuls, elles fournissent trois prélèvements de fèces et passent des tests d'effort sur tapis roulant et de force de préhension, avant une anesthésie sans réveil pour prélever leurs muscles. Le porteur teste l'effet d'un complément, les fructo-oligosaccharides, sur la performance musculaire et le microbiote, et vise des "allégations pour valoriser les produits" d'un industriel. Il reconnaît qu'aucun effet nocif n'est attendu de cette molécule déjà autorisée chez l'humain, mais affirme que le recours à l'expérimentation in vivo est "incontournable".

Objectifs

L'objectif de ce projet de recherche est d'identifier l'impact d'une supplémentation avec un produit naturel, la fructo-oligosaccharides à chaîne courte (FOS), sur la force musculaire et la nature du microbiote intestinal chez la souris. Ces effets peuvent être à l'origine d'une modulation de la performance sportive chez l'homme. Pour cela, nous allons mesurer la Vitesse Maximale Aérobie (VMA), le temps limite au seuil anaérobie (CMA) et la force maximale d’agrippement (Grip Strength) chez une population saine de souris mâles. Nous allons également observer si les changements des capacités musculaires peuvent être en relation avec un changement dans la composition du microbiote intestinal.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront d'envisager d'autres analyses qui pourront conduire à des évaluations chez l'homme. Dans ce sens, les résultats vont permettre des allégations pour valoriser les produits naturels commercialisés par l'industriel.

Procédures

1. Trois prélèvements de Fèces à réaliser la semaine 8, la semaine 12 et la semaine 16, pour chaque souris : Pendant le déroulement du protocole, 3 échantillonnages de fèces seront réalisés pour chaque animal. Nous récoltons les fèces des animaux, au moment où ils sortent de l’orifice du rectum. Les échantillons sont congelé -80°C pour analyse et caractérisation du microbiote intestinal. 2. Evaluation de la Vitesse Maximale Aérobie (VMA), sur tapis roulant. C'est la vitesse à partir de laquelle la consommation d'oxygène est considérée maximale. Il s'agit d'une course réalisée 3 fois /16 semaines et avec une durée de 15-40 min environ. 3. Une fois la valeur de la VMA connue, nous ferons l'évaluation de la capacité maximale aérobie (CMA), également sur tapis roulant. Il s'agit du temps que la souris est capable de passer à courir à sa VMA. C'est une course réalisée 3 fois /16 semaines et avec une durée de 15-40 min environ. 4. Test pour mesurer la force musculaire : Grip Strength : 3 fois /16 semaines et avec une durée de 0-5 min.

Impact sur les animaux

Compte tenu que le produit que nous testons est une molécule qui est déjà autorisée et utilisée chez l’homme, aucun effet nocif, toxique ou secondaire n’est attendu. Les rongeurs sont des animaux naturellement coopératifs pour faire de l'activité physique. Si un problème survient pendant les tests d'évaluation ou une perte de poids supérieure à 20% sur la durée du protocole, ils seront considerés dans le point limite. Si ces changements sont observés, les animaux seront euthanasiés.

Devenir

A l'issue de la fin du projet, une anesthésie sans réveil est prévue pour la totalité des animaux. En fait, nous avons besoin de prélever des échantillons de muscles pour les analyses ultérieures. Ces analyses nous permettrons d'identifier les acteurs moléculaires qui vont participer dans les changements observés.

Remplacement

Dans ce projet, nous cherchons à identifier les effets d’une molécule (FOS) sur la performance musculaire . Pour cela nous avons besoin de mesurer la performance lors d'une activité physique. Il n'existe donc pas d'alternative in vitro pour ce type d'évaluation (activité physique). La nécessité de la recherche rend incontournable le recours à l'expérimentation in vivo.

Réduction

Les cohortes seront constituées de 16 souris, afin d’obtenir un nombre d'animaux suffisant pour juger du caractère significatif des résultats. Nous avons calculé le nombre d'échantillon nécessaire par groupe pour pouvoir juger de l'effet du produit. La taille correspond à 16 animaux/groupe. Nous avons conclu que 16 doit être le nombre d'animaux par groupe. Cela représente désormais 48 animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour juger la significativité des donnés.

Raffinement

Les animaux utilisés dans ce projet nécessitent un hébergement en cage individuelle car il est indispensable de mesurer la consommation quotidienne de nourriture et eau mais des précautions sont prises. Les animaux seront hébergés dans des cages individuelles, côte à côte et enrichies avec de jouets et du matériel adapté ce qui permet de limiter l'isolement social et le stress. De plus, tout au long de la durée du protocole, les animaux suivront un contrôle quotidien effectué par les chercheurs via un registre journalier et individuel des animaux. Un questionnaire pour mesurer le niveau de souffrance des rongeurs est mis à disposition et disponible dans les locaux de l’animalerie. Le questionnaire fait ressortir les signes visibles de douleur et d’inconfort chez le rongeur (vocalisation, agressivité, retrait d’un membre, autres). En cas d'atteinte des points limites décrits dans chacune des procédures, nous procéderons à une injection intra-péritonéale d'anesthésiant en surdose.

Choix des espèces

La souris est très similaire à l’homme : 99 % de ses gènes présentent un gène homologue chez l'humain. Elle possède un développement rapide et une taille réduite. Nous avons choisi les BALB/c, mâles, car nous avions besoin d'un modèle de souris sain, robuste et avec une bonne disposition pour l'activité physique. De plus, ce sont des lignées consanguines ce qui reduit les écarts des réponses individuelles. Mâles, agés de 8 semaines, âge de maturité sexuelle et développement musculaire.

12 lapins vont être utilisés, tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque lapin reçoit sous la peau, sous anesthésie générale, un biomatériau osseux à tester et un témoin, avant une analyse des tissus après mise à mort. Le porteur attend une réaction inflammatoire pouvant provoquer douleur locale, encapsulation ou abcès, et évalue la tolérance du matériau en vue d'un marquage CE. Il affirme qu'il "n'existe pas d'autre méthode" pour étudier la tolérance de l'hôte et justifie l'usage par la "nécessité" de poursuivre les recherches sur de nouveaux biomatériaux.

Objectifs

En médecine humaine, les biomatériaux osseux servent à combler un défaut après un traumatisme ou une chirurgie. Ils constituent une alternative à l’autogreffe osseuse. Le biomatériau osseux idéal devrait être biocompatible, biorésorbable, tout en présentant une intégrité structurelle similaire à celle de l’os, une matrice ostéoconductrice, et contenir des facteurs ostéo-inducteurs. Actuellement, aucun substitut osseux ne répond à toutes ces exigences et la greffe autologue avec ses complications qu’elle entraîne, reste le traitement majoritairement utilisé. C’est pourquoi il est nécessaire de poursuivre les recherches quant à la création de nouveaux biomatériaux. De plus, pour l’obtention du marquage CE, la biocompatibilité des matériaux développés doit être évaluée selon la norme ISO 10993-6 concernant l'évaluation biologique des dispositifs médicaux.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de s’assurer de la tolérance et l’inocuité tissulaire locale de ce biomatériau destiné in fine à un usage en médecine humaine pour la reconstruction osseuse.

Procédures

1 intervention chirugicale d'implantations sous la peau du biomatériau à tester et du biomatériau témoin sous anesthésie générale durant approximativement 1 heure 1 anesthésie générale terminale avant euthanasie

Impact sur les animaux

En raison de l’objectif de l’étude, l’effet indésirable majeur est le developpement d’une réaction inflammatoire prolongée au niveau des sites d’implantation, pouvant générer une douleur locale, une inflammation chronique avec encapsulation et/ou abcédation. Un retentissement systémique de cette réaction inflammatoire prolongée avec baisse d'activité et de l'appétit enraînant une perte de poids constitue un des points limites lorsqu'un échec thérapeutique à l'administration d'antalgiques et de soins locaux est constaté.

Devenir

Nécessité de réaliser une analyse histopathologique détaillée des sites d'omplantations, seulement réalisable après prélèvement des tissus post-mortem. Néanmoins, les 2 lapins supplémentaires prévus en cas de pertes d'animaux non liées au protocole seront affectés à un autre protocole dans le cas où ils ne seraient pas utilisés.

Remplacement

A l’heure actuelle, il n’existe pas d’autres méthodes d'étude de la tolérance de l'hôte permettant d’éviter ou de remplacer l’utilisation d’animaux pour l’approche thérapeutique abordée dans ce projet.

Réduction

Compte-tenu d’études comparables déjà publiées, le nombre d’animaux par groupe correspond au nombre minimal requis pour atteindre une significativité́ statistique. L’animal étant son propre témoin, cela nous permet de réduire la variabilité individuelle, d’augmenter la puissante du test statistique et de travailler sur des faibles effectifs (n=5) sans perdre la validité statistique.

Raffinement

Les manipulations se dérouleront dans le strict respect du bien-être des animaux. L’hébergement est assuré dans des cages individuelles conformément à la réglementation en vigueur. Le modèle chirurgical est maîtrisé et réalisé par des chirurgiens qualifiés. Des traitements analgésiques adaptés seront mis en place et ajustés au niveau de douleur identifiée individuellement sur chaque lapin. Toute maladie concomitante apparaissant pendant l’étude fera l’objet de soins et de traitements adaptés. L’échec aux traitements conventionnels et l’impact de la maladie sur les résultats de l’étude seront évalués comme point limite. Les animaux ont accès librement aux granulés spéciaux pour lapins et à l’eau de boisson (ad libitum). L’enrichissement du milieu se fait par des jouets et des blocs de foin compacté et une tablette surélevée permettant aux lapins de se placer au-dessus ou en dessous. Les moyens mis en œuvre pour détecter, identifier et mettre un terme sans délai aux douleurs, souffrance et angoisse potentielles consiste en une surveillance quotidienne des animaux et l'utilisation d'un arbre décisionnel d'intervention (soin, analgésie, euthanasie) à partir de la collection de comportements et de signes physiques anormaux identifiés sur les animaux. Par ailleurs, le soin des lapins est assuré par un personnel qualifié dans un hébergement conforme et enrichi. Les animaux sont manipulés dans un environnement calme et sous sédation ou anesthésie dès lors que la manipulation est stressante et source d’inconfort. L’immobilisation chimique est réalisée par voie sous-cutanée ce qui évite de requérir à une contention physique pour réaliser l’injection des produits sédatifs et analgésiques.

Choix des espèces

Le choix des lapins est fondé sur plusieurs critères : - Animaux adultes : maturité squelettique - Animaux faciles à gérer en stabulation ; - Modèle d’inflammation induite chez le lapin largement répondu et décrit dans la littérature. Animaux adultes : aspect anatomique (modèle validé)

5 750 souris vont être utilisées, la plupart tuées à l'issue et 1 835 réutilisées pour entraîner le personnel aux gestes techniques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une fragilité osseuse décrite comme un phénotype dommageable, elles subissent tatouage, injections sous-cutanées répétées et prélèvements de sang, avant un prélèvement terminal sous anesthésie. Le porteur écarte l'adoption au motif qu'il s'agit de souris transgéniques. Il affirme qu'un "organisme entier" est nécessaire et qu'aucune méthode in vitro validée n'offre d'alternative.

Objectifs

Le but de ce projet est d’évaluer le profil d’élimination, l’efficacité et la tolérance de molécules à visée thérapeutique dans le cadre de traitement des problèmes de fragilité et densité osseuse sur un modèle de souris. Dans ce projet, nous allons tester des molécules en développement qui ont montrées un potentiel thérapeutique élevé in vitro et une bonne tolérance in vivo sur des animaux ne developpant aucune pathologie (objet d’une précédente Demande d'Autorisation de Projet).

Bénéfices attendus

Les maladies touchant la densité osseuse sont des pathologies lourdes, pouvant être létales. Elles se caractérisent chez les patients par des troubles du tissu conjonctif entrainant une faible masse osseuse, une fragilité osseuse et des fractures. Il n’existe actuellement aucun traitement curatif, c’est pourquoi il est nécessaire de développer de telles thérapies. Ce projet permettra de sélectionner des molécules d’intérêts pour des études pré-cliniques et cliniques.

Procédures

- Identification individuelle à l'oreille, tatouage (

Impact sur les animaux

Ce projet sera réalisé sur des souris présentant des fragilités osseuses, il s'agit d'un phénotype dommageable. Les premiers animaux générés (autre établissement utilisateur) expriment le phénotype attendu dès 2 mois : faible masse osseuse, une augmentation de la fragilité osseuse et des risques de fractures. Ces animaux sont également de petite taille. Etant donné le phénotype, seuls les mâles porteurs de la pathologie seront utilisés pour la reproduction. Les portées sont de tailles normales. Les femelles porteurses de la pathologie seront utilisées lors des expérimentations. S'agissant d'une lignée nouvellement créée, nous seront particulièrement vigilant quant à tout nouveau phénotype observé.

Devenir

Procédure 1: Les animaux trop vieux pour la reproduction seront euthanasiés. Les animaux ne développant aucune pathologies et surnuméraires pourront être utilisés dans un projet de formation aux gestes techniques (nous estimons à 1 835 le nombre de mâles générés et ne développant aucune pathologie). Etant donné qu’il s’agit de souris transgéniques, l’adoption ne peut être envisagé ici. Procédure 2 :Tous les animaux utilisés dans l’étude sont mis à mort afin de réaliser des analyses ex vivo.

Remplacement

Le but de ce projet est d’évaluer le profil d’élimination, la tolérance et l’efficacité d’une molécule à visée thérapeutique en développement pour une utilisation chez l’Homme. Pour cela un organisme entier est nécessaire. Il n’existe aucune méthode in vitro validée scientifiquement qui offrirait une alternative à l’expérimentation animale pour répondre aux questions adressées dans ce projet.

Réduction

Les molécules évaluées dans ce projet auront été auparavant testées in vitro afin de n’administrer que les molécules présentant un potentiel thérapeutiques élevé sur les animaux et ainsi réduire leur nombre. Les molécules testées ici sur des animaux transgéniques ont également fait l’objet d’une précédente demande avec des animaux ne développant aucune pathologie et seules celles ayant démontré une bonne tolérance seront utilisées. Des groupes de maximum 10 animaux sont réalisés, puisqu’il a été observé lors d’études préliminaires (réalisées dans un autre établissement) que ce nombre permettait d’avoir des résultats statistiques significatifs.

Raffinement

Dans un but de raffinement des expériences, nous réalisons une évaluation précise de l’état de santé des animaux au cours de l’hébergement et des procédures expérimentales grâce à des grilles de suivis et l’établissement de points limites précoces. Les conditions d’hébergement et de soins et les méthodes utilisées ont été choisies et conçues de manière à réduire au maximum toute douleur, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux (ex: recours à l'anesthésie avant certains prélèvements). Le bien-être des animaux sera évalué par l’observation des signes cliniques, la pesée des animaux après la période d’acclimatation et lors des injections. Les points limites spécifiques mis en place seront appliqués. Etant donné le phénotype des animaux, ils seront manipulés le moins possible et avec précaution. Bien que les traitements testés dans ce projet aient déjà démontrées une bonne tolérance in vitro ainsi que sur des animaux ne developpant pas de pathologie, nous porterons une attention accrue sur les animaux en cours de traitement tout au long de l’étude : comportement, sites d’injection, sites de prélèvement, poids, signes cliniques…

Choix des espèces

Compte tenu des connaissances et des technologies actuelles, la souris est un modèle de choix pour les modifications génétiques. Nous utilisons ici un modèle de souris dans lequel a été modifié un gène codant pour une protéine de la matrice osseuse. Cette modification génétique est retrouvée chez 80% des patients et ce modèle permet de récapituler au mieux la pathologie étudiée. C’est pourquoi nous utilisons la souris dans ce projet. Pour l’élevage, les animaux seront mis en croisement à partir de l’âge de 8 semaines (âge de maturité sexuelle) jusqu’à maximum 10 mois d’âge (âge au cours duquel la fertilité des animaux diminue). Pour les expérimentations, les animaux seront utilisés à partir de 8 à 10 semaines d’âge minimum et jusqu’à 18 à 20 semaines. En effet le pic de densité osseuse chez les souris C57Bl6/J (maturité du squelette) est atteint à l’âge de 4 mois. Nous choisissons d’évaluer l’efficacité des molécules sur la densité osseuse sur des animaux entre 8/10 et 18/20 semaines (durée du traitement) afin d’inclure la période de puberté. Lors d’une étude pilote (réalisée dans une autre CRO), il n’y a pas eu d’effet observé de cette classe de molécule sur des souris jeunes (2 semaines) contrairement à l’utilisation de souris de 8 semaines.

200 souris porteuses d'une mutation humaine reproduisant la dystrophie myotonique vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des tests de force et de course sur tapis, des examens cardiaques sous anesthésie et des injections de vecteurs de thérapie génique, avant mise à mort par injection de chlorure de potassium pour prélever leurs tissus. Le porteur indique que la lignée présente elle-même une forte mortalité précoce, un retard de croissance et des incisives à couper, symptômes recherchés du modèle. Il affirme qu'aucune méthode ne remplace le test d'une thérapie génique in vivo dans un "organisme entier" et présente l'étude comme préparatoire à un futur essai de dose.

Objectifs

La dystrophie myotonique (DM1) est la forme la plus courante de dystrophie musculaire chez l'adulte. Elle se caractérise par diverses manifestations cliniques multiples, notamment une faiblesse musculaire progressive, des défauts cardiaques et des symptômes extramusculaires tels qu'une cataracte, une atrophie testiculaire, un dysfonctionnement endocrinien et cognitif. Une mutation du gène DMPK (pour DM1 Protein Kinase) est responsable de la DM1. La mutation de ce gène le rend toxique, avec de nombreuses conséquences moléculaires qui peuvent expliquer les nombreux symptômes de la DM1. Plusieurs modèles animaux de la DM1 ont été développés. Parmi ces modèles, l'un des plus puissant aujourd'hui est le modèle de souris transgénique DMSXL, qui présente plusieurs symptômes associés au DM1, notamment un retard de croissance, des défauts musculaires, des défauts cardiaques et des troubles cognitifs. Les souris DMSXL semblent être aujourd'hui un des meilleurs modèles pour étudier le trouble multisystémique de la DM1, et surtout évaluer des approches thérapeutiques. Nous souhaitons aujourd’hui utiliser ce modèle de souris DMSXL afin d’évaluer des produits thérapeutiques de thérapie génique (visant à corriger le défaut génétique), avec la réalisation à terme d’une étude de dose qui sera support à une demande d’essai clinique chez des patients DM1. Avant la réalisation de cette étude de dose (qui fera l’objet d’une demande d’autorisation distincte), le présent projet a 2 objectifs : (1) La réalisation d’une courte étude d’histoire naturelle du modèle de souris DMSXL, qui nous permettra de concevoir au mieux le plan de l’étude de dose à venir. En effet, si des informations sur ce modèle DMSXL si disponibles dans la littérature, elles restent incomplètes (effet du sexe sur la pathologie ? phénotype précis à certains âges ? etc). Il est également important que notre équipe puisse se familiariser avec la manipulation et le suivi de ces souris. (2) La réalisation d'études pilotes lors desquelles l’efficacité de différents produits de thérapie génique sera évaluée, uniquement au niveau moléculaire. Ces études pilotes permettront de réaliser un criblage de différents produits thérapeutiques, afin d'aider à identification du produit de choix qui sera ensuite évalué lors de l’étude de dose.

Bénéfices attendus

La dystrophie myotonique (DM1) est la forme la plus courante de dystrophie musculaire chez l'adulte, sans traitement curatif à ce jour. Elle est caractérisée par de nombreux symptômes (neuromusculaire, respiratoire, cardiaque, endocrinienne, neurologique centrale, oculaire, digestive…), a un impact sur de nombreux aspects de la vie des patients et est responsable d’une réduction de l’espérance de vie et de la participation sociale. La prise en charge des patients est aujourd'hui essentiellement basée sur des consultations multidisciplinaires régulières et la mise en place de physiothérapie, d'ergothérapie, de mise en place d'appareils d'aide à la mobilité, et de soins de soutien pour la gestion de complications respiratoires et cardiaques. L'évaluation d'approches thérapeutiques reste donc essentielle pour évoluer vers la mise en place d'un réel traitement curatif pour ces patients. La thérapie génique est une des approches prometteuses qui permettrait de traiter la cause moléculaire de la maladie, au moins au niveau des atteintes musculaires et cardiaques. Pour évaluer de telles approches thérapeutiques, mieux connaître le modèle animal qui sera utilisé pour les études précliniques à venir (notamment la détermination de la dose thérapeutique des produits) est essentielle. C’est ce que nous visons avec le présent projet, via l’étude d’histoire naturelle de la souris DMSXL. De plus, les études pilotes qui seront réalisées pour tester l’efficacité moléculaire de différents vecteurs de thérapie génique dans ce modèle de souris DMSXL, nous permettront de réaliser un criblage de ces différents produits thérapeutiques, afin d’identifier le produit de choix qui sera ensuite évalué lors de la future l’étude de dose.

Procédures

Pour l'étude d'histoire naturelle de la souris DMSXL, les animaux seront soumis aux interventions suivantes: dans la semaine précédent leur euthanasie: test de mesure de force d'agrippement réalisé sur animal vigile (1 test par animal / durée maximale du test = 10 minutes) + test à l'effort sur tapis roulant réalisé sur animal vigile (1 test par animal / durée maximale du test = 15 minutes) + évaluation de la fonction cardiaque (électrocardiogramme et échocardiographie) sur animaux anesthésiés (1 test par animal) / durée maximale du test = 45 à 50 minutes). A 1 mois ou 4 mois d'âge, selon la durée de leur suivi, un prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie, avant euthanasie par une injection IV d'une dose létale de chlorure de potassium. Pour les études pilotes pour le criblage de produits thérapeutiques, les souris DMSXL seront soumises aux interventions suivantes: à 1 mois d'âge, injection unique (soit par voie intramusculaire, soit par voie intraveineuse) d'un vecteur de thérapie génique, sous anesthésie. Puis à 2 mois ou 4 mois d'âge, selon la durée de leur suivi, anesthésie puis euthanasie par une injection intraveineuse d'une dose létale de chlorure de potassium.

Impact sur les animaux

La majorité des gestes réalisés sur ces animaux seront non ou peu invasifs (tests musculaires non invasifs réalisés sur animaux vigiles, évaluations cardiaques non invasives réalisées sur animaux anesthésiés, injections intramusculaires ou intraveineuses réalisées sur animaux anesthésiés, et prélèvements sanguins réalisés sur animaux anesthésiés avant euthanasie). L’injection intramusculaire ou intraveineuse d’un vecteur de thérapie génique chez la souris est connue pour ne provoquer aucun effet indésirable. Lors de l’expression des transgènes thérapeutiques, aucun effet indésirable n’est non plus attendu. Au contraire, en cas d’effet thérapeutique, une diminution des symptômes liés à la maladie pourraient être réduits chez les souris DMSXL. Les seules nuisances attendues sur les animaux sont finalement celles liées au phénotype de la maladie chez les souris DMSXL. En effet, elles présentent un phénotype dès la naissance: forte mortalité subite pendant les 3 premières semaines de vie (55%), retard de croissance (jusqu’à 50% du poids des souris contrôles au moment du sevrage puis les souris rattrapent jusqu’à 70-80%), anomalies musculaires (baisse de la force), anomalies du comportement. Cela correspond à différents symptômes observés chez les patients DM1. Les souris DMSXL présentent également souvent des anomalies des incisives qui s'allongent de façon anormale. Les souris sont donc surveillées régulièrement et les incisives seront coupées (sur animaux vigiles, le geste étant sans douleur) si nécessaire.

Devenir

Tous les animaux de cette étude seront euthanasiés afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses histologiques et moléculaires nécessaires au projet.

Remplacement

Ce projet de caractérisation de l'histoire naturelle de la souris DMSXL (à différents âges et avec des évaluations adaptées) nous permettra à terme de réaliser l'évaluation préclinique de traitements potentiels de la DM1 dans ce modèle animal adapté, et donc de raffiner le nombre d'animaux utilisés dans ces futurs projets, notamment dans une étude de dose d'une produit thérapeutique qui est prévue à suivre. D'autre part, il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pour tester l’effet d’un traitement de thérapie génique in vivo. Nous savons que l’efficacité du transfert de gène dans une lignée cellulaire in vitro n’est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier. L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact d’un transfert de gène dans différents types cellulaires (différents organes) et sur son phénotype, en lien avec le mode d’administration utilisé et la dose administrée. L'utilisation du modèle DMSXL, modèle animal de la DM1, est donc essentiel pour l'évaluation préclinique de produits thérapeutiques. D'autre part, pour les criblage des produits thérapeutiques, si des études in vitro sur des cellules de patients DM1 seront également réalisées, des études pilotes chez la souris DMSXL restent essentielles, afin de valider également la fonctionnalité de ces vecteurs au niveau moléculaire dans ce modèle de souris qui diffère légèrement des modèles in vitro, de part la nature transgènique du gène DMPK humain présent dans ces souris.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe (pour l'étude d'histoire naturelle: minimum 8 animaux et maximum 15 animaux / pour les études pilotes pour le criblage de produits thérapeutiques: minimum 3 et maximum 5 animaux) a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu'il soit excessif, permettant d'assurer la robustesse des résultats. Il est basé sur notre expérience précédente de précédents projets et des données de la littérature sur le modèle de souris DMSXL, lors desquels des résultats cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de ces tailles. Pour l'étude d'histoire naturelle, notre objectif est d'obtenir des données complètes sur 8 à 12 animaux par groupe, notamment pour les tests d'évaluation des fonctions musculaires et cardiaques. Mais vu la mortalité potentielle observée chez les souris DMSXL, notamment lors du 1er mois de vie, un nombre plus important d'animaux (maximum 15 par groupe) pourra être inclus afin de réussir à avoir des données complètes sur un total de 8 à 12 animaux par groupe. Pour les études pilotes de criblage de produits thérapeutiques, de la même façon, le nombre d'animaux par groupe sera entre 3 et 5, 3 étant le minimum pour obtenir des données robustes d'évaluation de l'efficacité des produits au niveau moléculaire.

Raffinement

Le bien-être animal passera notamment par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu (cages équipées de mezzanine et mise à disposition d’éléments d'enrichissement comme des carrés de coton, des tunnels en carton, des papiers froissés et des morceaux de bois). 2) un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement, coupage des incisives si nécessaire). 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autre alternative). 4) Afin d'améliorer la réactivité du personnel animalier, une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates. 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire)

Choix des espèces

Les souris DMSXL portent une insertion de séquence génomique humaine comprenant le gène DMPK humain muté. Les souris DMSXL présentent plusieurs symptômes associés à la pathologie DM1 (dystrophie myotonique de type 1), notamment un retard de croissance, des défauts musculaires, des défauts de conduction cardiaque et des troubles cognitifs. En raison de l'expression du transgène DMPK humain muté, les souris DMSXL constituent aujourd'hui un des meilleurs modèles pour étudier le trouble multisystémique de la DM1, et surtout évaluer des approches thérapeutiques. Lors de l'étude d'histoire naturelle de la souris DMSXL, les animaux seront analysés à l'âge de 1 et 4 mois, afin d’évaluer le potentiel processus évolutif de la maladie, et obtenir des données de référence aux âges qui ont été ciblés pour la future étude de dose. En effet, lors de cette future étude de dose, il est prévu d’injecter les animaux à l’âge de 1 mois, et de les euthanasier 3 mois après injection, soit à l’âge de 4 mois. Lors des études pilotes de criblage de produits thérapeutiques, les animaux seront injectés à l'âge de 1 mois. Puis, selon la nature du vecteur thérapeutique (c’est à dire le principe d’action moléculaire du produit thérapeutique testé), les souris seront suivies entre 1 mois et 3 mois post-injection du vecteur avant euthanasie et analyses moléculaires sur les tissus prélevés post-mortem.

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent chaque jour du D-galactose par voie intrapéritonéale pendant huit semaines pour induire un vieillissement accéléré, avec prélèvements sanguins, traitements et mesures cutanées, avant mise à mort pour analyse des tissus. Le porteur indique des effets indésirables possibles des molécules testées, perte de poids et irritations cutanées. Sur le remplacement, il affirme que le modèle animal est "incontournable" et qu'aucun modèle in vitro ne rend compte du vieillissement de l'"organisme entier".

Objectifs

À l’échelle mondiale, la proportion de personnes âgées de 60 ans et plus est en constante augmentation depuis plusieurs années. En France, d’après les projections de l’Institut national de la statistique et des études économiques (Insee), un individu sur trois aura 60 ans et plus en 2050 (ils étaient un sur cinq en 2005). Accompagner ce vieillissement de la population est donc devenu un enjeu de santé publique mais aussi socio-économique. Ces dernières décennies, de nombreux modèles animaux de vieillissement ont été développés. Dans ce projet, on utilisera un modèle murin de vieillissement accéléré induit par le D-galactose avec pour objectif d'évaluer l'efficacité de nouvelles approches à visée thérapeutique. Le D-galactose est un nutriment physiologique, il s'agit d'un sucre réducteur qui, lorsqu'il est administré en excès chez la souris, contribue à la génération d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), à un dysfonctionnement mitochondrial, à la formation excessive de produits glyqués et est associé à de l'inflammation et à un déclin progressif des capacités cognitives. Ces changements miment le processus de vieillissement dans différents tissus et organes incluant le cerveau, le coeur, les poumons,le foie, les reins, le système reproducteur, la peau, les os, les muscles squelettiques, la réponse immunitaire et dans le sérum. Ainsi, ce modèle présente des caractéristiques mimant la senescence du vieillisement naturel et est adapté à l'évaluation d'efficacité de nouvelles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le vieillissement est un processus physiologique qui intervient chez tous les êtres vivants. Il correspond à un déclin qui altère, à l’échelle moléculaire et cellulaire, les capacités fonctionnelles de l’individu et ses possibilités d’adaptation face à un évènement aigu auquel il est confronté (une maladie, un stress). Dans le contexte biologique, le vieillissement se caractérise par l’accumulation d’évènements qui détériorent les fonctions des organes, et par une augmentation, avec le temps, des risques de décès ou de développer des maladies (cancer, diabète, troubles cardiovasculaires ou cérébraux, etc.). La recherche biologique sur le vieillissement s’intéresse, par définition, à l’étude de cette accumulation d’innombrables évènements inévitables qui apparaissent au cours de la période comprise entre la conception et le décès de l’individu. Il est donc important d'avoir un modèle préclinique prédictif du vieillissement afin d'évaluer de nouvelles thérapeutiques dans le but d'appréhender le vieillissement de manière à "vieillir mieux".

Procédures

Les animaux seront administrés quotidiennement par voie intrapéritonéale (durée d'intervention

Impact sur les animaux

Dans la littérature, il n'y a pas d'effet indésirable décrit pour ce modèle de vieillissement accéléré. Des effets indésirables peuvent être observés lors de l'administration des molécules thérapeutiques : mauvaise tolérance pouvant entraîner une perte de poids, irritation en cas d'application topique...

Devenir

A l'issue de la procédure tous les animaux seront mis à mort afin de prévlever les tissus et réaliser des analyses ex vivo (histologie, dosages de cytokines, dosages enzymatiques...) pour l'évaluation d'efficacité des traitements testés.

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux est incontournable afin d’étudier les mécanismes du vieillissement, mais aussi afin d’améliorer la compréhension des processus impliqués dans la survenue des syndromes de vieillissement accéléré. Il est indispensable d'améliorer les connaissances sur le vieillissement et les pathologies qui y sont associées. La complexité du vieillissement physiologique repose en fait sur la globalité de son impact : il intéresse l’ensemble des organes ; il est modulé par des facteurs qui peuvent être internes (c’est-à-dire physiologiques) mais aussi externes (environnementaux). Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro ou mathématique capable de prendre en compte la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du vieillissement. L’utilisation de modèles murins déjà établis dans la littérature et décrits pour leur pertinence dans ce domaine de la recherche biomédicale est une étape nécessaire pour valider l’efficacité thérapeutique et la tolérance de nouvelles molécules ou thérapies candidates en clinique humaine.

Réduction

La stratégie d'expérimentation sera une expérimentation en mesures répétées (étude longitudinale). Cette approche expérimentale permet d'appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées (ANOVA) et permet d'avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle car une observation est réalisée avant d'initier les phases de traitement. Le nombre d'animaux sera de 8 par groupe (groupe d'animaux traités avec excipient de la molécule à tester ou la molécule à tester). Ce nombre est le minimum pour avoir une significativité acceptable avec une variation de 15%, une puissance de 70% et une différence à souligner de 20% entre groupes témoins et tests comparativement à l'approche classique. Cette approche permet donc de réduire le nombre d'animaux de 50% au moins. Des analyses post mortem sur les tissus seront réalisées (histologie/immunohistologie/ PCR/ cytométrie et approches "omiques") afin d'obtenir le plus d'informations possibles relatives à l'efficacité des molécules administrées sur les animaux.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement par l’expérimentateur afin de s'assurer de leur bien-être (alimentation, boisson, comportement...). Plusieurs sources d’enrichissement dans la cage (tunnel, igloo, cotons,bâtonnets de bois) permettront d'améliorer leur environnement et leur confort d'hébergement. Leur poids sera évalué au 2 fois par semaine, cette mesure aidera à déceler une quelconque souffrance et/ou détresse. De la nourriture humidifiée ou du gel diététique pourra être ajouté dans leur cage. Au moindre signe de déshydratation, les animaux recevront une injection intra-péritonéale de sérum physiologique (20mL/kg). Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien-Etre Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : - Défaut d'alimentation et /ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation; - Perte de poids >20% du poids normal maintenue sur 72h; - Hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger; - Difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire - Plaie nécrosée, purulente ou exsudative - Complication au site d'injection (présence de plaie, douleur...) Si un de ces points limites est atteint, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Les rongeurs se sont rapidement imposés au cours du temps comme des modèles fondamentaux dans la recherche biomédicale. L’essentiel de la littérature est obtenue chez ces deux espèces pour diverses raisons (i) scientifiques, les mécanismes moléculaires et cellulaires décrits dans ces espèces sont retrouvés chez l’homme et (ii) pour un intérêt pratique (faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de manipulation et très bonne adaptation aux conditions expérimentales) ; l’intérêt majeur étant en premier lieu, l’historique de la connaissance de ces animaux, chez lesquels l’essentiel des traitements utilisés en clinique humaine aujourd’hui ont été évalués et validés. Des animaux adultes de plus de 8 semaines d'ages seront utilisés dans ce projet (cf Parameshwaran K et al, Rejuventation Research, 2010).